MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y a las heparinas de bajo peso molecular obtenidas por ese procedimiento. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La heparina es un polisacárido de la familia de los glicosaminoglicanos, formado por ácido urónico (ácido L-idurónico o D-glucurónico) y D- glucosamina, unidos de forma alternada. El ácido L-idurónico puede estar 2-O-sulfatado y la D-glucosamina, puede estar /V-sulfatada y/o 6-O-sulfatada, y en menor extensión /V-acetilada o 3-O-sulfatada. La heparina se usa preferentemente como sal sódica, pero también puede usarse como sal de otros metales alcalinos o alcalinotérreos y se utiliza principalmente como medicamento antitrombótico y anticoagulante.

Las heparinas se pueden clasificar en función de su peso molecular en, heparina no fraccionada (HNF), HBPM y heparina de muy bajo peso molecular (HMBPM). Las HBPM y HMBPM provienen de la despolimerización de la molécula original de HNF.

En el estado de la técnica se han descrito varios métodos para la preparación de HBPM. Uno de ellos corresponde a la despolimerización alcalina por un mecanismo de b- eliminación.

EP0040144 describe un proceso de obtención de HBPM mediante un procedimiento que comprende las etapas de transalificación de una sal de heparina en heparinato de bencetonio, esterificación del heparinato de bencetonio con cloruro de bencilo, purificación y obtención de la sal sódica del éster bencílico de la heparina, despolimerización con hidróxido de sodio con saponificación del éster y purificación del producto. EP1070503 describe un proceso de obtención de HBPM mediante un procedimiento que comprende las etapas de transalificación de una sal de heparina en heparinato de benzalconio, despolimerización en medio no acuoso con Tritón B y purificación del producto.

EP2881404 describe un proceso de obtención de HBPM que comprende una primera etapa de transalificación, una despolimerización con una base fosfaceno o una base derivada de la guanidina y una última transalificación. Existe la necesidad de procesos más reproducibles y estables que permitan la obtención de HBPM, especialmente de HBPM con una mayor estabilidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han encontrado un método de preparación de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) que presentan una estabilidad superior, mientras que mantienen una buena actividad anti-FXa y anti-FI la. Este método de preparación de HBPM comprende el tratamiento de la heparina despolimerizada cruda con H2O2 en una proporción de entre 0,04 y 1 ,0 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada.

Por lo tanto, en un primer aspecto la invención se refiere a un procedimiento de obtención de heparinas de bajo peso molecular con un peso molecular medio de entre 3 y 3,8 KDa, que comprende las siguientes etapas: a) preparar una solución acuosa de heparina sódica; b) añadir cloruro de benzalconio a la solución de la etapa (a) para obtener heparinato de benzalconio; c) disolver el heparinato de benzalconio obtenido en la etapa (b) en CI2CH2, añadir Tritón B y mantener una temperatura de entre 20 y 40 ^e C durante entre 24 y 48 horas; y d) realizar al menos dos tratamientos con H2O2 de la heparina despolimerizada obtenida en la etapa c) en una razón de entre 0,04 y 1 ,0 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada, en cada tratamiento.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una heparina de bajo peso molecular obtenible mediante el procedimiento de la invención.

Se ha encontrado que las HBPM obtenidas presentan un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de entre 1 y 15%. Por lo tanto, un tercer aspecto de la invención se refiere a una heparina de bajo peso molecular con un peso molecular medio de entre 3 y 3,8 KDa que presenta un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de entre 1 y 15 % en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas.

Las definiciones y realizaciones descritas para un aspecto, aplican igualmente al resto de aspectos de la invención.

En la presente invención se entiende como "heparina de bajo peso molecular" o "HBPM" a la definición recogida en el documento Heparins, Low-Molecular-Mass monograph, 0828, European Pharmacopeia 9th Ed., como la mezcla de polisacáridos obtenida de la heparina y que tiene un peso molecular medio menor de 8.000 Dalton y donde al menos el 60% de su masa total tiene un peso molecular menor de 8.000 Da. El peso molecular medio de las HBPM de la invención se ha determinado por el procedimiento de la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 9 ^a Edición).

En la presente invención se entiende como “residuos 1 ,6-anhidro” a diversos grupos químicos que se generan en las posiciones terminales de las HPBM durante el proceso de despolimerización. Ejemplos no limitantes de estos grupos son 2-sulfo- amino-1 ,6-anhidro-2-desoxi^-D-glucopiranosa (1 ,6-anhidroglucosamina) y 2-sulfo- amino-1 ,6-anhidro-2-desoxi^-D-manopiranosa (1 ,6-anhidromanosamina). La cantidad de estos residuos en la HPBM se expresa como el porcentaje de cadenas de oligosacárido que en su terminal reductor presentan estos tipos de residuos.

El contenido en terminales 1 ,6-anhidro de la HBPM puede obtenerse mediante el método analítico descrito en el documento Enoxaparin Sodium monograph, 1097, European Pharmacopeia 9th Ed, descrito en el apartado Identificación B. En este método se despolimeriza exhaustivamente la molécula con una mezcla de heparinasas I, II y III, separándose y cuantificándose los residuos generados por cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX-HPLC). El contenido en 1 ,6-anhidro, por ejemplo, se determina de acuerdo con la siguiente fórmula:

% 1 ,6-anhidro = Mw ^* (Ai + A ₂ + A ₃ ) ^* 100 / åMw _x ^* A _x donde:

Mw, peso molecular medio

Mw _x , peso molecular del derivado x (ver tabla 1097-1 del documento Enoxaparin Sodium monograph, 1097, European Pharmacopeia 9th Ed)

A _x , área del pico del derivado x Ai, área del pico del derivado 1 ,6-anhidro AIS A ₂ , área del pico del derivado 1 ,6-anhidro AIIS A ₃ , área del pico del derivado 1 ,6-anhidro AIS-IS

La proporción de residuos 1 ,6-anhidroglucosamina y de residuos 1 ,6 anhidromanosamina en la HBPM se puede determinar mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN), por ejemplo mediante ¹ H ¹³ C HSQC. La proporción entre ambos residuos se puede determinar integrando las señales correspondientes a cada uno de estos residuos en el espectro de ¹ H ¹³ C HSQC. La actividad anti-FXa y anti-Flla de las FIBPM de la invención se ha determinado por el procedimiento cromogénico de la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 9 ^a Edición, Monografía 0828) y se ha expresado en unidades internacionales por mg.

El grado de color de la FIBPM se puede determinar según el método II de la Farmacopea Europea capítulo 2.2.2.

El término “temperatura ambiente” se refiere a una temperatura de entre 20 y

25 ^e C.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa ± 10% del valor dado.

Las FIBPM de la invención tienen un peso molecular medio (Mw) de entre 3 y 3,8 KDa, preferiblemente de entre 3 y 3,6 KDa.

En una realización, la FIBPM de la invención presenta un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de entre 1 y 15% en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas; preferiblemente de entre 2 y 13%, más preferiblemente de entre 4 y 11%.

Preferiblemente, la proporción molar de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina en la FIBPM de la invención es mayor o igual a la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina. En una realización particular, la proporción molar de residuos 1 ,6- anhidroglucosamina:residuos 1 ,6 anhidromanosamina en la FIBPM es de entre 1 :1 y 3:1 , preferiblemente entre 1 :1 y 2,5:1 o entre 1 ,05:1 y 2,5:1 .

En una realización particular de la invención, la FIBPM tienen un peso molecular medio de entre 3 y 3,8 KDa, un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de entre 1 y 15% en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas, y una proporción de residuos 1 ,6- anhidroglucosamina mayor o igual a la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, preferiblemente entre 1 :1 y 3:1 .

Preferiblemente, la FIBPM de la invención presenta una actividad anti-FXa de entre 80-120 Ul/mg y una actividad anti-Flla de entre 5-20 Ul/mg. En una realización particular, presenta una actividad anti-FXa de entre 95-120 Ul/mg y una actividad anti- Flla de entre 10-20 Ul/mg.

En una realización particular de la invención, la FIBPM tienen un peso molecular medio de entre 3 y 3,8 KDa, un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de entre 1 y 15% en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas, y una proporción de residuos 1 ,6- anhidroglucosamina mayor o igual a la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, preferiblemente entre 1 :1 y 3:1 , una actividad anti-FXa de entre 80-120 Ul/mg y una actividad anti-Flla de entre 5-20 Ul/mg.

Preferiblemente, la FIBPM de la invención presenta un grado de color mayor o igual a 6 en la gama de soluciones de referencia del color establecidas en Farmacopea Europea capítulo 2.2.2. (método II), durante al menos 24 meses, preferiblemente durante al menos 36 meses, a temperatura ambiente y 60% de humedad relativa. Esta determinación se puede hacer siguiendo el método descrito en la Farmacopea Europea (capítulo 2.2.2; método II), o de forma automática utilizando un colorímetro.

Se ha observado que las HBPM de la invención presentan una elevada estabilidad. En concreto, se ha observado que son estables durante al menos 24 meses, o incluso durante al menos 36 meses a temperatura ambiente y 60% de humedad relativa.

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de obtención de heparinas de bajo peso molecular con un peso molecular medio de entre 3 y 3,8 KDa que comprende las siguientes etapas: a) preparar una solución acuosa de heparina sódica; b) añadir cloruro de benzalconio a la solución de la etapa (a) para obtener heparinato de benzalconio; c) disolver el heparinato de benzalconio obtenido en la etapa (b) en CH2CI2, añadir Tritón B y mantener una temperatura de entre 20 y 40 ^e C durante entre 24 y 48 horas; y d) realizar al menos dos tratamientos con H2O2 de la heparina despolimerizada obtenida tras la etapa c) en una razón de entre 0,04 y 1 ,0 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada, en cada tratamiento.

Realizaciones particulares y preferidas para la heparina de bajo peso molecular son tal y como se han definido previamente en este documento.

En una realización particular, la solución acuosa de heparina sódica de la etapa a) se prepara a partir de heparina obtenida de la mucosa intestinal del cerdo.

La adición de Tritón B en la etapa c) puede hacer mediante una o varias adiciones secuenciales, por ejemplo mediante 1 , 2, 3 o 4 adiciones secuenciales de Tritón B.

En una realización particular, la adición de Tritón B en la etapa c) se realiza en un máximo de tres adiciones secuenciales, i.e. 1 , 2 o 3, cada una de ellas con la adición de Tritón B en una razón en peso de 0,2:1 a 0,3:1 de Tritón B:heparinato de benzalconio. Preferiblemente, la adición de Tritón B en la etapa c) se realiza mediante tres adiciones secuenciales de Tritón B, y preferiblemente cada una de ellas con la adición de Tritón B en una razón en peso de 0,2:1 a 0,3:1 de Tritón B:heparinato de benzalconio.

En una realización de la invención, la adición de Tritón B en la etapa c) se realiza mediante tres adiciones secuenciales de Tritón B, de forma que tras la primera adición se mantiene la reacción durante 6-10 horas hasta la segunda adición, tras la segunda adición se mantiene la reacción durante 12-20 horas hasta la tercera adición, y tras la tercera adición se mantiene la reacción durante 6-10 horas. En una realización adicional, tras la primera adición se mantiene la reacción durante 7-9 horas hasta la segunda adición, tras la segunda adición se mantiene la reacción durante 14-18 horas hasta la tercera adición, y tras la tercera adición se mantiene la reacción durante 7-9 horas. En otra realización adicional, el tiempo de reacción tras la primera, segunda y tercera adición es de aproximadamente 8, aproximadamente 16 y aproximadamente 8 horas, respectivamente.

En una realización, la temperatura en la etapa c) es de entre 25 y 35 ^e C, preferiblemente entre 27 y 32 ^e C.

En una realización preferida, el tratamiento con H2O2 en la etapa d) se lleva acabo sobre una disolución acuosa de la heparina despolimerizada.

Preferiblemente, cada tratamiento con H2O2 en la etapa d) se realiza con una razón de entre 0,04 y 0,5 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada, preferiblemente entre 0,04 y 0,3 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada. En una realización particular, cada tratamiento con H2O2 en la etapa d) se realiza con una razón de entre 0,04 y 0,2 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada. En una realización preferida, la etapa d) comprende un primer tratamiento con H2O2 de la heparina despolimerizada obtenida tras la etapa c) en una razón de entre 0,05 y 0,25 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada, y un segundo tratamiento con H2O2 en una razón de entre 0,04 y 0,25 litros de H2O2 al 33 % p/v por cada kg de heparina despolimerizada.

En otra realización, la etapa d) incluye tres tratamientos con H2O2.

Preferiblemente, la etapa d) se lleva a cabo a una temperatura de entre 20 y 50 ^e C, preferiblemente entre 25 y 45 ^e C.

Preferiblemente, cada tratamiento con H2O2 se realiza durante al menos 3 horas. Por ejemplo, durante entre 3 y 20 horas. En una realización particular, el primer tratamiento con H2O2 se realiza durante un tiempo de entre 12 y 20 h, preferiblemente entre 14 y 18 h. Preferiblemente, el segundo y posteriores tratamientos con H2O2 se realizan durante un tiempo de entre 3 y 7 h, preferiblemente entre 4 y 6 h.

En una realización preferida, la etapa d) se lleva a cabo a un pH entre 10,5 y 11 ,5. Adicionalmente, el procedimiento de la invención puede incluir una etapa adicional de precipitación en metanol de la heparina despolimerizada después de cada tratamiento con H2O2 en la etapa d). En una realización particular, se llevan a cabo dos tratamientos con H2O2 y se realiza una etapa de precipitación en metanol de la heparina despolimerizada entre los dos tratamientos con H2O2. En otra realización, se llevan a cabo tres tratamientos con H2O2 y se realiza una etapa de precipitación en metanol de la heparina despolimerizada entre el primer y segundo tratamiento con H2O2 y entre el segundo y tercer tratamiento con H2O2.

Preferiblemente, tras el primer tratamiento con H2O2 en la etapa d) le heparina despolimerizada se precipita en una solución de acetato sódico en metanol.

En una realización preferida, la HBPM obtenida en el procedimiento de la invención se purifica mediante precipitación con metanol.

La HBPM obtenida se puede someter a liofilización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Espectro de ¹ H RMN de HBPM obtenida mediante el procedimiento de la invención con ampliación de zona anomérica.

Figura 2. Espectro de ¹ H ¹³ C HSQC de HBPM obtenida mediante el procedimiento de la invención con ampliación de zona anomérica.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan a continuación sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica.

Ejemplo 1

Se disuelven 10 g de heparina sódica en agua purificada y bajo agitación se añade una disolución de cloruro de benzalconio al 50 % (p/v), formándose el heparinato de benzalconio. El producto formado se lava varias veces con agua para eliminar el exceso de cloruros y finalmente el producto se seca por liofilización.

El heparinato de benzalconio se disuelve en cloruro de metileno y se ajusta la temperatura a 30 ± 5 ^e C. Se añade hidróxido de benciltrimetilamonio (Tritón B) al 40 % p/v en metanol a una razón en peso de 0,25:1 de Tritón B:heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a la temperatura anteriormente indicada. La adición se repite dos veces más, dejándose la primera adición de Tritón B 8 horas, la segunda, 16 horas y la tercera, otras 8 horas.

A la disolución del producto despolimerizado, y a un pH entre 10,5 y 11 ,5 se añade H2O2 al 33 % p/v, particularmente, se añaden 0,1 ± 10% litros de H2O2 al 33 % p/v por kg de heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a 30 ± 5 ^e C durante más de 3 horas (entre 14 y 18 horas). T rascurrido el tiempo de reacción se precipita sobre una disolución de acetato sódico en metanol, aislándose por centrifugación la heparina de bajo peso molecular cruda.

Esta heparina de bajo peso molecular cruda se disuelve en agua y se precipita nuevamente con metanol. El precipitado se disuelve en agua purificada y se trata con H2O233 % p/v, concretamente, se añaden 0,08 ± 10% litros de H ₂ C>233 % p/v por kg de heparinato de benzalconio a una temperatura de 40 ± 2 ^e C durante más de 3 horas (en torno a 5 horas). Tras el periodo de reacción, la solución se neutraliza y se precipita con metanol.

El precipitado se redisuelve en agua purificada y se trata de nuevo con 0,05 ± 10% litros de H2O233 % p/v por kg de heparinato de benzalconio a una temperatura de 40 ^e C ± 2 ^e C durante más de 3 horas (en torno a 5 horas). Tras el periodo de reacción, la solución se neutraliza y se precipita con metanol.

La concentración del heparinato de benzalconio en la solución en la que se realiza tanto la despolimerización como el primer tratamiento con peróxido de hidrógeno, es del 20 % p/v ± 2% en este y en todos los demás ejemplos, salvo que se indique lo contrario. La cantidad de peróxido de hidrógeno que se adiciona en las diferentes etapas es equivalente referenciarla tanto al heparinato de benzalconio como a la heparina despolimerizada, puesto que tras las diferentes adiciones de Tritón B el heparinato de benzalconio presente en la reacción se despolimeriza dando lugar a heparina despolimerizada.

El producto purificado se disuelve en agua y se liofiliza, obteniéndose 6,00 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3241 Da, una actividad anti-FXa de 118 Ul/mg y una actividad anti-Flla de 13,7 Ul/mg y presenta en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor o igual que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur.(2.2.2, Método II)).

El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 2 Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 1 , se obtienen 6,01 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3259 Da, una actividad anti-FXa de 103 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 15,2 Ul/mg. Esta heparina de bajo peso molecular presenta la característica de tener en el extremo terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur.(2.2.2, Método II)).

El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 3

Se disuelven 10 g de heparina sódica en agua purificada y bajo agitación se añade una disolución de cloruro de benzalconio al 50% (p/v), formándose el heparinato de benzalconio. El producto formado se lava varias veces con agua para eliminar el exceso de cloruros y finalmente el producto se seca por liofilización.

El heparinato de benzalconio se disuelve en cloruro de metileno y se ajusta la temperatura a 30 ^e C ± 5 ^e C. Se añade hidróxido de benciltrimetilamonio (Tritón B) al 40% p/v en metanol a una razón en peso de 0,25:1 de Tritón B:heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a la temperatura anteriormente indicada. La adición se repite dos veces más, dejándose la primera adición de Tritón B 8 horas, la segunda, 16 horas y la tercera, otras 8 horas.

A la disolución del producto despolimerizado, y a un pH entre 10,5 y 11 ,5 se añade H2O2 al 33 % p/v, particularmente se añaden 0,1 ± 10% litros de FbC^ al 33 % p/v/ kg de heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a 30 ± 5 ^e C durante 16 horas. Trascurrido el tiempo de reacción se precipita sobre una disolución de acetato sódico en metanol, aislándose por centrifugación la heparina de bajo peso molecular cruda.

Esta heparina de bajo peso molecular cruda se disuelve en agua y se precipita nuevamente con metanol. El precipitado se disuelve en agua purificada y se trata con FI2O2 33 % p/v, concretamente, se añaden 0,08 ± 10% litros de FI2O2 33 % p/v/ kg de heparinato de benzalconio a una temperatura de 40 ± 2 ^e C. Tras 5 horas de reacción, la solución se neutraliza y se precipita con metanol. El producto purificado se disuelve en agua y se liofiliza, obteniéndose 5,21 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3269 Da, una actividad anti-FXa de 119 Ul/mg y una actividad anti-Flla de 13,70 Ul/mg y presenta en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro entre 1 y 15% donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor o equivalente que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur.(2.2.2, Método II)).

El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 4

Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 1 , se obtienen 6,25 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3172 Da, una actividad anti-FXa de 108 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 13,1 Ul/mg y un perfil de residuos 1 ,6-anhidro en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor o equivalente que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular, como la enoxaparina.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)).

El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 5

Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 1 , se obtienen 6,34 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3347 Da, una actividad anti-FXa de 110 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 14,7 Ul/mg y un perfil de residuos 1 ,6-anhidro en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor o equivalente que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular, como la enoxaparina.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)). El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 6

Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 1 , se obtienen 7,11 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3400 Da, una actividad anti-FXa de 119 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 15,0 Ul/mg y y un perfil de residuos 1 ,6-anhidro en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6- anhidroglucosamina es mayor que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular, como la enoxaparina.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)). El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 7

Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 1 , se obtienen 6,92 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3328 Da, una actividad anti-FXa de 117 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 14,9 Ul/mg y y un perfil de residuos 1 ,6-anhidro en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6- anhidroglucosamina es mayor o equivalente que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular, como la enoxaparina.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)). El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 8

Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 3, se obtienen 7,04 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3331 Da, una actividad anti-FXa de 113 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 15,3 Ul/mg y un perfil de residuos 1 ,6-anhidro en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor o equivalente que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular, como la enoxaparina.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur.(2.2.2, Método II)). El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo 9

Partiendo de 10 g de heparina sódica y repitiendo los pasos indicados en el ejemplo 3, se obtienen 7,09 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3366 Da, una actividad anti-FXa de 115 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 16,0 Ul/mg y un perfil de residuos 1 ,6-anhidro en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas entre 1 y 15 % donde la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina es mayor o equivalente que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de otras heparinas de bajo peso molecular, como la enoxaparina.

Esta heparina de bajo peso molecular además presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur.(2.2.2, Método II)). El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado era estable a temperatura ambiente en un intervalo entre 24 y 36 meses.

Ejemplo comparativo 10 (sin tratamiento con H2O2)

Se disuelven 10 g de heparina sódica en agua purificada y bajo agitación se añade una disolución de cloruro de benzalconio al 50 % (p/v), formándose el heparinato de benzalconio. El producto formado se lava varias veces con agua para eliminar el exceso de cloruros y finalmente el producto se seca por liofilización.

El heparinato de benzalconio se disuelve en cloruro de metileno y se ajusta la temperatura a 30 ± 5 ^e C. Se añade hidróxido de benciltrimetilamonio (Tritón B) al 40 % p/v en metanol a una razón en peso de 0,25:1 de Tritón B:heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a la temperatura anteriormente indicada. La adición se repite dos veces más, dejándose la primera adición de Tritón B 8 horas, la segunda, 16 horas y la tercera, otras 8 horas.

La solución del producto despolimerizado se precipita sobre una disolución de acetato sódico en metanol, aislándose por centrifugación la heparina de bajo peso molecular cruda.

Esta heparina de bajo peso molecular cruda se disuelve en agua y se precipita nuevamente con metanol. El precipitado se disuelve en agua purificada a una temperatura de 40 ± 2 ^e C a pH 11. Trascurridas 5 horas, la solución se neutraliza y se precipita con metanol.

El producto purificado se disuelve en agua y se liofiliza, obteniéndose 5,28 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 3280 Da, una actividad anti-FXa de 112 Ul/mg y una actividad anti-Flla de 13,70 Ul/mg y presenta en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de 18,5 %. Además, se analiza la proporción de residuos 1 ,6-anhidroglucosamina respecto de la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina, a diferencia de los ejemplos anteriores, los restos 1 ,6 anhidromanosamina son mayores que los de 1 ,6-anhidroglucosamina.

Se analiza además el grado de estabilidad correlacionado con el color de la muestra, observando que a partir del décimo mes a temperatura ambiente presenta un grado de color de 4 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)).

El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado no era estable durante más de 9 meses a temperatura ambiente, por lo que las adiciones de H2O2, parecen ser las responsables de este comportamiento.

Ejemplo comparativo 11 (despolimerización a 60 ^e C)

Se disuelven 10 g de heparina sódica en agua purificada y bajo agitación se añade una disolución de cloruro de benzalconio al 50 % (p/v), formándose el heparinato de benzalconio. El producto formado se lava varias veces con agua para eliminar el exceso de cloruros y finalmente el producto se seca por liofilización. El heparinato de benzalconio se disuelve en cloruro de metileno y se ajusta la temperatura a 60 ± 5 ^e C. Se añade hidróxido de benciltrimetilamonio (Tritón B) al 40 % p/v en metanol a una razón en peso de 0,25:1 de Tritón B:heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a la temperatura anteriormente indicada. La adición se repite dos veces más, dejándose la primera adición de Tritón B 8 horas, la segunda, 16 horas y la tercera, otras 8 horas.

A la disolución del producto despolimerizado, y a un pH entre 10,5 y 11 ,5 se añade peróxido de hidrógeno al 33 % p/v, particularmente, se añaden 0,1 ± 10% litros de H2O2 al 33 % p/v /kg de heparinato de benzalconio y se deja reaccionar a 30 ± 5 ^e C durante 16 horas. Trascurrido el tiempo de reacción se precipita sobre una disolución de acetato sódico en metanol, aislándose por centrifugación la heparina de bajo peso molecular cruda.

Esta heparina de bajo peso molecular cruda se disuelve en agua y se precipita nuevamente con metanol. El precipitado se disuelve en agua purificada y se trata con peróxido de hidrógeno 33 % p/v, concretamente, se añaden 0,08 ± 10% litros de H2O2 33 % p/v por kg de heparinato de benzalconio a una temperatura de 40 ± 2 ^e C. Tras 5 horas de reacción, la solución se neutraliza y se precipita con metanol.

El precipitado se redisuelve en agua purificada y se trata de nuevo con 0,05 ± 10% litros de H2O233 % p/v por kg de heparinato de benzalconio H2O233% p/v a una temperatura de 40 ^e C ± 2 ^e C durante en torno a 5 horas. Tras el periodo de reacción, la solución se neutraliza y se precipita con metanol. El producto purificado se disuelve en agua y se liofiliza, obteniéndose 5,10 g de heparina de bajo peso molecular y un peso molecular medio de 2341 Da, una actividad anti-FXa de 109 Ul/mg y una actividad anti-FI la de 2,8 Ul/mg y presenta en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de 21 % donde la proporción de los residuos 1 ,6- anhidroglucosamina es mucho menor que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina. Se analiza además el grado de estabilidad correlacionado con el color de la muestra, observando que a partir del décimo mes a temperatura ambiente presenta un grado de color de 4 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)).

El grado de color, parámetro directamente relacionado con la estabilidad del producto, permitió determinar que el producto final envasado no era estable durante más de 10- 11 meses a temperatura ambiente, requiriendo cadena de frío para que la estabilidad del producto supere los 12 meses.

Ejemplo 12 Los productos obtenidos en los ejemplos 1 a 11 se analizan para determinar porcentualmente el contenido en residuos 1 ,6-anhidro de manera concreta, de acuerdo con el método descrito en el documento Enoxaparin Sodium monograph, 1097, European Pharmacopeia 9th Ed, descrito en el apartado Identificación B, obteniéndose los siguientes resultados.

Ejemplo 13

El producto obtenido en el ejemplo 1 , se analiza por resonancia magnética nuclear, en concreto por los experimentos de ¹ H-RMN y ¹ H- ¹³ C HSQC. La espectroscopia de ¹ H-RMN ha sido la técnica más ampliamente usada para el estudio de estos compuestos dado que se trata de un núcleo abundante y con una alta relación giromagnética. La región entre 1 ,8 - 2,1 ppm comprende las señales correspondientes a los grupos N-acetilo o los grupos metilos de los terminales reductores que pueden ser incluidos sintéticamente. La región entre 2,8 - 4,6 ppm, comprende la mayoría de las señales del anillo sacarídico y presentan un alto grado de solapamiento entre ellas, lo que hace que sea dificultosos extraer información estructural directamente de esta zona. Entre 4,6 - 6,0 ppm se encuentran las señales correspondientes a los protones anoméricos. Dada que es una zona mucho menos poblada de señales, es posible extraer una gran información de ella. Además, en el caso de HBPMs obtenidas por mecanismo de b-eliminación, también contienen las señales correspondientes a los H4 de los terminales no reductores de la molécula.

En concreto las señales correspondientes a los residuos 1 ,6-anhdro aparecen a 5,57 y 5,62 ppm, que corresponden al protón anomérico de las estructuras de 1 ,6- anhidromanosamina y 1 ,6-anhidroglucosamina, respectivamente, y tal como describe la literatura.

Otro experimento bidimensional de particular importancia para la caracterización estructural de este tipo de compuestos, es el ¹ H- ¹³ C HSQC (Heteronuclear Single- Quantum Correlation), que correlaciona desplazamientos químicos de protón con desplazamientos químicos de carbono 13, y permite asignar las estructuras primarias de oligosacáridos derivados de GAGs y la composición monosacarídica.

El incremento de dispersión espectral conseguida con esta técnica bidimensional permite la cuantificación de las integrales de las señales que se superponen en los correspondientes espectros monodimensionales.

Las señales correspondientes a los residuos 1 ,6-anhidro aparecen a 5,57-103,9 y 5,61 - 104,3 ppm, que corresponden al protón anomérico de las estructuras de 1 ,6- anhidromanosamina y 1 ,6-anhidroglucosamina, respectivamente, y tal como describe la literatura y así se observa en las figuras 1 y 2 para la muestra del producto obtenido en el ejemplo 1.

Ejemplo 14

Los productos obtenidos en los ejemplos 1 a 11 , se analizaron para determinar el contenido en residuos de 2-sulfo-amino-1 ,6-anhidro-2-desoxi^-D-glucopiranosa (1 ,6- anhidroglucosamina ó 1 ,6-an.A) y 2-sulfo-amino-1 ,6-anhidro-2-desoxi^-D- manopiranosa (1 ,6-anhidromanosamina ó 1 ,6-an.M), de acuerdo al procedimiento conocido en el estado de la técnica para los experimentos de ¹ H- ¹³ C HSQC, obteniéndose los siguientes resultados.

Ejemplo 15: reproducción del ejemplo 1 de EP1070503 y del mismo añadiendo los tratamientos con peróxido de hidrógeno

Se reprodujo el ejemplo 1 descrito en EP1070503 tal y como se describe en el mismo, y con una variante: añadiendo tras la despolimerización con Tritón B dos etapas de tratamiento con peróxido de hidrógeno a un pH entre 10,5 y 11 ,5, donde se añadieron en la primera etapa 0,08 litros de H2O233 % p/v por kg de heparinato de benzalconio a una temperatura de 40 ± 2 ^e C (5 horas de reacción) y en la segunda etapa 0,05 litros de H2O2 33 % p/v por kg de heparinato de benzalconio a una temperatura de 40 ^e C ± 2 ^e C durante en torno a 5 horas.

Al reproducir el ejemplo 1 de EP1070503 se obtuvo una heparina de bajo peso molecular que presentaba en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro de 0,3 % mientras que al añadir las dos etapas de tratamiento con peróxido de hidrógeno descritas arriba, este contenido fue del 6 %. Además, los restos 1 ,6 anhidromanosamina son mayores que los de 1 ,6-anhidroglucosamina al reproducir el ejemplo 1 de EP1070503 mientras que cuando se realizaron los tratamientos con peróxido de hidrógeno descritos arriba la proporción molar de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina fue mayor o igual que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina.

Al reproducir el ejemplo 1 de EP1070503 y analizar el grado de estabilidad correlacionado con el color de la muestra, se observó que a partir del décimo mes a temperatura ambiente presenta un grado de color de 4 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur. (2.2.2, Método II)). Sin embargo, con los tratamientos con peróxido descritos arriba, el producto obtenido resultó ser estable a temperatura ambiente durante 24-36 meses presentando un grado de color ³ 6 medido con un colorímetro de la marca LICO® que relaciona el color según la gama cromática de referencia establecida en Farmacopea (Ph. Eur.(2.2.2, Método II)).

Ejemplo 16:

Los ejemplos 1 y 3 se repitieron variando las cantidades añadidas de peróxido de hidrógeno, que siempre oscilaron en cada tratamiento entre 0,04 y 1 ,0 litros de H2O233 % p/v / kg de heparinato de benzalconio (o heparina despolimerizada) y en tiempos de entre 3 y 20 horas.

^* litros de H2O233 % p/v / kg de heparinato de benzalconio

En todos los casos las heparinas obtenidas presentaron un peso molecular medio de entre 3 y 3,8 KDa y una actividad anti-FXa de entre 80-120 Ul/mg y una actividad anti- Flla de entre 5-20 Ul/mg. Igualmente, en todos los casos las heparinas obtenidas presentaron en el terminal reductor de sus cadenas oligosacarídicas un contenido de residuos 1 ,6-anhidro entre 1 y 15 % y la proporción de los residuos 1 ,6-anhidroglucosamina era mayor o igual que la de los residuos 1 ,6 anhidromanosamina.