Procedimiento para la obtención de un extracto fenólico procedente de alpeoruio

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un extracto rico en compuestos fenólicos procedente de alpeorujo fresco de oliva mediante disolventes eutécticos naturales (NADES) de base acídica. La invención también se refiere al uso del extracto fenólico como nutracéutico, aditivo alimentario y como fitosanitario particularmente para el tratamiento de enfermedades microbianas. Asimismo, la invención se refiere al alpeorujo extractado para compostaje y vermicompostaje, particularmente como fertilizante y enmienda orgánica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El alpeorujo es el principal subproducto del proceso de extracción de aceite de oliva por el sistema de centrifugación en continuo a 2 fases, en el que a partir de las aceitunas se obtiene aproximadamente un 20% de aceite y se genera un 80% de subproducto.

El alpeorujo es una sustancia heterogénea constituida por la piel, pulpa y el hueso de la oliva con elevada humedad que oscila entre el 65% y el 75%, es de consistencia semisólida, de gestión costosa, fitotóxico (E. Benítez, E., Sainz, H., Melgar, R., Nogales, R. 2002, Vermicomposting of a lignocellulosic waste from olive oil industry: A pilot scale study. Waste Manage Res. 134-142) y de difícil degradación biológica (Venieri, D., Rouvalis, A., Iliopoulou-Georgudaki, J. 2010. Microbial and toxic evaluation of raw and treated olive mili wastewaters. J Chem Tech & Biotech, Vol. 85, 1380-1388) que produce un fuerte impacto ambiental, convirtiendo a este subproducto en una carga económica para la industria oleícola.

Sin embargo, el alpeorujo es rico en compuestos bioactivos, en particular compuestos fenólicos que son muy abundantes en la aceituna y tras la extracción del aceite de oliva permanecen retenidos hasta el 80% en el alpeorujo. Además, el alpeorujo contiene otras sustancias saludables y nutricionalmente valiosas como lípidos, carbohidratos y proteínas.

Los compuestos fenólicos pueden tener efectos neuroprotectores en varias patologías del sistema nervioso a través del control del estrés oxidativo, inflamación, apoptosis y disfunción mitocondrial. Según la literatura científica más reciente, la ingesta dietética de compuestos fenólicos atenúa el estrés oxidativo y reduce el riesgo de enfermedades neurodegenerativas relacionadas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, derrames cerebrales, esclerosis múltiple y la enfermedad de Huntington. También a nivel periférico, actúan como antioxidantes, defendiendo los tejidos contra el daño oxidativo y eliminando los radicales libres. [Polyphenols from Food and Natural Products: Neuroprotection and Safety. Silva RFM, Pogacnik L. Antioxidants (Basel). 2020 Jan 10;9(1)].

Muchos antioxidantes sintéticos se han utilizado para retrasar el proceso de oxidación, particularmente en los sistemas alimentarios (Shahidi, F. and Naczk, M. 2004. Phenolics in Food and Nutraceuticals, 576Boca Ratón, FL: CRC Press.). Sin embargo, el uso de antioxidantes sintéticos está bajo una estricta regulación debido a su potencial peligro para la salud en la promoción de la carcinogénesis, así como al rechazo general de los aditivos alimentarios sintéticos por parte de los consumidores. Los tocoferoles y el ácido ascórbico o sus derivados que se utilizan como alternativas a los antioxidantes sintéticos son antioxidantes mucho menos efectivos. (Emerging Role of Phenolic Compounds as Natural Food Additives in Fish and Fish Products. Sajid Maqsood, Soottawat Benjakul & Fereidoon Shahidi. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. Volume 53, 2013 - Issue 2).

Por otra parte, existe una demanda creciente de la industria agroalimentaria de antimicrobianos de origen natural asociada a las restricciones de la normativa europea en materia de fitosanitarios y a la regulación del uso sostenible de los mismos (Directiva 2009/128/CE. Reglamento (CE) n° 1107/2009 (Directiva 2009/128/CE) asociada a los riesgos para la salud y medioambiente que conllevan (toxicidad, persistencia a largo plazo, promoción de la resistencia de patógenos). Los consumidores demandan alimentos libres de residuos químicos de síntesis que se asocian con efectos perjudiciales para la salud (Balasubramanian, P., Karthickumar, P. 2017. Biofertilizers and biopesticides: A holistic approach for sustainable agriculture. Sustainable utilization of natural resources 256-284; Kulkarni, S. 2016. Sustainable agrochemicals for conservation of agriculture and climate change. Conservation agriculture: An approach to combat climate change in indian himalaya pp. 135-157).

Se ha descrito la actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos y entre ellos de los fenoles de la aceituna y del aceite de oliva (Brenes, M., Medina, E., García, A., Romero, C., de Castro, A. 2010. Olives and olive oil compounds active against pathogenic microrganisms, Health and disease prevention,109, 1013-1019). El alpeorujo es rico en estos compuestos y se conoce su acción antimicrobiana frente a un amplio espectro de microrganismos entre ellos las bacterias fitopatógenas (Medina, E., Romero, C., Santos, B., Castro, A., García, A., Romero, F., Romero, F., Brenes, M. 2011. Antimicrobial activity of olive Solutions from stored alpeorujo against plant pathogenic microorganisms. J. Agrie. Food Chem. 59, 6927-6932).

La industria agroalimentaria y la comunidad científica buscan además de la obtención de compuestos bioactivos de origen natural, que éstos sean obtenidos mediante extractantes no tóxicos, biodegradables y de bajo coste como una alternativa a los disolventes orgánicos convencionales que se utilizan de forma extensa y en su mayoría no cumplen estas premisas.

Se necesitan disolventes de alta capacidad extractiva de sustancias bioactivas, que produzcan extractos de baja toxicidad que se puedan utilizar en la industria agroalimentaria y de bajo impacto ambiental.

Los Disolventes Eutécticos Profundos Naturales (NADES) están constituidos por mezclas de sustancias naturales presentes en organismos vivos y pueden ser una alternativa a los disolventes convencionales en función de su formulación. Los NADES pueden constituirse por muy diferentes combinaciones de sustancias, típicamente se han formulado NADES para extracción de sustancias bioactivas basados en sales de amonio como cloruro de colina, asociado a otros componentes como azúcares, alcoholes, o aminoácidos entre otros (Dai, Y., Witkamp, G. J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. 2013. Natural Deep Eutectic Solvents as a New Extraction Media for Phenolic Metabolites in Carthamus tinctorius. L. Anal. Chem. 85, 6272-6278). Sin embargo, estos NADES pueden presentar toxicidad frente a células y a animales, lo que limita su uso como aditivo alimentario o nutracéutico. Radosevic, K., Búbalo, M. C., Srcek, V. G., Grgas, D., Dragicevic, T. L, Redovnikovic, I. R. 2015. Evaluation of toxicity and biodegradability of choline chloride based deep eutectic solvents. Ecotoxicol Environ Saf. 112, 46-53. Se han utilizado diferentes disolventes eutécticos para la extracción de fenoles de aceites de oliva y alpeorujo basados en sales de amonio y otros componentes (García, A., Rodríguez-Juan, E., Rodríguez-Gutiérrez, G., Ríos, J. J., Fernández-Bolaños, J. 2016. Extraction of phenolic compounds from Virgin olive oil by deep eutectic solvents (DESs). Food Chem. 197, 554-561, García, A., Rodriguez-Juan, E., Fernandez- Bolaños, J. 2017. Extraction of phenolic compounds from olive pomace by deep eutectic solvents (DESs), Green Chemistry. 3:3) pero no se han usado disolventes de baja toxicidad y alta capacidad extractiva como los NADES acídicos. El alpeorujo es un subproducto que actualmente se puede reciclar mediante diferentes procedimientos biotecnológicos, entre ellos, el compostaje (Tortosa, G., Alburquerque, J.A., Ait-Baddi, G., Cegarra, J. 2012. The production of commercial organicamendments and fertilisers by composting of two-phase olive mili waste ("alpeorujo"). Journal of Cleaner Production 26, 48-55) y el vermicompostaje.

El vermicompostaje facilita la transformación de residuos orgánicos mediante procesos de bajo coste en los que intervienen microorganismos y lombrices dando lugar a un producto, el vermicompost, útil para la agricultura como fertilizante y/o enmienda de suelos (Melgar, R., Benitez, E., Nogales, R., 2009. Bioconversion of wastes from olive oil industries by vermicomposting process using the epigeic earthworm Eisenia andrei. Journal of Environmental Science and Health, Part B, 44, 488-495. Nogales, R., Romero, E., Fernandez-Gómez, M. J. 2014. Vermicompostaje: Procesos, productos y aplicaciones. Mundi-Prensa, Madrid). Por tanto, sería deseable disponer de un procedimiento para la obtención de un extracto bioactivo y antimicrobiano del alpeorujo mediante NADES y el aprovechamiento del alpeorujo extractado mediante procesos como el vermicompostaje que permitiese la gestión sostenible de la producción del aceite de oliva con residuo cero. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un extracto fenólico procedente de alpeorujo que comprende las siguientes etapas: i. preparación de disolventes eutécticos naturales (NADES) seleccionados de ácido cítrico y fructosa en relación 1:1 p/p, con un contenido de entre el 8% y el 35% en peso de agua; y ii. adición de los NADES de la etapa (i) al alpeorujo en una relación alpeorujo: NADES comprendido entre 5:1 a 1:5 p/p, agitando durante un tiempo de entre 10 minutos a 6 horas, a una temperatura de entre 20 °C y 90 °C, y centrifugando entre 1.000 g y 17.000 g para separar la fase de extracto fenólico con los disolventes del alpeorujo extractado (ALE).

En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde la etapa (ii) se repite una o más veces, preferiblemente una o dos veces, y más preferiblemente una vez.

En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde en la etapa (i) de preparación de disolventes eutécticos naturales (NADES) el contenido de agua es de entre el 10% y el 30% en peso de agua, y preferiblemente 10% y el 25% en peso de agua, y más preferiblemente de 19% en peso de agua.

En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde en la etapa (ii) la relación de los NADES de la etapa (i) y alpeorujo es de 1 : 1 p/p.

En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde la etapa (ii) se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 °C y 50 °C, y preferiblemente de 40 °C.

En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde la etapa (ii) se lleva a cabo centrifugando entre 7.000 g y 17.000 g.

Tras la extracción de los alpeorujos mediante NADES 3 (constituido por ácido cítrico/fructosa tal y como se ha definido anteriormente), se obtiene un extracto rico en polifenoles que denominamos “extracto fenólico”, y un residuo que denominamos “alpeorujo extractado con NADES (ALE)”. Atendiendo a principios de economía circular (ver figura 12), el ALE puede transformarse mediante procesos con prácticamente residuo cero.

Se podrían usar varios procesos biológicos, entre los que cabe señalar el compostaje y el vermicompostaje. En este caso se ha trabajado con vermicompostaje, incluyendo un tratamiento previo de acondicionamiento del material que podría considerarse de pre- compostaje. Se ha trabajado con lombrices de la especie Eisenia fétida. Se justifica este proceso de transformación biológica en la dificultad para usar el alpeorujo extractado (ALE) tal y como se obtiene. Sus propiedades químicas (especialmente su acidez) y físicas (elevada viscosidad y escasa aireación) hacen del alpeorujo extractado un producto difícil de transformar mediante mecanismos biológicos. Los procesos de compostaje y vermicompostaje utilizados en esta invención facilitan su transformación. Se ponen en marcha procesos de economía circular que hacen de esta invención un proceso de residuo prácticamente 0 a partir del subproducto de la elaboración del aceite de oliva.

Otro aspecto de la invención se refiere al extracto fenólico procedente de alpeorujo obtenido por el procedimiento descrito anteriormente.

El extracto fenólico de la presente invención es un conjunto de compuestos bioactivos que puede utilizarse como nutracéutico debido a su actividad antiinflamatoria y también pueden utilizarse como aditivos alimentarios debido a su capacidad antioxidante.

Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso del extracto fenólico definido anteriormente como nutracéutico o aditivo alimentario.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del extracto fenólico definido anteriormente como fitosanitario.

En otra realización la invención se refiere al uso del extracto fenólico definido anteriormente como fitosanitario en el tratamiento de enfermedades microbianas de plantas, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades microbianas de plantas causadas por las bacterias de los géneros, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Rhizobium. Otro aspecto de la invención se refiere al alpeorujo extractado con NADES (ALE) obtenido por el procedimiento descrito anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del alpeorujo extractado con NADES (ALE) definido anteriormente, como suplemento orgánico para compostaje y vermicompostaje.

En otra realización la invención se refiere al uso del alpeorujo extractado con NADES (ALE) definido anteriormente, como suplemento orgánico para vermicompostaje caracterizado por que se lleva a cabo un tratamiento del ALE con lombrices de la especie Eisenia fétida.

El vermicompostaje así obtenido, da lugar a un producto útil como fertilizante o enmienda orgánica.

Otro aspecto de la invención se refiere a los disolventes eutécticos naturales (NADES) seleccionados de ácido cítrico y fructosa en relación 1:1 p/p.

En otra realización la invención se refiere a los disolventes naturales (NADES) definidos anteriormente donde el contenido de agua es de entre el 10% y el 30% en peso de agua, preferiblemente 10 % y el 25% en peso de agua, y más preferiblemente de 19% en peso de agua.

A lo largo de la descripción, el término “fertilizante” se refiere a un producto utilizado en agricultura o jardinería que, por su contenido en nutrientes, facilita el crecimiento de las plantas (Real Decreto 506/2013)

La unidad “g” se refiere a la unidad de fuerza centrífuga relativa, (FCR).

El término “enmienda orgánica” se refiere a un producto procedente de materiales carbonados de origen vegetal o animal, utilizado fundamentalmente para mantener o aumentar el contenido en materia orgánica del suelo, mejorar sus propiedades físicas y mejorar también sus propiedades o actividad química o biológica (Real Decreto 506/2013). La presente invención se refiere al alpeorujo extractado con NADES (ALE) como material carbonado de origen vegetal.

El término “alpeorujo extractado” se refiere a el residuo de alpeorujo tras la extracción mediante disolventes eutécticos profundos naturales (NADES) de compuestos bioactivos, principalmente compuestos fenólicos, por tanto, contiene poca cantidad de los mismos.

El término “nutracéutico” (agente bioactivo) se refiere a productos de origen natural que se encuentran en el extracto del alpeorujo, que se pueden administrar como tal en forma concentrada o ser adicionado a un alimento natural y que son beneficiosos para la salud y con capacidad preventiva y/o terapéutica ejemplos incluyen entre otros fitoesteroles, compuestos fenólicos, etc.

El término “aditivo alimentario” se refiere a productos de origen natural que se encuentran en el extracto del alperujo que, aunque no se consumen como alimentos por sí mismos, añadidos a estos durante su fabricación cumplen una importante función tecnológica colaborando en la crucial tarea de obtener alimentos seguros y de calidad.

El término “enfermedad microbiana” se refiere a la respuesta de las células y tejidos de las plantas a microorganismos patógenos que provocan daño en la fisiología o integridad de la planta y pueden ocasionar deterioro de la misma e incluso su muerte. Ejemplos de enfermedades bacterianas de plantas incluyen, entre otras, el “fuego bacteriano” causado por Erwinia amylovora sobre el frutal de pepita en rosáceas como el manzano, níspero, membrillero, entre otros y que provoca la muerte de la planta; “tuberculosis” en oleáceas, entre ellas el olivo produciendo tumores, agallas o verrugas con pérdida de vigor y productividad del cultivo, la infección afecta a las propiedades organolépticas y estabilidad del aceite causada por Pseudomonas savastanoi, necrosis, agallas, chancros, destruye el tejido infectado mermando a la planta frutal como peral, mango, cítricos, otras hortícolas y ornamentales causado por Pseudomonas siryngae ; tumores en el cuello de la planta disminuyendo la productividad y calidad de cultivos como la viña, frutal de pepita y de nuez causados por Rhizobium radiobacter, o marchitez de cultivos hortícolas y frutícolas causados por Xanthomonas campestris.

Así pues, en la presente invención se utilizan por primera vez NADES de base acídica de baja toxicidad para la obtención de sustancias bioactivas, especialmente compuestos fenólicos, de los alpeorujos frescos de oliva y se genera un nuevo subproducto alpeorujo extractado.

Tras la extracción del alpeorujo con NADES acídicos se genera un nuevo subproducto, “alpeorujo extractado”, difícilmente manejable por sus características de viscosidad y escasa aireación. Se ha desarrollado una metodología para el vermicompostaje de este nuevo subproducto. De este modo se recicla el alpeorujo extractado y se facilita el diseño de procesos de residuo cero en los que los materiales y nutrientes que contiene el producto vuelven a las parcelas agrícolas en el formato de fertilizantes y/o enmiendas.

Por tanto, la presente invención supone un punto de inflexión en el aprovechamiento integral del subproducto de la elaboración del aceite de oliva, el alpeorujo, que posibilita el aprovechamiento integral del mismo, para obtener por un lado sus compuestos bioactivos utilizando mezclas eutécticas acídicas extractivas y de baja toxicidad que generan extractos bioactivos, y por otra parte el subproducto de esta extracción, alpeorujo extractado, es transformado para ser reincorporado al suelo. Con esta invención, se contribuye al aprovechamiento integral del alpeorujo y a la gestión sostenible de la producción del aceite de oliva con residuo cero.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Esquema resumen del procedimiento de extracción fenólica.

Fig. 2. Concentración en compuestos fenólicos (mg/kg) extraídos de alpeorujo fresco de la variedad Picual mediante diferentes disolventes eutécticos naturales, mezclas acuosas de metanol y agua. Los números se corresponden con los disolventes que figuran en la tabla 1. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS. (n=2).

Fig. 3. Muestra la suma de los compuestos fenólicos extraídos (mg/kg) de alpeorujo fresco de la variedad Picual mediante diferentes disolventes eutécticos, mezclas acuosas de metanol y agua. Los números se corresponden con los disolventes que figuran en la tabla 1. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS (n=2).

Fig. 4. Muestra la concentración en compuestos fenólicos individuales (mg/kg) extraídos de alpeorujo fresco de las variedades Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lechín, Arbequina y Gordal mediante NADES 3. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS (n=2).

Fig. 5. Muestra la concentración en compuestos fenólicos (mg/kg) reunidos en 6 grupos de compuestos relacionados: agluconas secoiridoides, alcoholes, flavonoides, oleósidos, oleuropeína, verbascósido, expresados en mg/kg de alpeorujo fresco, extraídos de las variedades Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lechín, Arbequina y Gordal mediante NADES 3. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS (n=2).

Fig 6. Muestra la suma de los compuestos fenólicos (mg/kg) extraídos de alpeorujo fresco de las variedades Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lechín, Arbequina y Gordal mediante NADES 3. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de extructuras mediante HPLC-MS (n=2). Fig. 7a-7b. Efecto bactericida de diferentes disolventes sobre microorganismos fitopatógenos expresados como concentración mínima inhibitoria (MIC) en porcentaje, NADES 3 a pH ácido original y a pH ajustado 5,5-6, a), NADES 3 a pH ajustado, DMSO, glicerol y etanol b), sobre Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119, y Xanthomonas campestris CECT 97 (n=3). La línea de puntos indica el valor por debajo del cual no se considera toxicidad.

Fig. 8a-8d. Viabilidad de células microglía BV2 tratadas con distintas concentraciones de NADES 3 con o sin extracto en las Variedades Manzanilla y Branquita a pH 0 y 3, (8a) Manzanilla pH 0, (8b) Branquita pH 0, (8c) Manzanilla pH 3, (8d) Branquita pH 3. En el eje de las X se muestran la concentración de compuestos fenólicos en los extractos (μg/mL) y en el eje Y derecho se muestran los mg de NADES 3 para cada una de las muestras. Los resultados se expresan como porcentaje (%) de células vivas, según la siguiente relación: % = D.O de las células tratadas x 100/D. O de las células controles. P<0,5 . * Significativamente diferente para NADES 3 versus NADES 3 con su extracto. La línea de puntos indica el valor por debajo del cual se produce toxicidad celular.

Fig. 9a-9d. Viabilidad de células microglía BV2 tratadas con distintas concentraciones de compuestos fenólicos aislados de los extractos con NADES 3 mediante columna C18 en variedades Manzanilla y Branquita a pH 0 y 3, (9a) Manzanilla pH 0, (9b) Branquita pH 0, (9c) Manzanilla pH 3, (9d) Branquita pH 3. Los resultados se expresarán como porcentaje (%) de células vivas, según la siguiente relación: % = D.O de las células tratadas x 100/D. O de las células controles. P<0.5. Letra distinta para cada columna denota significativamente diferente para las distintas concentraciones de compuestos fénolicos A (a, b, c. d, e, f) y para las distintas concentraciones de compuestos fenólicos B (g, h, I, j, k, I). La línea de puntos indica el valor por debajo del cual se produce toxicidad celular.

Fig. 10. Evolución de la biomasa total de lombrices (adultas+juveniles) en los materiales de partida. ALP = alpeorujo; ALE = alpeorujo extractado, EST = estiércol; PAJ: paja. El sombreado de cada línea representa el intervalo de confianza al 95%.

Fig. 11. Biomasa total de lombrices (adultas+juveniles) en los tratamientos con alpeorujo extractado durante la semana 5. La línea central de la caja representa la mediana, la línea inferior de la caja el 1 er cuartil, la línea superior el 3ercuartil y los puntos los outliers o valores extremos., ALE=alpeorujo extractado con NADES, EST=estiércol, PAJ=paja. Valores con distinta letra minúscula son significativamente diferentes (P<0,05).

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1 : Preparación de NADES Se mezclan los componentes del NADES, ácido cítrico y fructosa en relación 1 :1 p/p, con un 8-35% en peso de agua. Los componentes correspondientes se mezclan en un matraz de fondo redondo y en agitación continua a temperatura de 50-80 °C hasta la constitución del disolvente como un gel transparente y estable.

Ejemplo 2: Procedimiento de extracción fenólica:

Se pesan alpeorujo y NADES en una relación alpeorujo: NADES comprendido entre 5:1 a 1:5 p/p, agitando durante 10 min a 6 h, a una temperatura de 20-90 °C. A continuación, la mezcla se centrifuga entre 1000-17000 g para separar la fase constituida por extracto fenólico más NADES del alpeorujo parcialmente extractado. Se toma la fase de extracto fenólico y se repite el proceso de extracción sobre la fase de alpeorujo parcialmente extractado. Las 2 fases de extracto resultantes de las 2 extracciones se combinan y constituyen el “extracto fenólico”. La fase de alpeorujo tras las 2 extracciones con NADES se denomina “alpeorujo extractado”.

Mediante este procedimiento, se obtienen extractos líquidos (o geles) ricos en fenoles combinados con los NADES cuya composición permite su uso como nutracéuticos o como aditivos alimentarios dado que dichos extractos líquidos no son tóxicos para dicho uso, y para su uso fitosanitario como antimicrobianos, puesto que los NADES se han descrito para ese uso.

Y, también, por dicho procedimiento se obtiene alpeorujo extractado con NADES (ALE), es decir, con una baja concentración de fenoles, útil para su uso en vermicompostaje al combinarlo con sustratos orgánicos.

El procedimiento de la invención se resume en la figura 1.

Ejemplo 3: Eficiencia extractiva de los NADES acídicos en estudio

Mediante este ensayo se ha determinado la capacidad extractante de dos disolventes eutécticos naturales (NADES) con base acídica y se ha comparado con NADES de diferente formulación y con disolventes convencionales. Para ello, se analizó el contenido fenólico extraído por 17 disolventes diferentes sobre los compuestos fenólicos de alpeorujo fresco de la variedad Picual (fig. 2 ,3). Tabla 1 : Composición y pH de los diferentes disolventes utilizados.

La tabla 1 muestra los diferentes componentes de los disolventes utilizados para la extracción de polifenoles de alpeorujo. Los NADES 3 son las formulaciones acídicas objeto de este estudio. Los disolventes 10 y 11 se corresponden con mezclas acuosas del disolvente metanol y 15 con agua, estos disolventes se utilizaron como controles de extracción ya que son las mezclas convencionales habituales para la extracción de polifenoles. En la figura 2 se muestran la concentración en fenoles de forma individualizada obtenida por cada disolvente por orden decreciente. Los disolventes 1 a 4 mostraron similar patrón de extracción de compuestos fenólicos y las mayores eficacias extractivas (ver figura 3). Los NADES 3 superaron 3900 mg/kg en peso húmedo de polifenoles extraídos en la variedad Picual, cantidades estadísticamente similares a las del resto de disolventes de base acídica utilizados.

Los NADES 3 fueron significativamente más extractivos que las mezclas convencionales acuosas de metanol (10, 11) y que el agua (15).

Ejemplo 4: Eficiencia extractiva de NADES 3 en alpeorujos de distintas variedades de aceituna

En este estudio se utilizó NADES 3 constituido por ácido cítrico/fructosa como extractante de polifenoles en alpeorujos de 17 variedades de olivas. Se cuantificaron 18 compuestos fenólicos (ver figura 4)

Se analizó el contenido fenólico de 16 variedades diferentes de olivas con NADES 3 (ver figura 5 y figura 6), y como resultado, se concluyó que NADES 3 es un eficaz extractante de polifenoles, siendo las variedades Branquita y Manzanilla las más ricas en polifenoles con más de 11000 mg/kg en alpeorujo fresco, mientras que Arbequina y Gordal mostraron los valores más bajos inferiores a 2000 mg/kg de alpeorujo fresco en el caso de la variedad Gordal.

Ejemplo 5: Determinación de la toxicidad de los NADES ácidos en estudio sobre bacterias fitopatógenas y la actividad antimicrobiana de extractos fenólicos obtenidos mediante estos NADES a partir de alpeorujos frescos.

Se analizó la toxicidad in vitro de los NADES 3 de base acídica (ácido cítrico/fructosa) sobre bacterias fitopatógenas de interés agronómico. Se determinó la actividad antimicrobiana de los extractos fenólicos obtenidos con los NADES 3 de alpeorujos frescos de las variedades Picual, Manzanilla y Branquita.

Los análisis de toxicidad y actividad antimicrobiana se realizaron con cepas obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119 y Xanthomonas campestris CECT 97.

Para cada experimento se incubó la cepa en condiciones de aerobiosis en agitación a 29 °C durante 24 h con lo que se obtuvieron caldos con valores aproximados de 10 ⁹ UFC/mL. La determinación de la capacidad antimicrobiana de los extractos se realizó calculando la mínima capacidad inhibitoria (MIC) mediante dilución seriada de los extractos en placas de microtitulación de 96 pocilios, se realizaron las diluciones correspondientes para obtener 10 ⁶ UFC/mL por pocilio.

Para el análisis de toxicidad de los NADES, se compararon los efectos de los NADES 3 a pH ácido inicial, que es el pH original del NADES, y ajustado a pH 5,5 - 6 con NaHCO ₃ . El ajuste de pH se llevó a cabo para evitar un medio excesivamente ácido incompatible para el desarrollo óptimo bacteriano. Se incluyeron además otros disolventes control convencionales como glicerol de baja toxicidad y utilizado para la crioconservación de bacterias y dimetilsulfóxido (DMSO) también considerado de baja toxicidad. Considerando que un disolvente muestra baja toxicidad cuando no inhibe el crecimiento de los microorganismos a una concentración en el medio de cultivo igual o superior al 10%. Se usó también etanol que es un disolvente tóxico frente a bacterias, estos 3 disolventes nos permiten establecer comparaciones con los NADES objeto de este estudio. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7.

En todos los casos, se observó que los NADES 3 ajustados a pH 5,5 - 6 no resultaron tóxicos frente a las cepas del género Erwinia, E. amyiovora y E. toletana incluso sin ajustar el pH. A continuación, se estudió el efecto sobre el crecimiento bacteriano de NADES 3 a pH ajustado a 5,5-6 y de dos disolventes convencionales de baja toxicidad, glicerol y dimetilsulfóxido (DMSO) como controles positivos, más etanol (EtOH) que se usó como control negativo por su toxicidad frente a bacterias (Figura 7b).

NADES 3 a pH ajustado presentó menor o igual toxicidad que los controles positivos para las cepas del género Erwinia, fue menos tóxico que DMSO en todos los casos excepto para X. campestris que mostró la misma toxicidad y que R. radiobacter en el que fue más tóxico.

Se determinó la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos mediante NADES 3 de las tres variedades de aceitunas Manzanilla, Picual y Branquita frente a las 6 cepas fitopatógenas. El pH de los extractos fue ajustado hasta valores óptimos para el crecimiento bacteriano a pH 5,5 - 6 con NaHCCO ₃ Tabla. 2: Efecto bactericida (MIC) mg/L de los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3 procedentes de las variedades de aceituna Manzanilla, Picual y Branquita sobre Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119, y Xanthomonas campestris CECT 97 ^T (n=3). Los extractos se ajustaron a pH 5,5-6. (n=3). * el disolvente tiene igual actividad antimicrobiana que el extracto.

** el disolvente muestra mayor actividad antimicrobiana que el extracto.

No=10 ⁶ UFC/ml, n=3.

En la Tabla 2 se muestra la actividad antimicrobiana frente a las 6 cepas bacterianas de los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3. Los microorganismos del género Erwinia, fueron los más resistentes a los extractos fenólicos de las 3 variedades, ejerciendo los extractos de Picual sobre E. toletana el mayor efecto antimicrobiano en este género. P. savastanoi, fue la cepa más sensible frente a los extractos de las 3 variedades.

Los extractos de las variedades Manzanilla y Picual fueron más inhibidores de los microorganismos que los de Branquita para todas las cepas excepto para E. amylovora, sin embargo, estos extractos contienen menor concentración fenólica total que los de la variedad Branquita, pero son más ricos en derivados secoiridoides y fenoles simples de conocido efecto antimicrobiano (Brenes, M., García, A., de los Santos, B., Medina, E., Romero, C. & de Castro, A., Romero, F. (2010). Olive glutaraldehyde-like compounds against plant pathogenic bacteria and fungí. Food Chemistry, Vol. 125, 1262-1266.).

El disolvente NADES 3 ejerce un efecto inhibidor del crecimiento de las cepas X. campestris y R. radiobacter (Tabla 2). El contenido del extracto fenólico de Manzanilla fue más tóxico que el disolvente para X. campestris, sin embargo, los extractos de Picual y Branquita mostraron la misma toxicidad que el disolvente y en el caso de R. radiobacter el disolvente resultó más tóxico que el extracto para estas dos variedades, en estos casos, no pudo evaluarse el efecto de los polifenoles sobre la viabilidad de los microorganismos por la toxicidad que exhibía NADES 3 incluso ajustado.

Estos resultados se relacionan con la capacidad bactericida de los diferentes fenoles que componen los extractos. Es bien conocido el efecto antimicrobiano de los compuestos fenólicos, especialmente de derivados de oleuropeína como oleaceina, otros secoiridoides, oleósidos, alcoholes como hidroxitirosol y en menor medida fenilpropanoides como verbascósido.

Estos resultados indican que los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3 de las variedades Manzanilla, Picual y Branquita muestran efecto antimicrobiano sobre las cepas estudiadas, que es comparable al que exhiben otros extractos fenólicos de origen natural.

Ejemplo 6: Citotoxicidad de alpeorujos extractados con NADES en células microglía BV2 múrinas.

Se analizó la citotoxicidad in vitro de los NADES 3 de base acídica (ácido cítrico/fructosa) y de los extractos obtenidos con dichos NADES de alpeorujos frescos de las variedades Manzanilla y Branquita en células microglía BV2 múrinas con el fin de determinar su potencial como nutracéutico frente a enfermedades neuronales tales como el Alzheimer debido a sus propiedades antiinflamatorias y antioxidantes.

La figura 8 muestra el porcentaje de células vivas tras la incubación con los NADES 3 (0 compuestos fenólicos) y los extractos de alpeorujo de la variedades Manzanilla y Branquita con los NADES 3 con distintas concentraciones de compuestos fenólicos (250, 200, 150, 100, 50 y 25 μg/mL de medio celular) a pH 0 y 3. Los resultados mostraron que los NADES 3 son citotóxicos para células microglía a partir de una concentración mayor a 50-75 mg de NADES por mililitro de medio, tanto a pHO como a pH3. Sorprendentemente, el efecto citotóxico de los NADES se vio contrarrestado con los extractos de alpeorujo en ambas variedades y ambos pH. La viabilidad celular fue mayor para la variedad Manzanilla que para Branquita.

Igualmente, se aislaron los compuestos fenólicos presentes en los extractos de las variedades de Manzanilla y Branquita mediante columna de fase sólida con relleno C18 y se determinó su efecto citotóxico en las células de microglía murinas. Los compuestos fenólicos de la variedad Manzanilla mostraron un efecto citotóxico a altas concentraciones (250-150 μg/mL) en células microglía tanto a pHO como a pH3. La variedad Branquita mostró citotoxicidad para concentraciones de compuestos fenólicos de 250-100 μg/mL a ambos pH (figura 9).

Los extractos aislados con NADES 3 podrían ser utilizados a pH inicial por lo que no se produciría ninguna modificación de los compuestos fenólicos debidos a cambios de pH. Ambos extractos parecen contener unos compuestos distintos de los fenoles que están favoreciendo la viabilidad celular, contrarrestando el efecto citotóxico que los fenoles tienen de manera aislada a concentraciones altas en estas células. Este dato sugiere que los extractos de los NADES estudiados podrían permitir el uso de altas concentraciones de compuestos fenólicos evitando su factor citotóxico en células de microgía y ejerciendo así funciones antiinflamatorias y antioxidantes típicas de estos compuestos.

Ejemplo 7: Vermicom postaje de alpeorujos extractados con NADES

El alpeorujo extractado con NADES 3 presenta unas características poco deseables para la supervivencia de las lombrices debido fundamentalmente (aunque no en exclusiva) a su bajo pH y escasa porosidad. Por ello es necesario transformar el producto antes de ponerlo en contacto con las lombrices.

Para mejorar sus propiedades físicas se ensayaron diferentes mezclas con materiales porosos (restos triturados de poda leñosa y paja de cereales), concluyendo que la mezcla de paja (PAJ): alpeorujo extractado (ALE) al 50% presenta buenas características.

Para la modificación de las propiedades químicas del material, se hizo un trabajo previo con la adición de CO ₃ Ca en diferentes proporciones. Tras 15 días de maduración, el material adquiría un pH adecuado para la supervivencia de Eisenia, pero se encarecía notablemente el manejo del residuo.

Considerando que el alpeorujo extractado es un residuo de otro proceso, el de obtención de aceite de oliva, su transformación no puede suponer elevados costes ni derivar en la obtención de un producto (el vermicompost) excesivamente caro, por lo que era necesario buscar otros procesos de transformación de las propiedades tanto físicas como químicas del producto. Atendiendo al poder tampón del estiércol se realizaron mezclas en diferentes proporciones con el alpeorujo extractado. Los resultados previos permitieron concluir que el mejor estiércol era el fresco de caballo con alta proporción de paja.

Se diseñaron 14 tratamientos, consistentes en: 4 materiales base (alpeorujo (ALP), alpeorujo extractado (ALE), paja (PAJ) y estiércol de caballo (EST); 2 mezclas de alpeorujo con paja al 50% (ALP: PAJ y ALE: PAJ); 4 mezclas de alpeorujo con estiércol en diferentes proporciones (ALP87,5:EST12,5; ALP75:EST25; ALP50:EST50; ALP25:EST75) y sus equivalentes para el alpeorujo detoxificado (ALE87,5:EST12,5; ALE75:EST25; ALE50:EST50; ALE25:EST75). Los cálculos se hicieron en base a peso seco de los materiales base.

Todos los tratamientos se sometieron a un proceso de precompostaje durante 3 semanas. Una vez concluido este periodo, se colocaron las 14 dietas diseñadas, con 6 repeticiones (5 de ellas con lombrices y una sin ellas), en recipientes de 3 litros de capacidad. Se añadieron las lombrices sobre un cordón de estiércol con una proporción que varió desde el 20 al 50% para facilitar la aceptación de la dieta. Con ello se consiguió mejorar la supervivencia de las lombrices.

Tras el análisis de los resultados obtenidos, se puede concluir que el alpeorujo extractado (ALE):

Tarda más días que ALP en alcanzar un pH adecuado en el proceso de precompostaje

Puede mezclarse en cualquiera de las proporciones con estiércol ensayadas (87,5; 75; 50 y 25%) porque se consigue alcanzar un pH adecuado para la supervivencia de las lombrices. El plazo requerido está correlacionado con la proporción de alpeorujo. Mientras el tratamiento ALE25:EST75 necesitó 15 días, ALE87,5:EST12,5 necesitó 40 días.

Tuvo un comportamiento similar al de ALP en la variable “biomasa total” de lombrices en lo referente al tiempo, con un máximo a los 4 meses de iniciada la experiencia. Los valores finales de biomasa total de lombriz fueron diferentes a nivel estadístico, con 11,9 g de lombriz en ALP frente a 6,5 g en ALE para los materiales puros, sin mezclar (Figura 10)

Ralentizó el crecimiento de las lombrices y afectó en mayor medida a las lombrices adultas que a las jóvenes

Mostró su mejor comportamiento en el tratamiento ALE75:EST25 en las variables “número total” y “biomasa total” de lombrices (Figura 11). En el caso de la “biomasa total” en el momento final de la experiencia, ALE75:EST25 no mostró diferencias significativas con ALP75:EST25 Los resultados obtenidos indican que es factible realizar el reciclaje del alpeorujo extractado (ALE) con NADES 3 mediante técnicas de vermicompostaje.

Ejemplo 8: Ensayo de estabilidad de los extractos fenólicos Se determinó la estabilidad de los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3 de las 16 variedades de alpeorujo tras un periodo de 12 meses de almacenamiento en oscuridad a temperatura ambiente. El ensayo se realizó conservando 5 mi de cada extracto en viales cerrados. Tras el almacenamiento se determinó la presencia o ausencia de precipitación. Como resultado no se detectó precipitación en ninguno de los extractos y se concluyó en que eran estables a las condiciones de ensayo.