MEMORIA DESCRIPTIVA

La presente invención corresponde al procedimiento de envasado de membrana amniótica (MA) humana para obtener un producto listo para ser usado como injerto en cirugías, como soporte para cultivo, con fines diagnósticos o terapéuticos. El procedimiento mantiene la estructura de la membrana amniótica por ejemplo, para ser usada como injerto en cirugías, tal como cirugías oculares.

Descripción de lo conocido en la materia

El trasplante de membrana amniótica humana preservada, puede ser considerado uno de los mayores desarrollos en la cirugía de la superficie del ojo o de la piel. El primer uso oftalmológico de la MA documentado en la literatura internacional fue hace casi 70 años atrás. No obstanteel trasplante de membrana amniótica ha sido realizada en grandes números de pacientes sólo desde 1995, con muy buenos resultados [1].

Varias enfermedades de la superficie ocular siguen siendo hoy un desafío clínico en la cirugía ocular. Dentro de ellas se incluyen los defectos epiteliales persistentes de la córnea, las quemaduras químicas o térmicas agudas con perdida a largo plazo de la integridad del epitelio superficial, y las enfermedades de membranas mucosas que producen cicatrización conjuntival como resultado de la inflamación. Desde la introducción de métodos modernos de preservación, la capa más interna de la placenta, MA, procurada en condiciones de esterilidad luego de una cesárea, ha experimentado un renacimiento como un substituto de membrana basal. Por ejemplo, durante el año 2008, en Alemania se realizó un total de 2308 trasplantes de membrana amniótica (http://www.dog . org/?cat= 12 ). Las posibles aplicaciones de MA van desde injerto en la curación de heridas, soporte para cultivo celular, como parche, hasta ser utilizada como substrato para el crecimiento ex -vivo de epitelio de la superficie ocular, para el crecimiento de microorganismos con fines diagnósticos terapéuticos o industriales. Cada tipo de aplicación lleva a diferentes patrones

i histológicos de integración de la MA en el tejido que la recibe. Indicaciones de uso de MA en la cirugía reconstructiva de la superficie ocular son por ejemplo, los defectos persistentes del epitelio corneal, ulceración corneal de distinta etiología, cobertura de defectos luego de remoción quirúrgica de extensos defectos conjuntivales como, por ejemplo, tumores, quemaduras químicas agudas, simblefaron y reconstrucción de fórnix en enfermedades de la cicatrización conjuntival y deficiencia de células troncales limbares de la córnea con injerto simultaneo de células madre [2].

Características de la Membrana Amniótica

La MA forma parte de los anexos fetales que proporcionan oxígeno y nutrientes al feto en gestación. Está conformada por un epitelio mono estratificado de células cuboides suspendidas por una membrana basal gruesa y tejido conectivo.

Dentro de las características únicas que posee la MA se destacan:

Reducción de la inflamación: La MA tiene la capacidad de inhibir la respuesta inmune, debido a la alta concentración de citoquinas inmunomoduladoras, como el factor de crecimiento transformante beta.

Propiedades antimicrobianas.

Promoción de re-epitelización

Inmunogenicidad reducida: La MA presenta una baja tasa de rechazo, determinada por la baja expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA).

Este conjunto de propiedades han sido clave en el uso benéfico de MA como injerto en patologías de la superficie del ojo o de la piel en las que el fenómeno inflamatorio constituye una vía final común que determina daño estructural y funcional.

Hasta la fecha se ha descrito el uso de la MA en el tratamiento de diversas patologías oftalmológicas. El procesamiento ha incluido el uso de radiación gama para el aseguramiento de la esterilidad. Entre las enfermedades oculares que afectan a los seres humanos alrededor de todo el mundo, se presenta el desafío de la reconstrucción de la superficie ocular, debido a la complejidad morfológica y funcional de la estructura ocular. Un punto clave en la resolución de patologías oculares o de la piel es la necesidad de una matriz biocompatible que se integre y mantenga las características distintivas en el que se conjugan distintos tipos de tejidos (epitelial, conectivo, vascular, glandular) y de células (células madre, células inmunológicas, células maduras).

El uso de MA fresca presenta un riesgo elevado de transmisión de enfermedades infecto-contagiosas, dado por la posibilidad de encontrarse el donante en el "periodo de ventana" de una enfermedad determinada, esto es, aquel margen de tiempo en el que los test diagnósticos resultan negativos pese a presentar la condición de portador y, por ende, potencial transmisor de una enfermedad.

La posibilidad de procesamiento y preservación durante distintos periodos de tiempo de órganos o tejidos trasplantables permite la realización de los test diagnósticos de enfermedades infecto-contagiosas fuera de este periodo de ventana, disminuyendo significativamente la probabilidad de transmisión de infecciones del donante al receptor [3].

Por otro lado, propicia la generación de un proceso de distribución a lugares distantes al lugar de producción, descentralizando el procedimiento de implante, como ocurre en los trasplantes de órgano sólido, como corazón o riñon.

En Chile, hasta la fecha, no existen procedimientos patentados para procesamiento de Membrana Amniótica. Está descrito su uso como MA fresca y procesada con aplicación de radiación Gamma, la que ha sido reportada como factor que altera las propiedades biomecánicas de MA.

La MA procesada y envasada puede ser objeto de distribución en todos los centros de atención médica de Chile y en el extranjero, siempre y cuando se mantenga una serie de condiciones de preservación (cadena de frío).

Existe una problemática actual en la generación de MA de buena calidad y distribuible como producto o insumo médico de manera segura, de modo que el injerto llegue al lugar de la cirugía en óptimas condiciones de uso. La patente norteamericana (número de patente US 6152142) describe el uso de membrana amniótica para cirugía ocular. Sin embargo, dicho documento no presenta el procedimiento de fabricación. Aun cuando dicho documento no describe el procedimiento de envasado, al usar dicho injerto se puede advertir que, para preservar el mismo, se han realizado modificaciones físico químicas, alterando las propiedades intrínsecas de la membrana amniótica. Por ello, el injerto obtenido presenta menor flexibilidad, menor calidad y dificultad en la manipulación quirúrgica.

Por otra parte, se quiere destacar que el procedimiento de obtención del injerto y su envasado presenta una serie de dificultades técnicas:

La membrana amniótica, luego del proceso de lavado, es muy difícil de manejar debido a su consistencia elástico-adherente y a su transparencia.

Para solucionar el problema del difícil manejo, en la presente invención se ha adherido la MA a un soporte para poder hacer manejable la MA, con el fin de extenderla y hacer cortes de dimensiones definidas manteniendo la superficie epitelial identificable.

El soporte utilizado para adherir la MA debe cumplir con una serie de condiciones, primero ser capaz de adherir la MA en su superficie, y ser de un material inerte que no interactúa ni reacciona con la MA. Adicionalmente, el material del soporte debe ser capaz de disminuir la afinidad por la MA al momento de hidratar la MA para proceder a desprender la MA del soporte.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de envasado de membrana amniótica que mantiene su estructura para ser usada como injerto en cirugías, como soporte para cultivo, con fines diagnósticos o terapéuticos, el procedimiento de envasado de membrana amniótica comprende adherir la membrana amniótica a un soporte, dimensionar la membrana amniótica junto con el soporte mediante un dispositivo de corte inerte o guillotina, pegar la membrana amniótica junto con el soporte al interior de un contenedor y esterilizar la membrana amniótica. La membrana amniótica se esteriliza con radiación UV. La membrana amniótica se puede esterilizar previamente con radiación UV y luego se adhiere un soporte esterilizado de etileno vinil acetato (EVA) o poliestireno expandido (plumavit). La etapa de adherir la membrana amniótica a un soporte esterilizado se lleva a cabo por deshidratación de la membrana amniótica en campana de flujo laminar.

La membrana amniótica junto con el soporte se pega al interior de un contenedor rígido, donde el contenedor rígido es de un material, tal como vidrio, poliestireno, plumavit, plástico o acrílico, que es resistente a trauma mecánico y protege la integridad de la membrana.

La membrana amniótica junto con el soporte se pega al contenedor rígido mediante adhesivos sintéticos tal como cianocrilatos u otros pegamentos.

El dimensionamiento de la membrana amniótica junto con el soporte se realiza con una guillotina de doble hoja o cizalla de material rígido, afilado y esterilizable, tal como acero inoxidable.

La presente invención se refiere a una membrana amniótica envasada, que comprende membrana amniótica esterilizada dimensionada, adherida a un soporte, donde la membrana amniótica está pegada junto al soporte a un contenedor rígido esterilizado. La membrana amniótica puede estar dimensionada en parches de 1 cm. La membrana amniótica puede estar dimensionada en parches de 5 cm comprendiendo 1 o más capas. La membrana amniótica puede estar enriquecida con proteínas o factores del plasma. Incluso la membrana amniótica puede estar enriquecida con proteínas o factores del plasma del mismo paciente.

La membrana amniótica envasada sirve como soporte de cultivo o con fines diagnósticos, como dispositivo de liberación de factores de crecimiento.

Mediante el procedimiento de la presente invención se logra preservar las características morfológicas y funcionales de la membrana amniótica humana, de modo que el injerto llegue al lugar de la cirugía en óptimas condiciones de uso.

La membrana amniótica procesada de la forma descrita en la presente invención, está lista para ser usada en cualquier tipo de herida o cirugía de la superficie del cuerpo, tales como úlceras en la córnea o en otras superficies del ojo y de la piel, cirugías de conjuntiva, úlceras de piel de tipo diabética, varicosa, u otras, cirugías reconstructivas, curación de heridas de cualquier zona, lesiones en la boca, cirugías dentales, reparación oro faríngea, cirugías de oído, oreja, tímpanos, reparación de estructuras internas, como órganos sólidos o huecos, articulaciones, ligamentos u otras membranas. Así mismo, la membrana amniótica de la presente invención puede ser posteriormente procesada para la obtención de concentrado de membrana, o pulverización, liofilización, fragmentación o purificación de su totalidad o de cualquiera de sus componentes. La membrana puede también ser usada como un parche en la curación de heridas o como un injerto quirúrgico en animales, tanto en la superficie como en el interior de sus cuerpos. Adicionalmente, la membrana puede ser usada como soporte para cultivo celular, crecimiento de otros microorganismos con fines diagnósticos, terapéuticos o industriales, así como también con fines de experimentación. La membrana procesada de esta forma, además, puede ser usada como un vehículo para administración de fármacos, compuestos activos, anticuerpos, extractos naturales u otros compuestos químicos de diversa naturaleza.

En la presente invención se utiliza un soporte de Etileno Vinil Acetato (EVA) o plumavit (poliestireno expandido). Dicho soporte se utiliza previamente esterilizado y cumple con las condiciones mencionadas anteriormente. El EVA es un polímero termoplástico conformado por unidades repetitivas de etileno y acetato de vinilo. Se caracteriza por ser de fácil maniobrabilidad, fácil de adherir, esterilizable, elástico, no tóxico, fácil de cortar y de baja absorción de agua. Esto permite una doble función, primero que la membrana deshidratada se adhiera a su superficie, y que luego de una rehidratación previo a su uso, el EVA pierda afinidad y adherencia con la MA, permitiendo que la MA pueda ser removida íntegramente sin tracción y sin sufrir daño. Además, dada su elasticidad, el EVA puede absorber cualquier vibración o trauma mecánico que pudiera dañar la membrana.

Una vez que la MA está adherida sobre el soporte, ésta puede ser extendida, deshidratada, irradiada, cortada y manipulada con mayor facilidad. En una modalidad de la presente invención también se puede utilizar un soporte de poliestireno expandido o papel.

Como material de soporte en la presente invención se puede utilizar EVA, plumavit (poliestireno expandido), papel e incluso nitrocelulosa. Preferentemente, se utiliza EVA como material de soporte.

El soporte de EVA utilizado en la presente invención presenta características que son superiores a un soporte de nitrocelulosa descrito previamente en el estado del arte, debido a que el soporte de nitrocelulosa absorbe agua en gran cantidad y es rígido, lo que dificulta el desprendimiento de la membrana amniótica al momento de ser usada y limita la flexibilidad propia de este tejido.

El uso de la membrana amniótica en pacientes requiere un correcto y preciso dimensionamiento del injerto. El corte de la MA puede realizarse con tijeras o matrices metálicas pre-fabricadas. Esto tiene la dificultad de no ser operador dependiente, y de generar cortes irregulares en la MA debido a la tracción generada con el corte con tijeras.

Para solucionar este problema en la presente invención se utiliza un dispositivo de corte inerte o cizalla tal como corte con guillotina con hoja metálica. El dispositivo de corte que debe ser de un material inerte, no reactivo, como el acero inoxidable, previamente esterilizado, para hacer cortes precisos y netos en la membrana amniótica sin generar tracción ni plegamiento de la membrana. El corte de la membrana amniótica, previamente adherida al soporte, usando guillotina estéril con hoja acero inoxidable debe hacerse al interior de campana de flujo laminar, en condiciones de esterilidad. De esta manera se logra dimensionar correctamente la membrana amniótica sin alterar su calidad.

Cuando la membrana amniótica se seca, se rompe con facilidad. Al cortar la membrana amniótica con guillotina de 1 hoja, la membrana amniótica con el corte tiende a romperte o craquelarse. Para evitar el problema del craquelado en la presente invención el corte de realiza con guillotina de doble hoja o cizalla. Aun cuando el corte de la membrana amniótica se realiza en húmedo, el corte queda mejor si se utiliza guillotina de doble hoja o cizalla. La membrana amniótica es un tejido que puede ser dañado durante su almacenamiento y transporte desde el laboratorio a la sala de cirugía, por lo tanto, debe ser protegido por un contenedor o estructura rígida que mantenga su integridad. Adicionalmente, es necesario un recipiente que pueda contener el agua o solución salina para la hidratación necesaria para que el injerto se desprenda de su soporte. Este problema ha sido resuelto inventivamente a través de la adhesión del soporte, junto con la membrana amniótica, al interior de un contenedor rígido estéril cuyo material es resistente a trauma mecánico y protege la integridad de la membrana. De esta forma, el contenedor rígido estéril, tiene una parte inferior y una tapa superior, sirve para la protección del injerto y, a la vez, como recipiente para hidratar la membrana, ya que se puede agregar agua o solución salina, directamente dentro de la parte inferior del contenedor que funciona, a su vez, como receptáculo. El soporte puede ser de EVA o plumavit.

La adhesión de la MA junto con el soporte al interior de un contenedor rígido debe hacerse con un tipo de adhesivo que no sea reactivo y que haya demostrado previamente que no daña tejidos biológicos para mantener la calidad del producto.

En la presente invención se usan pegamentos de la familia del cianocrilatro, ya que constituye un adhesivo aprobado para su uso en medicina. El cianocrilato es una resina acrílica que polimeriza rápidamente en presencia de agua formando cadenas largas y fuertes.

La familia de compuestos de cianoacrilatos se utiliza ampliamente como adhesivos tisulares (de tejidos biológicos vivos) en reemplazo de la sutura quirúrgica para el cierre de heridas, como sellantes y hemostáticos. De esta manera, dada la biocompatibilidad de los adhesivos de la familia de compuestos de cianoacrilatos, se evita el riesgo de daño de la membrana amniótica.

Descripción detallada de la Invención

La presente invención corresponde al procedimiento de envasado de membrana amniótica humana (MA) para obtener un producto listo para ser usado como injerto en cirugía, que sea estéril y que preserve las propiedades biológicas y biomecánicas del tejido.

El procedimiento de envasado de MA se enmarca dentro de un grupo de pasos secuenciales:

1. Obtención de placenta de procedimiento de cesárea electiva. Se informa a madre del procedimiento y se obtiene un consentimiento informado de parte de ella.

2. Separación de MA del resto de anexos fetales (corión).

3. Lavado de MA con soluciones que contienen antibióticos y antifúngicos, retirando los restos hemáticos.

4. PROCEDIMIENTO DE ENVASADO DE MEMBRANA AMNIOTICA:

A. Adhesión por deshidratación de MA a un soporte de: etileno vinil acetato estéril, Plumavit o papel

B. Corte con guillotina de acero inoxidable esterilizada

C. Pegado con adhesivos sintéticos (cianocrilato u otros pegamentos) de la membrana amniótica junto con el soporte al interior de contenedor rígido de: vidrio, poliestireno, plumavit, plástico o acrílico.

D. Irradiación con luz UV por un periodo de 20 a 60 minutos.

5. Protección del contenedor en el interior de un sobre trilaminar (poliestireno-poliamida-aluminio) estéril termosellado para su almacenamiento y transporte.

La membrana amniótica se puede dimensionar en cuadrados de 1 cm por 1 cm para aplicaciones oculares, o se puede dimensionar en cuadrados de 5 cm por 5 cm para aplicaciones para la piel por ejemplos como parches para la piel. La membrana amniótica se dimensiona en 1 o más capas. La membrana amniótica puede además ser enriquecida con factores de crecimiento u otro tipo de moléculas o fármacos.

Ejemplo de aplicación: Estudio piloto realizado in vitro y en pacientes chilenos La MA obtenida con el procedimiento de la invención previamente detallado en la sección anterior ha sido evaluada desde el punto de vista morfológico y funcional.

Como evaluación inicial, la MA fue sometida a un cultivo corriente y para hongos, no observándose la presencia de microorganismos.

Para evaluar las características morfológicas, se procedió a la tinción de la MA con Hematoxilina-Eosina, observándose por microscopía óptica una morfología similar a la descrita en la literatura, esto es, un epitelio de monocapa de células cuboides con una membrana basal y tejido conectivo subyacente.

Posteriormente se exploró la funcionalidad de la MA, tomando en cuenta que el objetivo principal del uso de la MA en oftalmología es la necesidad de una matriz que permita la reconstrucción de la superficie ocular.

En este sentido, se evaluó la MA procesada como matriz para crecimiento de células epiteliales. Se utilizó una línea celular de células del Epitelio Pigmentario de la Retina humano (ARPE-19). Estas células fueron sembradas sobre la MA procesada, observándose la adhesión y crecimiento de ARPE-19.

La membrana amniótica procesada a través de este procedimiento de envasado ha sido usada e injertada en 20 pacientes chilenos con un 95% de éxito quirúrgico definido como mejoría anatómica de la superficie ocular y mejoría de la agudeza visual. Las patologías tratadas comprenden: pterigion, tumores conjuntivales, causticaciones, simblefaron y glaucoma.

Este injerto ha sido usado en humanos, pero tiene otras aplicaciones potenciales en animales.

La membrana amniótica puede también ser usada enriquecida con factores de crecimiento para lo cual la membrana amniótica se sumerge en sangre, suero o plasma rico en proteínas y factores de crecimiento. La membrana amniótica puede ser enriquecida con factores de crecimiento agregado para lo cual la membrana amniótica se sumerge en sangre, suero o plasma rico en proteínas y factores de crecimiento agregados en forma externa. La membrana amniótica así enriquecida se puede aplicar en la piel o cualquier superficie del cuerpo, incluso en tejido ocular. La membrana amniótica puede también ser enriquecida sumergiéndola en suero o plasma rico en plaquetas del mismo paciente. El suero o plasma rico en plaquetas del mismo paciente puede ser además enriquecido con factores de crecimiento para obtener una membrana amniótica enriquecida, o bien como dispositivo de liberación sostenida de fármacos de diversa naturaleza

Referencias

1. Jhanji, V., A L. Young, J.S. Menta, N. Sharma, T. Agarwal, and R.B.

Vajpayee, Management of corneal perforation. Surv Ophthalmol, 2011. 56(6): p. 522-38.

2. Meller, D., M. Pauklin, H. Thomasen, H. Westekemper, and K.P. Steuhl, Amniotic membrane transplantation in the human eye. Dtsch Arztebl Int, 2011. 108(14): p. 243-8.

3. Buzzonetti, L., G. Petrocelli, and P. Valente, Amniotic membrane transplantation in corneal melting after anterior ¡amellar keratoplasty assisted by femtosecond láser in children. Eur J Ophthalmol, 2011 : p. 0.

. Li, M., M. Zhu, Y. Yu, L. Gong, N. Zhao, and M.J. Robitaille, Comparison of conjunctival autograñ transplantation and amniotic membrane transplantation for pterygium: a meta-analysis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2011.