Im medizinischen Bereich werden häufig Nukleinsäure-und Protein-haltige Gewebeproben zur Analyse entnommen und untersucht. Das gilt insbesondere für die Diagnostik von Tumoren und anderen Abnormitäten von Körperzellen.

Bekanntermaßen existieren diagnostische Marker, die mittels vergleichender Untersuchungen des Genotyps oder Phenotyps der Tumorzellen mit Normalgewebezellen Hinweise auf vorliegende Erkrankungen ermöglichen.

In der klinischen Praxis findet vielfach das TNM-System (tumour node metastasis) Anwendung. Das TNM-System ist eine Art Kurzschrift zur Beschreibung der Stadien bösartiger Tumoren im Falle epithelialer Tumore und wurde durch die UICC (Union Internationale contre le Cancer, Internationale Gesellschaft gegen Krebs) festgelegt. ("TNM classification of malignant tumours", UICC, Springer Verlag, Berlin, 1992). Die genaue klinische und pathoanatomische Beschreibung bösartiger Neubildungen beinhaltet mehrere Ziele, nämlich dem klinisch arbeitenden Arzt bei der Entwicklung einer Behandlungsstrategie zu helfen, Hinweise auf die Prognose zu geben, der Auswertung von Behandlungsergebnissen zu dienen, den Informationsaustausch zwischen nationalen und internationalen Behandlungszentren zu vereinfachen und zur Erforschung der Krebserkrankungen beizutragen. Es wird

zwischen der prätherapeutischen klinischen Klassifikation (TNM), die vor der Behandlung erfolgt und der postoperativen feingeweblichen (pathohistologischen) Klassifikation (pTNM) unterschieden.

Vergleichende Studien sind jedoch mit mehreren Nachteilen behaftet, da sie von verschiedenen Proben stammen und somit Variationen und methodologische Probleme auftreten können.

Aus WO 98/43091 AI ist deshalb ein Verfahren bekannt, das erlaubt, epitheliale Zellen als Zellmaterial zu isolieren, das frei von Stroma und anderen Verunreinigungen ist. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch ein immunologisches Trennverfahren, wonach unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (mAk), der spezifisch für epitheliale Zellen ist, die Zellen von den meisten anderen Gewebeteilen abgetrennt werden. Diese gereinigte Probe von epithelialen Zellen erlaubt dann die weitere Analyse von spezifischen Markern in Form von Proteinen und Nukleinsäuren zur Ermittlung von phenotypischen Unterschieden in abnormalen und Normalzellen.

Eine wesentliche Voraussetzung in der Nukleinsäureanalytik ist vor allem eine sofortige Stabilisierung der Nukleinsäuren und Proteine nach Entnahme der Gewebeproben aus ihrer natürlichen Umgebung. Das gilt insbesondere für RNA, die durch Nukleasen nach Entnahme einer biologischen Probe sehr schnell abgebaut werden kann. Nachfolgende spätere RNA- Analysen können deshalb verfälscht werden.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Stabilisierung von RNA beschrieben. Insbesondere haben sich in jüngster Zeit Salzlösungen hoher Konzentrationen bis hin zu gesättigten Lösungen als geeignete Konservierungsmittel zum Schutz von RNA bei Temperaturen oberhalb von-20°C etabliert (vgl. US 6,204, 375). Vorzugsweise wird Ammoniumsulfat verwendet,

welches-möglicherweise zur Bildung eines Protein/RNA- Komplexes führt, wodurch die RNA stabilisiert wird.

Es sind bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Verfahren bekannt, die es ermöglichen, aus ein und derselben Gewebeprobe sowohl die RNA als auch Proteine zu bestimmen.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das von lediglich einer Gewebeprobe eine parallele Isolierung sowohl von Proteinen als auch von RNA in einer solchen Qualität gestattet, dass zuverlässige biochemische und genetische Analysen zur Identifizierung der RNA und der Proteine möglich sind. Das Verfahren soll zuverlässig sowohl für Tumorgewebe als auch für Nicht- Tumorgewebe angewendet werden können, um insbesondere auch vergleichende Untersuchungen anstellen zu können.

Überraschend konnte die Aufgabe durch ein Verfahren gelöst werden, das die immunologische Abtrennung der Epithelzellen aus den Gewebeproben unter gleichzeitiger Stabilisierung von RNA und Proteinen gewährleistet, wodurch die parallele Gewinnung von RNA und Proteinen aus ein-und derselben Gewebeprobe möglich wird.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Gewebestücke (Tumorgewebe und Normalgewebe (Mucosa)), z. B. von einem humanen Patienten expandiertes Gewebe, unmittelbar nach der Resektion in eine Präparationslösung einlagert, die RNAlaterTm mit einer Salzkonzentration von 40 bis 100g/100m1 umfaßt. Vorzugsweise beträgt die RNAlater-Konzentration 60- 100g/100m1, besonders bevorzugt 70-80g/100m1.

Die Gewebeproben werden anschließend mechanisch aufgeschlossen, wobei die Waschlösungen erfindungsgemäß ebenfalls RNAlaterw, vorzugsweise 50% RNAlater in PBS,

umfassen. Danach werden die Epithelzellen unter Einsatz von Antikörpern, die spezifisch an Oberflächenproteine der Epithelzellen binden, immunologisch abgetrennt.

Trotz der hohen Salzkonzentrationen an RNAlater ist diese immunologische Trennung möglich. Bekanntermaßen führen hohe Salzkonzentrationen, wie z. B. hohe Ammoniumsulfat- Konzentrationen, zu einer Präzipitation von in Lösung befindlichen Proteinen in Form eines Niederschlages.

Desweiteren ist bekannt, dass die Einwirkung von hohen externen Salzkonzentrationen auf Zellen zu einer Hypotonie der Zelle führt. Aufgrund dieser Effekte und einer Stabilisierung der RNA in der Zelle, war eine qualitativ und quantitativ befriedigende Extraktion von Proteinen aus der Zelle überraschend.

Zur Kontrolle wird nach der Aufreinigung ggf. eine immunhistochemische Färbung durchgeführt. Sowohl RNA als auch Proteine können parallel mit hoher Genauigkeit und mit an sich üblichen Techniken aus ein und derselben Probe in guter Qualität extrahiert werden.

Die Inkubationszeit in der Präparationslösung, vorzugsweise RNAlater sollte erfindungsgemäß mindestens 15 Minuten betragen, dies gilt sowohl für Tumorgewebe als auch für Nicht-Tumorgewebe. Sind die Gewebestücke größer als 3-4 mm werden sie entweder zerkleinert oder für längere Zeit in RNAlater inkubiert (pro 1 mm zusätzlichem Durchmesser bevorzugt ca. 5 min. länger).

Das Verfahren ist auf alle epithelialen Gewebearten anwendbar, so z. B. Magen, Darm, Lunge, Pankreas, Brust usw..

RNAlater ist eine dem Fachmann bekannte Salzlösung (Firma Ambion, Inc., US). Es handelt sich dabei um hochkonzentrierte

Salzlösungen (zwischen 20g/100ml und der Sättigungskonzentration), welche die RNA vor Nukleasen schützen (vgl. auch US 20010026312 A1). Gemäß der Erfindung werden insbesondere Sulfate eingesetzt, wie z. B.

Ammoniumsulfat, Ammoniumbisulfat, Cäsiumsulfat, Cadmiumsulfat, Cäsium-Eisen (II) sulfat, Chrom (III) sulfat, Cobalt (II) sulfat, Kupfer (II) sulfat, Lithiumsulfat, Magnesium- sulfat, Mangansulfat, Kaliumsulfat, Natriumsulfat oder Zinksulfat. Aber auch andere Salze können verwendet werden, so z. B. Ammoniumchlorid und Ammoniumacetat, Lithiumchlorid und Lithiumacetat, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Kalium- chlorid, Natriumchlorid und Natriumacetat, Zinkchlorid und Zinkacetat. Besonders bevorzugt wird eine RNAlaterTM-Lösung aus Ammoniumsulfat eingesetzt.

Die immunologische Trennung erfolgt bevorzugt mit BerEP4 monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die an exprimiertes BerEP4 Oberflächenprotein binden. Solche Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Insbesondere wird ein mAK eingesetzt, der gegen das Oberflächenprotein BerEP4 gerichtet ist und der bei U. Latza, J. Clin. Pathol.

43,213 (1990) beschrieben ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Magnetobead-Separation, d. h. ausgehend von magnetischen Partikeln definierter Größe, Magnetobeads oder auch Dynabeads genannt (nach der norwegischen Firma Dynal), werden die Epithelzellen magnetisch gesammelt und anschließend gewaschen. Diese Magnetobeads haben einen superparamag- netischen Kern und sind umhüllt von einer Polystyrol- Beschichtung, die mit den spezifischen Antikörpern versehen ist, so dass die Beads an die Oberflächenmarker Zellen binden. Unter superparamagnetisch versteht man die Fähigkeit, in einem starken Magnetfeld magnetische Eigenschaften zu

erwerben, die nach dem Entfernen des Magnetfeldes wieder verschwinden. Dadurch können die Partikel nicht verklumpen.

Alternativ können die Zellen auch durch nichtmagnetische heterogene Methoden unter Verwendung der gleichen Liganden oder anderer isoliert werden, wie z. B. einem monospezifischen Antikörper oder mit Hilfe von Peptiden, welche an einen epithelialen Zellrezeptor binden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch den Schutz der RNA Genexpressionstudien und hat gleichzeitig überraschender Weise keinen Einfluß auf die "Proteinqualität", so daß eine gleichzeitige Proteinanalyse möglich ist.

Die erfindungsgemäße Gewebebestimmung ermöglicht das Aufzeigen von Unterschieden zwischen Normalgewebe und abnormalem Gewebe, wodurch Krankheitsprognosen möglich werden.

Die Proteine werden nach an sich üblichen Techniken, vorzugsweise mittels 2D Gelelektrophorese (2D-PAGE) bestimmt.

(Ott et al., The Pharmacogenomics Journal (2001) 1, 142-151).

Die RNA wird ebenfalls mittels an sich üblicher Techniken isoliert und quantifiziert. Dies geschieht vorzugsweise unter Verwendung des RNAeasy Kits (Qiagen GmbH, DE) nach der Guanidinthiocyanat-Methode oder RNA CLEAN.

Zur Quantifizierung und zur Kontrolle der integrität der RNA wird das Bioanalyzer-System (LabonaChip) von Agilent GmbH, DE herangezogen.

Anschließend soll die Erfindung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel Materialien und Lösungen - 2 Zentrifugen (Universal 16R''Tischzentrifuge der Firma Hettich, Tuttlingen, DE ; und Angle-Rotorzentrifuge SIGMA 2K 15"Sigma Laborzentrifugen GMbH, DE) - Vortexmixer Eisbad 1-6031, (neoLab# der Firma Fisher Scientific, dresden, DE) - Dynal-Sample-Mixer (Dynal AG, NOR) - Konzentrator für magnetische Partikel MPC-1 (Dynal AG, NOR, Katalog-Nr. 120.01) - Konzentrator für magnetische Partikel MPC-E-1 (Dynal AG, NOR, Katalog-Nr. 120.07) Sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, 50 ml und 15 ml (Greiner, DE 227261) - Mikroröhrchen 2 ml (BIOzym diagnostic, DE, Katalog-Nr.

710190) Pipetten 100y1bis zu 1000y1, Trichter, 2 Keramikschalen mit Stößel 2 Tassen (Kapazität ca. 0,8 1) - 1 normales Scalpel - 1 normale Anatomiezange - 1 Stahlsieb (Maschengröße 300 ym, Firma Roth, DE) eine Schere 4 Brillen Handschuhe - PBS-Puffer (eisgekühlt), 1 Tasche PBS (SIGMA Diagnostics, USA) gelöst in 1000ml aqua dest., bei 4°C gelagert, - RNAlaterTM der Firma Ambion #7024) - 100 mM Benzamidin0 (SIGMA, #B6506)

-Leupeptin@ : 100mg gelöst in 40m1 PBS-Puffer, wobei 2m1 dieser Lösung 5mg Leupeptin# beinhaltet - Pefabloc lg : lg gelöst in 20ml PBS-Puffer ; lml dieser Lösung befindet sich in 1 gefrorenen Aliquot Auf Eis präparierte Pufferlösung : 50ml PBS-Puffer + 50m1 RNAlaterTM (180 mg Ammoniumsulfat/100m1) + 0,8mM Benzamidin (800y1 der gelagerten Lösung) + 3mM EDTA (600µl der gelagerten Lösung) + 5mg Leupeptin# (1 gefrorenes Aliquot, gelagert bei-20°C) + 2mM Pefabloc# (1 gefrorenes Aliquot, gelagert bei-20°C) Zellreinigung Von einem Patienten explantiertes Gewebe (Tumor-und Normalgewebe) wird direkt nach der Resektion in ein Eis- gekühltes Glas mit 100% RNAlaterTM überführt und mindestens 15 min inkubiert.

Anschließend werden aus Mucosagewebe die Epithelareale mit einem Skalpel abgetrennt, Tumorgewebe wird in kleine Fragmente (ca. 1 mm) zerschnitten. Um die Präparate weiter zu zerkleinern, wird das Gewebe durch ein Stahlsieb gedrückt, ggf. mehrmals, wobei das Sieb zwischenzeitlich mit Präparations-Puffer und PBS-Puffer gereinigt wird, um die Zellen vollständig abzulösen.

Diese Lösung wird in ein eisgekühltes 50m1 Mikroröhrchen überführt und auf Eis gelagert.

Danach wird die Probe bei 300g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, das Pellet wird abhängig von seiner Menge in der Präparationslösung (ca. 5-15ml) verdünnt und anschließend einer immunologischen Trennung zugeführt, wobei etwa 4m1 Lösung benötigt werden.

Die restliche Lösung wird in Mikroröhrchen pipettiert und für 5 Minuten bei 13000rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und alle Röhrchen werden sorgfältig im Eisbad gelagert.

Immunologische Trennung der Epithelzellen Zur immunologischen Trennung werden vorgetextete Ber-EP4 anti-epitheliale Zellen Dynabeads (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg, DE) eingesetzt. Ca. 801il werden für jede Probe in ein 1, 6m1 Mikroröhrchen pipettiert. Das Röhrchen wird in einem kleinen magnetischen Konzentrator plaziert und nach ca.

1 Minute wird der Überstand sorgfältig abgesaugt und mit aqua dest. gespült (ca. gleiches Volumen).

Vortexen der Antikörperlösung. Es werden 801il der Antikörperlösung in jedes 15m1 Röhrchen pipettiert und auf Eis gelagert. 4-5ml Zellprobe werden in jedes Röhrchen gegeben und anschließend werden die Röhrchen in einem Probenmixer oder einem Schüttler für 30 Minuten in einen Kühlschrank (2-8°C) getan.

Danach wird der Überstand sorgfältig angesaugt, mit eisgekühltem PBS-Puffer (bis zu 8m1 total) 3-4 mal gespült und der Überstand erneut angesaugt.

Letztendlich wird das gereinigte Pellet in 12-14ml Präparationspuffer gelöst und auf 6-10 Mikroröhrchen verteilt. Diese Röhrchen werden bei 13000rpm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig

verworfen und alle Röhrchen werden in das Eisbad gelegt. Mit einem Zellzähler werden die Zellen gezählt.

Die nachfolgende Protein-Analyse und RNA-Isolierung wird wie folgt durchgeführt : 1. Erste Dimension-Isoelektrofokussierunq (IEF) Die Zellpellets werden mit einer Denaturierungslösung, dessen Volumen abhängig von der Pelletgröße ist, behandelt (Verhältnis Pellet zu Puffer ca. 1 : 4). Nach der Zugabe der Denaturierungslösung werden die Proben vorgetextet, unter Verwendung von Sonoplus (Bandelin electronic GmbH & Co. KG, DE) 3 mal für 10 Sekunden beschallt und für 10 Minuten bei 4°C bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert.

Die Proteinkonzentration wird nach dem Bradford Assay in Übereinstimmung mit den Anweisungen von Bio-Rad Laboratories, GmbH, DE bestimmt.

100 jUg der Proteinproben (analytische 2D-PAGE) oder 3 mg der Proteinproben (präparative 2D-PAGE), gelöst in 300 lil der oben genanten Lösung bei Verwendung von IPG Streifen von Bio- Rad (in 350 gl bei Verwendung von Streifen der Amersham Biosciences Europe GmbH, DE), werden in die Fokussierungsschale pipettiert. Nach Entfernen des Schutzfilms werden die IPG-Streifen so positioniert, dass das Gel der Streifen mit der Probe in Kontakt ist. Gel und Probe werden zur Vermeidung einer Verdampfung mit etwa 2 ml niedrig viskosem Öl abgedeckt (Mineralöl von Bio-Rad, Kat. Nr. 163- 2129). Unter Anwendung einer geringen Spannung von 50 V werden die Streifen 8 Stunden rehydratisiert.

Die Streifen werden dann bei 20°C und unter steigender Spannung von 300 V bis 3.500 V innerhalb von 3 Stunden, gefolgt von weiteren 3 Stunden bei 3.500 V, fokussiert (alternativ kann die Spannung linear von 300 V auf 3.500 V innerhalb von 8 Stunden gesteigert werden). Die Intensität sollte 50 yÅ pro Streifen (max. 2 mA insgesamt) betragen, wobei die Spannung auf 10. 000V bis zum Erreichen eines Voltstundenprodukts von 80-100 kVh erhöht wird.

Nach der Durchführung können die Streifen in Glasröhrchen bei - 20°C für einige Wochen eingefroren werden oder unmittelbar zur zweiten Dimension verwendet werden.

Lösungen : Denaturierungs-/ Rehydrierungslösung : Harnstoff (Merck Kat. Nr. 1.08487) 420,42 g Thioharnstoff (Merck Kat. Nr. 1.07979) 152,24 g - Lösen unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur Amberlit IRN-15OL (Pharmacia Kat. Nr. 17-1326-01) 100g - 10 Minuten rühren und dann Amberlit-Partikel abfiltern CHAPS (Sigma Kat. Nr. C-9426) 40g DTT (Sigma Kat. Nr. D-9163) 15,42g Servalyt 4-9T (Serva Kat. Nr. 42910.03) 50 ml Bromphenol, blau (Bio-Rad Kat. Nr. 161-0404) Spuren HPLC Wasser (J. T. Baker Kat. Nr. 4218) bis zu 11

Lagerung dieser Lösung bei-30°C +/-6°C.

2. Zweite Dimension-SDS-PAGE Nach dem ersten Dimensionsversuch werden die Streifen äquilibriert, um die Proteine zu lösen und S-S Bindungen zu reduzieren.

Jeder Streifen wird zweimal innerhalb von 15 Minuten (unter Schütteln) mit 10 ml Äquilibrationslösung äquilibiriert.

Im ersten Äquilibrationsschritt wird Dithiotreitol (DTT) in einer Konzentration von 10 mg/ml der oben genannten Lösung zugegegeben (um die Reduzierung jeglicher rückgebildeter Disulfidbrücken zu sichern) und im weiteren Äquilibrationsschritt wird Iodacetamid (IAA) in einer Konzentration von 48 mg/ml zur gleichen Lösung zugegeben (um die Proteine zu alkylieren und mit reduziertem DTT zu reagieren).

Nach der Äquilibrierung werden die IPG Streifen mit deionisiertem Wasser gespült und dann am Rand eines Stückchen Filterpapiers für einige Minuten platziert, um den überschüssigen Äquilibrierungspuffer abzuleiten.

SDS-Gele Wenn mit Ettan Dalt II (Amersham) gearbeitet wird : Verwendung des Pufferkits von Amersham (Kat. Nr. 17-6002-36) in Übereinstimmung mit den entsprechenden Anweisungen. Der Streifen wird oben auf ein vorgefertigtes Gel 12,5 (Kat. Nr.

17-6002-36) platziert, ebenso ein Filz (an dem rechten Ende des Streifens), auf welchem die Protein-Molekular-

gewichtsstandards (Amersham, Kat. Nr. RPN5800) geladen sind.

Für die Preparation dieser Standards wird die Markerlösung mit dem Ladungspuffer (1 : 4) gemischt und für 4 Minuten bei 95°C denaturiert. Die Versiegelungslösung wird oben auf das Gel pipettiert und der Streifen sorgfältig mit einem Spatel so angedrückt, dass ein vollständiger Kontakt erreicht wird.

Die Migrationsbedingungen sind folgende : 2,5 W/Gel für 30 Minuten und 19 W/Gel (170W Maximum) für 5 Minuten bis der Bromphenol-Blau-Farbstoff aus dem Gel entfernt ist.

Wenn mit MultiCell oder Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) gearbeitet wird : Mit heißer 0,5% Agaroselösung wird das SDS- Gel oben abgedichtet und dann schnell der Streifen oben auf dem Gel platziert. Vorsichtig wird der Streifen mit einem Spatel so auf die Oberfläche des SDS-Gels gedrückt, dass ein vollständiger Kontakt erreicht wird. Anschließend wird der Agarose mindestens 5 Minuten Zeit gegeben, um sich zu verfestigen. Molekulargewichtsmarker können auch verwendet werden. Die Migrationsbedingungen sind die folgenden : 25V und 40mA/Gel für eine Stunde und dann 600 V und 40 mA/Gel für 5 oder 6 Stunden, bis der Bromphenol-Blau-Farbstoff aus dem unteren Ende des Gels gewandert ist. Der Elektrophoresepuffer 1X muss präpariert werden.

Lösungen Aquilibrierungslösung : Harnstoff (Merck Kat. Nr. 1. 08487) 360 g SDS (Pharmacia Kat. No. 17-1313-01) 20 g Glycerol (Sigma Kat. Nr. G-6279) 300 g Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 33,40 ml Bromphenol blau 0, 1% 50 ml Destilliertes Wasser bis zu 11

Tris-HCl 1, 5M pH8, 8 : Tris (Merck Kat. Nr. 1.08382) 181,71 g HC1 (Merck Kat. Nr. 1.09057) bis pH 8,8 Destilliertes Wasser bis zu 11 Bromphenol, blau 0,1% : Bromphenol blau (Bio-Rad Kat. Nr. 161-0404 1 g Destilliertes Wasser bis zu 11 Agarose 0,5% : Agarose (Pharmacia Kat. Nr. US32835) 5 g Destilliertes Wasser bis zu 11 Gelpräparation : Natriumthiosulfat 5% : Natriumthiosulfat (Sigma Kat. Nr. S-6672) 5 g Destilliertes Wasser bis zu 100 ml Ammoniumpersulfat 10% : Ammoniumpersulfat (Bio-Rad Kat. Nr. 161-0700) 1 g Destilliertes Wasser bis zu 10 ml Gellösunq : PDA (Bio-Rad Kat. Nr. 161-0202) 1,95 g Tris-HCl 1,5M pH 8,8 150 ml Acrylamid 40% (Serva Kat. Nr. 10677.01) 182,625 ml Natriumthiosulfat 5% 3 ml Destilliertes Wasser bis zu 600 ml - mindestens für 10 Minuten unter Vakuum entgasen- TEMED (Bio-Rad Kat. Nr. 161-0800) 300 pl Ammoniumpersulfat 10% 3 ml 600 ml erlauben die Herstellung 10 großer Gele. Die Gele können für 6 Monate bei 2-8°C in Tris-HCl 375mM pH 8,8 oder im Elektrophoresepuffer gelagert werden.

Elektrophoresepuffer lOX : Tris (Merck Kat Nr. 1.08382) 30,30 g Glycin (Merck Kat. Nr. 1. 04210) 144 g SDS (Pharmacia Kat. Nr. 17-131-01) 10 g Destilliertes Wasser bis zu 11 Ladungspuffer : Tris-HCl 1,5M pH 8,8 420 gl Glycerol (Sigma Kat. Nr. G-6279) 1 ml SDS 10% 2 ml ß-Mercaptoethanol (Sigma Kat. Nr. M-7154) 500 ul Bromphenol blau (Bio-Rad Kat. Nr. 161-0404) Spuren Destilliertes Wasser bis zu 10 ml Isolierung der gesamten RNA - um eine gute RNA aus den Proben zu erhalten, ist es erforderlich, die gesamte Zeit Handschuhe zu tragen und nur RNase-und Dnase-freie tips and tubes zu verwenden oder diese zu autoclavieren.

- es wurde der Qiagen RNeasy Mini Kit Cat no. 74 106 verwendet l. vor der Verwendung : ß-Mercaptoethanol zum Puffer RLT hinzugeben (1ll1 ß-ME/lml Puffer) ; 96% Ethanol zum Puffer RPE hinzu- geben, wie auf der Flasche angegeben

2. Hinzugeben von 350µl oder 600µl Puffer RLT zum Lysieren der Zellen (in Abhängigkeit vom Pellet, ein größeres Pellet benötigt möglicherweise mehr RLT Puffer) 3. Homogenisieren der Probe mit dem Rotor Stator (30s) oder mit dem Sonicator (10s) 4. Hinzufügen des gleichen Volumens 70% igen Ethanols zu der Probe und Mixen durch Pipettieren (nicht durch Zentrifugieren oder Vortexen) 5.700 gl dieser Mischung auf eine Rneasy-Mini-Spin-Säule geben und schließen, wenn das Volumen 700 pl geladenes Aliquot auf der Säule überschreitet 6. Zentrifugieren für 15s bei 10.000 rpm (manchmal ist es notwendig höher oder länger zu zentrifugieren-es ist abhängig von der Probenviskosität und dem Säulendurchgang) 7. Verwerfen des Durchflusses und Nutzbarmachung der Sammelröhrchen 8. Hinzufügen von 700 jj. l Puffer RW1 (im Kit) 9. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 10.000 rpm 10. Verwerfen des Durchflusses und der Sammelröhrchen und Transfer der Säule in ein neues Sammelröhrchen 11. Hinzufügen von 500 pl Puffer RPE (im Kit) 12. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 10.000 rpm/Verwerfen des Durchflusses 13. Hinzufügen von weiteren 500 pl RPE Puffer

14. Zentrifugieren für 2 Minuten bei hoher Geschwindigkeit, um vom Puffer zu befreien 15. Zum Eluieren Transfer der Säule in ein neues 1,5 ml Sammelröhrchen und Pipettieren von 30 bis 50 J. l Rnase-freiem Wasser (im Kit) direkt auf die Silica-Gel-Membran 16. Zentrifugieren für 1 Minute bei 10.000 rpm 17. Wiederholen von Schritt 15 und 16 in demselben Röhrchen 18. Verschließen des Röhrchens und Platzieren der RNA direkt auf Eis für spätere Verfahrensschritte oder Einfrieren bei- 20° C Lösungen 20x SSC Puffer : 175,3g NaCl 88,2g Natriumcitrat-2H20 Lösen in 800 ml H20 Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 mit HCl Auffüllen auf 1000 ml mit Wasser Lagern bei Raumtemperatur 10% SDS : lOg SDS/100m1 Wasser Lagern bei Raumtemperatur 35% Guanidinhydrochlorid (Sigma G7153) : * 35 g Guanidinhydro chlorid/100 ml Wasser

* Durchleiten durch ein 0, 2pm-Filter, um die Partikel zu entfernen * Lagern bei 4°C Waschlösung 1 : 1,0 ml 10% SDS 25,0 ml 20xSSC 974,0 ml Wasser Waschlösung 2 : 3,0 ml 20xSSC 997 ml Wasser - Vor der Verwendung beide Lösungen durch eine 0, cm sterile Filtrationseinheit durchleiten - Lagern bei Raumtemperatur Silberfärbun Die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur mit Hoefer Processor Plus durchgeführt : Fixierung : Die Gele werden in 50% Methanol/5% Essigsäure in Wasser über Nacht fixiert.

Die Gele werden für 10 Minuten mit 50% Methanol in Wasser gewaschen und zusätzlich für 10 Minuten mit Wasser gespült, um die restliche Säure zu entfernen.

Sensibilisierung : Die Gele werden sensibilisiert mittels einer minütigen Inkubation in 0, 02% Natriumthiosulfat.

Die Gele werden zweimal für eine Minute mit destilliertem Wasser gespült.

Färbung : Die Gele werden in gekühlter 0, 1% iger Silbernitratlösung für 20 Minuten inkubiert.

Die Gele werden zweimal für eine Minute mit destilliertem Wasser gespült.

Entwicklung : Die Gele werden in der Entwicklungslösung entwickelt.

Reaktionsstopp : mit einer Lösung von 5% Essigsäure in Wasser.

Die Silber-gefärbten Gele werden in einer Lösung von 1% iger Essigsäure bei 4° C bis zur Analyse gelagert.