L' invention est relative à une méthode permettant de prédire l'aptitude à la conservation d'un lot de semences immédiatement après leur récolte, ainsi que leur résistance à un stress abiotique lors de la germination.

Le vieillissement des semences, qui intervient au cours de leur stockage, s'accompagne de la détérioration des membranes cellulaires, de la modification de l'activité catalytique de nombreuses enzymes (pour revue cf. WALTERS C, 1998; Seed Sci. Res . , 8: 223-244), et de l'accumulation de mutations de l'ADN. L'ensemble de ces phénomènes entraine une diminution de la vigueur germinative et de la viabilité des semences . La rapidité du vieillissement dépend d'un ensemble complexe de facteurs intrinsèques (notamment facteurs génétiques) et extrinsèques (conditions de conservation).

Les méthodes classiques pour évaluer la qualité germinative d'un lot de semences sont principalement des tests basés sur des essais de germination prenant en compte différents paramètres, tels que le délai moyen de germination du lot, l'étalement de la germination dans le temps, la capacité germinative, et la fréquence de plantules normales. La faculté germinative est par exemple définie par le pourcentage de plantules normales ayant germé, au bout d'un nombre de jours donné après le semis, pondéré par le pourcentage de très jeunes pousses. Ces tests sont définis et calibrés pour chaque espèce ou variété par un organisme de certification des semences selon les normes ISTA (International Seed Testing Association) . Cependant, ces essais sont lourds à mettre en oeuvre. D'autre part ils permettent d'évaluer la qualité germinative actuelle d'un lot de semences, mais pas de prédire son évolution future, et notamment ne permettent en aucun cas d'anticiper une chute de vigueur germinative.

La protéine L-isoaspartyl méthyltransférase (EC 2.1.1.77) est une enzyme de réparation protéique qui intervient dans la conversion de résidus anormaux L- isoaspartate et D-aspartate présents dans les protéines, en résidus L-aspartate.

Les résidus L-isoaspartate et D-aspartate qui constituent le substrat de la L-isoaspartyl méthyltransférase résultent de la déamidation, de l' isomérisation et de la racéraisation spontanées de résidus aspartate et asparagine, qui interviennent au cours du vieillissement des graines, et qui font partie des modifications pouvant affecter la fonctionnalité des protéines dans lesquelles ces résidus sont formés. La protéine L-isoaspartyl méthyltransférase permet de convertir au moins une partie de ces résidus en résidus L- aspartate, permettant aux protéines ainsi réparées de retrouver leur activité.

Chez les plantes, l'activité protéine L-isoaspartyl méthyltransférase est présente dans la quasi-totalité des espèces végétales ; elle est détectable dans de nombreux organes, mais elle apparaît maximale dans les graines sèches (MUDGETT M. B. et al., PlanT. Mol. Biol. , 1996, 30: 723-737) . SHEN-MILLER et al. [Am. J. Bot., 1995, 82(11) : 1367-1380) ont dosé l'activité IAMT dans des graines de Lotus Sacré (Nelumbo nuclfera) âgées d'environ 90 ans. Les graines qui se sont révélées capables de germer possédaient une activité PIMT élevée et le taux de résidus racémisés était équivalent à celui de graines fraîches, soit 2%. RESTER et al., (J. Exp. Bot., 1997, 309: 943-949) ont rapporté, chez des graines de tomates vieillies artificiellement, une diminution de l'activité IAMT corrélée à une baisse de la capacité germinative. MUDGETT M. B. et al., (Plant Physiol., 1997, 115: 1481-1489), ont également observé, sur des graines d'orge vieillies naturellement, que l'activité L-isoaspartyl méthyltransférase était plus faible dans des lots de semences plus âgés et que cette moindre activité s'accompagnait d'une accumulation de résidus L-isoaspartyl et d'un taux de mortalité des semences plus élevés au cours du stockage ainsi que d'une plus faible vigueur germinative.

Lors de précédents travaux (Demande PCT WO/2005/054499) , les Inventeurs ont montré que le niveau d ^Λ expression dans les graines d' Arabidopsis thaliana de l'un des deux gènes identifiés chez cette plante comme codant pour une L-isoaspartyl méthyltransférase (gène PIMT-I) , et la quantité de protéine L-isoaspartyl méthyltransférase produite par ce gène étaient corrélés à la longévité et la vigueur des semences. Ils ont développé une méthode permettant de suivre la conservation des semences au cours de leur stockage et d'évaluer leur degré de vieillissement des, mettant en œuvre le dosage de la protéine L-isoaspartyl méthyltransférase PIMT- 1 à l'aide d'anticorps spécifiques ; cette méthode est basée sur la mise en évidence d'une corrélation entre la disparition de cette protéine dans la graine sèche au fur et à mesure de sa conservation, et la perte de vigueur germinative.

Cependant, on ne disposait jusqu'à présent d'aucun moyen permettant d'évaluer, dès la récolte, la capacité de résistance de semences au vieillissement, et leur aptitude future à la conservation.

Les Inventeurs ont maintenant observé que dans des graines fraichement récoltées, dans lesquelles la quantité de protéine L-isoaspartyl méthyltransférase PIMT-I est maximale, et qui germent à 100%, on détectait toutefois la présence de résidus L-isoaspartate . Ils ont également observé que cette quantité initiale de résidus constituait un marqueur prédictif du potentiel des semences à conserver au cours du temps une bonne capacité germinative, et à résister à un stress abiotique au cours de la germination. Les graines dans lesquelles cette quantité de résidus L-isoaspartate est initialement importante sont plus sensibles au vieillissement que les graines dans lesquelles elle est initialement faible, en outre, leur capacité de germination est également beaucoup plus fortement affectée par un stress abiotique (tel que sécheresse, froid, salinité) .

La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'évaluation de la capacité de résistance au vieillissement et/ou de la capacité de résistance à un stress abiotique lors de la germination, de semences récemment récoltées, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification des résidus L-isoaspartate sur un échantillon desdites semences. On entend par : « semences récemment récoltées », des semences dont la récolte a été effectuée moins de deux mois, avantageusement moins d'un mois, de préférence moins de trois semaines, de manière encore plus préférée moins de deux semaines, et de manière plus particulièrement avantageuse, moins d'une semaine avant le dosage des résidus L- isoaspartate.

Pour une espèce donnée une quantité de résidus L- isoaspartate supérieure à 20 %, de préférence supérieure à 40 %, et de manière tout à fait préférée supérieure à 50 % de celle mesurée dans une population de référence de semences de longévité et de vigueur connues, est indicative d'une faible capacité de résistance au vieillissement ; au contraire, une quantité de résidus L-isoaspartate inférieure à 10 %, de préférence inférieure à 20 %, et de manière tout à fait préférée inférieure à 25 % de celle mesurée dans une population de référence de semences récemment récoltées de la même espèce, est indicative d'une bonne capacité de résistance au vieillissement et d'une bonne vigueur germinative au semi. La population de référence sera généralement constituée par une population de graines obtenues à partir d'un mélange de différents lots produits indépendamment et dont la vigueur germinative a été préalablement évaluée.

Le dosage des résidus L-isoaspartate peut s'effectuer de manière connue en elle-même par l'homme du métier, par exemple en mesurant la quantité de S-adénosyl homocystéine (SAH) formée par réaction de S-adénosyl méthionine avec les résidus L-isoaspartate en présence de protéine L-isoaspartyl méthyltransférase, comme décrit par Aswad, Promega Notes Magazine. 52, 27, 1995.

La présente invention permet de déterminer rapidement, dès la récolte ou à bref délai après celle-ci, si un lot de semences est apte à la conservation, ou si au contraire il doit être utilisé rapidement, ou éliminé. Elle permet également de sélectionner les semences les plus résistantes aux stress abiotiques pouvant intervenir lors de la germination. La présente invention peut s'appliquer aux semences de plantes, monocotylédones, ou dicotylédones, de toutes espèces, dans la mesure où elle est basée sur le dosage des résidus L-isoaspartate qui constituent un métabolite commun à tous les êtres vivants.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant la mise en évidence d'une corrélation inverse entre la quantité initiale de résidus L-isoaspartate dans des graines et l'aptitude de ces graines à la conservation.

EXEMPLE 1 : ACCUMULATION DE RESIDUS L-ISOASPARTATE DANS LES GRAINES AU COURS DE LA MATURATION :

Chez Arabidopsis thaliana , deux gènes codant pour des protéines L-isoaspartyl méthyltransférases ont été identifiés à l'heure actuelle. Le premier d'entre eux a été décrit par MUDGETT. et al (1996, précité) ; le second a été décrit par XU Q. et al. {Plant Physiol., 2004, 136 :1-13) ; ces deux gènes ont été dénommés par cette dernière équipe PIMT-I et PIMT-2, et leurs produits de traduction ont été respectivement dénommés PIMT-I et PIMT-2.

Il est montré dans la Demande PCT WO/2005/054499 que la protéine PIMT-I joue un rôle essentiel dans la capacité de conservation de la graine sèche au cours du stockage. Cette Demande décrit également le mutant atpimtl .1 ό.' Arabidopsis thaliana , possédant une mutation de type insertionnel dans le promoteur du gène PIMTl, qui a pour effet d'accroître le niveau d' expression de ce gène et d' augmenter la quantité de protéines PIMTl dans la graine sèche. Des lignées transgéniques d' Arabidopsis thaliana dans lesquelles l'expression du gène PIMTl est altérée ont été obtenues par transformation à l'aide d'une construction contenant le gène PIMTl sous contrôle transcriptionel du promoteur 35S, en utilisant la méthode décrite par BECHTOLD et PELLETIER, Methods Mol Biol-, 82, 259-66. 1998) . Le niveau d'expression de PIMTl dans ces plantes a été mesuré en utilisant l'anticorps anti-PIMTl décrit dans la Demande PCT WO/2005/054499 Trois lignées (dénommées ci-après 01, 02, et 03) surexprimant la protéine PIMTl dans les feuilles ainsi que dans les graines mures fraîchement récoltées, ont été sélectionnées. Trois autres lignées (dénommées ci-après Ul, U2, et U3) sous-exprimant PIMTl dans les feuilles ainsi que dans les graines mures fraichement récoltées (probablement suite à un mécanisme de co-suppression) , ont également été sélectionnées .

La quantité de résidus L-isoaspartates dans les graines mures fraichement récoltées de ces différentes lignées et de plantes sauvages, a été mesurée en utilisant le protocole suivant : Extraction des protéines

200 mg de tissus sont broyés dans un mortier à l'aide d'un pilon en présence d'azote liquide. La poudre est reprise dans 1 mL de tampon d'extraction [100 mM d'HEPES à pH 7.5, 500 μM d'EDTA, 100 μM de DTT, 10% (p/v) de saccharose, 1% (v/v) de cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma P-9599) ] puis le mélange est centrifugé 20 min à 4°C à 20,000 g. Précipitation des protéines dans 60% de sulfate d'ammonium La phase aqueuse est récupérée et le volume est ajusté à 1 mL avec du tampon d'extraction. Les protéines sont ensuite précipitées 1 h à 4°C par ajout et dissolution de 370 mg de sulfate d'ammonium. Après une centrifugation de 20 min à 4°C à 20,000 g, le culot protéique est isolé du surnageant et remis en suspension dans 1 mL de sulfate d'ammonium à 60% (370 mg de sulfate d'ammonium dissout dans 1 mL d'eau à 4 ⁰ C) . Cette étape de lavage est poursuivie par une centrifugation de 20 min à 4 ⁰ C à 20,000 g. Le culot est brièvement séché et resuspendu dans 200 μL de tampon HEPES 100 mM à pH 7.5. Test ISOQUANT

Le kit ISOQUANT ^® Isoaspartate Détection Kit (Promega MA-1010) est utilisé pour la détection des résidus L- isoaspartates dans les protéines.

12 μL d'échantillon protéique (~50 μg) sont incubés 30 min à 3O ⁰ C avec 6 μL de tampon de réaction 5X [500 μM de phosphate de sodium à pH 6.8, 5 mM d'EGTA, 0.02% d'azide de sodium, 0.8% de Triton X-100], 6 μL de S-Adenosyl Methionine à 100 μM et 6 μL d'enzyme PIMT (tous les réactifs sont fournis dans le kit) . La réaction est stoppée par ajout de 6 μL de solution stop [0.3 M d'acide phosphorique] , puis les protéines sont précipitées par centrifugation de 10 min à 4°C à 20,000 g. Les 36 μL de surnageant sont récupérés pour les analyses en HPLC.

Un double de chaque échantillon, auquel la solution stop est ajoutée avant l'incubation de 30 min, est réalisé pour évaluer le bruit de fond. HPLC et détection UV

L' analyse des réactions de méthylation et les standards de S-Adenosyl Homocystéine sont réalisés avec une colonne Synergi™ Hydro-RP (Phenomenex) . Le solvant A est composé de 50 mM de phosphate de potassium à pH 6.2 et le solvant B est du méthanol pur. Après l'équilibration de la colonne avec 8% de solvant B, 25 μL de l'échantillon sont injectés et un gradient de 8% à 30% de solvant B s'établit avec un débit de 0.25 mL/min. L'absorbance est mesurée à 260 nm à l'aide d'un détecteur UV. La quantification de S-Adenosyl Homocystéine éluée de la colonne est déterminée par la mesure de la surface du pic et comparé à une gamme de quantités de S- Adenosyl Homocystéine connues. 1 pmol de S-Adenosyl Homocystéine détectée équivaut à 1 pmol d' isoaspartate réparée par la PIMT. Dans les graines de plantes sauvages, la quantité de résidus L-isoaspartate mesurée est en moyenne de 260 pmol/mg de protéine. Dans les graines du mutant atpimtl-1, elle est en moyenne de 117 pmol/mg de protéine. Dans les graines des plantes des lignées 01, 02 et 03 elle est respectivement en moyenne de 214, 203 et 226 pmol/mg de protéine, et dans les graines des lignées Ul, U2, et U3, elle est respectivement en moyenne de 599, 865, et 816 pmol/mg protéine .

Ces résultats montrent que la formation de résidus L-isoaspartate n' est pas liée uniquement au vieillissement des graines, mais qu'ils apparaissent précocement dans celles-ci, au cours de leur maturation. EXEMPLE 2 : RESISTANCE DES GRAINES D' AEiABIDOPSIS THALIANA AU VIEILLISSEMENT ACCELERE EN FONCTION DE LA QUANTITE DE RESIDUS L-ISOASPARTATE INITIALEMENT PRESENTS

Des expérimentations de vieillissement accéléré ont été effectuées sur des graines fraîchement récoltées à partir de plantes sauvages, du mutant atpimtl-1, de plantes des lignées 01, 02 et 03 et de plantes des lignées Ul, U2, et U3.

Le vieillissement accéléré est réalisé sur des échantillons de 200 graines en plaçant les graines à 40 ⁰ C (étuve Jouan) et 82% HR (obtenu avec le sel Mg (NO ₃ ) ₂ saturé) (bocal hermétique et graines dans sachets en papier filtre stériles) pendant des périodes variant de 1 à 12 jours. La température et l'humidité sont contrôlées avec Testostor 175 (Testo) . Le test de germination est effectué en boîte de

Pétri (diamètre 55 mm) sur milieu aqueux additionné de MES (acide 2-N-Morpholino Ethane Sulfonique) à 0,58 g/1, ajusté à pH 5,9, et solidifié par 1 ' agar (7g/l) . Le semis est effectué sous hotte à flux laminaire, à raison de 25 graines par boîte, disposées régulièrement sur le milieu pour mieux repérer le début de la germination. Les graines semées sont observées quotidiennement à la loupe. Une graine est considérée comme germée lorsque la sortie de la radicule est visible à la loupe. Le pourcentage de graines germées est évalué 4 jours après le semis.

Les résultats sont illustrés par la Figure 1. Légende de la Figure 1 :

A : comparaison de la germination des graines issues de plantes sauvages (cercles noirs) et de celles issues du mutant atpimtl-1 (cercles gris)

B : comparaison de la germination des graines issues de plantes sauvages (cercles noirs) et de celles issues des lignées 01 (carrés gris) , 02 (cercles gris) , et 03 (triangles gris) C : comparaison de la germination des graines issues de plantes sauvages (cercles noirs) et de celles issues des lignées Ul (cercles gris), U2 (triangles gris), et U3 (carrés gris) . Ces résultats montrent que les semences qui au moment de la récolte, contiennent des quantités importantes de résidus L-isoaspartate sont celles qui résistent le moins au vieillissement ; au contraire, les semences qui contiennent la plus faible quantité de résidus L-isoaspartate conservent plus longtemps leur capacité germinative.

EXESMPLE 3 : RESISTANCE DES GRAINES D' ARABIDOPSIS THALIANA AU

STRESS ABIOTIQUE AU COURS DE LA GERMINATION EN FONCTION DE LA QUANTITE DE RESIDUS L-ISOASPARTATE INITIALEMENT PRESENTS Des graines fraichement récoltées à partir de plantes sauvages (WT) ou du mutant atpimtl-1 ont été imbibées d'eau pendant 24 heures, et la teneur en résidus L- isoaspartate des graines imbibées a été comparée à celle des graines sèches. Les résultats (exprimés en pmol/mg de protéine) sont illustrés dans le Tableau I ci-dessous :

Tableau I

Ces résultats montrent clairement que la teneur en résidus L-isoaspartate décroit de manière importante lorsque les graines ont été imbibées pendant 24 heures, qu'il s'agisse de graines issues 'de la plante sauvage, ou de graines issues du mutant atpimtl-1. Cette teneur demeure toutefois nettement plus élevée dans les graines de la plante sauvage que dans celles du mutant atpimtl-1. Afin de déterminer si la teneur initiale en résidus

L-isoaspartate avait une influence sur la résistance au stress abiotique au cours de la germination, des tests de germination ont été effectués, selon le protocole décrit à l'Exemple 2 ci- dessus, sur des graines fraichement récoltées à partir de plantes sauvages, du mutant atpimtl-1 , de plantes des lignées 01, 02 et 03 et de plantes des lignées Ul, U2, et U3, et en présence de 100 mM NaCl (conditions de stress salin) , ou de 300 mM ou 400 mM de mannitol (conditions de stress osmotique.

Les résultats de ces expérimentations- sont illustrés par la Figure 2.

Légende de la Figure 2 : A : comparaison de la germination des graines issues de plantes sauvages (WT) et de celles issues du mutant atpimtl-1 ;

B : comparaison de la germination des graines issues de plantes sauvages (WT) et de celles issues des lignées 01, 02, et 03

C : comparaison de la germination des graines issues de plantes sauvages (WT) et de celles issues des lignées Ul, U2, et U3. Ces résultats montrent que les graines issues des lignées sur-exprimant PIMTl et contenant la plus faible teneur en résidus L-isoaspartate, à savoir le mutant atpimtl-1 et les lignées 01, 02 et 03 (cf. Exemple 1), résistent mieux au stress salin et au stress osmotique au cours de la germination que les graines issues de plantes sauvage. Au contraire, les graines issues des lignées Ul, U2, et U3 qui sous-expriment PIMTl résistent moins au stress salin et au stress osmotique au cours de la germination que les graines issues des plantes sauvages .