La présente invention est relative à un procédé de préparation de dérivés de cellules sanguines dans lequel on isole des monocytes ou leucocytes à partir du sang et dans lequel on traite ces monocytes ou leucocyte dans un milieu de culture.

On a remarqué qu'en sélectionnant le milieu de culture, il était possible d'obtenir avec d'excellents rendements des macrophages, des facteurs de croissance, des mono ines et des inhibiteurs de protéases.

Le procédé suivant l'invention, qui est un procédé du type décrit dans le premier paragraphe du présent mémoire, est un procédé dans lequel on traite les monocytes ou leucocytes dans un milieu contenant au moins 1g/l d'acide(s) aminé(s), au moins 3 g/1 de glucose et au moins 10 mg/1 de vitamines placés dans une poche perméable aux échanσeR gazeux.

De préférence, le milieu contient plus de 4 g/1 de glucose et plus de 2 g/1 d'acide(s) aminé(s).

Un milieu avantageux suivant l'invention est un milieu contenant, à titre d'acides aminés, de la L-Cystine 2HC1, de la L-Glutamine, de la L-Isoleucine HC1 H-O, de la L-Leucine, de la L-Lysine HC1, de la L-Thréonine, de la L-Tyrosine et de la L-Valine.

Le milieu suivant l'invention contient également avantageusement plus de 5 g/1 de sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux.

Selon une particularité du procédé suivant l'invention, on traite les moncytes ou leucocytes dans un milieu contenant au moins 2%, de préférence de 2 à 5 % de sérum ou plasma décomplémenté. Le traitement suivant l'invention des cellules est avantageusement réalisé à une température comprise entre 30 et 40°C, de préférence d'environ 37°C sous une atmosphère constituée d'un milieu oxygéné contenant de 2 à 10% et, de préférence, 5% de CO ₂ , la concentration en monocytes ou leucocytes dans le milieu à traiter étant, de préférence comprise entre

1.10 ⁶ et 3.10 ⁶ cellules par ml.

Un milieu oxygéné convenant pour le procédé suivant l'invention est, par exemple, de l'air humide contenant 5 % de CO-.

Dans une variante du procédé suivant l'invention, on ajoute au milieu de culture au moins un facteur de croissance, ce facteur étant, de préférence, choisi parmi le monocyte-macrophage colony stimulating factor (MCSF) , le granulocyte-macrophage colony stimulating factor (G CSF) et l'insuline.

Dans une autre variante du procédé suivant l'invention, on ajoute au milieu de culture au moins un composé choisi parmi l'acide oxaloacétique, la glutamine, 1'acide pyruvique ou des acides aminés .

Selon une particularité avantageuse, on introduit dans le milieu de culture au moins un support poreux sur lequel les monocytes ou macrophages se fixent,

de manière a produire des médiateurs extracellulaires , le support poreux étant, de préférence, des billes en verre poreux. Dans le cas où un support poreux est introduit dans le milieu, on retire, de façon avantageuse, le milieu et les billes de la poche perméable aux échanges gazeux, après un séjour de 2 à 24 heures dudit milieu et desdites billes dans la poche perméable et on place ce milieu et ces billes dans un réacteur sous atmosphère contrôlée en CO_ et

°2 ^*

Pour obtenir des macrophages différenciés, on traite les monocytes ou leucocytes dans le milieu pendant au moins 6 jours. Ces macrophages différenciés peuvent être activés en ajoutant au milieu de culture des interférons recombinants humains et un inhibiteur de cyclooxygénase, en particulier l'indométhacine.

De façon avantageuse, on ajoute au milieu de 100 à 500 unités d'interférons par ml de milieu, de manière à obtenir après au moins 6 heures des macrophages antitumoraux. De tels macrophages sont avantageusement utilisés en thérapie cancéreuse.

Pour libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases, on ajoute au milieu de culture contenant les leucocytes ou les macrophages différenciés au moins un composé choisi parmi le murapeptide ou un formyl-peptide, un agent oxydant, la polylysine amino 1-3 polyglucose, un immunomodula- teur extrait de membranes bactériennes, du phorbol myristate acétate, de la phytohémagglutinine, un anticorps, un antirécepteur ou de la thrombine plus vitamine C, de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des

inhibiteurs de protéases . Pour extraire dudit milieu des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000, on soumet le milieu à une filtration moléculaire, tandis que pour extraire les cytokines et les inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, on soumet le milieu respectivement à une chromatographie d'affinité suivie d'une filtration et à une précipitation suivie d'une filtration moléculaire.

Dans une forme de réalisation du procédé, on soumet le milieu, d'une part, à une filtration molécu¬ laire, de manière à extraire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000 et, d'autre part, à une chromatographie d'affinité, à une précipi¬ tation et à une filtration moléculaire, de manière à extraire du milieu des cytokines et des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, On traite les cellules restant fixées aux billes de verre dans le milieu par de la phospholipase C et un détergent non ionique, de manière à solubiliser dans le milieu dépourvu de protéines des récepteurs membra- naires que l'on purifie par chromatographie d'affinité.

La présente invention a également pour objet :

* une composition de macrophages différenciés en cultu¬ re et repris dans un milieu glycérol, une telle compo¬ sition pouvant être congelée de manière à permettre la cryopréservation des macrophages dans ledit milieu glycérol, ce dernier étant de plus biocompatible et bactéricide ;

* des nouveaux facteurs de croissance, ces derniers se trouvant sous une forme glycosylée ;

* des compositions contenant au moins un nouveau facteur de croissance.

Un procédé suivant l'invention sera donné ci-après a titre d'exemple uniquement.

On a collecté 300 ml de sang que l'on a centrifugé selon des techniques connues, de manière à en extraire un concentré leucocytaire ou buff coat.

On a soumis ce concentré à une centrifugation

_ , (Lymphoprep) de manière à le purifier en cellules mononucléées.

On a remis en suspension les cellules mononucléées dans une solution physiologique (solution PBS, solution saline contenant 9 g/1 de tampon phosphate et on a soumis cette suspension à une centrifugation à 1700 tours/minute de manière a obtenir un concentré.

On a lavé deux fois ce concentré au moyen de ladite solution physiologique et on a mis ce concentré en suspension dans un milieu contenant plus de 1 g/1 d'acides aminés et plus de 4 g/1 de glucose. La compo¬ sition du milieu est donnée dans le tableau 1.

TABLEAU 1

TABLEAU 1 (suite)

On a également ajouté au milieu 30 μ molaire de mercaptoéthanol et 10 % de sérum ou plasma humain AB~ décomplémenté.

On a placé la suspension cellulaire dans des tubes coniques en polypropylène et on a soumis cette suspension à 4'C à une lente rotation horizontale pendant 30 à 45 minutes jusqu'à ce qu'on observe une floculation ^" de monocytes ou leucocytes.

Après avoir placé les tubes verticalement, on les a déposés dans un bassin contenant de la glace pendant 15 minutes jusqu'à ce que les monocytes ou leucocytes sédimentent.

On a aspiré le surnageant et on a ajouté aux monocytes ou leucocytes 3 à 10 ml du milieu dont la composition est donnée dans le tableau i. On a déposé cette suspension de monocytes ou leucocytes sur 2 à 5 ml de sérum décomplémenté. On a laissé ensuite les monocytes ou leucocytes agglutinés sédimenter à travers le sérum à ^< *f°C. Cette sédimentation prenait de 5 à 30 minutes.

On a aspiré ensuite le sérum et le milieu. 5

On a mis en suspension les monocytes ou les leucocytes (1 à 10 millions/ml) dans le milieu dont la composition est donnée dans le 0 tableau 1, ce milieu étant additionné de sérum humain décomplémenté (5%), d'antibiotiques à savoir de la pénicilline et de la streptomycine et de billes en verre creux. On a placé ce milieu contenant les monocytes ainsi que les billes en verre creux dans une poche en téfion dont les parois permettent un échange gazeux sous atmosphère à 5% de CO_ et à

35 37°C.

Après 7 jours de culture, les cellules étaient différenciées en macrophages.

Les cellules étant de préférence fixées sur le verre, on parvient par élimination du milieu de culture à obtenir un concentré de macrophages fixés sur les billes .

L'activâtion des macrophages peut alors être obtenue selon les procédés décrits ci-après .

Activâtion en macrophages antitumoraux

On a ajouté au concentré de macrophages 200 unités/ml d'interféron γ recombinant, 100 μg/ml d'indométhacine en tant qu*inhibiteur de la cyclooxy- génase et 10 ug/ml de cimétidine en tant qu'inhibiteur des sites de fixation du type 2 de l'histamine. Après 24 heures , les macrophages antitumoraux étaient activés Ces derniers peuvent être utilisés par exemple par injection pour le traitement du cancer et pour la lutte contre des infections .

Activâtion des macrophages pour la production de facteurs de croissance et dérivés ainsi obtenus

On a ajouté au concentré de macrophages différen¬ ciés 1 mg/ml de murapeptide, 5 μg/ml d*immunomodulateur extrait de membranes bactériennes LPS, lipopolysaccha- ride extrait de bactéries GRAM .

Ceci permet la libération .de facteurs de crois¬ sance dans le milieu extracellulaire.

On aurait également pu ajouter au concentré de macrophages différenciés , de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance., des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases, un ou plusieurs des composés suivants : polylysine (de 20 à 200 μg/ml) poly F extrait de la membrane de Streptococcus mutans (de 10 à 100 μg/ml) phorbol myristate acétate (de 0,01 à 0,5 μg/ml) phytohémagglutinine (de 1 à 10 μg/ml) fibronectine (de 1 à 10 μg/ml)

Zymosan (de 10 à 100 μg/ml) extrait de la membrane de Nocardia Opaca (de 10 à 100 μg/ml)

On peut également ajouter au milieu de 10 à

200 μg/ml de facteurs de croissance, en particulier de

MCSF (monocyte macrophage colony stimulating factor) et de GMCSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) .

Après 24 heures , on a soumis la préparation enrichie de facteurs de croissance à une filtration moléculaire, de manière à obtenir un concentré conte¬ nant essentiellement les facteurs de croissance suivants :

- PDGF (Platelet derived growth factor - facteur de croissance dérivé de plaquettes) ;

- IGF. (Insulin like growth factor - -facteur de croissance type insuline) ;

- MDGF (Macrophage derived growth factor - facteur de croissance dérivé de macrophage) ;

- MGCSF (facteur de croissance de granulocyte - macrophage CSF) -

- NAF (Neutrophil activating factor - facteur de croissance d'activation neutrophile) ;

- FGF (Fibroblast growth factor - facteur de croissance fibroblaste ) .

On a chauffé le concentré à 60°C pendant 10 heures pour provoquer une inactivation virale et on a purifié lesdits facteurs par chromatographie d'affinité sur des supports non poreux sur lesquels sont couplés des anticorps antirécepteurs (anticorps antirécepteurs pour 1'immunoglobbuline, MEDAREX, U.S.A. ).

Selon une procédure simplifiée le concentré leucocytaire ou buffy coat, est directement mis en culture dans 1 à 5 fois son volume du milieu décrit ci-avant en présence de 1 à 5 U/ml de thrombine humaine ou bovine et de vitamine C (10 à 200 μ ).

La préparation est cultivée pendant 8 heures selon les conditions précitées. Le milieu extracellulaire récolté donne une composition riche en facteurs de croissance multiples sous forme de cocktail.

Un schéma de purification et de préparation d'autres dérivés du sang.est donné, à titre d'exemple, ci-après :

On a utilisé un concentré inactivé viralement. Par filtration moléculaire, on a récupéré dudit concentré des facteurs de croissance d'un poids moléculaire inférieur à 20.000 et après une chromatographie d'affinité et une précipitation au sulfate d'ammonium, on a extrait du milieu, par filtration moléculaire, des inhibiteurs de protéases d'un poids moléculaire supérieur à 50.000 (tels, que l antiprotéase, inhibi¬ teur de la plasmine, inhibiteur de l'activateur du plasminogène) et des cytokines.

Les cellules restantes fixées sur les billes ont ensuite été traitées par de la phospholipase C et par du tween (un détergent non ionique), de manière à solu¬ biliser dans le milieu extracellulaire des récepteurs membranaires.

Les facteurs de croissance obtenus par le procédé suivant l'invention se différencient de ceux obtenus par génie génétique par le fait qu'ils se trouvent sous une forme glycosylée. Ils sont dès lors mieux absorbés par le corps humain et sont dès lors plus actifs.

Les macrophages humains différenciés sont avanta¬ geusement mélangés à une solution contenant au moins 10 % de glycérol, de manière à permettre leur congélation dans de l'azote liquide et donc leur cryopréseryation. Une telle composition macrophage- solution glycérol peut être utilisée après décongéla¬ tion rapide pour le traitement de la peau (par voie topique) , pour combattre des infections, pour induire le débridement et la cicatrisation des plaies.

La présente invention a également pour objet une composition sous forme d'hydrogel contenant au moins un, de préférence un mélange de facteurs de croissance glycosylés . Une telle composition peut être utilisée pour favoriser la cicatrisation de plaies , la chirurgie esthétique, la cosmétologie, la néovascularisation, pour combattre le vieillissement cellulaire, la calvitie, etc.

Les facteurs de croissance suivant l ' invention peuvent être utilisés pour 1 Ostéoporose , la réparation osseuse , les maladies autoimmunes , l 'arthrite , les ulcères , l 'ophtalmologie , l 'odontologie , la régénéra¬ tion nerveuse et des cellules souches ainsi que pour leurs absorptions sur des prothèses diverses .