本发明涉及恒河猴 2型糖尿病模型的制备方法。

背景技术

近年来， 全球糖尿病发病率增长迅速。 WHO 最新公布的数据显示， 全 球糖尿病患者人数已经超过 1.77亿， 预计到 2025年将达到 3.7 亿。 我国糖 尿病发病率也正以惊人的速度增加， 中华医学会糖尿病分会新近的流行病学 调査发现， 全国糖尿病发病率已经从 2002 年的 4%迅速提高到了现在的 11%， 此外还有 15%的人血糖异常。 我国目前糖尿病患者数量已经达到了 9100 万， 列居世界第一。 在糖尿病患者中， 90%以上为 2型糖尿病 （Type2 Diabetes Mellitus, T2DM) ，不断探索 T2MD治疗新模式及开发新型药物具有 重要的临床意义和社会价值。

T2DM 的发病过程影响因素繁多， 过程漫长， 个体反应差异明显。 在啮 齿类动物， 通过遗传筛选、 基因改造和饮食诱导已经成功建成了具有胰岛 素 抵抗特征的 T2DM模型， 但越来越多的研究证明， 小动物在脂代谢、炎性反 应等方面和人体存在巨大差异， 不能很好模拟人体代谢性疾病的病理生理特 征。建立大动物，特别是高度拟人的非人灵长 类 T2DM模型对 T2DM研究的 临床转化具有重要意义。

但建立大动物 T2DM模型， 制定标准的诱导方案和评价标准具有相当 的难度。 灵长类动物中筛选自发性糖尿病动物几率很小 ， 数量稀少， 而转基 因技术在灵长类动物还没有成熟的技术， 而且成本高昂。

发明内容

为了解决上述问题， 本发明提供了一种恒河猴 2型糖尿病模型的制备方 法。

本发明恒河猴 2型糖尿病模型的制备方法， 包括如下歩骤：

( 1 )向恒河猴饲喂高脂高胆固醇饲料，每天饲喂 2次，饲喂量为 0.3-0.4kg/ 次 ·只，所述饲料包含如下重量配比的原料：标� ��猴饲料 78份、动物油脂 15 份、 糖 5份、 胆固醇 2份；

(2) 24个月后， 将剂量为 25mg/Kg的链脲菌素施用于猴， 每周施用一 次， 连续 2次。

优选地， 所述动物油脂是猪油； 所述糖是蔗糖。

标准猴饲料， 是指《中华人名共和国国家标准 GB14924.8-2001》规定的 猴配合饲料。 动物油脂， 是指来源于动物的脂肪， 如， 牛油、 羊油、 猪油。

歩骤 （2 ) 中， 所述的施用方式是静脉注射。

本发明建立恒河 2型糖尿病模型的饲料， 它包含如下重量配比的原料： 标准猴饲料 78份、 动物油脂 15份、 糖 5份、 胆固醇 2份。

优选地， 所述动物油脂是猪油； 所述糖是蔗糖。

本发明还提供了前述方法制备得到的恒河猴 2型糖尿病模型及其在筛选 治疗 2型糖尿病模型的药物中的用途。

本发明筛选治疗 2型糖尿病模型的药物的方法， 它包括如下歩骤： a、 按照前述方法， 建立恒河猴 2型糖尿病模型；

b、 将候选药物施用于动物模型；

c、 用动物模型评价潜在的治疗 2型糖尿病的药物。

本发明造模方法可以诱导恒河猴出现高胰岛素 血症、 糖耐量受损和胰岛 素抵抗， 出现 2型糖尿病的临床表现， 给药方法简单， 可重复性强。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的 普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还 可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容再作进一歩 的详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限 于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本 发明的范围。

附图说明

图 1 恒河猴体重腹围检测；

图 2 恒河猴肝脏、 肌肉组织油红 0染色；

图 3 恒河猴肝脏组织 HE染色， A. 对照组肝脏 HE染色； B. 实验组 肝脏 HE染色 （箭头示炎性细胞浸润）； C. 实验组肝脏 HE染色 （箭头示肝 细胞轻度水肿）；

图 4 恒河猴脂代谢指标检测；

图 5 恒河猴糖代谢相关指标；

图 6 高脂饲养 18m后 IVGTT和高胰岛素血 -正常血糖钳夹实验结果； 图 7 胰岛功能损伤相关指标。

具体实施方式

实施例 1 本发明恒河猴 2型糖尿病征模型的制备

1实验材料和仪器

1.1实验材料

6月龄恒河猴 8只（雌雄各半）， 无 B疱疹病毒、 猴逆转录病毒、 猴白血 病病毒和免疫缺陷病毒感染， 购自成都平安动物繁育基地。 实验组： STZ组 （HF+STZ组, 4只） 给予髙脂高胆固醇饮食 24月后通 过静脉注射小剂量链脲菌素诱导 2型糖尿病， 高脂组（HF组， 4只）仅给予 高胆固醇饮食喂养。

对照组： 给予猴标准猴饲料

饲喂方式： 每天饲喂 2次， 饲喂量为 0.3-0.41¾/次*只。

饲料配方：

对照组： 猴标准猴饲料一一商业化的猴颗粒饲料 （购自四川省医学科学 院动物研究所， 配方与《中华人名共和国国家标准 GB14924.8-2001》规定的 猴配合饲料相同）。

实验组： 高脂高胆固醇饲料： 2% (w/w) 食用胆固醇 （安徽天启化工 科技有限公司）， 15% (w/w) 精炼猪油 （市售）， 5% (w/w) 蔗糖 （市售）， 78% (w/w) 猴标准猴饲料。

1.2 主要试剂

链脲菌素 （STZ): 购自成都宇洋高科技发展有限公司

1.3 主要溶液的配制

柠檬酸钠缓冲液配制：

A液 (0.1M枸橼酸溶液）: 称取 2.1g枸橼酸 (C6H807-H20 FW: 210.14 ) 溶于 100ml双蒸水中。 B液 （0.1M枸橼酸钠溶液）： 称取 2.94g枸橼酸钠 (C6H5Na307-2H20 FW: 294.10 ) 溶于 100ml双蒸水中。

工作液： 用时取 28 mlA液加 22 mlB液 （按照 1.32: 1的比例） ，双蒸水 稀释到 100ml,调 PH=4.5。

链脲菌素溶液： 按动物重量比称取 STZ, 用上述 AB混合工作液以 1% 的浓度溶解 STZ, 随用随配， 该液要求 4°C配置、 保存， 尽量在 30分钟内注 射完毕。

1.4 主要仪器

血糖检测仪： 罗康全活力型血糖检测仪， 罗康全活力型血糖试纸 其他检测均在四 ) 11大学华西医院检验科完成。

2 实验方法

2. 1诱导造糖尿病模型

实验组 （包括 STZ组和 HF组） 给予髙脂高胆固醇饮食喂养， 对照组给 予常规猴饲料喂养， 每天饲喂 2次， 饲喂量为 0.3-0.41¾/次*只；

给予髙脂高胆固醇饮食 24月后， STZ组静脉给予小剂量 STZ: 每次 25 mg/Kg, 每周一次， 连续 2次， HF组和对照组不作处理。

2. 2 恒河猴静脉葡萄糖耐受实验

通过静脉葡萄糖耐受实验（The intravenous glucose tolerance test, IVGTT ) 测试动物胰腺功能， 了解血糖波动范围，排除动物患有自发性糖尿 病的可能。 动物禁食 10-12h， 不禁水；

根据动物购买时体重， 按 15mg/Kg肌肉注射氯氨酮 （50 mg/ml) _;

待动物麻醉后， 准确称量体重， 并记录；

将恒河猴上下肢固定于手术台上， 下肢小腿后侧备皮暴露大隐静脉， 碘 氟消毒；

20G留滞针穿剌大隐静脉， 5ml注射器抽血 6ml (分别做生化、 血常规、 血糖和空腹胰岛素， 并标记为 0分钟数值）；

立即用 5ml注射器静脉推注 50%葡萄糖高渗溶液 0.5g/Kg (在 30sec内推 完），并开始记时，再注射生理盐水 5ml, 向留滞针内推肝素（250 U/ml) lml; 分别于记时后的第 1， 3， 5， 10， 30min时采血 1.5ml， 放入红头采血管， 测定胰岛素水平； 同时分别于第 0， 1， 3， 5， 10， 30， 60， 120 min时测定 血糖；

检测结束， 将动物放回饲养笼中， 观察动物状况至苏醒。

2.3 高胰岛素 -正常血糖钳夹试验

恒河猴空腹 16h以上， 常规麻醉， 称重、 采集下肢静脉血 4ml注入分离 胶促凝管。

取平卧位， 逆心方向行一侧手臂静脉穿剌， 置入留置导管， 以生理盐水 维持通道,以备取血测定血糖。 不采血时缓慢静滴生理盐水， 采血前临时关闭 输液器。 通过电热垫加热以维持手的温度在 50〜60°C。

从另一侧肘正中静脉置入静脉插管利用三通管 组成 2条静脉通道以备 输注胰岛素和葡萄糖。 钳夹开始 10 min内以 4 mU / ( kg · min)速率输注人 胰岛素溶液（优泌林， 40U/mL;>， 使血液胰岛素浓度迅速升高， 随后 llOmin 内以 2 mU/ ( kg * mm)速率持续输注， 并同时用输液泵输入 20% 葡萄糖液。

在此期间每 5 min测一次静脉血糖值， 根据血糖值调整 200 mL/L萄糖 液输注率， 使受试者血糖值维持在 4.5mmol/L左右。每 30 min采静脉血测定 血清胰岛素浓度。

当血糖水平变化小于 10% 时， 视为达到稳态， 稳态持续约 60 min后结 束试验。 检测胰岛素、 C肽的血标本离心分离血清后置 - 20°C冰箱保存， 统 根据 Steel's 公式计算钳夹试验过程中外周组织葡萄糖代谢 率 (glucose disposal rate, M), 计算公式： M=钳夹试验最后 40 min每分钟每公斤体重的 葡萄糖输注量 +(G80— G120) X 0.0625， 其中 G80和 G120分别为钳夹试验 80min和 120 min时的血糖浓度 (mg I dl)。 根据 M值计算胰岛素敏感指数 SIClamp = M/ Δ I / fat-free mass (Kg), M是稳态时的葡萄糖输注率， Δ Ι 是稳 态时胰岛素水平与实验前的基础胰岛素水平的 差值 0iIU/ml)。

3实验结果

3.1高脂饮食可以诱导恒河猴糖代谢、 脂代谢紊乱

实验结果如图 1~6和表 1所示：

表 1 IVGTT和钳夹实验中 (18m;>实验组和对照组葡萄糖代谢变量的均值

Variables Control (n =8) HFHCD (n =8)

K _Glu (%) 1.73±0.37 0.70±0.33***

AUC-insulin((JU/ L* min ^_1 ) 387.24±122.39 105.50±66.04***

M value(mg« kg— ¹ · min ^_1 ) 16.35±2.06 13.78±1.21

SIciamp (mg · kg - ¹ · min - ¹ /μΐυ/ L) 0.12±0.05 0.07±0.03

HOMA-IR 0.85±0.55 1.55±1.12

Note: HFHCD vs. Control： *** P <0.001.HFD: 高脂高胆固醇词养组， control: 对照组

根据图 1~6和表 1可以看出， 对照组的糖代谢和脂代谢均正常， 实验组 的糖代谢和脂代谢则出现异常：

1、高脂高胆固醇饮食使内脏发生脂肪异位，� �实验组恒河猴的肝脏和骨 骼肌中出现明显的脂滴沉积。

2、实验组出现明显的饮食依赖的高胆固醇血� �，持续的高胆固醇血症引 发了相应血清脂代谢参数的代偿性改变， 涉及到胆固醇的运输加速 （脂蛋白 HDL， LDL的升高）、 转化排泄增强、 脂肪的分解增加和甘油三酯的升高。

3、对照组正常， 实验组空腹血糖自喂养 6个月后呈逐渐升高趋势， 而血 清胰岛素水平进行性增加， HbAlC明显高于对照组。高糖剌激下葡萄糖曲线 下面积升高， 葡萄糖清除率 （Kglu) 和胰岛素曲线下面积下降， 钳夹实验的 M值和 SIciamp低于对照组， 胰岛素抵抗指数增加。

实验结果说明， 实验组恒河猴的胰岛 β细胞功能受损， 糖耐量受损， 外 周组织对外源性和内源性的胰岛素敏感性下降 。

3.2小剂量 STZ可以诱导胰岛功能损伤， 加速恒河猴 2型糖尿病发生 静脉注射 STZ 1个月后， 恒河猴胰岛功能的各项指标如图 7所示： 与对 照组相比， STZ组恒河猴出现明显的血糖升高， 达到 2型糖尿病诊断标准；

STZ组的空腹胰岛素水平、 IVGTT的血糖曲线下面积和胰岛素抵抗指数 (HOMA-I )都明显高于其他两组， 证明有高胰岛素血症、糖耐量受损和胰 岛素抵抗的发生。

实验结果说明， 本发明方法造成部分 β 细胞细胞损伤， 诱导恒河猴高 胰岛素血症、 糖耐量受损和胰岛素抵抗， 出现 2型糖尿病的临床表现， 成功 建立了恒河猴 2型糖尿病模型。 实施例 2 用本发明模型筛选治疗 2型糖尿病的药物

a、 按照实施例 1方法建立的恒河猴 2型糖尿病模型；

b、 将候选药物施用于动物模型；

c、观察候选药物对 2型糖尿病的各种指标的影响情况，评价潜在� �治疗 2型糖尿病的药物。 综上， 本发明造模方法， 高脂高胆固醇饲料喂养的基础上辅以小剂量 STZ, 既造成部分 β 细胞细胞损伤， 满足 2型糖尿病的必要条件， 又能通 过脂代谢紊乱诱导胰岛素抵抗， 在相对短的周期内形成较稳定和规范的恒河 猴 T2DM模型， 具有重要的实际应用价值。 工业应用性

本发明造模方法，在相对短的周期内形成较稳 定和规范的恒河猴 T2DM 模型， 可用于 2型糖尿病药物的筛选， 适于工业应用。