CAMPO DE INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de preparación de un sistema de liberación controlada de antibióticos y factores bioactivos que se basa en la combinación de dos tipos de andamios: microesferas incluidas en un hidrogel, con potencial para curación de heridas.

La invención tiene aplicación en el campo farmacéutico, específicamente en el campo técnico de los métodos de preparación de apósitos para heridas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En muchas ocasiones, el tiempo aceptable para la curación de heridas suele verse afectado por diversos factores, entre ellos está la generación de infecciones por múltiples agentes patógenos y también enfermedades de base como la diabetes, la cual afecta la producción de ciertos factores bioactivos indispensables para los procesos curativos.

Existen tratamientos tradicionales que son aplicados para combatir infecciones y posteriormente cerrar la herida, pero el problema asociado está en la aplicación de fármacos y factores bioactivos a muy altas concentraciones, los cuales pueden ser perjudiciales para los pacientes. Además, estos tratamientos requieren una aplicación frecuente y su eficacia depende en gran parte de la disciplina que tenga el paciente tras iniciar el tratamiento.

Una opción alternativa a los tratamientos tradicionales son los sistemas de liberación controlada de diversas moléculas bioactivas. Esta liberación se puede lograr a partir de la incorporación o encapsulación de las moléculas bioactivas con una matriz polimérica o andamios mediante diversas técnicas, como las microesferas y los hidrogeles. G.D. Mogosanu and A.M. Grumezescu en “Natural and synthetic polymers for wounds and burns dressing" habla que dependiendo de la aplicación de dichos sistemas de liberación controlada, se pueden usar diversos biomateriales, ya sean sintéticos o naturales, así podemos encontrar al PLA (ácido poliláctico), el PLGA (ácido poli(láctico-co-glicólico)), PCL (policaprolactona) y PVA (alcohol polivinílico), mientras que en el segundo grupo están el colágeno, fibroína, alginato, quitosano y ácido hialurónico.

Asimismo, la liberación de las moléculas bioactivas se rige a partir de fenómenos como la difusión y la degradación de la matriz polimérica o andamios que los contienen, a partir de esto se pueden generar sistemas que permitan predecir la tasa de liberación a través de un periodo de tiempo determinado, y a su vez asegurar la entrega de las biomoléculas a concentraciones que aseguren efectos terapéuticos deseados.

Son varias las técnicas utilizadas para la fabricación de andamios, entre ellas se encuentran los métodos para elaborar microesferas e hidrogeles. A.A. Chaudhari et al en “Future prospects for scaffolding methods and biomaterials in skin tissue engineering; A review’’ nos indica que las microesferas son de fácil fabricación, con características físicas controladas y son aptas para encapsular casi cualquier tipo de moléculas, aunque uno de los problemas asociados a este tipo de tecnologías es la liberación explosiva y su rango de aplicabilidad limitado cuando no se aplican con una matriz que las soporten. Por su parte, los hidrogeles son redes 3D que están conformados por biomateriales de tipo hidrofílico, cuyas características principales son alta retención de agua, transferencia eficiente de masa, similitud con tejidos naturales, naturaleza blanda que minimiza la fricción de los tejidos circundantes y sensibilidad a los cambios fisiológicos; estas propiedades los hacen atractivos para ser usados como soportes en sistemas de liberación. Además, la combinación de andamios es de gran interés actualmente ya que permite generar sistemas duales, los cuales permiten liberar al mismo tiempo más de una molécula bioactiva. De este modo, la presente invención nace como respuesta a la necesidad de encontrar un método de preparación de un sistema de liberación controlada que conste de dos tipos de andamios combinados: microesferas incluidas en un hidrogel, el cual garantice una óptima encapsulación del factor bioactivo en las microesferas y elabore un hidrogel con excelente capacidad de liberación de moléculas bioactivas y antibióticos que impida una liberación explosiva del factor bioactivo, así como valores de degradación y propiedades mecánicas óptimas para el uso como apósito de liberación controlada en heridas cutáneas crónicas.

En busca de una respuesta técnica a dicha necesidad, se consultaron diferentes documentos de patente relacionados, tales como el documento CN107496976A que describe un método para preparar un apósito de hidrogel de quitosano con acción antibacteriana y cicatrizante, en donde se preparan microesferas de quitosano que luego se dispersan uniformemente en una solución acuosa con una relación masa-volumen de 1 a 4 % (p/v), y se reticulan con glutaraldehído en una relación de volumen de 1 % (v/ v). Después de 3 horas, se remoja en agua desionizada, se elimina el exceso de agente reticulante y se obtiene un apósito de hidrogel de quitosano, que se almacenó en condiciones estériles a 4 °C.

Otra solución técnica considerada muy cercana a la necesidad identificada se encuentra en el documento CN1 13244444A, el cual hace referencia a un apósito para heridas basado en microesferas compuestas de hidrogel. El apósito para heridas es preparado a partir de microesferas compuestas e hidrogel de tipo de respuesta inteligente, y la relación de masa de las microesferas compuestas al hidrogel de tipo de respuesta inteligente es (1 :100)-( 1 :200) ; el hidrogel elaborado es una solución acuosa compuesta que contiene pluronic F68 y pluronic F127; y la microesfera compuesta comprende una microesfera de una sola capa de alginato de sodio a nanoescala cargada con un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y una microesfera de una sola capa de alginato de sodio a nanoescala cargada con leptina (LP). El apósito para heridas basado en microesferas compuestas de hidrogel se puede aplicar al tratamiento de heridas combinadas, y se utilizan dos medicamentos con diferentes efectos, de modo que el apósito preparado tiene los efectos duales de regular y controlar el proceso de inmunorreacción y promover la angiogénesis.

Otro documento relacionado es CN1 11228565A, el cual hace referencia a un hidrogel compuesto de ácido hialurónico y gelatina cargado con microesferas de PLGA y Gentamicina sulfato. Además, dicho documento describe el método de preparación tanto de las microesferas como del hidrogel. El método de preparación de las microesferas consiste en: disolver el copolímero de ácido poliláctico-ácido glicólico en diclorometano para preparar una fase oleosa, y el sulfato de Gentamicina se disuelve en agua desionizada para preparar una fase acuosa. La fase de aceite se mezcla con la fase de agua, se agita y se somete a ultrasonidos para obtener una solución W ₁ /O; la solución W ₁ /O se agrega a la solución de alcohol polivinílico, se agita, se mezcla y se sónica, formando una emulsión doble; se agrega la emulsión doble a la solución de alcohol polivinílico para formar una solución W ₁ /O/W ₂ . El método para preparar el hidrogel consiste en: combinar ácido hialurónico de metacrilato de aminoetilo, gelatina metacrilada y microesferas compuestas de PLGA y Gentamicina sulfato. El fotoiniciador se agrega al agua desionizada y se irradia con luz ultravioleta para obtener un hidrogel compuesto de ácido hialurónico-gelatina que contiene microesferas de PLGA con Gentamicina sulfato.

Además, en el estudio realizado por C. Xiao et al en “Synthesis and properties of degradable poly (vinyl alcohol) hydrogel”, se ha preparado un nuevo hidrogel degradable mediante la condensación de alcohol polivinílico (PVA) con ELDA, un di-ácido derivado del ácido láctico.

Asimismo, en el estudio realizado por S. Lin et al en “Evaluation of PVA/dextran/chitosan hydrogel for wound dressing”, el poli (alcohol vinilico) (PVA), el dextrano y el quitosano se integran para producir un apósito ideal para heridas en el que se utiliza glutaraldehído (GA) como agente de enlace cruzado. El resultado demostró que se encontró que el hidrogel de PVA al 6% con quitosano al 0,25% proporciona capacidad antimicrobiana. El hidrogel de PVA/quitosano combinado con dextrano al 4% que utiliza reticulación GA también presenta una alta capacidad de proliferación celular, lo que sugiere que el hidrogel tiene potencial como vendaje para heridas.

Por otro lado, en el estudio realizado por Shamloo et al en “Fabrication and evaluation of Chitosan/Gelatin/PVA hydrogel incorporating Honey for wound healing applications: An In Vitro, In Vivo Study” se desarrollaron hidrogeles reticulados físicamente mediante el método de congelación y descongelación, mientras que se incluyeron diferentes concentraciones de miel en los hidrogeles para acelerar la cicatrización de heridas. El hidrogel estaba compuesto por quitosano, alcohol polivinílico (PVA) y gelatina en una proporción de 2:1 :1 (v/v), respectivamente. Además, se investigó el efecto de las concentraciones de miel sobre las propiedades anti bacterianas y el comportamiento celular.

Adicionalmente, en el estudio realizado por A. Luciani et al en “PCL microspheres based functional scaffolds by bottom-up approach with predefined microstructural properties and release profiles” se describió un procedimiento para elaborar andamios que se obtienen a través del ensamblaje térmico de microesferas de poli(3-caprolactona) (PCL) activadas por proteína preparadas con emulsión doble y microesferas de PCL libres de proteína más grandes obtenidas con emulsión única. En este estudio se muestra que la dimensión de los poros, la interconectividad y las propiedades mecánicas en la compresión del andamio podrían predefinirse mediante una elección adecuada del tamaño de las micropartículas libres de proteínas y las condiciones del proceso. Las micropartículas cargadas con proteínas se incluyeron con éxito dentro del andamio y proporcionaron una entrega sostenida de una proteína modelo (BSA).

Sin embargo, ninguna de las invenciones anteriores logra solucionar totalmente el problema planteado, esto es debido a que, si bien logran desarrollar métodos de preparación de apósitos de microesferas incluidas en un hidrogel, ninguno de los métodos describe la adición de microesferas que garanticen una óptima encapsulación de un factor bioactivo dentro de un hidrogel, en el cual ya se encuentra incorporado un antibiótico, esto asegura una mejoría en capacidad de liberación tanto de las moléculas bioactivas como del antibiótico, impidiendo una liberación explosiva del factor bioactivo. Finalmente, gracias a este método de preparación innovador se puede obtener un apósito de liberación dual que libera tanto factores bioactivos de interés como antibióticos, permitiendo combatir infecciones y a su vez promoviendo los procesos de curación de heridas crónicas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra una micrografía de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM por sus siglas en inglés) de las microesferas, donde se puede observar que dichas microesferas poseen estructuras esféricas de tamaño micrométrico, con una superficie lisa sin defectos.

La figura 2 muestra un gráfico de la distribución de tamaño para Microesferas de policaprolactona (PCL).

La figura 3 muestra una micrografía SEM para hidrogel que contiene una proporción 2:1 :1 (PVA:Quitosano:Alginato), donde se puede observar que dicho hidrogel cuenta con alta porosidad y con tamaños de poro diversos.

La figura 4 muestra un gráfico de la liberación acumulada del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), siendo Mes (verde) solamente microesferas que contienen dicho HGF y HgA-Mcs (celeste) el sistema de liberación compuesto por microesferas incluidas en un hidrogel.

La figura 5 muestra un gráfico de la liberación acumulada para tres concentraciones diferentes del antibiótico Meropenem, en donde a medida que la concentración del antibiótico aumenta, aumenta también el tiempo de la liberación de concentraciones terapéuticas. La figura 6 muestra los halos de inhibición por el método de difusión en agar para comprobar el efecto de los biomatehales usados en el hidrogel elaborado y la concentración del Meropenem (10X y 100X) en la inhibición de las bacterias S. aureus, E. coli, K. pneumoniae P. aeruginosa. En la parte superior se muestran los resultados del hidrogel sin antibiótico (halo izquierdo) y del hidrogel con Meropenem 10X (halo derecho). Asimismo, en la parte inferior se muestran los resultados del hidrogel con Meropenem 100X.

La figura 7 nos muestra un gráfico que indica el porcentaje de proliferación celular del sistema de liberación controlada de antibióticos y factores bioactivos que se basa en dos tipos de andamios combinados: microesferas incluidas en un hidrogel (barras verdes), elaborado por el método novedoso descrito en el presente documento técnico. Como control (barras marrones) se utilizó solamente un hidrogel de proporción 2:1 :1 (PVA:Quitosano:Alginato).

La figura 8 nos muestra una foto del sistema de liberación controlada de antibióticos y factores bioactivos que se basa en dos tipos de andamios combinados: microesferas incluidas en un hidrogel, elaborado por el método novedoso descrito en el presente documento técnico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de preparación de un sistema de liberación controlada que se basa en dos tipos de andamios combinados, los cuales son las microesferas y el hidrogel. Las microesferas se encargan de encapsular los factores bioactivos y posteriormente son incorporadas dentro del hidrogel, en el cual se encontrará incorporado también el antibiótico.

El método de preparación de dicho sistema de liberación controlada consta de dos fases, la primera está relacionada con la síntesis de las microesferas que contienen factores bioactivos, usando la técnica de emulsión W ₁ /O/W ₂ . es decir, un método agua-fase orgánica-agua. En esta metodología se realizaron ajustes en algunos parámetros, esto con la finalidad de garantizar una mayor encapsulación de los factores bioactivos de interés. Para la fase Wi se utilizó un porcentaje de alcohol polivinílico (PVA) en solución al 1 % y 3% p/v. Lo mismo ocurrió en la fase orgánica (O), la cual es una solución de policaprolactona (PCL) en cloroformo al 3% y 5% p/v. Cabe resaltar que los valores superiores para la fase W ₁ y O no aparecen señalados en otras metodologías del estado del arte.

El método de preparación de las microesferas se describe a continuación:

Preparación de microesferas que contienen factores bioactivos

Para la síntesis de microesferas se recurre a un método W1/O/W2, en donde la fase W ₁ (acuosa) está compuesta por PVA al 3% p/v, albúmina de suero bovino (BSA) y el factor bioactivo de interés, la fase O (orgánica) está compuesta por PCL en solución con cloroformo al 5% p/v y la fase W ₂ está compuesta por un surfactante, en este caso es PVA al 5% p/v.

Preparación de las soluciones iniciales:

Preparación de la solución de PVA al 3% y 5% p/v: para ambos casos, el PVA se disuelve en solución tampón de fosfato (PBS) a pH 7,4, estas se dejan selladas en un recipiente en agitación a 700 rpm por 24 horas a 135°C.

Preparación de la solución de PCL al 5% p/v: el PCL se disuelve en cloroformo y se deja en agitación a 700 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente, completamente sellado. El envase que contiene la solución debe ser de color ámbar ya que el cloroformo es un solvente fotosensible.

Proceso de síntesis:

Preparación de la solución del factor bioactivo: se prepara una solución de 10pg/mL del factor bioactivo de interés (por ejemplo, un factor bioactivo de carga catiónica, seleccionado de: HGF, TGF-β1 , TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, VEGF, IGF, NGF y BPM), en donde el solvente es PBS 1 X suplementando con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % p/v. Durante todo el proceso se debe mantener la temperatura de la solución a 4°C, esto con la finalidad de preservar el factor bioactivo usado.

Preparación de la fase Wi: Inicialmente a la solución de PVA (3% p/v) se le agrega BSA al 0,1 % p/v y la solución del factor bioactivo hasta obtener una concentración final del factor de 1 pg por cada mL de W ₁ . Posteriormente, se homogeniza la solución durante 1 minuto a 2000rpm. Las soluciones deben estar a 4°C.

Preparación de la fase W ₁ /O: para obtener la emulsión, por cada 10mL de solución de PCL en cloroformo, se agrega 1 mL de la fase Wi, luego se homogeniza la mezcla durante 1 minuto a 2000 rpm usando un homogenizador. Se debe garantizar que las soluciones estén a 4°C.

Síntesis de microesferas W ₁ /O/W ₂ : La solución Wi/O se agrega a la fase W2 (PVA al 5% p/v) mediante goteo continuo a un flujo de 1 mL por minuto con un inyector. La mezcla se homogeniza a 2000rpm durante 1 min y luego se agita magnéticamente durante 12h a 700rpm, para asegurar que el cloroformo presente en la fase orgánica (O) se evapore completamente.

Recolección, liofilizado y almacenamiento: Las microesferas se recolectan mediante centrifugación a 2500 gravedades por 5 min, se descarta el sobrenadante, y el precipitado se lava con agua desionizada, el proceso se repite 3 veces. Por último, se hace una selección de microesferas por tamaño, para ello se emplean microtamices de tamaño de poro de 40 pm, esto asegura la eliminación de residuos indeseados. El producto se liofilizó a -47°C y a 0,0125 mBar durante 24 horas, el liofilizado obtenido se almacenó a -20°C.

Como podemos observar, en cuanto a los parámetros críticos que tienen alta influencia en el proceso de encapsulación, se utilizó un número de revoluciones para homogeneización de 2000 rpm durante 1 minuto. También se tuvo en cuenta la temperatura de las soluciones a usar en cada etapa del proceso de síntesis, lo cual no está contemplado en el estado del arte. Este factor es muy importante ya que permite garantizar que los factores bioactivos no vayan a sufrir procesos de inactivación debido a cambios súbitos en la temperatura. Por otra parte, se usó un tiempo de agitación a 12 horas con el fin de asegurar la evaporación total del solvente empleado en la solución orgánica (cloroformo).

En cuanto a la metodología relacionada con la preparación del hidrogel, se destaca la combinación del PVA (polímero sintético), quitosano (Cs) y alginato de sodio (ALG) (polímeros naturales). La combinación de dichos materiales no se había registrado previamente en el estado del arte.

El método de preparación del hidrogel se describe a continuación:

Preparación de hidrogel incorporando microesferas y antibióticos

Preparación de las soluciones iniciales:

Solución de PVA al 5% p/v: el PVA se disuelve en solución tampón de fosfato (PBS) a pH 7,4, esta se deja sellada en un recipiente en agitación a 700 rpm por 24 horas a 135°C.

Solución de quitosano al 2% p/v: el quitosano se disuelve en solución de ácido acético (0,1 M), la mezcla se deja sellada en un recipiente en agitación a 700 rpm durante al menos 2 horas a temperatura ambiente.

Solución de alginato al 2% p/v: el alginato se disuelve en solución tampón de fosfato (PBS) a pH 7,4, dejando sellado el recipiente y en agitación a 700 rpm durante al menos 2 horas a temperatura ambiente

Obtención del hidrogel

Los biomateriales PVA, quitosano y alginato se mezclan en proporción: 50% PVA, 25% quitosano y 25% alginato, se realiza una agitación inicial a 700 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se realiza un ajuste del pH de la solución entre 7,2 y 7,4 usando hidróxido de sodio (NaOH) a concentración 1 M, el ajuste de pH se debe hacer usando un pHmetro. La solución se sigue agitando durante 2 horas más antes de añadir las microesferas de PCL-HGF previamente sintetizadas (100 mg de microesferas por mL de hidrogel), a su vez se agrega el antibiótico de elección a una concentración de 1 mg por cada mL de hidrogel, y se deja en agitación constantemente durante 1 hora o más, luego la mezcla se vierte en moldes. El hidrogel obtenido con las microesferas y el antibiótico se somete a 3 ciclos de congelamiento durante 20h a -30°C y descongelamiento por 4h a temperatura ambiente. Después de completados los 3 ciclos, los hidrogeles se reservan en congelamiento entre -20°C y -30°C.

Se puede observar que se registra como novedad del método descrito la incorporación conjunta de microesferas y antibióticos en el mismo hidrogel. Asimismo, vemos que se preparó un hidrogel a base de PVA/quitosano/alginato (PVA/Cs/ALG) para aprovechar el efecto antimicrobiano y biocompatible del quitosano y el alginato, y para complementarlos con las buenas propiedades mecánicas del PVA. Además, en ensayos previos se utilizaron diferentes proporciones de PVA/Cs/ALG (1/1/1 , 2/1/1 , 1/1/2 y 1/2/1 ) para evaluar el efecto sinérgico de su combinación, encontrando que el candidato más apto para ser usado en el sistema de liberación fue el hidrogel de proporción 2/1/1 . El resultado esperado del estudio fue la mejora de las propiedades del híbrido en términos de sus propiedades mecánicas, químicas, microestructurales y biológicas.

Los ensayos que se muestran a continuación buscan demostrar que la elección de los biomateriales para la fabricación del hidrogel y las variaciones en los parámetros en el método de preparación de las microesferas que conllevan a la formación de un sistema de liberación con características óptimas para combatir infecciones y a su vez promoviendo los procesos de curación de heridas crónicas. Eficiencia de encapsulaton y morfología de microesferas

En cuanto a las microesferas, se le realizó un ensayo de porcentaje de encapsulation, usando como molécula modelo la Albúmina de Suero Bovino (BSA), la cual también es usada en este experimento como agente estabilizante para factores bioactivos. Se obtuvo una eficiencia de encapsulation aproximada del 70%, para microesferas de PCL cuya formulación fue 3% PVA (W1 ), 5% PCL (O) y 5% PVA (W2), lo que significó un aumento en la encapsulation en comparación a diversos trabajos con microesferas de PCL cuyo principio de síntesis se basa en un método W1/0/W2.

En la micrografía SEM de la figura 1 , se observa que las microesferas poseen estructuras esféricas de tamaño micrométrico, con una superficie lisa sin defectos. Por otro lado, en la figura 2 podemos observar que el diámetro medio de las microesferas medidas fue de 23.75 ± 4.73 μm.

Estos resultados al ser contrastados con lo divulgado en el estado del arte, por ejemplo, el ensayo descrito por A. Luciani et al, muestran que las variaciones realizadas en el método descrito no representan cambios considerables en el tamaño ni la morfología de las microesferas, pero sí representa un aumento sustancial en la encapsulation, lo cual repercute en un mejor aprovechamiento de las moléculas bioactivas (por ejemplo, HGF).

Morfología hidrogeles

Otro componente clave en el método de preparación del sistema de liberación controlada descrito es el método de preparación del hidrogel que contiene las microesferas de PCL con el factor bioactivo y el antibiótico de interés, además de ser el soporte que estará en contacto directo con la zona de la herida. Dicho hidrogel será el encargado de liberar las moléculas al medio donde se requiera y es por ello que radica la importancia de desarrollar un método que permita una óptima caracterización morfológica. El hidrogel obtenido por medio del método descrito es el que contiene preferentemente una proporción 2:1 :1 (PVA:Cs:ALG). En la figura 3 se muestra el SEM obtenido para dicho andamio.

A partir de las micrografías SEM del hidrogel, se encontró que su tamaño de poro fue de 15.05 ± 12.16 μm. Además, su porosidad relativa es del 73.57%; lo cual lo hace un hidrogel con alta porosidad y con tamaños de poro diversos, convirtiéndolo en un andamio con excelente capacidad de liberación de moléculas bioactivas y de antibióticos.

Degradación y propiedades mecánicas del sistema de liberación controlada obtenido por el método descrito

Otras propiedades a tener en cuenta en la fabricación de sistemas de liberación controlada que comprenden el uso de hidrogeles, es la degradación y las propiedades mecánicas. En cuanto a la degradación del sistema elaborado, se obtuvieron valores de 63.73 ± 1.96% tras dos meses de estudio. El uso de biomateriales naturales como el quitosano y el alginato, los cuales no se entrecruzan en el hidrogel y la incorporación de microesferas deriva en que el sistema de liberación se degrade más rápido en comparación con hidrogeles que contienen solamente PVA. Estudios como el de C. Xiao, et al., muestra que hidrogeles compuestos solamente por PVA presentan una degradación baja tras 25 días de ensayos (12.5%).

En cuanto a las propiedades mecánicas, se obtuvo un valor del módulo de Young de 28.14 ± 4.40 KPa, para el sistema de liberación controlada obtenido por el método descrito. Este valor resultó ser superior en comparación a investigaciones como la de S. Lin et al., 2019; y Shamloo et al., 2021 ; en donde obtuvieron módulos de 2.5 Pa y 6.8 ± 0.82 KPa, respectivamente; para hidrogeles en cuya composición se incluía PVA. En las patentes encontradas en el estado de la técnica no se encuentran resultados relevantes que permitan realizar una comparación con respecto a los resultados obtenidos para el sistema de liberación controlada elaborado por el método descrito en los ítems de degradación y propiedades mecánicas.

Liberación del factor de crecimiento de heoatocitos (HGF):

Uno de los problemas más comunes al usar microesferas es su liberación de tipo explosiva, esto impide que se aproveche de forma óptima la molécula con acción terapéutica durante las primeras horas de liberación. Para solventar dicho inconveniente, se ha optado por incorporar las microesferas en un hidrogel de PVA/Quitosano/Alginato (HgA). En la figura 4, se observa el efecto de incorporación de las microesferas en el hidrogel; siendo Mes solamente microesferas y HgA-Mcs el sistema de liberación compuesto por las microesferas incluidas en el hidrogel.

Al cabo de 15 días, se observó el porcentaje promedio liberado de HGF en el medio fue de 74,88 ± 3,86% para las microesferas (Mes), mientras que para el sistema hidrogel-microesferas (HgA-Mcs) se reportó un valor promedio de 56,28 ± 0,56%.

El sistema de liberación HgA-Mcs después de las primeras 24 horas libera HGF en un porcentaje aproximado del 3 al 4% por día. Esto indica que por cada 100 mg de microesferas (aproximadamente 700 ng encapsulados de HGF) incorporadas en 1 mL de hidrogel, diariamente se libera entre 21 a 28 ng del HGF, lo cual es una cantidad óptima para estimular la proliferación y migración celular in vitro.

No existe un reporte en la literatura sobre perfiles de liberación de HGF el cual esté encapsulado en microesferas y embebido en hidrogeles, tampoco se encuentra en la revisión de patentes algún perfil de liberación que involucre dicho factor. La patente CN1 13244444A, señalada en el estado de la técnica, hace referencia a la encapsulación del VEGF (Factor de Crecimiento Vascular Endotelial), usando otros biomateriales (Alginato para microesferas y Pluronic F127 + F68 para hidrogeles) para su encapsulación, debido a la diferencia en la naturaleza de los biomateñales, factores y técnicas usadas para la generación del apósito, no puede ser considerado como válido para hacer una comparación con lo propuesto en este documento.

Liberación de antibiótico

Al sistema de liberación controlada que comprende microesferas de factores bioactivos incluidas en un hidrogel, se le incorporan antibióticos (por ejemplo, un Carbapenem seleccionado de: Meropenem, Doripenem, Ertapenem, Imipenem, entre otros), con la finalidad de crear un efecto sinérgico al momento de tratar heridas cutáneas crónicas. Así pues, el método descrito elabora un sistema de liberación dual con el potencial para combatir las infecciones de diversos agentes patógenos y a su vez de promover la proliferación celular por medio de la acción de factores bioactivos.

Para este ensayo específico se decidió utilizar el Meropenem, que es un antibiótico que pertenece a la familia de los Carbapenems. Previo a realizar el perfil de liberación para el Meropenem, se realizó un ensayo de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), para cuatro cepas bacterianas: S. aureus, E. coli, K. pneumoniae y P. aeruginosa. Tras el ensayo se determinó que, para garantizar una inhibición de las 4 cepas, durante al menos un día, la concentración mínima inhibitoria (CMI) incorporada en los hidrogeles debería ser de 10 μg/mL.

La concentración y el tipo de antibiótico que se incorpora al sistema de liberación controlada elaborado por el método descrito se puede ajustar acorde al tipo de bacterias y tiempo estipulado de tratamiento. En la figura 5, por ejemplo, se observa la liberación acumulada para tres concentraciones diferentes del antibiótico Meropenem (X=10μg/mL). A medida que la concentración del antibiótico aumenta, aumenta también el tiempo en donde la liberación de concentraciones terapéuticas durante un periodo de tiempo más prolongado. En el caso del hidrogel 1X, liberó la totalidad de su contenido a las 24 horas. En el caso de los hidrogeles con antibiótico a 10X y 100X, después de 24 horas, la liberación que se registró fue de 55,20 ± 2,43 y 276.491 ± 26.82 μg/mL, respectivamente. Después del primer día y hasta el día séptimo, los hidrogeles con antibiótico 10X y 100X registraron una liberación sostenida de 4,66 y 55,93 pg/mL, en promedio por día, dichas concentraciones están dentro del rango de concentración considerado como susceptible para inhibición bacteriana, según el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (Manual M-100, tabla 5a).

Antibioqramas:

Una de las ventajas de los biomateriales usados para la preparación de los hidrogeles (quitosano y alginato), es que estos tienen un carácter antibacteriano inherente, esto combinado con algún antibiótico, genera un efecto sinérgico que potencia la inhibición de agentes patógenos.

Para comprobar el efecto de los biomateriales usados y la concentración del Meropenem (10X y 100X) en la inhibición de las bacterias: S. aureus, E. coii, K. pneumoniae y P. aeruginosa, se midió el halo de inhibición por el método de difusión en agar (Figura 6). Se encontró que el hidrogel (PVA/Cs/ALG) sin antibiótico presentó un halo de inhibición para las cepas de S. aureus y E. Coii, el cual puede ser atribuido a un efecto bacteriostático debido a la presencia de quitosano y alginato en la estructura del hidrogel. La cepa S. aureus fue la de mayor inhibición (16,0 mm), mientras que para la E. coli fue de 15.3 mm, en el caso de la K. pneumoniae y P. aeruginosa no se registró halo inhibitorio. Se realizó una comparación entre los halos obtenidos en nuestro hidrogel de PVA/Cs/ALG y el hidrogel de quitosano fabricado en la patente CN107496976A, y se encontró que nuestro hidrogel sin ningún componente extra tiene una capacidad más alta de inhibición que el hidrogel fabricado en dicha patente. Por otra parte, al incorporar antibióticos en el hidrogel, ejemplo: Meropenem, se puede evidenciar un aumento en el halo de inhibición a medida que la concentración del antibiótico aumenta. Como se observa en la siguiente tabla 1 , para los tratamientos con antibiótico (II y III), en todos los casos, las bacterias son de carácter susceptible a la inhibición, esto según lo contemplado en el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (Manual M-100, tabla 4A-I), aunque cabe resaltar que para el caso de la E. Coli y S. aureus el halo de inhibición es mayor en comparación a las otras dos cepas.

En la tabla 1 se observan los halos obtenidos para los tratamientos I (sólo hidrogel), tratamiento II (hidrogel-Meropenem 10X) y tratamiento III (hidrogel- Meropenem 100X).

Tabla 1. Halos de inhibición obtenidos para 4 cepas bacterianas (mm)

Ensayo de proliferación celular

Se evaluó la proliferación celular usando el método de cuantificación por Resazurina, esto con la finalidad de observar el efecto del sistema de liberación controlada elaborado por el método descrito (con concentración de Meropenem al 100X) sobre células estromales mesenquimales de gelatina de Wharton. Como control se utilizó solamente un hidrogel de proporción 2:1 :1 (PVA:Cs:ALG). Se observó que en el hidrogel la proliferación celular fue superior al 70%, lo cual lo hace apto para su aplicación, ya que cumple con los requerimientos mínimos de citotoxicidad. Asimismo, se evidencia que la encapsulación y liberación de factores bioactivos (por ejemplo, HGF), aumenta la proliferación celular, logrando valores máximos aproximados de 125% después de 48 horas, esto comprueba a su vez que la adición de antibióticos no tiene efecto adverso sobre la proliferación. Estos resultados de proliferación celular están normalizados con un estándar, que es el cultivo de células en placa.

Como podemos ver, la presente invención describe un método novedoso para elaborar un sistema de liberación dual que libera tantos factores bioactivos de interés y antibióticos, permitiendo combatir infecciones y a su vez promover los procesos de curación de heridas crónicas. Los experimentos in vitro realizados, demostraron que el sistema de liberación promueve la proliferación celular, esto gracias a la adición de factores bioactivos (por ejemplo, HGF). También se demostró que el hidrogel por sí solo tiene propiedades antimicrobianas inherentes, lo cual permite potenciar el efecto que pueden tener los antibióticos en el tratamiento de infecciones. La adición de las microesferas de PCL con un factor bioactivo en el hidrogel permitió obtener un perfil de liberación sin un efecto explosivo significativo, también se obtuvieron valores de degradación y propiedades mecánicas aceptables para ser usado como apósito de liberación en heridas cutáneas crónicas.