本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种制备同时表达多个基因的转基 因动物的方法。 背景技术

在传统制备转基因动物的研究中， 往往借助真核表达载体来实现， 通过 分子生物学手段将目的基因片段连接到真核启 动子下游， 整合到细胞基因组 中后能指导外源基因表达， 该方法在基因表达及功能的研究中有着极其广 泛 的应用， 传统转基因方法每次转基因只整合一个目的基 因， 进而制备表达一 个基因的转基因动物， 如果涉及制备多基因转基因动物， 则需单独制备相应 的单基因转基因动物， 然后通过转基因动物间的交配等方法制备转多 基因动 物的后代， 这种制备多基因动物的方法费时费力而且耗费 高。 发明公开

本发明的目的在于提供一种制备转基因胚胎的 方法。

本发明提供的制备转基因胚胎的方法， 是将植酸酶基因和人粘病毒抗性 基因 A均导入目的胚胎中， 得到转基因胚胎。

上述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列 1的自 5'端第 1360— 2658 位； 上述人粘病毒抗性基因 A的核苷酸序列如序列表中序列 1的自 5'端第 3803—5791位。

上述植酸酶基因和人粘病毒抗性基因 A具体可以是通过核苷酸序列如序 列表中序列 1所示的 DNA片段导入胚胎中。

上述胚胎为原核期胚胎。

上述胚胎为除人以外的任何一种动物的胚胎， 具体可以是猪、 牛、 羊、 猫、 狗、 兔或鼠的胚胎。

本发明的又一目的在于提供一种培育转基因动 物的方法。

本发明提供的培育转基因动物的方法是将上述 的制备转基因胚胎的方法 所制备的转基因胚胎移植到雌性的目的动物的 体内， 得到能同时表达多个基 因的转基因动物。

上述目的动物可为除人以外的任何一种动物， 具体可以是猪、 牛、 羊、 猫、 狗、 兔或鼠。 附图说明

图 1 : 扩增 appA凝胶电泳图。

图 2: pcDNA-appA质粒图谱。

图 3 : 扩增 MxA凝胶电泳图。

图 4: pcDNA-MxA质粒图谱。

图 5 : pcDNA-appA-MxA质粒图谱。

图 6: 显微注射 AMP基因后胚胎定量检测 appA及 MxA的表达。

图 7: AMP转基因猪 PCR检测外源基因。

图 8 : AMP转基因猪 SOUTHERN BLOT检测外源基因。

图 9: 定量检测 appA及 MxA的表达。 实施发明的最佳方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于以下实 施例。

下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。

实施例 1、 转基因胚胎的制备

一、 重组表达载体的构建

实施例 1、 表达双基因的载体的构建

1、 单基因表达载体基本构件的获得

( 1 )真核表达载体 pcDNA-appA的制备

以大肠杆菌 DH5 CC (购自北京全式金公司， 货号 CD201 ) 为模板， 以表

1中列举的扩增 appA的引物扩增植酸酶基因 （appA) 片段。 反应体系为反应 体系为 50μ1， 5 μL lOxBuffer, SμL 2.5mM dNTP、 ΙμΙ^ 20 μΜ引物 appA-Ll、 L 20 μΜ引物 appA-Rl (引物序列见表 1 ) 、 0. 5 L5 U/ 高保真 Tag聚合 酶， 2μ1大肠杆菌 DH5 CC做模板， 加超纯水至 5(^L (高保真酶购自大连宝生 物， 货号 DR010A)。 PCR扩增程序： 98°C 10s, 68°C 2min， 循环 30次。 PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 （如图 1所示） 。

PCR产物用 QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见 公司试剂 盒） ， 用 HindIII、 EcoR l双酶切纯化产物； 同时用 HindIII、 EcoR I双酶切 pcDNA3.1 ( + ) 载体 （购自 invitrogen公司） ； 将 PCR扩增产物和酶切后的 载体连接 （连接酶购自 promega公司， 货号 M1804 ) ； 按公司要求操作步骤 转化 DH5 CC (购自北京全式金公司， 货号 CD201 ) 感受态大肠杆菌； 菌液涂 琼脂糖凝胶板，于 37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体 LB培养基中 培养， 部分菌液送公司测序 （invi trogen北京公司） ； 选取测序结果表明含 有 appA (核苷酸序列如序列表中序列 1的自 5'端第 1360— 2658位所示） 的 载体， 提取质粒备用， 将该测序表明正确的质粒命名为 pcDNA-appA (质粒图 谱如图 2所示） 。

(2 ) 真核表达载体 pcDNA-MxA的制备

以人 cDNA (提取人的离体血液提取总 RNA， 反转录而来） 为模板， 以 表 1中列举的扩增 MxA的引物扩增人粘病毒抗性基因 A (MxA)片段。反应体 系为反应体系为 50μ1， 5 μL lOxBuffer, SμL 2.5mM dNTP、 ΙμΙ^ 20 μΜ引物 Mx-LK 20 μΜ引物 Mx-Rl (序列见表 1)、 0. 5 μL5 U/ μL高保真 Tag聚合 酶， 100ng 人 cDNA为模板， 加超纯水至 50μΙ^ (高保真酶购自大连宝生物， 货号 DR010A) 。 PCR扩增程序： 98°C 10s, 68°C 2min， ， 循环 30次。 PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 （图 3 ) 。

PCR产物用 QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化（操作步骤见 公司试剂 盒） ， 用 HindIII、 EcoR I双酶切纯化产物； 同时用 HindIII、 EcoR I双酶切 pcDNA3.1 ( + ) 载体 （购自 invitrogen公司） ； 将 PCR扩增产物和酶切后的 载体连接 （连接酶购自 promega公司， 货号 M1804 ) ； 按公司要求操作步骤 转化 DH5 CC (购自北京全式金公司， 货号 CD201 ) 感受态大肠杆菌； 菌液涂 琼脂糖凝胶板，于 37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体 LB培养基中 培养， 部分菌液送公司测序 （invi trogen北京公司） ； 选取测序结果表明含 有 MxA片段（核苷酸序列如序列表中序列 1的自 5'端第 3803— 5791位所示） 的载体， 提取质粒备用， 将该测序表明正确的质粒命名为 pcDNA- MxA (质粒 图谱如图 4所示） 。

2、 双基因表达载体 AMP构建 以上述 pcDNA-appA (质粒图谱如图 2所示） 为模板， 以表 1所列的引物 扩增表 1所列的相应构件。 5 μL lOxBuffer, SμL 2.5mM dNTP、 ΙμΙ^ 20 μΜ引 物 CMV-appA-LK ΙμΙ 20 μΜ引物 CMVappA-Rl (序列见表 1)、 0. 5 μ15 U/ 高保真 Tag聚合酶， 100ng pcDNA-appA质粒， 加超纯水至 5(^L (高保真酶 购自大连宝生物， 货号 DR010A) 。 PCR扩增程序： 98°C 10s, 68°C 3min， 循环 30次。 PCR扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR产物部分测序

(invitrogen公司） ； 表明扩增得到的 CMV-appA-BGH pA片段（核苷酸序列 如序列表中序列 1的自 5 ' 端第 618-2977位所示） ； CMV-appA-BGH pA片 段由依次串连的 CMV启动子、 appA和 BGH终止子组成； 其中 CMV启动子 (核苷酸序列如序列表中序列 1的自 5 ' 端第 671-1358位所示） 、 appA (核 苷酸序列如序列表中序列 1的自 5 ' 端第 1360— 2658位所示） 和 BGH终止子 (核苷酸序列如序列表中序列 1的 5 ' 端第 2735-2959位所示） 。

上述 PCR产物 CMV-appA-BGH pA片段用 QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒 回收纯化 （操作步骤见公司试剂盒） ， 用 Mlu l酶切纯化产物； 同时用 Mlu I单酶切 pcDNA-MxA质粒； 将 PCR扩增产物和酶切后的载体连接 （连接酶 购自 promega公司， 货号 M1804) ； 按公司要求操作步骤转化 DH5 α (购自 北京全式金公司， 货号 CD201 ) 感受态大肠杆菌； 菌液涂琼脂糖凝胶板， 于 37°C培养箱中培养过夜。

挑单菌落接种于液体 LB培养基中培养， 菌液 PCR检测插入片段中 CMV-appA-BGH pA片段 （扩增体系同上扩增 CMV-appA-BGH pA片段部分 (引物见表 1 )，其中模板改为菌液 2微升）， 结果有对应的 CMV-appA-BGH pA片段扩增条带， 将上述两样的部分菌液送公司测序 （invitrogen北京公 司）； 结果表明获得含有 CMV-appA-BGH pA片段和 MxA表达盒的重组表达 载体， 将该载体命名为 pcDNA-appA-MxA， 简称为 AMP。 AMP的质粒图谱 如图 5所示。

测序表明， AMP具有序列表中序列 1的核苷酸序列，其序列中含有 appA 表达盒和 MxA表达盒。

其中 appA表达盒由依次串联的 CMV启动子（核苷酸序列如序列表中序 列 1的自 5 ' 端第 671-1358位所示） 、 appA (核苷酸序列如序列表中序列 1 的自 5 ' 端第 1360— 2658位所示） 和 BGH终止子 （核苷酸序列如序列表中序 列 1的 5' 端第 2735-2959位所示）组成； MxA表达盒由依次串联的 CMV启 动子 （核苷酸序列如序列表中序列 1的 5' 端第 3114-3802位所示） 、 MxA

(核苷酸序列如序列表中序列 1的 5' 端第 3803— 5791位所示） 和 BGH终止 子 （核苷酸序列如序列表中序列 1的 5' 端第 5868-6092位所示） 组成。

二、 转基因胚胎的制备

1、 将步骤一得到的 pcDNA-appA-MxA用 Seal (购自 fermentas公司， 货 号 ER0431)及 Smal (购自 fermentas公司， 货号 ER0661)双酶切后琼脂糖凝 胶电泳回收 6.9Kb大小的条带， 稀释成 5ng/ l。测序表明， 该 6.9Kb大小的 条带的核苷酸序列如序列表中序列 1所示。

将上述 6.9Kb大小的线性化片段利用显微注射的方法注� ��到猪的原核期 胚胎中， 得到转基因胚胎， 在 NCSU 23 培养基中 （购自 millipore公司， 货 号 MR-182-D) 培养至 8细胞期。

2、 转基因胚胎检测

取其中部分胚胎的基因组 DNA直接作为模板， 按照 ProtoScript M-MuLV TaqRT-PCR试剂盒 (购自 NEB公司， 货号 E6400S)操作说明 （引物为表 1所列 举的 appA及 MxA的定量 PCR检测引物） ， 直接检测胚胎中 appA (引物是表 1 中的 appA -RTL1

禾口 appA-RTRl) 及 MxA (引物是表 1中的 hMxl - RTL1和 hMxl - RTR1) 。 PCR反应体系为 50μ1， 5 μΐ 10 X Buffer, 8 L 2.5mM dNTP、 20 μΜ上 游引物、 20 μΜ下游引物、 0. 5 μ15 U/ L高保真 Tag聚合酶， 加超纯 水至 5( L，以获得的小猪基因组 DNA为待检测模板， PCR扩增程序： 95°C 5 min; 94 °C 20s, 退火温度 56°C， 72 °Clm， 循环 30次， 最后 72°C延伸 5min。 PCR 扩增产物用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测， 筛选出分别能扩增出 appA、 MxA基因 的， 结果表明， 所检测的 24个胚胎中， 第 13和第 17号胚胎检测出能同时表 达 appA基因及 MxA基因 （图 6) 。 实施例 2、 转基因动物的制备

一、 制备转基因动物

按实施例 1中方法制备的转基因胚胎， 体外发育到 8细胞期， 然后将在 体外通过阴道子宫颈移植到发情同步的母猪子 宫角经过培养得到 38个转基 因猪。 二、 转基因猪的整合检测

1 PCR检测

利用 appA和 MxA定量检测引物（见表 1 )检测转基因猪基因组 DNA中 相应基因的整合检测上述转基因猪中外源基因 的整合情况。

PCR反应体系及扩增体系同实施例 1的步骤二的转基因胚胎检测相同， 筛选出分别能扩增出 appA和 MxA基因的猪 (图 7) (图中， +:阳性对照， pcDNA-appA-Mx质粒为模板； 阴性对照， 正常猪 DNA为模板； 1 23 : 为不同转基因后代猪扩增条带)。

从图 7的上图中可见： 1-23号猪中 3 6 11 17 20 22号猪基因组 DNA能扩增出 355bp左右的条带，条带和预期扩增的 appA条带一致；从图 7 的下图可见 1-23号猪中猪中 3 6 11 17 20 22号猪基因组 DNA能扩出 325bp条带和预期扩增的 MxA条带一致。 扩增产物测序表明扩增出的片段的 核苷酸序列均正确。

2 southen杂交检测

分别以表 1中 appA和 MxA的定量 PCR检测引物为引物，按照试剂盒操 作说明书体系加样； PCR运行程序如下： 95 °C 5 min, 94 °C 45 S 56 °C 1 min, 72 °C l min 30个循环后 72 °C 延伸 10 min (探针标记试剂盒购自 innogen-cn 公司， 货号： DDLK-010) ， 得到两个 PCR产物。

分别以上述两个 PCR产物为探针进行 southen杂交检测， 杂交前在 95°C 变性 5分钟后立即冰水中放置 10分钟备用； 大量抽提步骤 1中鉴定过的编号 为 3 6 11 17 20 22号转基因猪的猪耳组织 DNA， 用 Hindlll及 Not l 双酶切基因组， 浓缩基因组酶切产物至 300ng l; 于 1%琼脂糖凝胶电泳分离 各酶切片段， 每孔上样 50微升； 然后使 DNA原位变性后转移到带正电荷尼 龙膜上。 按照试剂盒操作说明进行预杂交、 杂交及 X-光片曝光检测杂交信号 (购自 innogen-cn公司， 货号： DIGD-210)。检测结果（图 8 )表明， southern 杂交检测的编号为 3 6 11 17 20 22号转基因猪中整合了 appA基因和 MxA基因。 三、 RT- PCR检测

分别从步骤二中筛出的编号为 3、 6、 11、 17、 20、 22号转基因猪的猪耳 静脉采集 100微升血液， 按照天根血液总 RNA提取试剂盒 （货号： DP433 ) 操作说明， 提取各组细胞总 RNA; 按照 TOYOBO反转录试剂盒 （货号： FSK-100) ， 将提取的总 RNA反转录成 cDNA.

分别以上述的 cDNA为模板，用表 1中 appA和 MxA定量 PCR检测引物， 进行半定量 PCR检测 appA和 MxA， 其中以猪 GAPDH基因为内参 （引物见 表 1 )， PCR反应体系为 50μ1， 5 μL lOxBuffer, SμL 2.5mM dNTP、 ΙμΙ^ 20 μΜ 上游引物、 20 μΜ下游引物（扩增 appA、 MxA及猪 GAPDH的引物分别 见表 1 )、 0. 5 L5 U/ μ 高保真 Tag聚合酶， lOOng模板， 加超纯水至 50μ 。

PCR扩增程序： 95。C 5 min; 94 °C 20s, 退火温度 56°C， 72 °C lm， ， 最后 72°C延伸 5min， 内参 GAPDH扩增时 23个循环， 其他模板扩增 32个循 环。

PCR扩增产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 (；图 9)。 半定量结果表明， 3、 20号猪均能检测到 MxA和 appA的表达， 说明对应的转基因猪能同时表达 MxA及 appA基因。

表 1 : 本发明中用于扩增载体构件的引物

appA -RTL1 CGTGAGAAACAGGACGAA

定量 PCR检 AG

355

测 appA appA -RTR1 GCCGAGATTTGCCAGATT

- AG

定量 PCR检 hMxl -RTL1 GCATCCCACCCTCTATTAC ―

325

测 Mxl hMxl -RTR1 CCTTGCCTCTCCACTTATC ―

mGAPDH TACACAGCCACTCAGAAG

猪内参定量

-LI AC

PCR检测 Pig 249

mGAPDH TTTCACAGCCTCCGTGATA

GAPDH

-Rl G 工业应用

本发明利用构建的同时表达植酸酶和人粘病毒 抗性基因的真核表达载体 pcDNA-appA-MxA, 利用显微注射法制备了含双基因 （植酸酶基因 （appA) 和人粘病毒抗性基因 A (MxA) ) 的转基因猪。 能同时检测出转基因猪种同时 整合双基因本发明的载体显著优势表现在一次 转基因实现多基因的同时表 达， 为制备转联合基因动物等提供一种便捷的手段 。