1. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биологии, предназначено для профилактики или лечения коронавирусных инфекций путем применения препарата «ТРИАВИР».

2. Уровень техники

Коронавирусы (КоВ) - многочисленное семейство вирусов, вызывающих болезнь от бытовой простуды до более серьезных заболеваний, таких как ближневосточный респираторный синдром (БВРС- КоВ) и тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС-КоВ). Новый коронавирус (нКоВ, COVID-19, SARS-CoV-2) - это новый штамм, ранее у человека не выявлявшийся [10].

Первым известным человечеству коронавирусом стал IBV -вирус птичьего инфекционного бронхита, который до сих пор причиняет массу неприятностей птицеводам. Данный вирус был зарегистрирован в 1937 году. На данный момент известно 39 видов коронавируса, в каждый из которых может входить десятки и сотни штаммов, кроме того, есть еще 10 кандидатов к коронавирусы [16].

В XXI веке появились нескольких новых коронавирусов (CoV). Особенностью новых вирусов является необычайно высокая вирулентность и патогенность, а вызываемые ими поражения нередко заканчиваются летальным исходом [1,2]. Впервые коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) был выявлен в 2003 году [3]. Десятилетие спустя появился второй новый коронавирус - возбудитель ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), впервые выявленный в Саудовской Аравии [1]. За время существования с момента первого выявления SARS-CoV инфицировал около 8000 человек, а летальный исход регистрировался примерно у 10 % инфицированных [4]. MERS-CoV был не так широко распространен, как SARS-CoV, но по своей активности он более патогенен и вирулентен, а также способствует более высокому проценту летальных исходов, равному 35-50 % от всех диагностированных случаев заражения [1,2].

Вызывает озабоченность тот факт, что в популяциях животных были обнаружены и другие CoV, что как повышает вероятность повторения подобных вспышек [4]. Поскольку оба вируса SARS-CoV и MERS-CoV зоонозные и способны вызвать гораздо более тяжелые заболевания, чем те, что обычно наблюдают для CoV. Следствием инфицирования SARS-CoV и MERS-CoV является тяжелое поражение легких в виде острого повреждения легочной ткани (ОПЛ), сопровождающееся отеком легких и дыхательной недостаточностью. При этом возможно динамическое развитие в ОПЛ - острый респираторный дистресс-синдром (ОРД С) [5].

Развитие указанных синдромов имеет место и при новой коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2. Выявлено, что расстройства иммунной функции играют ключевую роль в ее патогенезе [6, 7, 8, 9]. Отмечается наличие лимфопении и отсутствии нейтропении. Лимфоциты периферической крови преимущественно относились к клеткам, имеющим маркеры HLA-DR и CD38. Они относились к субпопуляциям перфорин и/или гранулизин-положительных CD8 ⁺ Т- лимфоцитов или воспалительным ТЫ7- клеткам. Поскольку последние обладают выраженными повреждающими тканевыми эффектами, а также иммуносупрессивной активностью, то следствие подобных изменений являлось значительное повреждение легочной ткани в виде диффузного повреждения альвеол, и развитие ОРДС. Подобные изменения согласуются с высокой экспрессией рецептора SARS-CoV-2 на пневмоцитах. Последними исследованиями показано, что одним из биологически правдоподобных механизмов повреждения легких при SARS-CoV-2 является антителозависимое усиление (АЗУ) [8,9]. Антителозависимое усиление вызывается не только нейтрализующими антителами, но и ненейтрализующими антителами. Применительно к SARS-CoV-2 АЗУ обеспечивается клетками с фенотипом CD32, к которым относят моноциты и макрофаги, альвеолярные макрофаги.

Первые случаи заражения COVID-19 зафиксированы в Китае в декабре 2019 г. Однако уже на 04 марта 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности 93 090 случаев заболевания COVID-19 и 3198 смертей. Большая часть случаев и смертей - в Китае (80422 и 2984, соответственно), однако случаи коронавируса и смерти от него зафиксированы также в 76 странах мира [11].

На 03 апреля 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности 1 095 904 случаев заболевания COVID-19 и 58 814 смертей. Большая часть случаев и смертей - в США (275 744 и 7 086, соответственно), Италии (119 827 и 14 681, соответственно), Испании (119 199 и 11 198, соответственно), Германии (91 159 и 1 275, соответственно), в Китае (81 620 и 3 322, соответственно). Случаи коронавируса и смерти от него зафиксированы уже в 205 странах мира [12]. Очевидно, что темпы распространения инфекции крайне высокие, несмотря на принимаемые меры.

2019-nCoV - это вирус, оказывающий серьезное воздействие на здоровье населения, экономику и социально-политические вопросы. Сдерживание COVID-19 должно быть главным приоритетом для всех стран [13].

Поскольку это новое инфекционное заболевание, то на сегодняшний день зарегистрированной вакцины против нового коронавируса нет [14]. Но из-за существования риска АУЗИ вакцина, формирующая прежде всего гуморальный ответ организма, нуждается в очень тщательной проверке на безопасность в модельных системах, максимально приближенных к воспроизведению реальных инфекций и в клинических исследованиях. В то же время, вакцина, формирующая клеточный иммунитет на консервативные антигенные детерминанты, не будет провоцировать АЗУИ.

Также существует острая неудовлетворенная потребность в оптимальном лечении, включая специфическую противовирусную терапию, изучении роли модуляции иммунной системы и как лучше всего обеспечить поддержку отказавших систем органов. На данный момент зарегистрировано более 160 рандомизированных и неслучайных исследований. Для лечения COVID-19 используют различные средства, включая кортикостероиды, различные комбинации рибавирина, лопинавира/ритонавира, хлорохина, гидроксихлорохина, интерферонов и других агентов. Проводится РКИ с использованием ремдесивира при тяжелом течении COVID-19 (NCT04257656). [15]. Лечение осуществляют также с использованием средств народной медицины.

Кроме обозначенных выше есть еще четыре человеческих коронавируса, два из которых, HCoV-229E и HCoV-OC43, были известны ещё до атипичной пневмонии от SARS-CoV, а два других, HCoV-NL63 и HCoV-HKUl, открыли в 2004 и 2005 годах. Все четыре не вызывают ничего серьёзнее мягкой простуды; хотя коронавирусная простуда встречается довольно часто — на её счёт относят 15 — 30% всей простуды в мире [16].

Однако для всех коронавирусов характерно следующее.

В электронный микроскоп можно увидеть, что округлые вирусные частицы украшены выступами, которые создают вокруг вируса как бы дополнительную оболочку, похожую на солнечную корону. Выступы — булавообразные молекулы белка S, который нужен вирусу, чтобы проникнуть в клетку. (Надо сказать, что «корона» из белка S есть ещё у одной группы вирусов — торовирусов, родственников коронавирусов, обычно заражающих животных и редко — человека.) У некоторых коронавирусов имеется «подкорона» — дополнительный слой выступающих из оболочки белков размером поменьше S. Этот более мелкий белок называется НЕ, гемагглютининэстераза. НЕ тоже нужен для взаимодействия с клеткой, и он есть кроме коронавирусов у торовирусов и у некоторых вирусов гриппа.

И белок S, и белок НЕ сидят в мембранной липидной оболочке, которую вирус берет у клеток хозяина, выходя из клетки. Кроме S и НЕ в ней сидит очень много белка М, который поддерживает и структурирует мембрану, и ещё немного белка Е. Под липидной оболочкой с белками геном вируса — нить молекулы РНК, которая усажена белком N: он упаковывает вирусную РНК в компактную свёрнутую спираль. Когда РНК попадает в клетку, то на ней сразу можно синтезировать белки, и такую РНК у вирусов обозначают плюсом. По этим признакам коронавирусы относят к РНК-содержащим вирусам, чей геном представляет собой одну-единственную плюс-цепь РНК.

Коронавирус подходит к клетке и касается её шипиками белка S — того самого, который образует «корону». Поверхность клетки усажена множеством белков; среди них есть и ферменты-протеазы, то есть способные резать другие белковые молекулы. Клетка сначала поглощает вирус, впячивая в себя мембрану в том месте, где он с ней взаимодействовал, — и вирус оказывается внутри мембранного пузырька в клеточной цитоплазме. Ферменты-протеазы, с которыми соединился белок S, разрезают его, и в результате оставшаяся у вируса часть белка S меняет пространственную форму. Изменённый S помогает сблизиться мембране вируса и мембране пузырька, в который его поместила клетка, — две мембраны сливаются, вирусная мембранная оболочка расходится, и в клеточную цитоплазму выходит вирусная РНК [16].

В уровне техники описаны следующие подходы к лечению коронавирусной инфекции.

Остановка копирования вирусного генома. Если ферменту, синтезирующему РНК, к обычным рибонуклеотидам добавить какую-нибудь молекулу-аналог, похожую на рибонуклеотид, то синтез РНК испортится: фермент остановится, не закончит начатую нить РНК или же продолжит её синтезировать, но теперь в РНК будут часто попадаться неправильные буквы, которые будут вступать в разные химические реакции и тем самым провоцировать многочисленные мутации.

Коронавирусы и другие РНК-вирусы используют для синтеза особый фермент — РНК-зависимую РНК-полимеразу. В самой клетке такого фермента нет, клетка не занимается синтезом молекул РНК на шаблоне РНК, поэтому можно попробовать подействовать на вирусную полимеразу, не мешая клетке. Молекулы-аналоги рибонуклеотидов синтезируют давно, и некоторые из них создавали как раз для борьбы с вирусами. Например, лекарство ремдесивир разрабатывали против вирусов Эбола, но впоследствии оказалось, что ремдесивир подавляет размножение MERS-CoV и SARS-CoV. Известно, что ремдесивир блокирует инфекцию SARS-CoV-2 в культуре клеток человека и обезьяны. Клинические испытания с больными людьми проходят в Китае и США, и как минимум один пациент, принимавший ремдесивир, уже выздоровел — правда, пока непонятно, насколько он своим выздоровлением обязан именно этому препарату.

Другой аналог рибонуклеотидов под названием EIDD-2801 разрабатывали против вируса гриппа, — и он, как говорится в недавней статье в «Science Translational Medicine», также подавляет инфекцию SARS- CoV и MERS-CoV у мышей и размножение нового SARS-CoV-2 в клетках лёгких человека. EIDD-2801 провоцирует много мутаций в вирусной РНК, при этом клеточная РНК не повреждается. Осталось дождаться результатов клинических исследований.

Можно попробовать выключить саму вирусную РНК-полимеразу. Хлорохин используют против малярийного паразита, иногда — против патогенных амёб. Как оказалось, он ещё и подавляет активность вирусной полимеразы: хлорохин сильно повышает в клетке уровень ионов цинка, которые как раз мешают работать ферменту. Кроме того, хлорохин не даёт вторгающемуся в клетку вирусу высвободить свой геном в клеточную цитоплазму. Однако у хлорохина есть серьёзный минус — из-за него возникают аномалии в сердечном ритме, и, чем выше доза лекарства, тем выше риск сердечных аномалий. А пока нельзя сказать, могут ли небольшие дозы хлорохина остановить инфекцию SARS-CoV-2.

Другой путь - это помешать проникнуть вирусу в клетку. Вне клетки вирус не может размножаться, а те вирусные частицы, что остались в межклеточном пространстве и в крови будут уничтожены клетками иммунной системы. S-белок играет роль отмычки, взламывающей клетку: чтобы вирус вошёл в клетку, его S-белок взаимодействует с белком АСЕ2, который сидит на поверхности клеточной мембраны.

Вирусному S-белку можно предоставить обманку, похожую на АСЕ2, чтобы он отвлёкся от клеток. Например, сам АСЕ2, только свободно плавающий вокруг вируса, а не сидящий на клетке. Так, в апрельской статье в журнале «Cell» говорится про человеческий модифицированный АСЕ2, выращенный в бактериальных клетках. Его действие проверяли на органоидах — крохотных моделях почки и кровеносных сосудов, выращенных из стволовых клеток человека, и такой белок действительно не позволял вирусу проникать в человеческие клетки [17].

Однако универсально решения по профилактике и лечению короновирусной инфекции еще не найдено и на данный момент все еще существует острая необходимость в эффективных средствах и способах профилактики или лечении как новой короновирусной инфекции, так и любой из известных, а также вновь возникшей в будующем.

3. Сущность изобретения

Рецептура препарата «ТРИАВИР». Наименование компонента Количество на 1 флакон 100 мл

Активные вещества

Интерферон а2Ь рекомбинантный 100 000 ME

Интерферон у рекомбинантный 10 000 ME

Лопинавир 2,0 мг

Вспомогательные вещества

Натрия хлорид 900 мг

Спирт этиловый 2.0

Приведенный вариант рецептуры служит не для ограничения объёма притязаний, а для демонстрации конкретного примера воплощения.

Дозы, используемые в рецептуре могут быть выбраны из следующего диапазона: лопинавир 0,1-32 мг/100 мл, интерферон альфа 50000 - 1000000 ME \100 мл, интерферон гамма 5000 - 500000 ME /100 мл.

Характеристика каждого из компонентов ингаляционной смеси, препарата «Триавир».

Интерфероны - мультигенное семейство индуцибельных цитокинов, обладающих разнообразными функциями, включающими противовирусную, антипролиферативную, противоопухолевую и иммуномодулирующую.

ИФН подразделяют на три типа:

Тип I - известный как вирусный интерферон, включает ИФН-а (лейкоцитарный, синтезируется активированными моноцитами и В- лимфоцитами), ИФН--Ь (фибробластный, синтезируется фибробластами и эпителиальными клетками, макрофагами), ИФН-w, ИФН-к;

Тип II - известный как иммунный, включает ИФН-у (синтезируется активированными Т-лимфоцитами и NK-клетками);

Тип III - был обнаружен позже типа I и типа II, информация о нем свидетельствует о важности ИФН типа III в некоторых видах вирусных инфекций.

Первому типу (ИФН-а), главным образом, присущи антивирусный и антипролиферативный эффекты, в меньшей степени иммуномодулирующий. Они вырабатываются непосредственно после встречи с патогеном, их действие направлено на локализацию возбудителя и предотвращение его распространения в организме. Эти интерфероны осуществляют раннюю и неспецифическую защиту организма от инфекционного агента.

Главное действие интерферонов второго типа (ИФН-у) - участие в реакциях иммунитета. Он начинает вырабатываться на последующих этапах инфекционного процесса уже сенсибилизированными Т-лимфоцитами и активно участвует в каскаде специфического иммунного ответа.

Вирусные интерфероны индуцируются в процессе вирусной инфекции, а синтез интерферонов II типа (ИФН-у) активируется митогенными или антигенными стимулами. Большинство типов вирусоинфицированных клеток способно синтезировать ИФН а/b в клеточной культуре. В противоположность этому ИФН-у синтезируется только некоторыми клетками иммунной системы, включая естественные киллерные (NK) клетки, CD4 Т-клетки и CDS цитотоксические супрессорные клетки [18]. Согласно «Временным методическим рекомендациям Минздрава РФ» [19], «рекомбинантный интерферон альфа 2Ь (ИФН-а2Ь) в виде раствора для интраназального введения обладает иммуномодулирующим, противовоспалительным и противовирусным действием. Механизм действия основан на предотвращении репликации вирусов, попадающих в организм через дыхательные пути».

Эффективность ингаляционного применения ИФН-а2Ь при COVID-19 также доказана с высокой степенью достоверности [20-23,29]. Именно поэтому, согласно Клиническим рекомендациям, принятым в настоящее время в КНР: «Интерфероновая ингаляция ИФН-а2Ь рекомендуется во всех протоколах лечения COV1D-19». При этом ингаляции ИФН-а2Ь входят в протоколы лечения разных периодов, а также степей тяжести заболевания и применяются у детей старше 5 лет [25].

Таким образом, ингаляционное введение ИФН-а2Ь является существенно более эффективным средством, чем его интраназальное применение, особенно при COVID-19, где поражаются преимущественно нижние отделы дыхательной системы [25,20-23,29]. При этом обращает на себя внимание чрезвычайно высокий уровень безопасности такого способа введения препарата. Так, при использовании дозированного распыляющего небулайзера, разовая доза ИФН-а2Ь для взрослых колебалась от 1,0 до 120 млн. ME. При этом ИФН-а2Ь в плазме крови не определялся при ингаляционных дозах в 1-18 млн ME, но при дозах 60 млн. ME определялись следовые дозы ИФН-а2Ь в плазме. При этом у пациентов, получавших ингаляционно 120 млн ME ИФН-а2Ь, в плазме определялось от 11 до 35 ME ИФН-а2Ь. Никаких системных и местных побочных эффектов от ингаляционного приема ИФН-а2Ь в дозах 1-18 млн ME не наблюдалось, однако дозы от 60 до 120 млн ME, приводили к гипертермии, головной боли и общему недомоганию. Эти симптомы начинались через 3-6 часов, достигали максимальной выраженности через 8-10 часов и заканчивались через 12-24 часа после ингаляции [26]. Таким образом, применение ИФН-а2Ь является традиционным способом терапии COVID-19, с доказанной эффективностью и безопасностью. Интерферон гамма (ИФН-у), кроме внутримышечного и подкожного способа введения применяется интраназально и в виде ингаляций, в том числе у детей [29-31, 32,28,27]. В отличие от других интерферонов ИФН-у, повышает экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) как1-го, таки 2-го классов на разных клетках, причем индуцирует экспрессию этих молекул даже на тех клетках, которые не экспрессируют их конститутивно. Тем самым повышается эффективность презентации антигенов и способность их распознавания Т-лимфоцитами. ИФН-у блокирует репликацию вирусных ДНК и РНК, синтез вирусных белков и сборку зрелых вирусных частиц. Интерферон гамма оказывает цитотоксическое воздействие на вирусинфицированные клетки. Применение ИФН-у при новой коронавирусной инфекции обусловлено тем, что только этот тип ИФН блокирует синтез 0-TGF, ответственных за развитие фиброза легких, который является частым отдаленным осложнением C0VID-19 [32,33]. В клинической пульмонологии в настоящее время возрастает интерес к потенциальной роли ИФН-у в лечении заболеваний респираторного тракта, причем предпочтение отдается прямой доставке препарата прямо в орган- мишень путем ингаляционного введения, как наиболее эффективного и безопасного способа [34,35]. Исследования на здоровых добровольцах при сравнении ингаляционного и подкожного введения ИФН-у продемонстрировали, что, в отличие от ингаляционного, при парентеральном введении препарата, определяются отчетливое повышение уровня ИФН-у в плазме крови, но не в легочных смывах[32]. Многочисленные клинические данные продемонстрировали существенно большую эффективность и безопасность аэрозольного пути введения ИФН-у для лечения респираторных вирусных инфекций [32,34,35]. Эффективные терапевтические дозировки ИФН-у в тысячи раз ниже возможных токсических, и составляют для взрослого человека при дозированном ингаляционном введении 125-500 пг/мл (31250-125000МЕ/мл). При этом, терапевтические дозы интерферонов, из-за их низкой концентрации практически не обладают каким-либо местно-раздражающим действием и могут применяться по нескольку раз в день в течение длительного времени (до нескольких месяцев] [34]. Таким образом, безопасность введения ИФН-у путем небулайзерных ингаляций в терапевтических дозах несомненно доказана по результатам достоверных клинических исследований. Кроме того, важным доводом в пользу этого утверждения является функциональное и структурное сходство молекул ИФН-у и ИФН-а2Ь, что определяет отсутствие межмолекулярного взаимодействия между ними, а также сходные токсикологические свойства.

Лопинавир является ингибитором SARS ЗС-подобной протеазы, и активно изучался на возбудителях SARS и MERS in vitro, продемонстрировав определенные результаты в плане ингибирования репликации этих вирусов [29-30,35]. При этом сравнительный генетический анализ показал практически полную идентичность структуры SARS ЗС-подобной протеазы у вируса SARS-CoV-2, по сравнению с таковыми у SARS и MERS [36].

Недавние систематизированные обзоры изучения клинического эффекта при COVID-19 лопинавира/ритонавира при пероральном введении [20,38,24] показали недостаточную клиническая эффективность лопинавира/ритонавира.

Таким образом, поскольку в уровне техники уже изучалось воздействие лопинавира/ритонавира на новую короновирусную инфекцию, но результаты применения лопинавира/ритонавира были неудовлетворительными, то специалист не мог бы предполагать, что при изменении пути введения будет достигнут необходимый уровень лечебного эффекта. Поскольку ингаляционное введение оказалось эффективным для COVID-19, то учитывая генетическую близость коронавирусов по ЗС- подобной протеазы, лечебный эффект для профилактики и лечения COVID- 19 может быть экстраполирован на любую коронавирусную инфекцию.

Как показали наши исследования, ингаляционное воздействие in situ приводит к существенному потенцированию противовирусного эффекта, предположительно в связи со значительным повышением активной концентрации вещества при его непосредственном воздействии на вирус. Очень важным доводом в пользу этого является существенно более высокая безопасность такого способа введения по сравнению с пероральным. Это связано с тем, что максимальная дозировка, которая применяется при пероральном введении лопинавира оставляет 400 мг два раза в день, при этом средняя максимальная концентрация в плазме (Стах) составляет 9,8±3,7 мкг/мл и достигается примерно через 4 ч после приема. Очевидно, что ингаляционное введение препарата в дозе 400 мкг/мл, т.е., в 1000 раз меньшей, практически безопасно (в отношении системного и местнораздражающего действия) и при этом воздействует на SARS ЗС-подобную протеазу вируса в среднем в 40-50 раз более эффективной дозой в плане её блокирующего воздействия на инфицирование вирусом.

Однако ранее в уровне техники не содержалось подобных предположений. Следовательно, средний специалист не мог бы предположить, что ингаляционное введение будет эффективным в сравнении с пероральным. Обычно специалист ожидает повысить эффект препарата изменив путь введения на внутривенный или по меньшей мере внутримышечный.

Имеющиеся данные по доклиническим токсикологическим исследованиям препарата калетра (лопинавир/ритонавир) при его пероральном применении, который как известно прошел всестороннее изучение безопасности по протоколам FDA, а также по правилам доклинического исследования препаратов, зарегистрированных в РФ,- свидетельствуют о том, что действующая субстанция относится к классу малотоксичных препаратов (ЛД50 при однократном пероральном введении лопинавира отдельно, составляет более 2500 мг/кг, low toxicity (GRAS status).

Риск ингаляционного отравления при использовании терапевтических доз практически отсутствует [39,40].

Техническим результатом, достигаемым при реализации заявляемого решения, является эффективная профилактика или лечение пациентов с коронавирусной инфекцией.

Нами проведено рандомизированное контролируемое в параллельных группах, проспективное, одноцентровое терапевтическое исследование комбинированной ингаляционной смеси препарата «ТРИАВИР®» для профилактики и лечения COVID-19: у пациентов 25-90 лет. В результате исследования была разработана эффективная ингаляционная смесь препарата «ТРИАВИР®» для лечения и профилактики COVID-19 у пациентов 25-90 лет.

Примеры

Общая длительность исследования для каждого пациента составила не более 14 дней, разделенных на 3 периода:

- период скрининга (1 день) — день исследования -1 день;

- период лечения исследуемым препаратом (14 дней (±2 дня)) - день исследования с 1 по 10 (±2);

- период завершения исследования (1 день) — день исследования 14 (±2).

Период скрининга:

Визит V0 (день -1), Врач-исследователь проводит сбор эпидемиологического анамнеза, демографических данных, жалоб и анамнеза, физикальное обследование, оценку клинических проявлений заболевания, назначает проведение компьютерной томографии (МСКТ) легких, ЭКГ, пульсоксиметрии с измерением SpO2, забор мазков из носоглотки и ротоглотки на наличие РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР, общий (клинический) анализ крови с определением уровня лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, абсолютного и процентного содержания лимфоцитов, биохимических анализ крови, общий анализ мочи, исследование уровня С-реактивного белка (СРВ) в сыворотке крови.

На основании полученных результатов проведена оценка критериев включения/невключения.

Период лечения исследуемым препаратом:

Визит VI (день 1).

После заключительной оценки критериев включения невключения по результатам выполненных обследований, проведены сбор жалоб, регистрация сопутствующей терапии, физикальное обследование, оценка клинических проявлений заболевания, после чего, принято решение о включении пациента в исследование, и он рандомизирован методом случайных чисел в одну из четырех групп:

- Первая группа пациентов (контрольная) получала стандартную терапию в соответствии с временными методическими рекомендациями Министра здравоохранения Российской Федерации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (covid-19) (Версия 5 (08.04.2020).

- Вторая группа - дополнительно к стандартной терапии в соответствии с временными методическими рекомендациями Министра здравоохранения Российской Федерации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (covid-19) (Версия 5 (08.04.2020) пациентам назначена комбинированная ингаляционная смесь №1 через небулайзер в течение 10 минут 4 раза в день в течение 14 дней.

- Третья группа - дополнительно к стандартной терапии в соответствии с временными методическими рекомендациями Министра здравоохранения Российской Федерации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (covid-19) (Версия 5 (08.04.2020) пациентам назначена комбинированная ингаляционная смесь №2 через небулайзер в течение 10 минут 4 раза в день в течение 14 дней.

- Четвертая группа - дополнительно к стандартной терапии в соответствии с временными методическими рекомендациями Министра здравоохранения Российской Федерации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (covid-19) (Версия 5 (08.04.2020) пациентам назначена комбинированная ингаляционная смесь №3 через небулайзер в течение 10 минут 4 раза в день в течение 14 дней.

- Пятая группа - дополнительно к стандартной терапии в соответствии с временными методическими рекомендациями Министра здравоохранения Российской Федерации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (covid-19) (Версия 5 (08.04.2020) пациентам назначен и применен препарат «ТРИАВИР®» в виде ингаляций через небулайзер в течение 10 минут 4 раза в день в течение 10 дней.

Для этого каждому участнику исследования присвоен рандомизационный номер методом генерации случайных чисел с использованием статистической программы SPSS Statistics 19.0. Этот номер определяет вид применяемой терапии (Т1-Т5) в соответствии с планом рандомизации. Данный номер закреплялся за участником исследования на весь период исследования.

Пациент находился в стационаре на протяжении всего исследования и до полного выздоровления или иного исхода. Пульсоксиметрия, регистрация симптомов, жалоб, физикальный осмотр и измерение температуры тела производился в каждый день исследования с момента рандомизации для мониторинга динамики заболевания.

Затем проведена оценка нежелательных явлений.

Визит V2 (день 4 от Визита VI).

На данном визите проведены сбор жалоб (изменения после предыдущего визита), регистрация сопутствующей терапии, физикальное обследование, оценка клинических проявлений заболевания, пульсоксиметрия с измерением SpO2, забор мазков из носоглотки и ротоглотки на наличие РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР.

Визит V3 (день 8 от Визита VI).

На данном визите проведены сбор жалоб (изменения после предыдущего визита), регистрация сопутствующей терапии, физикальное обследование, оценка клинических проявлений заболевания, пульсоксиметрия с измерением SpO2, забор мазков из носоглотки и ротоглотки на наличие РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР, проведение общего (клинического) анализа крови с определением уровня лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, абсолютного и процентного содержания лимфоцитов, биохимического анализа крови, исследование уровня С- реактивного белка (СРВ) в сыворотке крови.

Визит V4 (день 14 (±2) от Визита VI).

На данном визите проведены сбор жалоб (изменения после предыдущего визита), регистрация сопутствующей терапии, физикальное обследование, оценка клинических проявлений заболевания, проведение компьютерной томографии (МСКТ) легких, пульсоксиметрия с измерением SpO2, забор мазков из носоглотки и ротоглотки на наличие РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР, проведение общего (клинического) анализа крови с определением уровня лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, абсолютного и процентного содержания лимфоцитов, биохимического анализа крови, общего анализа мочи, исследование уровня С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови.

В исследование включено 70 взрослых пациентов 25-90 лет обоих полов со среднетяжелой формой COVID-19.

В ходе исследования все пациенты рандомизированы на 5 групп: 36 пациентов - в контрольной; по 9 пациентов в каждой исследуемой группе.

В исследование были включены пациенты с подтвержденным диагнозом: «Новая коронавирусная инфекция COVID-19, среднетяжелая форма, внебольничная двусторонняя пневмония без дыхательной недостаточности» на основании исследования мазка из носоглотки и МСКТ легких. Отсутствие приема препаратов, содержащих Лопинавир за 7 дней до начала исследования. Интервал между началом симптомов (гипертермия, кашель) и рандомизацией не более 7 дней. Для женщин отрицательный тест на беременность или подтверждение отсутствия репродуктивного потенциала.

Пациенты, имеющие одно из следующих, не были включены в исследование:

1. Повышенная чувствительность к любому компоненту препарата.

2. Наличие дыхательной недостаточности ДН II или III степени, острого респираторного дистресс синдрома.

3. Наличие бактериального сепсиса с поражением легких (возбудитель не уточнен)

4. Наличие противопоказаний к приему лопинавира

5. Наличие противопоказаний к приему интерферонов

6. Наличие у пациента факторов риска серьезного течения и смертности при COVID-19; 7. Сахарный диабет 1 или 2 типа;

8. Бронхиальная астма;

9. ХОБЛ;

10. Легочно-сердечная недостаточность;

11. Наличие трансплантированных органов и тканей;

12. Онкологические заболевания любой локализации;

13. Ожирение;

14. ВИЧ, Гепатит и другие острые инфекционные заболевания, кроме COVID-19;

15. Другие заболевания и состояния, которые на момент исследования считаются факторами риска;

16. Беременность и лактация;

17. Пациент нуждается в приеме препаратов запрещенной терапии;

18. Активный туберкулез, муковисцидоз, системные заболевания соединительной ткани;

19. Тяжелые, декомпенсированные или нестабильные соматические заболевания (любые заболевания или состояния, которые угрожают жизни пациента или ухудшают прогноз пациента, а также делают невозможным проведение клинического исследования);

20. Наличие психического заболевания, не позволяющего проводить оценку проводимой терапии (в т.ч. клаустрофобия);

21. Алкоголизм и наркомания в настоящее время, либо в анамнезе;

22. Отсутствие готовности пациента к сотрудничеству;

23. Участие пациента в любом другом клиническом исследовании в последние 30 дней.

Длительность применения исследуемых препаратов составила 14 дней (±2 Дня).

Длительность наблюдения пациента 14 дней (±2 дня). Контроль безопасности и переносимости препаратов проводился на протяжении всего периода его использования и последующего наблюдения.

Контроль заключался в оценке частоты, характера и интенсивности нежелательных явлений и серьезных нежелательных явлений.

Состав ингаляционных смесей:

Ингаляционная смесь №1 - ИФНа2Ь -2000МЕ/мл

Ингаляционная смесь№2 - ИФНу -200МЕ/мл

Ингаляционная смесь №3 - ИФНа2Ь ,2000МЕ/мл + ИФНу, 200МЕ/мл

Ингаляционная смесь №4 - препарат «ТРИАВИР®»

(ИФНа2Ь,1000МЕ/мл + ИФНу, 100МЕ/мл+ лопинавир 80 мкг/мл)

Результаты лечения

Таблица 1. Характеристика исследуемой популяции

Ингаляционная смесь №1 - ИФНа2Ь -2000МЕ/мл

Ингаляционная смесь№2 - ИФНу -200МЕ/мл

Ингаляционная смесь №3 - ИФНа2Ь ,2000МЕ/мл + ИФНу, 200МЕ/мл Препарат «ТРИАВИР» (ИФНа2Ь ,1000МЕ/мл + ИФНу, 100МЕ/мл+ лопинавир 80 мкг/мл).

Таблица 2. Таблица 3.

Возрастные характеристики также отражены на фиг.1.

Таблица 4. Весовые характеристики также отражены на фиг.2.

Таблица 5.

Ростовые характеристики также отражены на фиг.З.

Таблица 6.

Характеристики ИМТ также отражены на фиг.4.

Таким образом, выборка пациентов исследуемых групп является однородной.

Нет существенных различий, влияющих на результат в исследуемых группах и контроле.

Проведённая оценка эффективности проведенного лечения нижеприведенными составами:

Состав ингаляционных смесей:

Ингаляционная смесь №1 - ИФНа2Ь -2000МЕ/мл

Ингаляционная смесь№2 - ИФНу -200МЕ/мл

Ингаляционная смесь №3 - ИФНа2Ь ,2000МЕ/мл + ИФНу, 200МЕ/мл

Ингаляционная смесь №4 - препарат «ТРИАВИР» (ИФНа2Ь ,1000МЕ/мл + ИФНу, 100МЕ/мл+ лопинавир 80 мкг/мл), при использовании указанных ниже критериев показала следующее. Первичные конечные точки:

1. Положительная динамика результатов специфических изменений легких, характерных для пациентов с подтвержденным диагнозом «Новая коронавирусная инфекция COVID-19» при проведении компьютерной томографии (МСКТ) легких, по сравнению с результатами скрининга.

2. Положительная динамика результатов пульсоксиметрии с измерением SpO2 по сравнению с визитом 1.

3. Положительная динамика нормализации относительно количества лимфоцитов в общем клиническом анализе крови.

4. Положительная динамика (нормализация уровня С- реактивного белка в анализе крови.

Вторичные конечные точки:

Количество пациентов с отрицательным результатом исследования мазков из носоглотки и ротоглотки на наличие РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР.

Частота ухудшения (обострения пневмонии).

Таблица 7.

Результаты исследования результатов компьютерной томографии (МСКТ) легких

Таблица 8.

Выводы по результатам исследования:

1. Положительная динамика отмечается у всех пациентов, включая контрольную группу.

2. В группах, получавших лечение ингаляционными смесями, отмечается достоверно более выраженная положительная динамика (см. фиг.5-10).

3. В группе, получавшей лечение препаратом «ТРИАВИР» она выражена в наибольшей степени (см. фиг.5-10).

Таблица 9. Классификация результатов КТ в зависимости от степени выявленных изменений

Таблица 10. Стадии развития вирусного поражения легких при

COVID 19

Все исследователи подчеркивают значимость таких изменений, как матовое стекло, консолидация, ретикулярные изменения и площадь поражения, единодушно соглашаясь, что они отражают тяжесть заболевания и позволяют прогнозировать его дальнейшее развитие. Но их комбинация широко обсуждается, что порождает массу классификаций. Очевидно, что существует достоверная корреляционная связь между тяжестью поражения легких, методом КТ и клиническим течением заболевания, целесообразность количественной оценки протяженности изменений в паренхиме легких.

Таблица 11. Анализ результатов пульсоксиметрии с измерением SpO2

Статистика Визит 1

Визит1 Диаграмма ствол-лист для

Группа= 1,00

Frequency Stem & Лист

2,00 Extremes (=<90, 0)

2,00 91. 00

,00 91 .

9,00 92. 000000000

,00 92 .

22,00 93 . 0000000000000000000000

,00 93 .

1,00 94. 0

Ширина ствола: 1

Каждый лист: 1 наблюдения Визит1 Диаграмма ствол-лист для

Группа= 2,00

Frequency Stem & Лист

3,00 Extremes (=<90, 0)

14,00 92 . 00000000000000

,00 92 .

14,00 93 . 00000000000000

,00 93 .

4,00 94. 0000

1,00 Extremes (>=95,0)

Ширина ствола: 1

Каждый лист: 1 наблюдения

Фиг.11 также описывает визит 1.

Если в результате получена вероятность ошибки р менее 0,05, то данное распределение значимо отличается от нормального. В данном примере распределение можно считать нормальным.

По диаграмме нормального распределения, называемой диаграммой Q- Q (см.фиг.11) можно визуально определить, достаточно ли близко заданное распределение приближается к нормальному. Здесь каждое наблюдаемое значение сравнивается со значением, ожидаемым при нормальном распределении. При условии точного выполнения нормального распределения все точки лежат на прямой. Наблюдаемые значения откладываются по оси X, а ожидаемые - по оси Y, при этом все значения подвергаются стандартизации (z-преобразованию). В данном примере наблюдаемые значения достаточно близки к прямой.

На диаграмме с исключенным трендом отклонения наблюдаемых значений от ожидаемых при нормальном распределении представлены в зависимости от наблюдаемых значений. В случае нормального распределения все точки лежат на горизонтальной прямой, проходящей через нуль. Явное отклонение от прямой указывает на отличие распределения от нормального. На этой диаграмме все значения, также подвергаются стандартизации (z-преобразованию) (см.фиг.11).

Статистика Визит 4

Визит 4 Диаграмма ствол-лист для

Группа= 1,00

Frequency Stem & Лист

4,00 92 . 0000 ,00 92.

22,00 93 . 0000000000000000000000

,00 93 .

7,00 94. 0000000

,00 94.

2,00 95 . 00

I,00 Extremes (>=96,0)

Ширина ствола: 1

Каждый лист: 1 наблюдения

Визит 4 Диаграмма ствол-лист для

Группа= 2,00

Frequency Stem & Лист

2,00 92 . 00

,00 92 .

7,00 93 . 0000000

,00 93 .

II,00 94. 00000000000

,00 94. 14,00 95.00000000000000

,00 95.

2,00 96. 00

Ширина ствола: 1

Каждый лист: 1 наблюдения

Фиг.12 также описывает визит 4.

Визит 1

Таблица 20. Критерий для независимых выборок

Визит 4

Таблица 21. Статистика группы

Таблица 22. Критерий для независимых выборок

Результат анализа следующий: - так как значение р-уровня <0,05, можно сделать вывод о статистически значимых различиях в уровне выраженности уровня насыщенности гемоглобина кислородом до и после лечения; - учитывая, что значение t-критерия отрицательное = -4,171, можно говорить о статистически значимом росте значений SpO2 после проведения лечения; то есть проведенное лечение оказалось эффективным. Выведенные результаты содержат: количество наблюдений, средние значения, стандартные отклонения и стандартные ошибки средних в обеих группах, результаты теста Левена на равенство дисперсий.

Как правило, гипотеза о равенстве (гомогенности) дисперсий не принимается, если тест Левена дает значение р < 0,05 (гетерогенность дисперсий). Для случаев как гомогенности (равенства), так и гетерогенности (неравенства) выводятся следующие характеристики: результаты t-теста: значение распределения Т, количество степеней свободы ст. св., вероятность ошибки р (под обозначением «Значимость (2- сторонняя)»), а также разница средних значений, ее среднеквадратичная ошибка и доверительный интервал. В данном случае наблюдается значимое различие воздействия схемы лечения на количество кислорода в крови пациента (р = 0,000).

Таблица 23. Статистика парных выборок

Наблюдается Значимое изменения содержания кислорода как в целом за время лечения (р = 0,001). Так и внутри группы сравнения.

Вывод: - так как значение р-уровня <0,05, можно сделать вывод о статистически значимых различиях в уровне выраженности уровня насыщенности гемоглобина кислородом до и после лечения; - учитывая, что значение t-критерия отрицательное = -10,073 (по всем пациентам) и -11,441 (по группам сравнения), можно говорить о статистически значимом росте значений SpO2 после проведения лечения; то есть проведенное лечение оказалось эффективным, особенно значимое лечение - с применением ингаляционных смесей.

В этом примере дисперсионный анализ дает значимый результат (р = 0,003).

Данные по SpO2 также представлены на фиг.13а - Сводный результат по SpO2 (из расчета среднегрупповых показателей), сравнения по группам фиг.13б.

Таблица 32.

РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР

На фиг.14 представлены отрицательные и положительные пробы ПЦР по группам после окончания лечения.

На фиг.15 представлены сравнения результатов ПЦР по группам во время визитов 1-3.

Критерий результат ПЦР не дает достоверных отличий, очевидно, это связано с недостоверностью самого критерия определения эффективности (уровень ложно- отрицательных результатов равен 45%).

Общий (клинический) анализ крови с определением уровня лейкоцитов, лейкоцитарной формулы,

Таблица 33. Процентное содержание лимфоцитов

Таблица 34. Описательные статистики

Содержание лимфоцитов также отражено на фиг.16.

Приведенные данные достоверно показывают повышение эффективности лечения, в исследуемой группе по сравнению с контрольной группой. При этом среди групп сравнения наибольшая эффективность отмечается в группе «препарат «ТРИАВИР®».

Таблица 36. Уровень С-реактивного белка (СРВ) в сыворотке крови.

Таблица 37. Описательные статистики Таблица 38. ANOVA

Указанные данные также демонстрирует фиг.17.

Приведенные таблицы и фиг.17 достоверно показывают повышение эффективности лечения, в исследуемой группе по сравнению с контрольной группой. При этом среди групп сравнения наибольшая эффективность отмечается в группе «препарат «ТРИАВИР®».

Приведенные выше примеры однозначно свидетельствуют о промышленной применимости заявленного изобретения, так как показывают как воспроизводимость, так и реализацию назначения. При этом они достоверно подтверждают правомерность широты заявленных притязаний, так как согласно национальному законодательству для обоснования правомерности использованной заявителем степени обобщения при раскрытии существенного признака изобретения предоставляются сведения о частных формах реализации этого существенного признака. Выше представлено достаточное количество примеров осуществления изобретения, подтверждающих возможность получения указанного заявителем технического результата при использовании частных форм реализации существенного признака изобретения. Как было указано выше все корона вирусы имеют принципиальное сходство строения, механизма проникновения и жизнедеятельности. На основании национального законодательства может быть приведен один пример со ссылками на графические материалы. Приведенные примеры показывают возможность реализации изобретения с достижением технического результата и не должны служить для ограничения объема прав заявителя. Исходя из приведенного выше, следует, что существенным признаком изобретения, за счёт которого достигается технический результат, является использование препарата «ТРИАВИР» в виде ингаляций через небулайзер. При этом специалист может подобрать эффективное количество препарата, а также время его использования и периодичность, исходя из веса и состояния пациента. Приведенные выше сведения, как указывалось, получены на пациентах средней тяжести, не имеющих избыточной массы тела. Соответственно, для других групп пациентов частота использования и доза, а также длительность лечения может быть изменена на основании общих подходов, используемых в медицине.

Из приведенных сведений с достоверной очевидностью следует, что «ТРИАВИР» может быть применен как в комбинированной профилактики или терапии, так и в виде монотерапии для начальных и лёгких форм или монопрофилактики. Режимы введения и дозировки при комбинированном применении и монопременении будут подбираться специалистом, исходя из состояния пациента.

4. Краткое описание чертежей

На Фиг.1. представлены возрастные характеристики исследуемой популяции; на фиг.2 - весовые характеристики исследуемой популяции; на фиг.З - ростовые характеристики исследуемой популяции; на фиг.4 - характеристики ИМТ; на фиг.ба - Результаты КТ контрольной группы на Визите 1; на фиг.56 - Результаты КТ группы сравнения на Визите 1; на фиг.ба - Результаты КТ контрольной группы на Визите 4; на фиг.бб - Результаты КТ группы сравнения на Визите 4; на фиг.7а - Результаты КТ группы 2 на Визите 1; на фиг.7б - Результаты КТ группы 2 на Визите 4; на фиг. 8а - Результаты КТ группы 3 на Визите 1; на фиг. 86 - Результаты КТ группы 3 на Визите 1; на фиг. 9а - Результаты КТ группы 4 на Визите 1; на фиг. 96 - Результаты КТ группы 4 на Визите 4; на фиг. 10а - Результаты КТ группы 5 на Визите 1; на фиг. 106 - Результаты КТ группы 5 на Визите 4; на фиг. 11а - Диаграмма ствол-лист для группы 1,00 и 2,00; на фиг. 116 - Гистограмма для группа 1,00; на фиг. Ив - Гистограмма для группа 2,00; на фиг. Иг - Нормальный график Q-Q Визит1 для группа 1,00; на фиг. Ид - Нормальный график Q-Q Визит1 для группа 2,00; на фиг. Ие - Нормальный график Q-Q с удаленным трендом Визит 1 для группа 1,00 ; на фиг. Иж - Нормальный график Q-Q с удаленным трендом Визит 1 для группа 2,00; на фиг. 12а - Визит 4 Диаграмма ствол-лист для Группа = 1,00 и 2,00; на фиг. 126 - Гистограмма для группы 1,00; на фиг. 12в - Гистограмма для группы 2,00; на фиг. 12г - Нормальный график Q-Q с удаленным трендом Визит 4 для группы 1,00; на фиг. 12д - Нормальный график Q-Q с удаленным трендом Визит 4 для группы 2,00; на фиг. 12е - Нормальный график Q-Q с удаленным трендом Визит 4 для группы 1,00; на фиг. 12ж - Нормальный график Q-Q с удаленным трендом Визит 4 для группы 2,00; на фиг. 13а - Сводный результат по SP02 из расчета среднегрупповых показателей; на фиг. 136 Результаты пульсоксиметрии с измерением SP02 на фиг. 14а Контрольная группа Визит 1; на фиг.14б Контрольная группа Визит 2; на фиг.14в - Контрольная группа Визит 3; на фиг.14г - Контрольная группа Визит 4; на фиг. 15а - Группа сравнения Визит 1; на фиг. 156 - Группа сравнения Визит 2; на фиг. 15в - Группа сравнения Визит 3; на фиг. 15г - Группа сравнения Визит 3; на фиг. 16а - Среднее содержание лимфоцитов на Визит 1; на фиг. 166 - Среднее содержание лимфоцитов на Визит 2; на фиг. 16в - Среднее содержание лимфоцитов на Визит 3; на фиг. 16г - Среднее содержание лимфоцитов на Визит 4; на фиг. 17а - Среднее СРВ на Визит 1; на фиг.17б - Среднее СРВ на Визит 2;