Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung, welche Glycerin und zusätzlich ein Salz der Brenztraubensäure (Pyruvat) oder der Milchsäure (Lactat) enthält.

Wässerige Lösungen, welche Glycerin und Pyruvat oder Lactat enthalten, sind wichtige Ausgangsmaterialien für die Herstellung diverser Kosmetikprodukte. Das gilt auch für Glycerin, Pyruvat und Lactat als solche.

Durch Reduktion von Pyruvat gelangt man zu Milchsäure bzw. Lactat, welches über einen breiten Anwendungsbereich verfügt. Milchsäure wird z.B. auch als Säuerungsmittel in der Lebensmittelindustrie, als Entkalkungsmittel, pH-Regulator oder Reinigungsmittel in der chemischen Industrie, als Zusatz in Anti-Akne-Cremes oder Feuchtigkeitscremes in der kosmetischen Industrie sowie als Precursor für Acrylsäure oder Ethyllactat verwendet (Wee et al., 2006). Darüber hinaus kann Milchsäure auch zum Hautpeeling (Chemisches Peeling) eingesetzt werden (Smith, 1996). Die bifunktionelle Milchsäure lässt sich des Weiteren auch polymerisieren, wobei Polylactid (PLA), ein bioabbaubarer und biokompatibler Kunststoff, entsteht, der Anwendungen in der Verpackungsindustrie, Textilindustrie, im Elektronik- sowie im Medizinbereich hat (Balla et al., 2021).

In den letzten Jahren hat sich das Interesse auf Prozesse verlagert, welche hochselektive Umsetzungen mittels Enzymkaskadenreaktionen nutzen, um Zielchemikalien in einem Schritt (Eintopf oder One-Pot) zu erhalten. Die EP2700714A1, die US8859247B2 und die EP2204453B1 beschreiben ein Portfolio an Kaskadenreaktionen, in welcher Glucose in einer Kaskade aus fünf enzymatischen Umsetzungen zu zwei Molekülen Pyruvat umgewandelt wird. Von Glucose ausgehend folgt die Kaskade dem nicht- phosphorylierenden Entner-Doudoroff-Pfad zu D-Glyceraldehyd und Pyruvat (Zuckeroxidation, Dehydratisierung und Aldolspaltung). D-Glyceraldehyd wird danach weiter zu D-Glycerat oxidiert und anschließend zu Pyruvat dehydratisiert. Dieses dient dann als Plattform für weitere Transformationen zu einer Reihe an Aminosäuren und Alkoholen. Die Enzyme der Kaskade umfassen dabei eine Glucose- Dehydrogenase, eine promiskuitive Dihydroxysäure-Dehydratase (katalysiert Dehydratisierungen von Gluconat und D-Glycerat), eine 2-Keto-3-deoxygluconat-Aldolase und eine Aldehyd-Dehydrogenase. Bei Verwendung einer ebenfalls promiskuitiven Dehydrogenase, welche sowohl Glucose als auch D-Glyceraldehyd als Substrat akzeptiert, kann das System auf drei Enzyme minimiert werden.

Der in der EP2700714A1 beschriebene Prozess zur Bildung von Pyruvat aus Glucose wurde von Sutiono et al. aufgegriffen und um Glycerin als Startmaterial erweitert. Die Umwandlung von Glucose zu zwei Molekülen Pyruvat erfolgt in fünf Schritten (siehe vorhergehender Absatz). Glycerin muss zuerst zu D-Glyceraldehyd oxidiert werden, welches dann in zwei Schritten zu Pyruvat umgewandelt wird. Das Hauptaugenmerk dieser Studie lag in der Charakterisierung einer promiskuitiven Dehydratase aus Paralcaligenes ureilyticus, welche sowohl die Dehydratisierung von Gluconat als auch von D-Glycerat ermöglicht. Mit einer Enzymkaskade, welche die besagte Dehydratase beinhaltet, konnten 25 mM Glucose (4,5 g/l) in Gegenwart von 5 mM NAD ⁺ zu ca. 45 mM Ethanol (= 90% Umsatz) innerhalb von 12 h umgewandelt werden (Sutiono et al., 2020).

Durch Reduktion von D-Glyceraldehyd gelangt man zu Glycerin. Aus Glycerin lassen sich wertvolle Folgeprodukte, wie z.B. 1,3-Propandiol, welches in der Synthese von Polymeren, bei der Herstellung von Kosmetika oder in Schmierstoffen Anwendung findet, oder Acrolein (2-Propenal), einen Ausgangsstoff für Acrylsäure oder deren Ester, herstellen. Glycerin selbst wird z.B. in Kosmetika, Lebensmittel und Pharmazeutika eingesetzt.

Glycerin und Milchsäure dienen ferner als Ausgangsstoffe für die Synthese von Glycerin-Lactat-Ester (wie Glycerintrilactat), die als Nahrungsergänzungsmittel während körperlicher Betätigung und anschließender Regeneration eingesetzt werden können, da Milchsäure als Energiequelle für Herz und Skelettmuskel dient (US 6743821 B2).

Wie oben bereits angeführt, finden sowohl Glycerin als auch Milchsäure (und zum Teil auch Brenztraubensäure) Anwendung in Kosmetikprodukten, wie z.B. Hautpeelings (Smith, 1996; Prestes et al., 2013; Ghersetich et al., 2004; O'Connor et al., 2018) oder Salben (Apotheke des Universitätsklinikums Heidelberg, 2015). Zur Herstellung solcher Produkte werden die einzelnen Reinstoffe miteinander vermischt.

Glycerin kann durch Hydrolyse von Triglyceriden mit Alkalilaugen (Verseifung) oder Wasser hergestellt werden (Tan et al., 2013; Rodrigues et al., 2017). Des Weiteren sind aber auch fermentative Verfahren zur Herstellung von Glycerin (z.B. ausgehend von Glucose oder Saccharose) bekannt (z.B. Wang et al., 2001; Aslankoohi et al., 2015; US 8129170 Bl).

Großtechnisch fällt Glycerin hauptsächlich als Nebenprodukt der Biodiesel-Herstellung an, bei der Fette und Öle mit Methanol umgesetzt werden und dabei Fettsäuremethylester und Glycerin bilden (Tan et al., 2013; Rodrigues et al., 2017).

Die Verwendung von Methanol hat einen prinzipiellen Nachteil: es wird heutzutage zu einem großen Teil aus Erdgas (ca. 65%) und Erdöl (ca. 35%) produziert, also aus nicht erneuerbaren Kohlenstoffquellen. Nur ca. 0,2% stammt aus erneuerbaren Ressourcen (IRENA & METHANOL INSTITUTE, 2021). Die heutige großtechnische Herstellung von Glycerin ist also auf den Verbrauch nicht erneuerbarer Kohlenstoffquellen angewiesen.

Aus Liepins et al. (2006) sind Enzyme zur NADPH-abhängigen Reduktion von Dihydroxyaceton und D- bzw. L-Glyceraldehyd bekannt.

Aus der kürzlich (2022) erschienenen Publikation von Wang et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, 106(9-10)) ist bekannt, aus Glycerin und Glucose auf biosynthetischem Weg L-Lactat herzustellen. Zur Regenerierung von NADH aus NAD ⁺ , welches zur Reduktion von Pyruvat gebraucht wird, empfehlen Wang et al. eine Formiat-Dehydrogenase.

Im Stand der Technik ist somit kein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend Glycerin und ein Salz der Brenztraubensäure (Pyruvat) oder der Milchsäure (Lactat) bekannt, welches von erneuerbaren Rohstoffen ausgeht und in einem einzigen Biosynthese-Schritt (One-Pot Biosynthesis) zu den gewünschten Produkten führt.

Genau hier setzt nun die vorliegende Erfindung an und setzt sich zur Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend Glycerin und ein Salz der Brenztraubensäure oder der Milchsäure, wie es zum Beispiel in der Kosmetikindustrie gebraucht wird, zur Verfügung zu stellen, welches ausschließlich von einer erneuerbaren Kohlenstoffquelle ausgeht und darüber hinaus auch als „vegan" bezeichnet werden kann, was insbesondere bei der Anwendung der wässerigen Lösung in der Kosmetikindustrie von Bedeutung ist. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem ein Salz der Gluconsäure und/oder der Galactonsäure, in einer wässerigen, Alkohol-hältigen Lösung in vitro mit einem Enzymsystem, welches eine Dehydratase, eine Aldolase, eine Alkoholdehydrogenase samt Kofaktor, eine Glyceraldehyd- Reduktase samt Kofaktor und gegebenenfalls eine Lactat-Dehydrogenase samt Kofaktor umfasst, behandelt wird, wodurch eine Glycerin und ein Salz der Brenztraubensäure oder der Milchsäure haltige wässerige Lösung erhalten wird, aus welcher das Enzymsystem abgetrennt und welche gegebenenfalls aufkonzentriert wird.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird somit der Kofaktor der Alkoholdehydrogenase mit einem Alkohol, insbesondere einem Ci-4-Alkohol, bevorzugt Isopropanol, regeneriert. Es hat sich überraschend gezeigt, dass die Regenerierung des Kofaktors mit einem Alkohol wesentlich ist, die Aufgabe der Erfindung zu lösen. Eine Regenerierung mit Formiat führt nicht zum Ziel (siehe untenstehendes Vergleichsbeispiel).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der beiliegenden Figur 1 schematisch dargestellt. Zur Regenerierung des Kofaktors NADPH bzw. NADH wird eine Alkoholdehydrogenase eingesetzt, wobei auch zwei verschiedene Alkoholdehydrogenasen eingesetzt werden können.

In dieser Patentanmeldung werden die Begriffe D-Glucose austauschbar mit Glucose, D-Gluconat austauschbar mit Gluconat, Gluconat austauschbar mit Gluconsäure, D-Galactonat austauschbar mit Galactonat, Galactonat austauschbar mit Galactonsäure, D-Glycerinaldehyd austauschbar mit D-Glyceraldehyd bzw. Glyceraldehyd sowie Milchsäure austauschbar mit Lactat verwendet.

Gluconsäure (bzw. deren Anion Gluconat) ist eine von der Glucose abstammende Zuckersäure, die eine wichtige Industriechemikalie darstellt. Glucose wiederum kommt in gebundener Form (Cellulose) in Biomasse vor und ist das häufigste Monosaccharid in der Natur. Generell enthalten Strohe, Hölzer oder Abfallprodukte aus der Lebensmittelindustrie, wie Getreide-Spreu (z.B. Hafer-Spelzen) Cellulosen und Hemicellulosen, aus welchen Monomer-Zucker in wechselnder Zusammensetzung freigesetzt werden können, vornehmlich die Hexosen Glucose, Mannose und Galactose, die Pentosen Xylose und Arabinose, sowie von den Zuckern abgeleitete Säuren (z.B. Glucuronsäure). In Mais-Hüllen beispielsweise findet man, bezogen auf den Gesamtzucker, 64% Glucose, 4% Galactose, 2% Mannose, 10% Arabinose und 16% Xylose (Hromädkovä & Ebringerovä, 1995), in Weizenstroh hingegen sind es 56% Glucose, 1% Galactose, 2% Mannose, 5% Arabinose und 30% Xylose (Collins et al., 2014). Methoden zur effizienten Trennung der Cs- und C ₅ -Zucker erlauben es, diese Stoffstromtypen getrennt voneinander weiter zu behandeln (z.B. WO 2011/014894).

Gluconat ist durch Oxidation an der Ci-Position der Glucose chemisch leicht zugänglich. Die fermentative Herstellung von Gluconat mittels Aspergillus niger oder Gluconobacter oxydans stellt die wichtigste Technik dar. Gluconat kann aber auch enzymatisch unter Verwendung der Glucose-Oxidase aus Glucose gewonnen werden, wobei Luftsauerstoff als Oxidationsmittel dient. Das entstehende Wasserstoffperoxid ist schädlich für das eingesetzte Enzym und muss daher z.B. durch den Einsatz von Katalase entfernt werden (Kornecki et al., 2020). In Organismen ist Gluconat ein wichtiges Intermediat im sogenannten Entner-Doudoroff-Weg (ED- Weg), bei dem ausgehend von Glucose zwei Pyruvat-Moleküle und ein Adenosintriphosphat-Molekül (ATP) gebildet werden. Die genaue Ausprägungsform des ED-Wegs hängt vom Mikroorganismus ab, er tritt beispielsweise in Bakterien wie Escherichia coli auf. Für Archaeen sind weitere Abwandlungen wie der nicht-phosphorylierende, semi-phosphorylierende oder verzweigte ED-Weg bekannt. Der Kernschritt in allen Wegen ist die Aldolspaltung einer Cg-Zuckersäure (2-Keto-3-deoxygluconat bzw. 2- Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat je nach Mikroorganismus) in zwei Ca-Produkte (Pyruvat und Glycerinaldehyd bzw. Glycerinaldehyd-3-phosphat) (Entner & Doudoroff, 1952; Conway, 1992; Peekhaus & Conway, 1998; Reher et al., 2010; Sutter et al., 2016).

Im ED-Weg wird das Intermediat D-Glyceraldehyd ausschließlich zur D-Glycerinsäure oxidiert, welches dann über mehrere Schritte weiter zum Pyruvat umgewandelt wird. Pyruvat ist ein zentrales Intermediat im zellulären Stoffwechsel und als solches ein wichtiger Ausgangsstoff für die Herstellung von Alkoholen, Aminosäuren oder 2,3-Butandiol (Sutiono et al., 2020), was den ED-Weg für biosynthetische Anwendungen interessant macht. Pyruvat kann aber auch zur Behandlung von Sonnen-geschädigter Gesichtshaut in Form von Peelings eingesetzt werden (Ghersetich et al., 2004).

Durch die Promiskuität der Enzyme des Entner-Doudoroff-Weges kann nicht nur Glucose, sondern auch Galactose (das C4-Epimer) von denselben Enzymen zu Pyruvat und D-Glyceraldehyd umgewandelt werden. Dies ist sehr gut für das hyperthermophile Archaeon Sulfolobus solfataricus belegt (Lamble et al., 2003; Theodossis et al., 2004).

Die erfindungsgemäß hergestellten Lösungen können als Basis für die Herstellung von diversen Kosmetikprodukten dienen und basieren vollständig auf erneuerbaren Rohstoffen (Cg-Zuckersäuren, zum Beispiel gewonnen aus in Biomasse vorkommenden Monosacchariden) und sind darüber hinaus vegan. Somit umgeht das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung von Methanol aus fossilen Rohstoffen zur Herstellung von Glycerin.

Es hat sich ferner Überaschenderweise gezeigt, dass die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann, wenn die Umsetzung in vitro durchgeführt wird, wenn also die Enzyme als solche in der wässerigen Lösung enthalten sind. Es muss nicht fermentativ gearbeitet werden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Umsetzung auch bei nichtphysiologischen Bedingungen, wie etwa hohen Substratkonzentrationen, vorgenommen werden kann, also bei Konzentrationen, unter denen ein fermentatives Verfahren gar nicht arbeiten könnte.

Der Begriff „Enzymsystem" bezeichnet die Gesamtheit der eingesetzten Enzyme, also die Dehydratase, die Aldolase, die Glyceraldehyd-Reduktase samt Kofaktor, die Lactat-Dehydrogenase samt Kofaktor sowie eine Alkoholdehydrogenase samt Kofaktor, zum Beispiel eine NAD-spezifische Alkoholdehydrogenase und/oder eine NADP-spezifische Alkoholdehydrogenase. Diese Enzyme samt den Kofaktoren können zum Beispiel als solche (Enzymisolate) der wässerigen Lösung zugegeben werden. Es ist jedoch auch möglich, Zellen, welche die angegebenen Enzyme exprimieren, in der wässerigen Lösung zu suspendieren. Je nach Reaktionsbedingungen bleiben die Zellen intakt oder platzen auf und geben das Enzym in die wässrige Umgebung ab. Bei Vorliegen von intakten Zellen diffundieren die Substrate in die Zelle, wo sie vom Enzym umgesetzt werden, und die Produkte im Anschluss wieder heraus. In diesem Fall wird unter dem Begriff „Enzymsystem" eine Zellsuspension verstanden. Ferner ist unter dem Begriff „Enzymsystem" ein Homogenat zu verstehen, welches aus der Zellsuspension erhalten werden kann, indem die Zellen z.B. Ultraschall ausgesetzt werden, um sie zum Platzen zu bringen. Schließlich sind unter dem Begriff „Enzymsystem" auch Lysate zu verstehen, die aus den Homogenaten erhalten werden, indem die festen Zellbestandteile abgetrennt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird ein Alkalisalz, insbesondere das Natriumsalz oder das Kaliumsalz der Gluconsäure und der Galactonsäure eingesetzt.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Konzentration des Alkalisalzes der Gluconsäure und/oder der Galactonsäure in der wässerigen Lösung zwischen 50 und 350 g/l, 150 und 300 g/l und noch mehr bevorzugt zwischen 150 und 250 g/l.

Zusätzlich ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 °C, zwischen 25 und 40 °C und noch mehr bevorzugt zwischen 30 und 40 °C durchgeführt wird.

Der besonders bevorzugte pH-Bereich der Reaktion liegt zwischen 7,5 und 8,5.

Bei einer weiteren, bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die das Enzymsystem bildenden Enzyme in einer Suspension, im Homogenat und/oder im Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vor. Es hat sich gezeigt, dass bei Verwendung von Suspensionen, Lysaten und/oder Homogenaten die Kofaktoren der Dehydrogenasen und Reduktasen nicht extra zugesetzt werden müssen, weil sie in der Suspension, im Lysat und/oder im Homogenat bereits enthalten sind.

Suspension bedeutet in diesem Kontext eine Suspension von resting cells. Diese werden nach der Kultivierung geerntet (vom Nährmedium abgetrennt) und in einem geeigneten Puffersystem suspendiert. Im Gegensatz zu fermentativen Verfahren, bei denen auch mit ganzen Zellen gearbeitet wird, können die resting cells aufgrund der Entfernung von Kohlenstoff-Quellen und Nährstoffen nicht mehr wachsen, sondern dienen nur der Umsetzung von Substraten (Lin & Tao, 2017). Homogenat steht in diesem Kontext für eine physikalisch und/oder chemisch behandelte Suspension (z.B. mittels Druckes, Lysozym oder Ultraschall behandelt), wobei die Zellbestandteile aus den Zellen freigesetzt werden. Ein Lysat wird erhalten, wenn die unlöslichen Zellbestandteile des Homogenats beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden (siehe Produktion Enzyme für Details).

In einer weiteren Variante können die Enzyme auch in Pulverform vorliegen, in oder auf einem festen Trägermaterial immobilisiert sein oder Teil eines Fusionsproteins sein.

Um die Umsetzung beider Cg-Zuckersäuren zu ermöglichen, wird natürliche Enzympromiskuität genutzt, die es erlaubt, mit einem Enzym bis zu zwei Zielreaktionen zu katalysieren, um die Enzymkaskade zu minimieren.

Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung finden alle Reaktionsschritte des Verfahrens sowie die Regeneration der Kofaktoren in einem einzigen Reaktionsgefäß statt (Eintopfreaktion), d.h. es wird die kostenintensive Isolierung der Intermediate vermieden. In der bevorzugten Ausführungsform werden alle Enzyme zu Beginn der Reaktion eingesetzt.

Die Umwandlung von Gluconat über (4S,5R)-4,5,6-Trihydroxy-2-oxohexanoat (2-Keto-3-deoxygluconat = KDG) bzw. Galactonat über (4R,5R)-4,5,6-Trihydroxy-2-oxohexanoat (2-Keto-3-deoxygalactonat = KDGal) zu Pyruvat und D-Glyceraldehyd umfasst dabei eine Dehydratase und eine Aldolase.

Die im Verfahren verwendete Dehydratase kann aus einer der Gruppen EC 4.2.1.5 (Arabonat- Dehydratase), 4.2.1.6 (Galactonat-Dehydratase), 4.2.1.7 (Altronat-Dehydratase), 4.2.1.8 (Mannonat- Dehydratase), 4.2.1.9 (Dihydroxysäure-Dehydratase), 4.2.1.25 (L-Arabonat-Dehydratase), 4.2.1.39 (Gluconat-Dehydratase), 4.2.1.40 (Glucarat-Dehydratase), 4.2.1.42 (Galactarat-Dehydratase), 4.2.1.67 (D-Fuconat-Dehydratase), 4.2.1.68 (L-Fuconat-Dehydratase), 4.2.1.82 (Xylonat-Dehydratase), 4.2.1.140 (Gluconat/Galactonat-Dehydratase), 4.2.1.146 (L-Galactonat-Dehydratase), 4.2.1.156 (L-Talarat- Dehydratase), 4.2.1.158 (Galactarat-Dehydratase, D-threo-bildend) und 4.2.1.176 (L-Lyxonat- Dehydratase) stammen, wobei die Gruppe 4.2.1.25 (L-Arabonat-Dehydratase) besonders bevorzugt ist.

Die im Verfahren verwendete Aldolase kann aus einer der Gruppen EC 4.1.2.18 (2-Dehydro-3-deoxy-L- pentonat-Aldolase), 4.1.2.20 (2-Dehydro-3-deoxyglucarat-Aldolase), 4.1.2.21 (2-Dehydro-3-deoxy-6- phosphogalactonat-Aldolase), 4.1.2.28 (2-Dehydro-3-deoxy-D-pentonat-Aldolase), 4.1.2.29 (5- Dehydro-2-deoxyphosphogluconat-Aldolase), 4.1.2.51 (2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconat-Aldolase), 4.1.2.52 (4-Hydroxy-2-oxoheptandioat-Aldolase), 4.1.2.53 (2-Keto-3-deoxy-L-rhamnonat-Aldolase), 4.1.2.54 (L-threo-3-Deoxy-hexylosonat-Aldolase), 4.1.2.55 (2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconat/2- Dehydro-3-deoxy-6-phosphogalactonat-Aldolase) sowie 4.1.3.39 (4-Hydroxy-2-oxovalerat-Aldolase) stammen, wobei die Gruppe 4.1.2.55 (2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconat/2-Dehydro-3-deoxy-6- phosphogalactonat-Aldolase) besonders bevorzugt ist.

Die zur Reduktion von D-Glyceraldehyd verwendete Reduktase (Glyceraldehyd-Reduktase) stammt bevorzugt aus der Gruppe der D-Xylose-Reduktasen (EC 1.1.1.307).

Die zur Reduktion von Pyruvat zu Lactat verwendeten Dehydrogenase stammt aus der Gruppe EC 1.1.1.27 (L-Lactat-Dehydrogenase).

Die zur Regenerierung der Kofaktoren eingesetzten Alkoholdehydrogenasen stammen bevorzugt aus den Gruppen EC 1.1.1.1 (NAD-abhängige ADH) oder EC 1.1.1.2 (NADP-abhängige ADH).

Die hier vorgestellte enzymatische Strategie minimiert die Anzahl der Enzyme und erlaubt somit einen hocheffizienten und kostengünstigen/preislich kompetitiven Bioproduktionsprozess.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine wässrige Lösung umfassend Glycerin und ein Salz der Brenztraubensäure oder der Milchsäure erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.

Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung noch näher beschrieben.

Materialien

Natrium-Gluconat, 2-Keto-3-deoxygluconsäure-Lithium-Salz, D-Glyceraldehyd, Natrium-Pyruvat, Natrium-L-Lactat, Zinkchlorid, IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) sowie HEPES (2-(4-(2- Hydroxyethyl)-l-piperazinyl)-ethansulfonsäure) wurden von Sigma-Aldrich, Glycerin, Magnesiumchlorid-Hexahydrat, Kaliumdihydrogenphosphat, di-Kaliumhydrogenphosphat, NAD ⁺ , NADH-Dinatriumsalz, NADP ⁺ -Dinatriumsalz sowie Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Carl Roth, NADPH-Tetranatriumsalz, Lysozym sowie Methanol wurden von PanReac AppliChem (ITW Reagents) und Triethanolamin wurde von Chem-Lab NV bezogen. Kalium-D-Galactonat wurde gemäß Literaturvorschrift (Moore & Link, 1940) aus Galactose hergestellt. Produktion der Enzyme

Für die rekombinante Enzymproduktion in einem Escherichia co//-Stamm wurde zunächst das zu exprimierende Gen in einer PCR unter der Verwendung der genomischen DNA oder deren synthetisch an die Codon-Verwendung von E. coli angepasstes Äquivalent als Matrize zusammen mit spezifischen Oligonukleotiden, die zusätzlich Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen tragen, amplifiziert und aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Nach dem Nukleinsäure-Verdau mit den Restriktionsenzymen Sphl und Hindlll wurde das für das Target-Enzym kodierende Genfragment in das mit Sphl und Hindlll geschnittene Rückgrat des Expressionsvektors pQE70-Kan ligiert. Das Ligationsprodukt wird in chemisch kompetente E. co//-Zellen ToplOF transformiert und die entstandenen Kolonien wurden für die Plasmid-Isolierung und Restriktionsanalyse benutzt.

Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA- Sequenzierung überprüft. Das resultierende Konstrukt trägt das Target-Gen unter dem IPTG- induzierbaren T5-Promotor.

Für die Überexpression des Enzymes in E. coli wurde das resultierende Expressionsplasmid in die kompetenten Expressionszellen RB791 transformiert. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden entstandene Kolonien für die Expressionstests in LB-Medium angeimpft.

Am nächsten Tag wurden damit Expressionskulturen mit einer optische Dichte OD550 von 0,02 angeimpft und bei 37 °C geschüttelt, bis eine OD550 von 0,3 erreicht wurde. Anschließend wurde die Temperatur auf 25 °C gesenkt und die Kulturen wurden beim Erreichen einer OD550 von 0,5 mit 0,1 mM IPTG induziert. Nach 22 h wurden die Kulturen geerntet (vom Medium mittels Zentrifugation in Form eines Zellpellets abgetrennt) und auf die Expression des rekombinanten Enzymes mit Hilfe von SDS- Gelelektrophorese und einer Aktivitätsbestimmung (Verwendung in Use-Test oder optischenzymatischer Assay) analysiert.

Herstellung von Zell-Suspensionen

Zur Herstellung von Zell-Suspensionen wurden die nach obigen Verfahren hergestellten Zellpellets in einem geeigneten Gefäß eingewogen und mit Puffer versetzt (z.B. Triethanolamin (TEA)-HCI-Puffer) und unter Rührung im Eisbad gelöst. Der Massenanteil an Biomasse beträgt üblicherweise 20%, der Rest entfällt auf den Puffer.

Herstellung von Homogenaten mittels Sonifier-Aufschlusses

Der oben hergestellten Zell-Suspension wurde Lysozym in einer Menge von 0,5 mg/ml zugefügt. Zum Zell-Aufschluss wurde ein Branson Sonifier 450 verwendet. Die Suspension wurde in ein 5 ml Eppendorf-Vial überführt. Die Metallspitze des Apparats wurde nun in die Suspension getaucht, danach wurde die Suspension dreimal mit je 15 Ultraschall-Stößen (Einstellungen am Gerät: Timer = 15; Duty Cycle = 50; Output Control = 3 - 5) behandelt. Auf diese Weise wurde das Homogenat als Mischung von aufgeschlossenen Zellen und Puffer erhalten.

Herstellung von Lysaten durch Zentrifugation

Das Homogenat wurde 10 min lang bei 4 °C und 16000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5417R), um die unlöslichen Zellfragmente abzutrennen und das Lysat zu erhalten. Tabelle 1. Enzymtypen und Spenderorganismen für die verwendeten Enzyme.

Analytische Methoden

High Performance Anion Exchange Chromatography

Substrat-Umsätze und Produkt-Konzentrationen wurden durch HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) ermittelt. Dazu wurde ein Dionex ICS6000 System mit AS-AP Autosampler verwendet. Die Messung der organischen Säuren bzw. deren Anionen (Gluconat, KDG, KDGal, Pyruvat und Lactat) erfolgte mittels Leitfähigkeitsdetektion (CD) gekoppelt an einen Dionex AERS 500 elektrolytisch regenerierten Suppressor im externen Wassermodus. Zur Trennung der Analyten wurde eine Dionex lonPac ASll-HC-4pm Säule mit entsprechender Vorsäule sowie einem NaOH-Gradienten verwendet. Das Laufmittel wurde zusätzlich mit einer Dionex ATC Anion Trap Column vorbehandelt.

High Performance Liquid Chromatography

Zur Quantifizierung von D-Glyceraldehyd und Glycerin mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) wurde ein Agilent HPLC 1260 Infinity II Series System verwendet. Detektion erfolgt mittels eines Brechungsindex-Detektors (Rl-Detektion). Zur Messung wird eine Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) Säule mit entsprechender Vorsäule verwendet und mit 1 mM Schwefelsäure isokratisch eluiert.

Bestimmung von Enzym-Aktivitäten (optisch-enzymatischer Assay)

Enzym-Aktivitäten in den Homogenaten bzw. Lysaten wurden mit einem Shimadzu UV-1900 Spektrophotometer bestimmt. Dazu wurde die Bildung bzw. der Verbrauch von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm über die Änderung der Absorption verfolgt. Die Messungen wurden mit 0,2 mM Kofaktor (NAD ⁺ oder NADH) durchgeführt. Dazu wurden 20 pl einer 10 mM Stock-Lösung des Kofaktors in einer Küvette (Greiner bio-one Semi-Micro-Küvette aus Polystyrol) vorgelegt und der gewünschte pH-Wert wurde mit 100 mM TEA-HCl-Puffer eingestellt (870 pl). Nach Temperieren der Küvette wurden 10 pl Homogenat bzw. Lysat (verdünnt oder unverdünnt) und 100 pl Substrat-Lösung zugesetzt und die Messung unmittelbar danach gestartet. Die Messungen wurden standardmäßig bei 25 °C durchgeführt. Über den Extinktionskoeffizienten von NADH bei 340 nm (E = 6220 L mol ¹ cm ¹ ) kann die Enzym-Aktivität des Lysats in U/ml (bezogen auf das Volumen des Lysats) bzw. U/g (bezogen auf die zur Herstellung eingesetzte Biomasse) bestimmt werden. 1 U steht dabei für 1 pmol Substratumsatz pro Minute (1 U = 1 pmol/min = l,67-10 ^_8 kat).

Allgemeines zur Aufarbeitung der Reaktionslösung

Die erfindungsgemäß hergestellte Glycerin- und Lactat-hältige bzw. Glycerin- und Pyruvat-hältige wässrige Lösung wird erhalten, indem nach Beendigung der Reaktion die Zellbestandteile durch Denaturieren (z.B. durch Einwirkung von Wärme) und anschließender Filtration bzw. Zentrifugation entfernt werden. Zur Entfernung von kleineren Zellbestandteilen kann zusätzlich eine Membranfiltration durchgeführt werden. Das so erhaltene Filtrat kann nun beispielsweise durch Verdampfung des Wassers zur gewünschten Konzentration aufkonzentriert (z.B. auf 250 g/l Glycerin oder Lactat) werden.

Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens noch näher beschrieben. Die in diesen Beispielen eingesetzten Suspensionen, Homogenate und Lysate wurden nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt.

Beispiel 1

Umsetzung von Natrium-Gluconat zu Pyruvat und Glycerin

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vorgelegt: 25 pl eines 2000 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5), 143 pl deionisiertes Wasser, 80 pl Dehydratase-Lysat, 80 pl Aldolase-Lysat, 2 U D-Xylose-Reduktase-Lysat sowie 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NADP-spezifisch). Durch Zugabe von 100 pl einer Natrium-Gluconat-Lösung (2296 mM) wurde die Reaktion gestartet. Zur Kofaktor- Regeneration wurden 50 pl Isopropanol zugesetzt. Der Ansatz wurde insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. 26 h nach Start der Reaktion wurden 100 pl einer Isopropanol/Wasser-Mischung (3/7 v/v) zum Ansatz zugesetzt. Das Gesamtvolumen des Ansatzes bei Start der Reaktion betrug 500 pl.

Zur Aufarbeitung wurden 20 pl des Ansatzes mit 180 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurde die Probe 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt. Zusätzlich zu den in der Tabelle angeführten Produkten werden auch die Intermediate KDG und KDGal detektiert.

Der obenstehenden Tabelle kann entnommen werden, dass Gluconat vom Enzymsystem zu Glycerin und Pyruvat umgesetzt wird.

Beispiel 2

Umsetzung von Natrium-Gluconat zu Lactat und Glycerin

In einem 2 ml Glas-Vial (Vial 1) wurden folgende Komponenten vorgelegt: 25 pl eines 2000 mM TEA- HCI-Puffers (pH 8,5), 172 pl deionisiertes Wasser, 80 pl Dehydratase-Lysat, 80 pl Aldolase-Lysat, 2 U D-Xylose-Reduktase-Lysat, 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NADP-spezifisch), 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NAD-spezifisch) sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. In einem weiteren 2 ml Glas-Vial (Vial 2) wurde eine ähnliche Mischung, allerdings mit 122 pl (Vial 2) deionisiertem Wasser, vorgelegt.

Durch Zugabe von 50 pl einer Natrium-Gluconat-Lösung (2296 mM) zu Vial 1 (Vial 2: 100 pl) wurden die Reaktionen gestartet. Zur Kofaktor-Regeneration wurden je 50 pl Isopropanol zugesetzt. Die Ansätze wurden insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. 26 h nach Start der Reaktion wurden je 100 pl einer Isopropanol/Wasser- Mischung (3/7 v/v) zu den Ansätzen zugesetzt. Das Gesamtvolumen der Ansätze bei Start der Reaktion betrug je 500 pl.

Zur Aufarbeitung wurden x pl des Ansatzes mit y pl Reinstwasser (x = 40, y = 160 für Vial 1; x = 20, y = 180 für Vial 2) und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.

Zusätzlich zu den in der Tabelle angeführten Produkten werden auch die Intermediate KDG und KDGal detektiert. Den obenstehenden Tabellen kann entnommen werden, dass das Verfahren auch für den Umsatz einer konzentrierteren Substrat-Lösung (459 mM) geeignet ist.

Beispiel 3

Einfluss von verschiedenen Enzym-Formulierungen (Suspension, Homogenat bzw. Lysat) auf die Umsetzung von Natrium-Gluconat zu Lactat und Glycerin

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vorgelegt: 25 pl eines 2000 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5), 130 pl deionisiertes Wasser, 80 pl Dehydratase-Formulierung (siehe nachfolgende Tabellen), 80 pl Aldolase-Formulierung, 2 U D-Xylose-Reduktase-Formulierung, 2 U Alkoholdehydrogenase-Formulierung (NADP-spezifisch), 2 U Alkoholdehydrogenase-Formulierung (NAD-spezifisch) sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. Durch Zugabe von je 100 pl einer Natrium- Gluconat-Lösung (1145 mM) wurden die Reaktionen gestartet. Zur Kofaktor-Regeneration wurden je 50 pl Isopropanol zugesetzt. Die Ansätze wurden insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. 26 h nach Start der Reaktion wurden je 100 pl einer Isopropanol/Wasser-Mischung (3/7 v/v) zu den Ansätzen zugesetzt. Das Gesamtvolumen der Ansätze bei Start der Reaktion betrug je 500 pl.

Zur Aufarbeitung wurden 40 pl des Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC-Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.

Zusätzlich zu den in der Tabelle angeführten Produkten werden auch die Intermediate KDG und KDGal sowie Pyruvat detektiert.

Den obenstehenden Tabellen kann entnommen werden, dass unterschiedliche Enzym-Formulierungen (Suspensionen, Homogenate und Lysate) für das Enzym-System verwendet werden können. Den größten Umsatz erhält man, wenn alle Enzyme in Form von Lysaten zugesetzt werden.

Beispiel 4

Einfluss von Kofaktor-Zusatz (NAD ⁺ und NADP ⁺ ) auf die Umsetzung von Natrium-Gluconat zu Lactat und Glycerin

In einem 2 ml Glas-Vial (Vial 1) wurden folgende Komponenten vorgelegt: 25 pl eines 2000 mM TEA- HCI-Puffers (pH 8,5), 130 pl deionisiertes Wasser, 80 pl Dehydratase-Lysat, 80 pl Aldolase-Lysat, 2 U D-Xylose-Reduktase-Lysat, 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NADP-spezifisch), 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NAD-spezifisch) sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. In einem zweiten 2 ml Glas-Vial wurde eine ähnliche Mischung, allerdings mit 10 pl einer 10 mM NAD ⁺ -Lösung, 10 pl einer 10 mM NADP ⁺ -Lösung sowie 110 pl statt 130 pl deionisiertes Wasser, vorgelegt.

Durch Zugabe von je 100 pl einer Natrium-Gluconat-Lösung (1145 mM) zu beiden Glas-Vials wurden die Reaktionen gestartet. Zur Kofaktor-Regeneration wurden je 50 pl Isopropanol zugesetzt. Die Ansätze wurden insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. 26 h nach Start der Reaktion wurden je 100 pl einer Isopropanol/Wasser- Mischung (3/7 v/v) zu den Ansätzen zugesetzt. Das Gesamtvolumen der Ansätze bei Start der Reaktion betrug je 500 pl.

Zur Aufarbeitung wurden 40 pl des Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC-Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.

Zusätzlich zu den in der Tabelle angeführten Produkten werden auch die Intermediate KDG und KDGal sowie Pyruvat detektiert.

Den obenstehenden Tabellen kann entnommen werden, dass die Zugabe von Kofaktor (0,2 mM NAD ⁺ und 0,2 mM NADP ⁺ ) bei einer Natrium-Gluconat-Konzentration von 229 mM keine Vorteile bezüglich des Umsatzes mit sich bringt, da bereits ausreichend Kofaktor aus den eingesetzten Lysaten vorliegt. Bei höheren Substrat-Konzentrationen kann allerdings ein Kofaktor-Zusatz notwendig sein.

Beispiel 5

Umsetzung von Kalium-Galactonat zu Pyruvat und Glycerin

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vorgelegt: 25 pl eines 2000 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5), 147 pl deionisiertes Wasser, 80 pl Dehydratase-Lysat, 80 pl Aldolase-Lysat, 2 U D-Xylose-Reduktase-Lysat sowie 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NADP-spezifisch). Durch Zugabe von 100 pl einer Kalium-Galactonat-Lösung (1282 mM) wurde die Reaktion gestartet. Zur Kofaktor- Regeneration wurden 50 pl Isopropanol zugesetzt. Der Ansatz wurde insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. 26 h nach Start der Reaktion wurden 100 pl einer Isopropanol/Wasser-Mischung (3/7 v/v) zur Probe zugesetzt. Das Gesamtvolumen des Ansatzes bei Start der Reaktion betrug 500 pl.

Zur Aufarbeitung wurden 40 pl des Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurde die Probe 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC-Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.

Zusätzlich zu den in der Tabelle angeführten Produkten werden auch die Intermediate KDG und KDGal detektiert.

Der obenstehenden Tabelle kann entnommen werden, dass das Enzymsystem auch Galactonat zu Glycerin und Pyruvat umsetzt.

Beispiel 6

Umsetzung von Kalium-Galactonat zu Lactat und Glycerin

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vorgelegt: 25 pl eines 2000 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5), 130 pl deionisiertes Wasser, 80 pl Dehydratase-Lysat, 80 pl Aldolase-Lysat, 2 U D-Xylose-Reduktase-Lysat, 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NADP-spezifisch), 2 U Alkoholdehydrogenase-Lysat (NAD-spezifisch) sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. Durch Zugabe von 100 pl einer Kalium-Galactonat-Lösung (1282 mM) wurde die Reaktion gestartet. Zur Kofaktor- Regeneration wurden 50 pl Isopropanol zugesetzt. Der Ansatz wurde insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. 26 h nach Start der Reaktion wurden 100 pl einer Isopropanol/Wasser-Mischung (3/7 v/v) zur Probe zugesetzt. Das Gesamtvolumen des Ansatzes bei Start der Reaktion betrug 500 pl.

Zur Aufarbeitung wurden 40 pl des Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurde die Probe 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.

Zusätzlich zu den in der Tabelle angeführten Produkten werden auch die Intermediate KDG und KDGal sowie Pyruvat detektiert.

Der obenstehenden Tabelle kann entnommen werden, dass das Enzymsystem auch Galactonat zu Glycerin und Lactat umsetzt. Vergleichsbeispiel

Umsetzung einer Mischung von D-Glyceraldehyd und Pyruvat zu Glycerin und Lactat

In zwei 2 ml Eppendorf-Vials wurden folgende Komponenten vorgelegt: 100 pl eines 500 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5; finale Konzentration 100 mM), 0,1 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat, 0,1 U D-Xylose- Reduktase-Lysat, 10 pl einer 10 mM NAD ⁺ -Lösung (finale Konzentration 0,2 mM) sowie 10 pl einer 10-mM NADP ⁺ -Lösung (finale Konzentration 0,2 mM).

Zu Vial 1 wurden 0,5 pl Alkoholdehydrogenase-Lysat (NAD-spezifisch), 0,5 pl Alkoholdehydrogenase- Lysat (NADP-spezifisch) sowie 38,5 pl einer 10 v% Isopropanol-Lösung (entspricht einer finalen Konzentration von 100 mM) hinzugefügt. Zu Vial 2 wurden 0,5 pl Formiat-Dehydrogenase-Lysat (NAD- spezifisch; aus Starkeya novella, NCBI Protein Database: WP_013168047.1), 0,5 pl Formiat- Dehydrogenase-Lysat (NADP-spezifisch durch Kofaktor-Engineering; aus Starkeya novella) sowie 100 pl einer 500 mM Natrium-Formiat-Lösung (finale Konzentration 100 mM) hinzugefügt.

Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 pl einer Substrat-Lösung (50 mM Natrium-Pyruvat und 50 mM D-Glyceraldehyd in deionisiertem Wasser) gestartet. Die Ansätze wurden 1 h bei 30 °C und 1200 rpm in einem Eppendorf-Thermomixer inkubiert. Das Gesamtvolumen der Ansätze bei Start der Reaktion betrug je 500 pl (aufgefüllt mit deionisiertem Wasser).

Zur Aufarbeitung wurden 200 pl eines Ansatzes mit 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Zur Quantifizierung der Analyten wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC- Vials überführt und mittels HPLC (Rl-Detektion) vermessen.

In Vial 1 (Kofaktor-Regeneration durch Alkoholdehydrogenasen und Isopropanol) wurden 79% des Pyruvats (10 mM Start-Konzentration) zu Lactat und 61% des D-Glyceraldehyds (10 mM Start- Konzentration) zu Glycerin reduziert. In Vial 2 (Kofaktor-Regeneration durch Formiat-Dehydrogenasen und Natrium-Formiat) wurden nur 32% des Pyruvats zu Lactat umgesetzt und Glycerin konnte überhaupt nicht detektiert werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Kofaktor-Regeneration durch die Alkoholdehydrogenasen bei Einsatz gleicher Biomasse (je 0,5 pl 20%iges Lysat) im Vergleich zu der Regeneration mit den Formiat- Dehydrogenasen zu höheren Umsätzen führt.

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