Als Coenzym spielt Biotin (Vitamin H) eine essentielle Rolle bei enzymkatalysierten Carboxylierungs-und Decarboxylierungsreaktio- nen. Biotin ist damit ein essentieller Faktor in lebenden Zellen.

Biotin muß von fast allen Tieren und einigen Mikroorganismen von außen aufgenommen werden, da sie Biotin nicht selber synthetisie- ren können. Es ist damit für diese Organismen ein essentielles Vitamin. Bakterien, Hefen und Pflanzen hingegen können Biotin aus Vorstufen selbst synthetisieren (Brown et al. Biotechnol. Genet.

Eng. Rev. 9,1991 : 295-326, DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996 : 704-708, ISBN 1-55581-084-5).

Die Biotinsynthese wurde in bakteriellen Organismen speziell im gramnegativen Bakterium Escherichia coli und im grampositiven Bakterium Bacillus sphaericus untersucht (Brown et al. Bio- technol. Genet. Eng. Rev. 9,1991 : 295-326). Als erstes bis- her bekanntes Intermediat in E. coli wird Pimelyl-CoA (PmCoA) angesehen, das aus der Fettsäuresynthese stammt (DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996 : 704-708, ISBN 1-55581-084-5 1996). Der Syntheseweg dieser Biotin-Vorstufe in E. coli ist bisher weitgehend unbekannt (Ifuku 1993, Lemoine 1996). Es wurden mit bioC und bioH zwei Gene identifiziert, deren korrespondie- rende Proteine für die Synthese von Pm-CoA verantwortlich sind.

Die enzymatische Funktion der Genprodukte BioH und BioC ist bisher nicht bekannt (Lemoine et al., Mol. Microbio. 19,1996 : 645-647, DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds.

Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996 : 704 -708, ISBN 1-55581-084-5). Pm-CoA wird in vier weiteren enzy- matischen Schritten zum Biotin umgewandelt. Ausgehend vom Pm-CoA findet zuerst die Kondensation mit Alanin zu 7-Keto-8-Amino- Pelargonsäure (KAPA) statt. Das Genprodukt für diese Umsetzung ist BioF (KAPA-Synthetase). KAPA wird mit dem Kosubstrat S-Adeno- syl-Methionin durch BioA (DAPA-Aminotransferase) zu 7,8 Diamino- Pelargonsäure transaminiert. Der nächste Schritt führt nach einer ATP-abhängigen Carboxylierungsreaktion zum Dethiobiotin (DTB) und wird durch BioD (Dethiobiotin-Synthase) katalysiert. Im letzten

Schritt findet die Umsetzung von DTB zu Biotin statt. Dieser Schritt wird durch BioB (Biotin-Synthetase) katalysiert. Die für die beschriebenen Proteine kodierenden Gene bioF, bioA, bioD, und bioB sind in E. coli auf einem bidirektionalem Operon kodiert.

Dieses Operon liegt zwischen der-attachment-site und dem uvrB Gen Locus bei ca. 17 Minuten auf dem E. coli Chromosom (Berlyn et al. 1996 : 1715-1902). Auf diesem Operon sind zusätzlich noch zwei weitere Gene kodiert, von denen das eine, bioC, bereits beschriebene Funktionen in der Synthese von Pm-CoA hat, während einem offenen Leseraster hinter bioA bisher keine Funktion zuge- ordnet werden konnte (W094/8023, Otsuka et al., J. Biol. Chem.

263,1988 : 19577-85). Hoch konservierte Homologe zu den E. coli Proteinen BioF, A, D, B wurden in B. sphaericus, B. subtilis, Syneccocystis sp. (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991 : 295-326, Bower et al., J. Bacteriol. 175,1996 : 4122- 4130, Kaneko et al., DNA Res. 3,3,1996 : 109-136), Archae- bakterien wie Methanococcus janaschi, Hefen wie Saccharomyces cerevisiae (Zhang et al., Arch. Biochem. Biophys. : 29-35) oder in Pflanzen wie Arabidopsis thaliana (Baldet et al., C. R. Acad. Sci. III, Sci. Vie. 319,2,1996 : 99-106)) gefunden.

Die Synthese von Pm-CoA scheint in den beiden bisher unter- suchten gram-positiven Mikroorganismen anders zu verlaufen als in E. coli. Es konnten keine Homologen von bioH und bioC ge- funden werden (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9,1991 : 295-326).

Biotin ist eine optisch aktive Substanz mit drei Chiralitäts- zentren. Es wird bisher wirtschaftlich nur über eine vielstufige, teure chemische Synthese hergestellt werden.

Alternativ zu dieser chemischen Synthese wurde eine Vielzahl von Versuchen unternommen, ein fermentatives Verfahren zur Her- stellung von Biotin mit Mikroorganismen aufzubauen. Durch Klonie- rung des Biotin-Operons auf multi-copy-Plasmide konnte die Bio- tinsynthese in den mit diesen Genen transformierten Mikroorganis- men erhöht werden. Eine weitere Erhöhung der Biotinsynthese wurde durch die Deregulierung der Biotingenexpression über die Selek- tion von birA-Mutanten erreicht (Pai C. H., J. Bacteriol. 112, 1972 : 1280-1287). Die Kombination beider Ansätze, das heißt die Expression der Plasmid-kodierten Biosynthesegene in einem regula- tionsdefizienten Stamm (EP-B-0 236 429), brachte eine weitere Steigerung der Produktivität. Das Biotin-Operon kann dabei ent- weder unter Kontrolle seines nativen bidirektionalem Promotors verbleiben (EP-B-0 236 429), oder seine Gene können unter die

Kontrolle eines extern regulierbaren Promotors gebracht werden (W094/8023).

Durch die bisher verfolgten Ansätze zur fermentativen Herstellung von Biotin in E. coli konnte keine wirtschaftlich ausreichende Produktivität erreicht werden. Es zeigte sich, daß die Ausbeute in der fermentativen Herstellung von Biotin durch die unvoll- ständige Umwandlung von DTB zu Biotin durch das BioB-Genprodukt (Biotinsynthase) verursacht wird. Zellen die Mutationen im bioB- Gen tragen, sind nicht in der Lage auf DTB zu wachsen und damit DTB in Biotin umzuwandeln. Der chemische und enzymatische Mecha- nismus der Umwandlung von DTB zu Biotin ist bisher nur unvoll- ständig verstanden und aufgeklärt.

Durch intensive genetische Untersuchungen konnten bisher keine weiteren an der Reaktion beteiligten Proteine identifiziert werden. Eine Charakterisierung der Umwandlung von DTB zu Biotin wurde bisher ausschließlich in bakteriellen bzw. pflanzlichen Zellextrakten durchgeführt (W094/8023, EP-B-0 449 724, Sanyal et al. Arch. Biochem. Biophys., Vol. 326, No. 1,1996 : 48-56 und Biochemistry 33,1994 : 3625-3631, Baldet et al. Europ. J.

Biochem. : 479-485, Méjean et al. Biochem. Biophys.

Res. Commun., Vol. 217, No. 3,1995 : 1231-1237, Ohshiro et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58,9,1994 : 1738-1741).

Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß niedermolekulare Faktoren wie S-Adenosylmethionin, NADPH, Cystein, Thiamin, Fe2+, Asparagin, Serin, Fruktose 1-6-bisphosphat die Synthese von Biotin stimulie- ren (Ohshiro et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58,9,1994 : 1738-1741, Birch et al., J. Biol. Chem. 270,32,1995 : 19158- 19165, Ifuk et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59,2,1995 : 185-189). Neben diesen niedermolekularen Faktoren wurden weitere Proteine identifiziert, die die Synthese von Biotin aus DTB in Gegenwart von BioB stimulieren. Dabei handelt es sich um Flavodoxin und Flavodoxin-NADPH-Reduktase (Birch et al., J. Biol.

Chem. 270,32,1995 : 19158-19165, Ifuk et al., Biosci. Bio- technol. Biochem., 59,2,1995 : 185-189, Sanyal et al., Arch.

Biochem. Biophys. : 48-56).

Die Biotin-und Liponsäuresynthese weisen eine große Homologie auf. In beiden Synthesewegen wird auf der letzten Synthesestufe zwischen nicht aktivierte C-Atome ein Schwefel bzw. zwei Schwe- felatome inseriert. Die Synthese von Liponsaure ist bisher nur unzureichend charakterisiert (DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996 : 704-708, ISBN 1-55581-084-5). Es wurden bisher nur zwei notwendige Gene in E. coli identifiziert : lipA und lipB.

Beide Gene liegen in einem Operon, mit einem bisher nicht charak-

terisiertem Open Reading Frame (= ORF) zwischen beiden Genen. Ein weiters Gen lplA ist in der Lage Liponsäure über ein Lipoyl-AMP- Intermediat auf Lysin zu übertragen. Diese Reaktion hat somit Ähnlichkeit mit der Aktivität von birA. Zwischen LipA und BioB konnten durch Sequenzvergleiche homologe Bereiche in der Amino- säuresequenz identifiziert werden. Diese Umfassen unter anderem ein Cystein-Cluster. Es konnte gezeigt werden, daß LipA für den Einbau von zwei Schwefelatomen in die Liponsäure katalysiert (DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996 : 704-708, ISBN 1-55581-084-5).

Uber die Herkunft des Schwefels im Biotinmolekül existieren widersprüchliche Ergebnisse. Bei Untersuchungen der Biotinsynt- hese in Gesamtzellextrakten wurde gezeigt, daß in Gegenwart von 35S-markiertem Cystein Radioaktivität in Biotin inkorporiert wurde ; weder mit 35S-markiertem Methionin noch mit S-Adenosyl- Methionin konnte ein Schwefel-Einbau ins Biotinmolekül nachge- wiesen werden (Ifuku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59,2, 1995 : 184-189, Birch et al., J. Biol. Chem. 270,32,1995 : 19158 -19165).

Im Gegensatz dazu stehen Untersuchungen mit gereinigtem BioB- Protein in Gegenwart von 35S-markiertem Cystein und ohne Zugabe von Zellextrakten, bei denen zwar eine Biotin-Synthese aber kein Einbau von Radioaktivität in das Biotinmolekül beobachtet werden konnte (Sanyal et al., Arch. Biochem. Biophys. : 48-56, Mejean et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2127,3, 1995 : 1231-1237). Unter diesen Synthesebedingungen ohne Zell- extraktzugabe war die gebildete Biotinmenge niedrig und entsprach maximal ca. 2 Mol Biotin/Mol BioB (Sanyal et al., Arch. Biochem.

Biophys. : 48-56) bzw. 0,1 Mol Biotin/Mol BioB (Mejean et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2127,3,1995 : 1231-1237). Nach diesen Untersuchungen kann ein Einbau von Schwefel in Biotin erfolgen, ohne das Cystein als Schwefeldonor verwendet wird. Diese Biotinbildung ohne externe S-Quelle könnte durch eine Übertragung von Schwefel aus dem in BioB nachge- wiesenen 2Fe-2S Cluster erklärt werden. Die tatsächliche Schwefelquelle für die Biotinsynthese ist nach wie vor unklar.

Damit konnte bisher in vitro keine echte katalytische Aktivität von BioB nachgewiesen werden.

Trotz dieser Vielzahl von Ansätzen reicht die Ausbeute an Biotin durch mikrobielle Fermentation bisher für eine industrielle Produktion nicht aus.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein technisches, fermentatives Verfahren zur Herstellung von Biotin zu entwickeln, daß eine möglichst optimale Umwandlung von Dethiobiotin in Biotin aufweist und damit eine verbesserte Biotinsynthese ermöglicht.

Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Her- stellung von Biotin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Biotin- gen mit der Sequenz SEQ ID No. l oder SEQ ID No. 3 sowie seine funktionellen Varianten, Analoge oder Derivate in einem proka- ryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus, der in der Lage ist Biotin zu synthetisieren, exprimiert, diesen züchtet und das synthetisierte Biotin direkt, nach Abtrennung der Biomasse oder nach Reinigung des Biotins verwendet, gelöst.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Biotingene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 3 werden in der SwissProt- Datenbank unter den"Accession"-Nummern AE000364 und D90811 geführt. Die Sequenz D90811 wird außerdem von Aiba et al. in DNA Res. 3,6,1996 : 363-377 beschrieben. Bei beiden Sequenzen wird in der Datenbank eine Homologie zum NifS-Protein vermerkt.

Weitere Informationen zu diesen Sequenzen sind der Datenbank bzw. der Publikation nicht zu entnehmen.

Durch Expression der Sequenzen SEQ ID No. 1 und/oder SEQ ID No. 3 in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus läßt sich die Produktivität der Biotinbiosynthese deutlich steigern. Durch die Expression der Gene wird die Synthese von Biotin aus Dethiobiotin um mindestens den Faktor 2 gegenüber der Kontrolle ohne diese Gene, bevorzugt um einen Faktor größer 3, gesteigert. Bevorzugt wird die Sequenz SEQ ID No. 1 verwendet.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Biotingene mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 erhältlich, die für die in SEQ ID NO : 2 und SEQ ID No. 4 angegebenen Aminosäuresequenzen oder deren Allelvariationen kodieren. Unter Allelvarianten sind SEQ ID No. 1-oder SEQ ID No. 3-Varianten zu verstehen, die 40 bis 100 % Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 50 bis 100 %, ganz be- sonders bevorzugt 80 bis 100 % aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Inser- tion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO : 1 oder SEQ ID NO : 3 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität aber erhalten bleibt.

Unter Analoge von SEQ ID NO : 1 oder SEQ ID NO : 3 sind beispiels- weise ihre bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder Hefe- Homologen, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Derivate sind beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion (en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirk- samere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo- tidsequenz im Bereich von-1 bis-30 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protei- nexpression erhöht wird. Vorteilhafterweise geschieht dies durch eine veränderte Shine-Dalgarno-Sequenz.

Als prokaryontische Wirtsorganismen des erfindungsgemäßen Ver- fahrens kommen prinzipiell alle Biotin synthetisierenden gram- negativen oder gram-positiven Bakterien in Frage. Als gram- negative Bakterien seien beispielhaft Enterobacteriaceae wie die Gattungen Escherichia, Aerobacter, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Klebsiella, Serratia, Erwinia oder Salmonella, Pseudo- monadaceae wie die Gattungen Pseudomonas, Xanthomonas, Burkhol- deria, Gluconobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Methanomonas, Comamonas, Cellulomonas oder Acetobacter, Azotobacteraceae wie die Gattungen Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia oder Derxia, Neisseriaceae wie die Gattungen Moraxella, Acinetobacter, Kingella, Neisseria oder Branhamella, die Rhizobiaceae wie die Gattungen Rhizobium oder Agrobacterium oder die gram-negativen Gattungen Zymomonas, Chromobacterium oder Flavobacterium, genannt. Als gram-positive Bakterien seien beispielhaft die Endosporen-bildenden gram-positiven aeroben oder anaeroben Bakterien wie die Gattungen Bacillus, Sporolactobacillus oder Clostridium, die coryneformen Bakterien wie die Gattungen Arthrobacter, Cellulomonas, Curtobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium oder Kurthia, die Actinomycetales wie die Gattungen Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces oder Nocardia, die Lactobacillaceae wie die Gattungen Lactobacillus oder Lactococcus, die gram-positiven Kokken wie die Gattungen Micrococcus oder Staphylococcus, genannt.

Bevorzugt werden Bakterien der Gattungen Escherichia, Citro- bacter, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Azotobacter, Chromobacterium, Bacillus, Clos-

tridium, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactococ- cus, Lactobacillus, Streptomyces, Rhizobium, Agrobacterium oder Staphylococcus im erfindungsgemäBen Verfahren verwendet. Beson- ders bevorzugt werden Gattungen und Arten wie Escherichia coli, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Salmonella typhimu- rium, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mutabilis, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni, Acinetobacter calcoaceticus, Azotobacter vinelandii, Chromobacterium violaceum, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus stearother- mophilus, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium primorioxydans, Corynebacterium sp., Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacte- rium linens, Brevibacterium sp., Streptomyces lividans, Rhizobium leguminosarum oder Agrobacterium tumefaciens. Vorteilhafterweise werden Bakterien verwendet, die schon eine erhöhte natürliche Biotinproduktion besitzen.

Die taxonomische Stellung der aufgeführten Gattungen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wandel und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs-und Artnamen korrigiert wer- den. Aufgrund dieser in der Vergangenheit häufig erforderlichen taxonomischen Umgruppierungen der genannten Gattungen innerhalb der bakteriellen Systematik sind auch andere als die oben genann- ten Familien, Gattungen und Arten für das erfindungsgemäße Ver- fahren geeignet.

Als eukaryontische Wirtsorganismen des erfindungsgemäßen Verfah- rens kommen prinzipiell alle Biotin synthetisierenden Organismen in Frage wie Pilze, Hefen, Pflanzen oder pflanzliche Zellen. Als Hefen seien die Gattungen Rhodotorula, Yarrowia, Sporobolomyces, Saccharomyces oder Schizosaccharomyces bevorzugt genannt. Beson- ders bevorzugt sind die Gattungen und Arten Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Yarrowia lipolytica, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces shibatanus oder Saccharomyces cerevisiae.

Als Wirtsorganismus können prinzipiell alle Pflanzen verwendet werden, bevorzugt werden Pflanzen, die in der Tierernährung oder in der humanen Ernährung eine Rolle spielen wie Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Kartoffeln, Erbsen, Bohnen, Sonnenblumen, Palmen, Hirse, Sesam, Kopra oder Raps. Auch Pflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Lavendula vera sind geeignet. Besonders bevorzugt werden pflanzliche Zellkulturen, Protoplasten aus Pflanzen oder Kaluskulturen.

Vorteilhafterweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren Mikroor- ganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen oder pflanzliche Zellen ver- wendet, die in der Lage sind Biotin in das Anzuchtsmedium aus- zuscheiden und die gegebenenfalls zusätzlich schon eine erhöhte natürliche Biotinsynthese haben. Vorteilhafterweise können diese Organismen noch bezüglich der Regulation ihrer Biotinbiosynthese defekt sein, das heißt es findet keine oder nur eine sehr verrin- gerte Regulation der Synthese statt. Dieser Regulationsdefekt hat zur Folge, daß diese Organismen schon eine wesentlich höhere Biotinproduktivität besitzen. Ein solcher Regulationsdefekt ist beispielsweise von Escherichia coli als birA-Defektmutanten bekannt und sollte vorzugsweise in Form eines durch äußere Einflüsse induzierbaren Defektes, beispielsweise temperatu- rinduzierbar, in den Zellen vorhanden sein. Es können im Prinzip auch Organismen verwendet werden, die keine natürliche Biotin- produktion aufweisen, nachdem sie mit den Biotingenen transfor- miert wurden.

Um die Biotinproduktivität insgesamt weiter zu steigern sollten die Organismen im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise zusätzlich mindesten ein weiteres Biotingen ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR enthalten. Dieses zusätzliche Gen oder diese zusätz- lichen Gene können in ein oder mehreren Kopien in der Zelle vor- handen sein. Sie können auf dem gleichen Vektor wie die Sequenzen SEQ ID No. 1 und/oder SEQ ID No. 3 lokalisiert sein oder auf getrennten Vektoren oder aber chromosomal integriert worden sein.

Auch die Sequenzen SEQ ID No. 1 und/oder SEQ ID No. 3 können ins Genom inseriert werden.

Unter dem erfindungsgemäßen Genkonstrukt sind die Biotingense- quenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 sowie deren funktionelle Varianten, Analoge oder Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression funk- tionell verknüpft wurden. Zusätzlich zu diesen neuen Regula- tionssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und ge- gebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natür- liche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen SEQ ID No. 1 und/oder SEQ ID No. 3 inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt.

Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation durch Biotin mehr erfolgt und die Ge- nexpression gesteigert wird. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatorische Elemente inseriert werden. Die Biotingene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 und/oder

SEQ ID No. 3 können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver- fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, X-PR-oder im-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden.

Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula- tionssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthe- tische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Im Genkonstrukt können weitere Biotingene ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR in einer oder mehreren Kopien enthalten sein, die einen eigenen Promotor haben können oder aber unter der Regulation des Promotors der Sequenzen SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 3 liegen können.

Das Genkonstrukt wird zur Expression in den oben genannten Wirts- organismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermög- licht. Geeignete Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUCl9, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, Xgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen YEp6, YEpl3 oder pEM- BLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBINl9, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Vektoren dar. Weitere Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Unter Expressionssysteme sind die Kombination aus den oben bei- spielhaft genannten Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie das T7 RNA Polymerase/Promoter System oder Vektoren mit regulatorischen Sequenzen für den Phagen X zu verstehen.

Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme die Kombina- tion aus Escherichia coli und seinen Plasmiden und Phagen und den dazugehörenden Promotoren sowie Bacillus und seine Plasmide und Promotoren zu verstehen.

Für die vorteilhafte erfindungsgemäße Expression der SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 sind außerdem weitere 3'und/oder 5'Terminale regulatorische Sequenzen geeignet.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Biotingene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs- weise die Biotingenexpression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder"Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Unter"Enhancer"sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Biotingenexpression bewirken.

Eine Steigerung der von den Sequenzen SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 3 abgeleiteten Proteinen und ihrer Enzymaktivität läßt sich zum Beispiel gegenüber den Ausgangsenzymen durch Veränderung der entsprechenden Gensequenzen oder der Sequenzen seiner Homologen durch klassische Mutagenese wie W-Bestrahlung oder Behandlung mit chemischen Mutagentien und/oder durch gezielte Mutagenese wie site directed mutagenesis, Deletion (en), Insertion (en) und/oder Substitution (en) erzielen. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität neben der beschriebenen Genamplifikation durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymbiosynthese reprimieren und/oder durch Synthese aktiver statt inaktiver Enzyme erreicht werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Umwandlung von DTB in Biotin und damit die Biotinproduktivität insgesamt über die in die Organismen über Vektoren und/oder chromosomal klonierten Bio- tingene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 3 vorteil- haft gesteigert.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die SEQ ID No. 1 und/oder SEQ ID No. 3 enthaltenen Mikroorganismen in einem Medium, das das Wachstum dieser Organismen ermöglicht angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di-oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker- quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bis- phosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronen- saure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder Amino- zucker, die auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden können.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH4C1 oder (NH4) 2SO4, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquell- wasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefe- extrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffel- protein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen können.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen.

Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat-und Phosphation zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren ist der Zusatz von Fe2+-oder Fe3+-Salzen und/oder Kaliumsalzen zum Produktionsmedium.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Asparagin, Asparagin- säure, Glutamin, Serin, Methonin oder Lysin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol.

Zur Stabilisierung der Vektoren mit den Biotingenen in den Zellen können gegebenenfalls Antibiotika dem Medium zugesetzt werden.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorge- legt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation nachgegeben werden.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht wer- den. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15 °C bis 40 °C.

Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25 °C und 37 °C.

Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 fest- gehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8.

Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 8 bis 240 Stunden bevorzugt von 8 bis 120 Stunden ausreichend. Innerhalb diser Zeit reichert sich die maximale Menge an Biotin im Medium an und/oder ist nach Aufschluß der Zellen verfügbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Biotin kann kontinuierlich oder batch-weise durchgeführt werden. Werden aus den mit den Biotingenen transformierten Pflanzenzellen ganze Pflanzen regeneriert, so können diese nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ganz normal angezüchtet und vermehrt werden.

Beispiele : Ausgehend von der Überlegung, daß an der Umsetzung von DTB zu Biotin außer BioB und den bekannten weiteren Kofaktoren mögli- cherweise ein Fe-S-Cluster-regenerierendes Enzym beteiligt sein könnte, wurde der Versuch unternommen ein solches hypotetisches Gen zu identifizieren und zu klonieren.

NifS-Gene sind in der Lage Schwefelatome in einem Fe-S-Cluster von Proteinen, die an der Stickstofffixierung beteiligt sind, zu regenerieren (Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,1993 : 2754-2758 und Biochemistry 33,1994 : 4714-4720). Durch Ver- gleich aller bekannten Proteine der NifS-Klasse in den Datenban- ken Swiss-Prot und PIR mit dem Programmpaket Lasergene (DNA-Star Inc.) unter dem Megalign Modus, konnte ein streng konservierter Bereich dieser Proteine mit der Aminosäuresequenz HK (I, L) xGPxG (x entspricht Aminosäuren mit geringer bzw. nicht erhaltener Kon- servierung) identifiziert werden. Die Tatsache der vollständigen Konservierung dieser Sequenz deutet auf eine wichtige Rolle dieser Aminosäuren (= As) in der Funktion dieser Proteinen hin.

Diese konservierten Aminosäuren werden im folgenden als Motiv I bezeichnet.

Das derart beschriebene As-Motiv diente als Vergleichsequenz für eine weitere Analyse der Datenbank Swiss-Prot/PIR Release 93 bzw.

94 nach Proteinen bzw. ORF's (= open reading frame) zu suchen, in denen diese NifS-Funktionssequenz vollständig konserviert ist.

Als Programm für die Sequenzanalyse wurde das Programm Geneman des Pakets DNA-Star eingesetzt. Die Analyseparameter wurden wie folgt fixiert : Menue"consensus sequence"mit einer 80% Konser- vierung des Motivs.

Als Ergebnis dieser Recherche wurde gefunden, daß neben bereits als NifS-homolge Proteine identifizierte Proteine weitere Proteine/bzw. ORF's existieren, die dieses Sequenzmotiv auf- weisen. Unter den in der Datenbank enthaltenen weiteren Sequenzen konnte ein offenes Leseraster aus E. coli mit signifikanter Konservierung der Konsensus-Sequenz identifiziert werden, das wie die eigenen Arbeiten zeigten an der Biotinsynthese beteiligt ist.

Dieses offene Leseraster mit der Bezeichnung ECU29581_24 (= SEQ ID No. 1 = ORF401) kodiert für ein hypothetisches von dieser Sequenz abgeleitetes Protein von 401 As. Es zeigte sich, daß diese Sequenz im Rahmen der E. coli Genomsequenzierung durch F. Blattner und Mitarbeitern sequenziert worden war (DNA-Research 1996), ohne daß dessen Funktion erkannt worden war. Diese Sequenz (SEQ ID No. 1) wird im Nachfolgenden als BioS1 bezeichnet.

Vergleicht man die Proteinsequenz von BioS1 mit der von NifS aus A. vinelandii (Programm : DNA-Star-"Megalign"im Modus : paarweises Alignement nach Lipman-Pearson, Analyseparameter : k-tuple 2, gap-penalty 4, gap-length-penalty 12) zeigt sich, daß ECU2958124 auch in anderen Bereichen der Sequenz über einen Sequenzbereich von 218 As eine Homologie von 27,6% zu NifS aus A. vinelandii aufweist. Gegenüber dem als NifS identifiziertem Protein aus Rhodococcus capsulatus beträgt die Homologie 25,3 % über einen Bereich von 376 As.

In der Datenbank Swiss-Prot/PIR konnten weitere Sequenzen identi- fiziert werden, die Homologien zu ECU2958124 aufweisen (Programm Geneman/Modus sequence similarity ; Einstellungen default). Die höchste gefundene Sequenzähnlichkeit zu ECU29581_24 zeigt ein translatierter ORF (= open reading frame) aus H. influenza (Da- tenbankbezeichnung HIU00082_62). Zwischen BioS1 und HIU0008262 wurde eine Sequenzhomolgie von 45,5% aber die gesamte Lange bei- der Proteine gefunden. Die Sequenzähnlichkeit bzw. die Homologie beider Proteine ist damit signifikant höher, als zwischen ECU2958124 (= BioSI) und NifS aus R. capsulatus bzw. A. vine- landii. Es handelt sich damit vermutlich um das H. influenza Homologe zu BioSl.

Von Fleischmann et al. (Science. 269,1995 : 496-512) war neben dem ORF HIU0008262 ein weiterer ORF (HIU00072_10) in H. influ- enza aufgrund seiner Sequenzähnlichkeit zu NifS gefunden worden.

Aufgrund dieser Beschreibung von Fleischmann et al. wurde ge- folgert, daß neben bioS1 auch in E. coli noch ein weiteres NifS- ähnliches Gen existiert. Dieses hypothetische Gen wurde bioS2 genannt.

1. Konstruktion der Vektoren pHSlund pHS2 : Die Plasmide pHS1 und pHS2 bestehen aus verschiedenen sog.

Kassetten, die einen Replikationsursprung, eine Resistenzkas- sette, einen Promotor, eine Klonierungsstelle, und Terminatoren tragen. Die Plasmide wurden aus unterschiedlichen DNA-Fragmenten zusammengesetzt. Die dafür notwendigen DNA-Fragmente wurden durch PCR-Reaktionen mit unterschiedlichen Plasmiden als Matrizen her- gestellt. a.) Herstellung der Kassette mit einem Replikationsursprung : Um den Replikationsursprung aus einem P15A-Replikon-enthaltenden Plasmid als klonierbare Kassette bereitzustellen, wurde durch eine PCR Reaktion mit dem Plasmid pRep4 (Quiagen) mit den Oligo- nukleotiden P15A, 1 (5'-GGCCCCTAGGGGATATATTCCGCTTCCTCGC-3') und P15A, 2 (5'-GGCCACTAGTAACAACTTATATCGTATGGGG-3') ein DNA-Fragment von 919 Basen Länge aus dem Plasmid isoliert. Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen AvrII und SpeI in einem geeigneten Puffer geschnitten.

PCR-Bedingungen : Es wurden 2,5 U Taq-Polymerase sowie 15 pMol der Oligonukleotide in 100 pl Ansatzlösung zur Isolierung der Replikationskassette aus dem Plasmid pRep4 verwendet. Die Oligonukleotide wurden bei 50 °C angelagert. Die Elongation erfolgte bei 72 °C für 1 min.

-aber 30 Zyklen. b.) Herstellung der Kanamyzin-Resistenzkassette : Um eine Kanamyzin-Resistenzkassette als klonierbare Kassette bereitzustellen wurde durch eine PCR Reaktion aus einem die Kanmyzin-Resistenzkassette enthaltenden Plasmid (pRep4, Quiagen) mit den Oligonukleotiden Kan-R, l (5'-GGCCGAGCTCTCGAACCCCA- GAGTCCCGCT-3') und Kan-R, 2 (5'-GGCCGACGTCGGAATTGCCAGCTGGGGCGC-3') ein DNA-Fragment von 952 Basen Länge isoliert. Das Fragment wurde mit AatII und SacI in einem geeigneten Puffer geschnitten.

PCR-Bedingungen : Es wurden 2,5 U Taq-Polymerase sowie 15 pMol der Oligonukleotide in 100 p1 Ansatzlösung zur Isolierung der Kanamyzin-Resistenz- kassette aus dem Plasmid pRep4 verwendet. Die Oligonukleotide wurden bei 50 °C angelagert. Die Elongation erfolgte bei 72 °C für 1 min. aber 30 Zyklen. c.) Herstellung der Terminationsbereiche : * Um den Terminator TO aus dem Phagen Lambda als klonierbare Kassette bereitzustellen wurde durch eine PCR Reaktion mit dem Plasmid pDS12-luzi (Schroder H. et al., EMBO Journal. 12, 11,1993 : 4137-4144) als Matrize mit den Oligonukleotiden T0,1 (5'-GGCCGAGCTCGCTTGGACTCCTGTTGATAG-3') und T0,2 (5'-GGCCACTAGTGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCC-3') ein DNA--Frag- ment von 120 Basen Länge isoliert. Das Fragment wurde durch die Enzyme SpeI und SacI in einem geeigneten Puffer ge- schnitten.

Matrize für T0 : pDS12-luzi Es wurden 2,5 U Taq-Polymerase sowie 15 pMol der Oligonukleo- tide in 100 p1 Ansatzlösung zur Isolierung des Terminations- bereiches aus dem Plasmid pDS12-luzi verwendet. Die Oligo- nukleotide wurden bei 50 °C angelagert. Die Elongation er- folgte bei 72 °C für 0,5 min. über 30 Zyklen. Anschließend wurde ein 120 bp groBes Fragment isoliert und aufgereinigt.

Dieses wurde mit je 20 U SpeI und SacI verdaut.

* Um den Terminator T1 aus dem rrnB-Operon als klonierbare Kassette bereitzustellen, wurde durch eine PCR Reaktion mit dem Plasmid pDS12-luzi (Schroder et al. siehe oben) als Matrize und mit Hilfe der Oligonukleotide Tl, l (5'-GGCCCCTAG- GTCTAGGGCGGCGGATTTGTCC-3') und T1,2 (5'-GGCCTCTAGAGGCATCAAA- TAAAACGAAAGGC-3') ein DNA-Fragment von 120 bp Länge isoliert.

Das Fragment wurde durch die Enzyme XbaI und AvrII in einem geeigneten Puffer geschnitten.

Matrize für T1 : pDS12-luzi Es wurden 2,5 U Taq-Polymerase sowie 15 pMol der Oligonukleo- tide in 100 l Ansatzlösung zur Isolierung des Terminations- bereiches aus dem Plasmid pDS12-luzi verwendet. Die Oligo- nukleotide wurden bei 50 °C angelagert. Die Elongation er- folgte bei 72 °C für 0,5 min. über 30 Zyklen. Anschließend

wurde ein 120 bp großes Fragment isoliert und aufgereinigt.

Dieses wurde mit je 20 U XbaI und AvrII verdaut. d.) Herstellung der Promotoren für pHS1 und pHS2 : Die Oligonukleotide PPHS1,1 (5'-TCGAGATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCCGATCCTAAGGTTTACAATTGTGAG CGCTC ACAATTATGATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACACGCTAGCGGTAC-3' ) und PPHS1,2 (5'-CGCTAGCGTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTGAATCTATCATAATTGTGAG CGCTC<BR> ACAATTGTAAACCTTAGGATCGGCTAATCTTATGGATAAAAATGCTATC-3') bzw.

PPHS2,1 <BR> <BR> (5'-AATTCTCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAG ACATC ACCAGGACGCACTGACCG-3'9 und PPHS2,2 (5'-AATTCGGTCAGTGCGTCCTGGTGATGTCTCAGTATCTCTATCACTGATAGGGATGT CAATC TCTATCACTGATAGGGAGG-3') wurden durch chemische Synthese herge- stellt. Die Oligonukleotide PPHS1,1 und PPHS1,2 sowie PPHS2,1 und PPHS2,2 wurden jeweils in einer Konzentration von lpg/pl ver- mischt, 5 min bei 95 °C inkubiert und dann langsam abgekühlt. Die aneinandergelagerten Oligonukleotide wurden in einer Konzentra- tion von 10 ng/pl in der Ligation eingesetzt. Die Oligonucleotide PPHS1,1 und PPHS1,2 bildeten den Promotor für das Plasmid pHS1 und die Oligonucleotide PPHS2,1 und PPHS2,2 den für das Plasmid pHS2. e.) Herstellung der Klonierungsstelle : Zur Konstruktion der Klonierungsstelle wurden die beiden Oligonu- kleotide PMCS1,1 <BR> <BR> (5'-GTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTG CAGCC CGGGGGATCCCATGGTA-3') und PMCS1,2 <BR> <BR> (5'-ACGCGTACCATGGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC CGTCG ACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACC-3') synthetisiert. Die beiden Oligonu- kleotide wurden in einer Konzentration von lpg/pl vermischt, 5 min bei 95 °C inkubiert und dann langsam abgekühlt. Die aneinander- gelagerten Oligonukleotide wurden in einer Konzentration von 10 ng/pl in der Ligation eingesetzt. f.) Klonierungsablauf von pHSl und pHS2 Ausgehend von pDS12 luci wurde die ampR-Kassette des Plasmides durch einen SacI/AatII-Verdau herausgeschnitten und durch ein entsprechendes SacI/AatII-Fragment ersetzt, das die Kanamyzin- Resitenzkassette enthält. Nach Transformation und Isolierung positiver Klone wurde der erhaltene Vektor SpeI/SacI verdaut und der durch PCR-amplifizierte Terminator TO als SpeI/SacI-Fragment stromabwärts der Kanamyzin-Resistenzkassette eingesetzt. Nach

Transformation und Isolierung positiver Klone wurde der erhaltene Vektor wurde mit XbaI/AvrII verdaut und der durch PCR-ampli- fizierte Terminator T1 als XbaI/AvrII-Fragment eingesetzt. Der erhaltene Vektor wurde mit XhoI/EcoRI verdaut und mit den jeweils aneinandergelagerten Promotoroligonukleotiden (PPHS1,1 und PPHS1,2 bzw. PPHS2,1 und PPHS2,2) ligiert. Der entstandene Vektor wurde XbaI verdaut und mit Hilfe von Klenow-Fragment aufgefüllt, dann KpnI verdaut und die Vektorbande ohne das Luziferase-Frag- ment isoliert. Zwei weitere aneinandergelagerte Oligonukleotide (PMCS1,1 PMCS1,2), die die Klonierungsstelle enthalten, wurden mit den so verdauten Vektoren ligiert.

2. Klonierung von bioSI (ECU29581 24, SEQ ID No. 1) : Das Gen, das für BioS1 kodiert, wurde aus dem Chromosom von E. coli durch eine PCR-Reaktion amplifiziert, mit otimierten Translationssignalen versehen und in einen Vektor kloniert, der eine Überexpression des Gens in E. coli Stämmen ermöglicht. a.) Entwicklung von Oligonukleotiden zur Amplifizierung des bioS1 Gens aus dem E. coli Chromosom : BioS1 soll als Expressionskassette bestehend aus einer ribosoma- len Bindungstelle, dem Startkodon der kodierenden Sequenz und dem Stopkodon zwischen zwei Erkennungstellen für Restriktionsenzyme amplifiziert werden. Für beide Restriktionsschnittstellen wurde die Erkennungssequenz von MluI gewählt. Das bioS1 Gen wurde mit Hilfe der Oligonucleotide PbioSl, 1 (5'-CGCACGCGTGAGGAGTACCAT- GAACGT-3') und PbioSl, 2 (5'-CGCACGCGTTTAATCCACCAATAATT-3f) kloniert.

Durchführung der PCR : Bedingungen : Als Matrize wurden 0,5Ug chromosomale DNA von E. coli W3110 ver- wendet. Die Oligonukleotide PbioSl, l und PbioSl, 2 wurden in einer Konzentration von je 15 pMol eingesetzt. Die Konzentration an dNTP's betrug 200 ßM. Als Polymerase wurden 2,5 U Pwo DNA-Poly- merase (Boehringer Mannheim) im Reaktionspuffer des Herstellers eingesetzt. Das Volumen der PCR-Reaktion betrug 100p1.

Amplifikationsbedingungen : Die Denaturierung der DNA erfolgte für 2 min bei 94 °C. Anschlie- ßend wurden die Oligonukleotide für 30 sec bei 55 °C angelagert.

Die Elongation erfolgte für 45 sec bei 72 °C. Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen durchgeführt.

Das erhaltene DNA-Produkt mit einer Größe von 1200 bp wurde auf- gereinigt und durch MluI im geeigneten Puffer verdaut.

5pg des Vektors pHS1 wurden duch MluI verdaut und durch Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) (Boehringer Mannheim) dephosphoryl- liert. Nach Denaturierung der SAP wurden Vektor und Fragment in einem molaren Verhältnis von 1 : 3 durch den Rapid-DNA-Ligation Kit nach der Vorschrift des Herstellers ligiert. Die Transformation des Ligationsansatzes erfogte in den Stamm E. coli XL-1-blue.

Positive Klone wurden durch Plasmidpräparation und Restriktions- analyse identifiziert. Die richtige Orientierung des bioSl-Frag- ments in pHS1 wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung bestimmt. Das erhaltene Konstrukt wurde pHS1 bioS1 (Figur 1) ge- nannt. Die Sequenz von pHS1 bio51 ist SEQ ID No. 5 zu entnehmen.

Die abgeleitete Aminosäuresequenz von bioS1 im Vektor ist SEQ ID No. 6 zu entnehmen. 2 g des Vektors pHS1 bioS1 wurden mit MluI verdaut und das Gen bioS1 durch ein Agarosegel isoliert. Der Vek- tor pHS2 wurde mit MluI verdaut mit SAP-Phospahtase dephosphoryl- liert und mit dem Fragment bioS1 zusammen in einer Ligation ange- setzt. Der Ligationsansatz wurde in XLl-blue transformiert und positive Klone in der richtigen Orientierung durch Plasmidisolie- rung und Restiktionsverdau identifiziert. Der erhaltenen Vektor wurde pHS2 bioS1 (Figur 2) genannt. Die Sequenz von pHS2 bioSI ist SEQ ID No. 9 zu entnehmen. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von bioS1 im Vektor ist SEQ ID No. 10 zu entnehmen.

3. Klonierung von bioS2 (SEQ ID No. 3) : Um in E. coli weitere Gene zu klonieren, die für Genprodukte kodieren die am Aufbau von Fe-S-Clustern beteiligt sind, wurde folgender Weg beschritten : Ein Sequenzvergleich (Programm Megalingn, Modus Clustal) von As- Sequenzen von Proteinen der Datenbank Swissprot/PIR mit einer hohen Homologie (>40%) zum NifS Protein aus A. vinelandii zeigte, daß neben dem bereits beschriebenen Sequenzmotiv I auch der N- Terminus dieser Proteine eine signifikante Konservierung zeigt.

Als eine typische N-terminale konservierte Sequenz von Proteinen der NifS-Familie wurde die As-Sequenz mit der Sequenz MIYLDNXATT identifiziert und als Motiv II a bezeichnet.

Eine Analyse der Datenbank Swissprot/PIR auf eine Konservierung dieser Sequenz mit mehr als 80% zeigte ein weiteres Protein in E. coli. Von diesem Protein ist durch Edman-Abbau erhaltene N-terminale Sequenz von 11 As bekannt (Datenbankbezeichnung : UP06Ecoli). Dieses Protein wurde als hypothetisches NifS-Homolog

angesehen und in Analogie zu BioS1 als im folgenen als BioS2 bezeichnet.

Um das Gen für das Protein BioS2 zu klonieren und zu sequenzie- ren, wurde folgender Weg beschritten. Ausgehend von der Protein- sequenz HIU0007210 wurde zum einen das konservierte Aminosäure- Motiv I zum anderen die oben genannte As-Sequenz von UP06Ecoli benutzt, um degenerierte Oligonukleotide herzustellen, die in der Lage sind, ein Fragment des bioS2 Gens zu amplifizieren. Dafür wurden die beiden As-Motive HIU0007210 (Motiv I) und UP06Ecoli (Motiv II b, MKLPIYLDYSAT) in die korrespondierenden DNA-Sequen- zen revers translatiert. Aus dem Motiv II wurde so das degene- rierte Oligonukleotid PbioS2,1 (5'-ATGAARYTNCCNATHTAYYTNGAY- TAYWSNGCNAC-3') und aus dem Motiv I das degenerierte Oligonukleo- tid PbioS2,2 (5t-cccaghggrccrtgcagyttrtgrccrga-3g) synthetisiert.

Durchführung der PCR-Reaktion : Als Matrize diente chromosomale DNA von E. coli W3110. Je 0,5 ig der Oligonukleotide Pbio2,1 und PbioS2,2 wurden mit je 15 pMol Nukleotidmix, 2,5 U Pwo DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) im Reaktionspuffer des Herstellers umgesetzt. Das Volumen der PCR- Reaktion betrug 100p1.

Amplifikationsbedingungen : Die Denaturierung erfolgte für 2 min bei 94 °C. Die Anlagerung der Oligonukleotide wurde bei 45 °C, die Elongation für 45 sec bei 72 °C durchgeführt. Die PCR wurde über 30 Zyklen durchgeführt.

Durch die PCR konnten drei Fragmente selektiv amplifiziert wer- den, von denen eines die aus den Sequenzvergleichen erwartete GröBe von 600 bp hatte. Dieses DNA-Fragment wurde durch Agarose- gel-Aufreinigung isoliert und mit dem Oligonukleotid PbioS2,2 sequenziert. Die erhaltene DNA-Sequenz wurde in allen sechs mög- lichen Leserastern translatiert. Die erhaltenen translatierten As-Sequenzen wurden dann mit der translatierten AS-Sequenz von HIU0007210 bzw. NifS aus A. vinelandii verglichen. Eines der translatierten Leseraster zeigt eine hohe Homologie mit der As-Sequenz des beschriebenen ORF HIU00072-10 und mit bioS2 bezeichnet.

Um die gesamte DNA-Sequenz von bioS2 (= SEQ ID No. 3) zu be- stimmen und zu klonieren, wurde folgender Weg beschritten : Zuerst wurde eine markierten DNA-Sonde hergestellt, die zu bioS2 homolog ist. Dies geschah mit Hilfe des PCR-DIG-Labelling-Kit (Boehringer Mannheim). Als Matrize für die Herstellung der DIG-

DNA-Sonde diente das beschriebene PCR-Produkt, das durch die Oligonukleotide PbioS2,1 und PbioS2,2 hergestellt wurde.

Die Bedingungen der PCR waren : Einsatz : 1p1 der PCR-Matrize, 5p1 Nukleotid-DIG-dUTP-Mix, je 15 pMol Oligonukleotid PbioS2,1 und PbioS2,2, Puffer des Kits mit 1,75 mM MgCl2 0,75 p1 Expand-Polymerase-Mix (Boehringer Mannheim).

Amplifikationsbedingungen : Aufschmelzen der DNA bei 94 °C für 2 min, Aufschmelzen der DNA 10 sec bei 94 °C, Annealing 30 sec bei 45 °C, Elongation 3.30 min bei 68'C aber 10 Zyklen, Aufschmelzen der DNA 10 sec bei 94 °C, Annealing 30 sec bei 45 °C, Elongation 3.30 min bei 68 °C, Ver- längerung der Elongation für 20 sec pro Zyklus aber 20 Zyklen.

Aufreinigung des DIG-markierten Frgaments durch PCR-Purification Kit.

4. Southern-Analyse von bioS2 mit chromosomaler DNA In weiteren Schritten wurde genomische DNA durch Restriktions- enzyme verdaut und durch Southern-Hybridisierung mit Hilfe der markierten DNA-Sonde analysiert.

Chromosomale E. coli DNA W3110 (10gag) wurde mit den folgenden Restriktionsenzymen vollständig verdaut EcoRI, BamHl, Acc65I, HindIII, SalI. Das Volumen der Ansätze betrug 50 p1, die Enzym- menge je 30 U. Die Ansätze wurden 4h inkubiert. Die derart ver- daute DNA wurden durch ein 1% Agarosegel in TBE-Puffer (Sambrook, J. Fritsch, E F. Maniatis, T. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989, ISBN 0-87969-373-8) aufgetrennt und mit Hilfe einer Druckübertragungskammer (Stratagene) auf eine Nylon-Membran (Boehrineger Mannheim) übertragen und durch W- Bestrahlung (Stratalinker, Stratagene) kovalent an der Membran fixiert. Die Hybridisierung erfolgte mit der DIG-markierten DNA- Sonde in DIG-Easyhyb Puffer (Boehringer Mannheim) bei 65'C far 15 h. Die Entwicklung des Blots nach Anweisungen des Hersteller zeigt Hybridisierung der BioS2-DIG-DNA-Sonde mit Banden, die mit Größen von ca. 3-4 kb im Fall von Acc65I, EcoRI und HindII bestimmt wurden. BamHl verdaute DNA zeigte eine Hybridisierung mit der bioS2-Sonde mit einem Fragment eines wesentlich höheren Molekulargewichts. Zur weiteren Klonierung wurden Fragmente von 3-4 kb bevorzugt weiter bearbeitet.

Klonierung von bioS2 durch inverse PCR Im Fall des EcoRI-Verdaus wurde ein Fragment von ca. 4 kb identi- fiziert, das das gesuchte Gen trägt. Das gesamte Gen wurde dann durch die Technik der inversen PCR amplifiziert und kloniert. Im ersten Schritt der inversen PCR wurde chromosomale E. coli DNA durch EcoRI vollständig verdaut. Im zweiten Schritt wurde dann die EcoRI verdaute DNA bei geringen DNA-Konzentrationen (ca. 20 ng/ml) aus dem vorher beschriebenen Restriktionsverdau durch Li- gase kovalent ligiert, unter Bedingungen unter denen statistisch gesehen eine intramolekulare Verknüpfung erfolgt. Im dritten Schritt wurde dann eine PCR-Reaktion durchgeführt, bei der Oligo- nukleotide eingesetzt werden, deren Sequenz spezifisch für das gesuchte Zielgen ist.

Spezifisch amplifizierte DNA-Segemente können anhand ihrer Größe identifiziert werden, die sich aus der Größe des Restriktions- fragments aus der Southern-Analyse und aus der Lokalisierung der Oligonukleotide im bekannten Abschnitt des Gens ergibt. Derart identifizierte Fragmente werden dann in einen geeigneten Vektor wie pBS SK Blueskript/pCR Script (Stratagene) kloniert und sequenziert.

Experimentelle Durchführung : lpg chromosomale DNA aus dem Stamm W3110 wurde durch 15 U EcoRI (Boehringer Mannheim) in einem Volumen von 50 p1 vollständig ver- daut. Die Vollständigkeit des Verdaus wurde durch Auftrag von 30 pl auf ein Agarosegel überprüft. Fragmente dieses Verdaus chromosomaler DNA (10 pl des Verdaus = 200 ng) wurden in einem Volumen von 100 pl zusammen mit 10 pl Ligationspuffer und 2 U T4-Ligase (Boehringer Mannheim) für 15h bei 15 °C inkubiert.

(intramolekulare Ligationsreaktion). Nach der Ligationsreaktion wurde die T4-Ligase durch Inkubation bei 65'C fUr 20 min. inaktiviert. Von diesem Ligationsansatz wurden 5 p1 als Matrize für eine PCR-Reaktion eingesetzt. Die Primer PbioS2,3 (5'-GCGTGGGTAAACTGCCTATCGACCTGAGCC-3') und PbioS2,4 (5'-CTACGCTT- CCTTCAGCCTGCCAGCCGAAA-3') wurden ausgehend von der Sequenz von bioS2 synthetisiert.

Oligonukleotid PbioS2,3 hybridisiert auf der 5'-Seite von bioS2 und bewirkt das die Elongation der Amplifikation der kodierenden Sequenz auf der 5'-Seite auf dem Gegenstrang in 3'-Richtung stattfindet.

Oligonukleotid PbioS2,4 hybridisiert auf der 3'-Seite von bioS2 und bewirkt das die Elongation der Amplifikation der kodierenden Sequenz auf der 3'-Seite auf dem kodierenden Strang in 3'-Rich- tung stattfindet.

Einsatz : 5p1 des Ligationsansatz, 1,75 1 Desoxynukleotid-Mischung (350 pool, Boehringer Mannheim), je 15 pMol Oligonukleotid PbioS2,5 und PbioS2,6, Puffer ldes Kits mit 1,75 mM MgCl2 0,75 p1 Expand-Polymerase-Mix.

Bedingungen für die Amplifikation der ligierten E. coli DNA mit Primer Expand-Kit (Boehringer Mannheim) Auf- schmelzen der DNA 2 min bei 94 °C, Aufschmelzen der DNA 10 sec bei 94 °C, Annealing 30 sec bei 61 °C, Elongation 3.30 min bei 68 °C über 10 Zyklen, Aufschmelzen der DNA 10 sec bei 94 °C, Annealing 30 sec bei 61 °C, Elongation 3.30 min bei 68 °C, Verlängerung der Elongation für 20 sec pro Zyklus über 20 Zyklen.

Durch die beschriebene Amplifikation wurde ein PCR-Produkt von ca. 3 kb erhalten. Dieses DNA-Fragment zeigte in einer Southern- Hybridisierung unter stringenten Bedingungen eine deutliche Hybridisierung mit der bereits beschriebenen bioS2-DIG-DNA-Sonde.

Es wurde angenommen, daß dieses DNA-Fragment DNA-Sequenzen ent- hält, die zu bioS2 hochgradig homolog sind. Daher wurde dieses DNA-Fragment in einen Vektor kloniert, um es weiter zu charakte- risieren und zu sequenzieren. Das DNA-Fragment wurde mit dem pCR- Skript Kit (Stratagene) zuerst laut Anweisung des Herstellers mit Pfu-Polymerase behandelt und dann in den Vektor pCR Skript ligiert. Der Ligationsansatz wurde in XL-1-blue Zellen (Strata- gene) transformiert und auf LB-Amp ausplattiert. Ein positiver Klon, der ein Fragment trug, wurde durch Minipräparationsanalyse identifiziert. Die Sequenzierung ergab die in SEQ ID No. 3 wiedergegebene Gesamtsequenz (= bioS2).

BioS2 wurde dann als Expressionskassette analog zu bioS1 amplifi- ziert und kloniert. Dafür wurden dem Gen durch PCR mit den Oligo- nukleotiden PbioS2,5 (5'-CATGACGCGTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAAATTAC- CGATTTATTTGG-3') und PbioS2,6 (5'-GCGACGCGTGATTAATGATGAGCCCAT-3') eine Erkennungstelle für MluI und eine optimierte Shine-Dalgarno- Sequenz auf der 5'Seite und eine Erkennungstelle für MluI auf der 3'Seite zugefügt.

Durchführung der PCR : Als Matrize wurden 0,5 pg chromosomale DNA von W3110 eingesetzt.

Die Oligonukleotide PbioS2,5 und PbioS2,6 wurden in einer Konzen- tration von je 15 pMol eingesetzt. Die Konzentration an dNTP's

betrug 200 M. Als Polymerase wurden 2,5 U Pwo DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) im Reaktionspuffer des Herstellers ein- gesetzt. Das Volumen der PCR-Reaktion betrug 100 pl.

Amplifikationsbedingungen : Denaturierung 2 sec bei 94 °C, Anlagern der Oligonukleotide fur 30 sec bei 55 °C, Elongation für 45 sec bei 72 °C. Die PCR wurde über 30 Zyklen durchgeführt.

Das erhaltene DNA-Produkt der richtigen Größe von ca. 1200 bp wurde durch den PCR-Purification-Kit (Boehringer Mannheim) auf- gereinigt und durch MluI im geeigneten Puffer verdaut.

5 pg des Vektors pHS2 wurden duch MluI verdaut und durch Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) (Boehringer Mannheim) dephosphoryl- liert. Nach Denaturierung der SAP wurden Vektor und Fragment in einem molaren Verhältnis von 1 : 3 durch den Rapid-DNA-Ligation Kit nach der Vorschrift des Herstellers ligiert. Die Transformation des Ligationsansatzes erfolgte in den Stamm XL-1-blue. Positive Klone wurden durch Plasmidpräparation und Restriktionsanalyse identifiziert. Die richtige Orientierung des bioS2-Fragments in pHS2 wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung bestimmt.

Der Vektor wurde mit pHS2 bioS2 (Figur 3) bezeichnet. Die Sequenz von pHS2 bioS2 ist SEQ ID No. 11 zu entnehmen. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von bioS2 im Vektor ist SEQ ID No. 12 zu ent- nehmen. Analog wurde die Klonierung von bioS2 in den Vektor pHS1 vorgenommen. Die Sequenz von pHS1 bioS2 ist SEQ ID No. 7 zu ent- nehmen (Figur 4). Die abgeleitete Aminosäuresequenz von bioS2 im Vektor ist SEQ ID No. 8 zu entnehmen.

5. Konstruktion des Plasmids pHBbiol4 Die in vivo-Klonierung des Bio-Operons wurde durch einen transdu- zierenden Lambda-Phagen durchgeführt. Die Selektion von Lambda bio+ Phagen erfolgte durch die Transduktion eines E. coli bio- negativen Stammes zu bio+. Der isolierte bio+ transduzierende Lambda Phage wurde propagiert und die Lambda DNA aufgereinigt. Es folgte die Excision eines 8,7 kb EcoRI/HinDIII-Fragments mit dem gesamten Biotin-Operon aus der Lambda-Phagen DNA und Ligation des Fragments in pBR322, der EcoRI/HinDIII geschnitten worden war.

Positive Klone wurden durch Plasmidpräparation und Restriktions- analyse identifiziert.

Deletion eines 1,2 Kb Fragments 3'von bioD Nicht benötigte Gensequenzen auf der 3'-Seite des bioD Gens wur- den entfernt. Dafür wurde durch PCR-Reaktion hinter dem Stopkodon von bioD eine EcoRI-Schnittstelle eingebaut. Die Entwicklung der Oligonukleotide Pbiol, l (5'-AATAAGGAATTCTTATGTACTTTCCGGTTGCCG-3') und Pbiol, 2 (5'-AACAGCAGCCTGCAGCTGGATTA-3') für diese PCR-Reak- tion erfolgte nach der Operon-Sequenz von Otsuka et al. (J. Biol.

Chem. 263,1988 : 19577-85).

PCR-Bedingungen : 2,5 U Taq-Polymerase (Perkin Elmer) und je 15 pmol Primer wurden in einem Volumen von 100 p1 umgesetzt. Das Annealing wurde bei 50 °C und die Elongation für 1 min bei 72 °C über 30 Zyklen durchgeführt. Isolierung und Aufreinigung eines 488 bp-Fragments erfolgte über Agarose-Gel. Verdau des erhaltenen Fragments mit EcoRI/PstI. Verdau von pHBbiol mit EcoRI/PstI. Isolierung eines 9,5 kb Fragments.

Das 9,5 kb Fragments wurde mit dem 488 bp Fragments legiert und in XLl-blue-Zellen transformiert. Erhaltene Klone wurden durch Plasmidpräparation und durch Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA mit den Enzymen EcoRI und HinDIII analysiert, positive Klone, die ein 5,9 kb Fragment trugen, wurden identifiziert. Es wurde ein Klon, der mit pHBbio2 bezeichnet wurde, isoliert. Von diesem Klon wurde Plasmid-DNA gewonnen. 5 pg pHBbio2 wurden mit EcoRI/HinDIII verdaut und das 5,9 kb Fragment isoliert, das die gesamten Bio- tin-Biosynthesegene enthielt.

5 pg des Plasmids pAT153 wurden mit EcoRI und HinDIII verdaut.

Das erhaltenen 5,9 kb Fragment mit den Biotin-Biosynthesegenen wurde mit dem verdauten Vektor pAT153 ligiert und in XL-1-blue transformiert. Erhaltene Klone wurden durch Plasmidpräparation und durch Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA mit den Enzymen EcoRI und HinDIII analysiert. Positive Klone wurden identifiziert und ein Klon mit der Bezeichnung pHbiol4 isoliert.

6. Erhöhung der Biotin-Produktivität durch Überexpression von bioS1 Stamm BM4092 (Barker und Campbell) wurde durch eine Pl-Transduk- tion mit Hilfe eines Pl-Lysats, das auf einem recA : : TnlO tragen- dem Stamm gewachsen war, nach recA-transduziert. Der Erfolg der Transduktion wurde durch eine erhöhte UV-Sensitivitat der positi- ven Transduktanden nachgewiesen. Daraufhin wurde der erhaltene Stamm LU8091 mit dem Plasmid pHBbiol4 nach der CaCl2-Methode transformiert und auf LB-Ampizillin 100 pg/ml angezogen. Ein Klon

wurde isoliert, und dieser wurde jeweils mit den Plasmiden pHS1 bioS1 und pHS2 bioS2 durch die CaCl2-Methode transformiert und auf LB-Agar, Ampizillin 100 Ug/ml und Kanamyzin 25 g/ml selektio- niert.

Je eine Kolonie der jeweiligen Transformanden wurde in einer DYT- Kultur mit dem entsprechendem Antibiotika angeimpft und für 12 h inkubiert. Die Übernachtkultur (= UNK) wurde eingesetzt um eine 10 ml Kultur in TB-Medium (Sambrook, J. Fritsch, E F. Maniatis, T. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989 ISBN 0-87969-373-8) mit den entsprechenden Antibiotika anzuimpfen und über 24h Stunden angezogen. Nach Ende des Wachstums wurden die Zellen vom Kulturüberstand durch Zentrifugation abgetrennt und die Biotin-und Dethiobiotin-Konzentration durch einen ELISA mit Streptavidin und Avidin im Überstand bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind Tabelle I zu entnehmen.

Tabelle I : Bestimmung der Biotin-und Dethiobiotinkonzentration Stamm Plasmid I Plasmid II |Biotin mg/l Dethiobiotin mg/l Lu8091 pHBbiol4 L 9, 4 45,6 Lu8091 pHBbiol4 pHSl bioSl 15, 3 19,7 Lu8091 pHBbiol4 pHS2 bioSI 19, 2 15,8 1