Blakeslea trispora ist als Produktionsorganismus für ß-Carotin (Ciegler, 1965, Adv Appl Microbiol. 7 : 1) und Lycopin bekannt (EP 1201762, EP 1184464, WO 03/038064).

Von Blakeslea trispora sind bisher verschiedene DNA-Sequenzen be- kannt, insbesondere die DNA-Sequenz, die für die Gene der Carotinoid- biosynthese von Geranylgeranylpyrophosphat bis ß-Carotin codiert (WO 03/027293).

Insbesondere aufgrund der hohen Produktivität, die mit Blakeslea in der . Produktion von Lycopin und ß-Carotin erreicht werden, bietet sich dieser Organismus zur fermentativen Herstellung von Carotinoiden an.

Es ist auch von Interesse die Produktivitäten der bisher natürlicherweise produzierten Carotine und deren Vorstufen weiter zu steigern und die Her-

stellung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle zu ermöglichen, die von Blakeslea bisher nicht oder nur in sehr geringem Maße gebildet und isoliert werden können.

Carotinoide werden Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Nahrungsergän- zungsmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln zugesetzt. Die Carotinoide die- nen vor allem als Pigmente zur Färbung. Daneben werden die antioxidati- ve Wirkung der Carotinoide und andere Eigenschaften dieser Substanzen genutzt. Man unterteilt die Carotinoide in die reinen Kohlenwasserstoffe, die Carotine und die sauerstoffhaltigen Kohlenwasserstoffe, die Xantho- phylle. Xanthophylle wie Canthaxanthin und Astaxanthin werden bei- spielsweise zur Pigmentierung von Hühnereiern und Fischen eingesetzt (Britton et al. 1998, Carotinoids, Vol 3, Biosynthesis and Metabolism). Die Carotine ß-Carotin und Lycopin werden vor allem in der Humanernährung eingesetzt. ß-Carotin wird beispielsweise als Getränkefarbstoff verwendet.

Lycopin hat eine krankheitsvorbeugende Wirkung (Argwal und Rao, 2000, CMAJ 163 : 739-744 ; Rao und Argwal 1999, Nutrition Research 19 : 305- 323). Die farblose Carotinoidvorstufe Phytoen kommt vor allem für An- wendungen als Antioxidans in kosmetischen, pharmazeutischen oder dermatologischen Zubereitungen in Frage.

Der überwiegende Teil der Carotinoide und deren Vorstufen, die als Zu- satzstoffe für die oben genannten Anwendungen eingesetzt werden, wird durch chemische Synthese hergestellt. Die chemische Synthese ist tech- nisch sehr aufwendig und verursacht hohe Herstellkosten. Fermentative Verfahren sind demgegenüber technisch verhältnismäßig einfach und ba- sieren auf kostengünstigen Einsatzstoffen. Fermentative Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden und deren Vorstufen können dann wirtschaftlich attraktiv und wettbewerbsfähig zur chemischen Synthese sein, wenn die Produktivität der bisherigen fermentativen Verfahren gesteigert würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten

würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten Produktionsorga- nismen hergestellt werden könnten.

Hierzu ist eine gentechnische, d. h. gezielte genetische Veränderung von Blakeslea erforderlich. Insbesondere, wenn Xanthophylle produziert wer- den sollen, da diese Verbindungen natürlicherweise vom Wildtyp der Bla- keslea nicht synthetisiert werden.

Z. B. zur Herstellung von Phytoen mittels Fermentation von Blakesles trispora sind bisher zwei Methoden bekannt : (i) Durch zufallsabhängige Mutagenese mit chemischen Agenzien wie MNNG können Mutanten erzeugt werden, in denen Phytoen nicht zu Lycopin und somit nicht weiter zu ß-Carotin umgesetzt werden kann (Mehta und Cerdä-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol.

Biotechnol. 42 : 836-838).

(ii) Durch Zugabe von Inhibitoren des Enzyms Phytoendesaturase wie z. B. Diphenylamin und Zimtalkohol kann die weitere Umsetzung von Phytoen blockiert werden, so dass es sich anreichert (Cerdä- Olmedo, 1989, In : E. Vandamme, ed. Biotechnoiogy of vitamin, growth factorand pigment production. London : Eisevier Applied Sci- ence, S. 27-42).

Die genannten Methoden zur Herstellung von Phytoen mit Blakeslea trispora weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf.

Die zufallsabhängie Mutagenese betrifft in der Regel nicht nur die Gene der Carotinoidbiosynthese zur weiteren Umsetzung von Phytoen, sondern auch weitere wichtige Gene. Daher sind Wachstum und Syntheseleistung der Mutanten oft beeinträchtigt. Die Erzeugung z. B. von Phytoenüberpro-

duzenten durch zufallsabhängige Mutagenese von Lycopinüberproduzen- ten oder ß-Carotinüberproduzenten ist daher entweder nicht oder nur mit großem experimentellem Aufwand zu erreichen. Die Zugabe von Inhibito- ren verursacht eine Erhöhung der Produktionskosten und gegebenenfalls eine Verunreinigung des Produktes. Daneben kann das Zellwachstum durch den Inhibitor beeinträchtigt werden, so dass die Produktion von Ca- rotinoiden oder deren Vorstufen, insbesondere Phytoen eingeschränkt wird.

Durch eine gentechnische Veränderung könnten die oben genannten Nachteile der zufallsabhängigen Mutagenese und der Inhibitorzugabe vermieden werden.

Allerdings sind bisher keine Methoden zur gentechnischen, d. h. gezielten gentechnischen Veränderung von Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora bekannt.

Als Methode zur Herstellung von gentechnisch veränderten Pilzen wurde in einigen Fällen die Agrobacterium-vermittelte Transformation erfolgreich eingesetzt. So sind z. B. folgende Organismen durch Agrobakterien trans- formiert worden : Saccharomyces cerevisiae (Bundock et al., 1995, EMBO Journal, 14 : 3206-3214), Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani pisi, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, Pleurotus ostreatus, Fusarium graminearum (van der Toorren.-et al., 1997, EP 870835), Agraricus bispo- rus, Fusarium venenatum (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnol.

16 : 839-842), Mycosphaerella graminicola (Zwiers et al. 2001, Curr. Ge- net. 39 : 388-393), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Mol. Gen. Ge-

nomics 268 : 645-655), Mucor miehei (Monfort et al. 2003, FEMS Microbio- logy Lett. 244 : 101-106).

Von Interesse ist besonders eine homologe Rekombination, bei der zwi- schen der einzuführenden DNA und der Zell-DNA möglichst viele Se- quenzhomologien bestehen, so dass eine ortsspezifische Einführung bzw.

Ausschaltung von genetischer Information im Genom des Empfängeror- ganismus möglich ist. Andernfalls wird die Spender-DNA durch illegitime bzw. nicht-homologe Rekombination ins Genom des Empfängerorganis- mus integriert, was nicht ortsspezifisch erfolgt.

Eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation und anschließende homologe Rekombination der transferierten DNA wurde bisher bei folgen- den Organismen nachgewiesen : Aspergillus awamori (Gouka et al. 1999, Nature Biotech 17 : 598-601), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Moi.

Gen. Genomics 268 : 645-655), Mycosphaerella graminicola ( (Zwiers et al.

2001, Curr. Genet. 39 : 388-393).

Als weitere Methode zur Transformation von Pilzen ist die Elektroporation bekannt. Die integrative Transformation von Hefe durch Elektroporation wurde von Hill, Nucl. Acids. Res. 17 : 8011 gezeigt. Für filamentöse Pilze wurde die Transformation durch Chakaborty und Kapoor beschrieben (1990, Nucl. Acids. Res. 18 : 6737).

Eine"biolistische"Methode, d. h. die Übertragung von DNA durch Be- schuss von Zellen mit DNA-beladenen Partikeln wurde beispielsweise für Trichoderma harzianum und Gliocladium virens beschrieben (Lorito et-al.

1993, Curr. Genet. 24 : 349-356).

Diese Methoden konnten bisher jedoch nicht erfolgreich zur gezielten ge- netischen Veränderung von Blakeslea und insbesondere Blakeslea trispo- ra eingesetzt werden.

Eine besondere Schwierigkeit bei der Herstellung von gentechnisch ver- änderten Blakeslea und Blakeslea trispora, ist die Tatsache, dass deren Zellen in allen Stadien des sexuellen und des vegetativen Zellzyklus mehrkernig sind. In Sporen von Blakeslea trispora Stamm NRRL2456 und NRRL2457 wurden z. B. im Durchschnitt 4,5 Kerne pro Spore nachgewie- sen (Metha und Cerdä-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 : 836- 838). Dies hat zur Folge, dass die gentechnische Veränderung in aller Regel nur in einem oder wenigen Kernen vorliegt, die Zellen also hetero- karyotisch sind.

Sollen die genetisch veränderten Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora zur Produktion eingesetzt werden, so ist es insbesondere bei einer Gendeletion wichtig, dass in den Produktionsstämmen die gentechnische Veränderung in allen Kernen vorliegt, so dass eine stabile und hohe Syn- theseleistung ohne Nebenprodukte möglich wird. Die Stämme müssen folglich in Bezug auf die gentechnische Veränderung homokaryotisch sein.

Lediglich für Phycomyces blakesleeanus ist ein Verfahren beschrieben worden, um homokaryotische Zellen zu erzeugen (Roncero et al., 1984, Mutat. Res. 125 : 195). Durch Zugabe des mutagenen Agens MNNG (N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) werden nach dem dort beschriebenen Verfahren Kerne in den Zellen eliminiert, so dass statistisch eine gewisse Anzahl von Zellen mit nur noch einem funktionellem Kern vorliegt. Die Zel- len werden dann einer Selektion unterzogen, in der nur einkernige Zellen mit einem rezessiven Selektionsmarker zu einem Mycel auswachsen kön- nen. Die Nachkommen dieser selektierten Zellen sind mehrkernig und homokaryotisch. Ein rezessiver Selektionsmarker für Phycomyces blakes-

leanus ist z. B. dar. dar-Stämme nehmen das toxische Riboflavin-Analog 5-Carbon-5-deazariboflavin auf ; dar-Stämme dagegen nicht (Delbrück et al. 1979, Genetics 92 : 27). Die Selektion von rezessiven Mutanten erfolgt durch Zugabe von 5-Carbon-5-deazariboflavin (DARF).

Allerdings ist dieses Verfahren nicht für Blakeslea, insbesondere Blakes- lea trispora bekannt und insbesondere nicht mit im Zusammenhang mit einer Transformation oder der Produktion von Carotinoiden oder deren Vorstufen beschrieben worden.

Auch die Isolierung aus natürlichen Quellen wird durchgeführt. Beispiels- weise ist es für die Gewinnung von Phytoen bekannt, ein Gemisch aus Carotinoiden, Vitamin E und anderen Komponenten, welches auch Phy- toen enthält, aus Tomaten, Karotten oder Palmöl usw. zu extrahieren.

Problematisch ist hierbei die Trennung der einzelnen Carotinoide vonein- ander. So ist beispielsweise das Phytoen nach diesem Verfahren nicht in reiner Form erhältlich. Insbesondere ist die natürlich vorkommende Menge der Carotinoiden in den Pflanzen gering.

Fermentative Verfahren sind demgegenüber technisch verhältnismäßig einfach und basieren auf kostengünstigen Einsatzstoffen. Fermentative Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden können dann wirtschaftlich attraktiv und wettbewerbsfähig zur chemischen Synthese sein, wenn die Produktivität der bisherigen fermentativen Verfahren gesteigert würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten Produktionsorganismen herge- stellt werden könnten. Problematisch bei der fermentativen Herstellung von Carotinoiden sind allerdings die Aufarbeitungsverfahren, die nur ge- ringe Mengen an hochreinen Carotinoiden bereitstellen. Zudem sind dafür meist aufwendige Vielschritt-Prozesse ggf. unter Verwendung großer Lö- sungsmittelmengen erforderlich. So fallen große Mengen Abfall an oder es

muss ein hoher Aufwand zur Wiederverwertung (Recycling) betrieben werden.

Die Produktion von Carotinoiden durch verschiedene Mikroorganismen ist an sich bekannt. So ist z. B. in der WO 00/13654 A2 offenbart, ein Ge- misch aus Phytoen und Phytofluen aus Algen der Art Dunaliella sp. zu ex- trahieren. Auch nach diesem Verfahren ist das Phytoen nicht in reiner Form erhältlich und muss von den anderen Produkten getrennt werden.

Zudem handelt es sich um gentechnisch unveränderte Algen, deren Bio- synthese mittels eines hinzugefügten Inhibitors beeinflusst werden muss.

Blakeslea trispora als Produktionsorganismus für ß-Carotin ist auch aus der WO 98/03480 A1. bekannt. Hier werden ß-Carotin Kristalle aus Bio- masse von Blakeslea trispora mittels Extraktion erhalten. Allerdings müs- sen in dem beschriebenen Verfahren große Mengen unterschiedlicher Lö- sungsmittel eingesetzt werden, um Kristalle mit hoher Reinheit durch meh- rere Extraktions-und Waschschritte zu erhalten. Auch sind die erhaltenen Mengen ß-Carotin bezogen auf die eingesetzte Menge Biomasse klein.

Aus der WO 01/83437 A1 ist ein Verfahren zur Extraktion von Astaxanthin aus Hefe bekannt, bei dem die Kulturbrühe zur Sterilisation und zum Zell- aufschluss mit Mikrowellenstrahlung behandelt wird. Der Zellaufschluss mittels Mikrowellenstrahlung ist danach nötig, um Astaxanthin aus Hefe zu gewinnen, ohne es dabei zu zerstören. Anschließend soll Astaxanthin mit- tels Methanol, Ethanol oder Aceton oder deren Mischungen extrahiert werden. Hierzu sind allerdings große Mengen Lösungsmittel (5 bis 20 Tei- le Lösungsmittel auf 1 Teil Suspension) und ein langer Zeitraum (24h) er- forderlich. Zudem sind keine Reinheiten des Astaxanthins angegeben und die erhaltenen Mengen sind klein. Versuche der Anmelderin und andere Veröffentlichungen bestätigen jedoch, dass eine Extraktion mittels Metha- nol oder Ethanol nicht durchführbar ist.

Aus der WO 98/50574 ist ebenfalls die Isolierung von Carotinoid Kristallen aus Biomasse von Mikroorganismen bekannt, wobei hiernach im Gegen- satz zur WO 01/83437 A1 Methanol, Ethanol, Aceton nur zum Entfernen von Lipiden aus der Biomasse d. h.. zum Waschen verwendet werden kann. Als Lösungsmittel zur Extraktion von Carotinoiden wird demnach Ethylacetat, Hexan oder ein Öl verwendet. Anschließend sind mehrere Reinigungs-und Waschschritte mit großen Mengen Ethanol und Wasser nötig, wobei lediglich eine Reinheit von 93,3 % bei einer Ausbeute von 35 % erreicht wird.

Die WO 03/038064 A2 beschreibt die fermentative Produktion von Lycopin durch Co-Kultivierung von mutiertem Blakeslea trispora Paarungstyp (-) und Blakeslea trispora Paarungstyp (+), die ohne Zusatz von Inhibitoren der Carotinoid Biosynthese Lycopin herstellen. Die Erzeugung der zur Fermentation eingesetzten Mutante wird durch unselektive chemische Mu- tation und anschließendes Screening vorgenommen. Die Aufarbeitung der Kulturbrühe erfolgt mittels Zellaufschluss und anschließender Reinigung mit unterschiedlichen wässrigen Medien mit verschiedenem Salzgehalt und pH-Wert und mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmit- teln wie Ethylacetat, Hexan und 1-Butanol zur Entfernung von Lipiden.

Alternativ ist eine Extraktion mittels großer Mengen Ethylacetat beschrie- ben. Angaben zur Reinheit fehlen. Da Ethylacetat und Hexan Lösungsmit- tel für Lycopin sind, ist davon auszugehen, dass ein Teil des Lycopins herausgewaschen und so die theoretische mögliche Ausbeute verringert wird.

Auch aus der WO 01/55100 A1 ist die Isolierung von Carotinoiden allge- mein bzw. ß-Carotin im speziellen aus der Biomasse durch Anwendung mehrerer Wasch-und Reinigungsschritte auf die aufgeschlossene Bio- masse ohne Extraktion mittels Lösungsmittel beschrieben. Hierzu wird

aufgeschlossene Biomasse von Blakeslea trispora mit Wasser, Lauge, Säure, Butanol und Ethanol gewaschen, so daß eine große Zahl unter- schiedlicher Lösungsmittel und wässriger Medien verwendet werden muss. Die Reinheit des erhaltenen ß-Carotins beträgt 96-98 %. Angaben zur Ausbeute fehlen jedoch.

Die WO 97/36996 A2 beschreibt allgemein eine Verfahren zur Isolierung von Substanzen (u. a. Carotinoide) aus Mikroorganismen, wobei die Sub- stanzen aus der Biomasse mittels Fest/Flüssig-Extraktion isoliert werden.

Ein Zellaufschluß soll hierbei nicht nötig sein, jedoch muss die Biomasse zunächst durch Extrusion in eine granulierte, poröse Gestalt gebracht werden. Wie nur Carotinoide isoliert werden können und wie deren Rein- heit bzw. Ausbeute ist, ist nicht angegeben. Der Rückstand der Extrusion kann anschließend als Futtermitteizusatz verwendet werden.

In allen oben beschriebenen Verfahren müssen große Mengen Lösungs- mittel zur Extraktion eingesetzt werden, um die isolierte Menge an Caroti- noid durch vollständige Extraktion zu erhöhen, und/oder große Mengen wässriger Medien zur Reinigung und zum Waschen eingesetzt werden.

Dies bedingt hohe Kosten und aufwendige Maßnahmen zur Wiederver- wendung bzw. ggf. Abfälle.

Zudem werden die nahrhafte Kulturbrühe und die darin enthaltene Bio- masse nach Extraktion bzw. Isolierung der Carotinoide als Abfall behan- delt. Die oben angegebenen Verfahren haben neben diesen vordergründi- gen Nachteilen einen entscheidenden weiteren Nachteil. Es ist nämlich danach notwendig, die Carotinoide den Nahrungsmitteln nachträglich zu- zusetzen, d. h. sie sind nicht Bestandteil der Nahrungsmittel an sich bzw. nicht in ausreichender Menge. Von großem Vorteil wäre daher, wenn der Gehalt an Carotinoiden in den Nahrungsmitteln bereits durch die eigentli- chen Nahrungsmittel selbst gedeckt würde.

Es ist ebenfalls nötig die Produktivitäten der bisher natürlicherweise pro- duzierten Carotine und deren Vorstufen weiter zu steigern und die Herstel- lung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin zu ermöglichen, die von den Wildtypen der Mikroorganismen bisher nicht oder nur in sehr ge- ringem Maße gebildet und isoliert werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es gentechnisch veränderte Zellen von Blakes- lea-Stämmen, insbesondere Blakeslea trispora bereitzustellen, die Caroti- noide oder deren Vorstufen, insbesondere Xanthophylle, besonders be- vorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin produzieren. Zudem soll das Verfahren die Steigerung der Carotinoid-Produktivität der veränderten Zellen gegenüber den korrespondierenden Wildtypen erlau- ben. Ferner soll das Verfahren die Erzeugung neuer Zellen oder aus ihnen bestehendes Mycel erlauben, die sich für die Verwendung zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen eignen, die bisher nicht in wirt- schaftlich interessanten Mengen aus den natürlich vorkommenden Pilzen gewinnbar waren, insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Asta- xanthin oder Zeaxanthin und Phytoen oder Bixin. Das Verfahren soll dabei eine gentechnische Veränderung von Blakeslea-Stämmen, insbesondere Blakeslea trispora möglich machen und die Herstellung homokaryotischer gentechnisch veränderter Produktions-Stämme erlauben.

Des weiteren soll das Verfahren die Herstellung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle, insbesondere Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phy- toen oder Bixin ermöglichen, die von den Wildtypen der Mikroorganismen bisher nicht oder nur in sehr geringem Maße gebildet und isoliert werden können.

Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Her- stellung von Carotinoiden aus gentechnisch veränderte Zellen von Blakes- lea-Stämmen, insbesondere Blakeslea trispora, zur Verfügung zu stellen, welches den Einsatz geringerer Lösungsmittelmengen erlaubt und im we- sentlichen ohne Abfälle auskommt und zudem eine hohe Reinheit und hö- here Ausbeuten erlaubt.

In diesem Zusammenhang soll ein möglichst großer Anteil der im Fermen- ter vorliegenden Nährstoffe, sowohl Carotinoide als auch weitere sich in den Mikroorganismen befindende, verwertet werden.

Somit ist es auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Carotinoid-haltigen Nahrungsmittels bereitzustellen, wo- bei das Nahrungsmittel selbst den Bedarf an Carotinoiden ohne Zusätze deckt. Insbesondere soll der Nährstoffgehalt der nach dem Verfahren er- hältlichen Nahrungsmittel gegenüber den bisher erhältlichen Nahrungsmit- teln zumindest gleichwertig sein. Ferner soll das Verfahren die effiziente Verwertung der produzierten Carotinoide ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mittels gentechnisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea gelöst, umfassend (i) Transformation mindestens einer der Zellen, (ii) ggf. Homokaryotisierung der aus (i) erhaltenen Zellen, so dass Zellen entstehen, in denen die Kerne in einem oder in mehreren genetischen Merkmalen alle gleichartig verändert sind und diese genetische Veränderung zur Ausprägung bringen, und (iii) Selektion und Vermehrung der gentechnisch veränderten Zelle oder Zellen, (iv) Kultivierung der gentechnisch veränderten Zellen,

(v) Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen ver- änderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe.

Mit der erfindungsgemäßen Methode ist es möglich, Blakeslea gezielt und stabil genetisch zu verändern, um so Mycel aus Zellen mit einheitlichen Kernen zu gewinnen, das Carotinoide oder deren Vorstufen, insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin und Phy- toen oder Bixin produziert. Vorzugsweise handelt es sich um Zellen von Pilzen der Art Blakeslea trispora. Die produzierten Carotinoiden oder de- ren Vorstufen sind dabei im wesentlichen frei von Verunreinigungen erhält- lich und es können hohe Konzentrationen der Carotinoiden oder deren Vorstufen im Kulturmedium erzielt werden.

Unter Transformation wird die Übertragung einer genetischen Information in den Organismus, insbesondere Pilz verstanden. Darunter sollen alle dem Fachmann bekannten Möglichkeiten zur Einschleusung der Informa- tion, insbesondere DNA fallen, z. B. Beschuss mit DNA-beladenen Parti- keln, Transformation mittels Protoplasten, Mikroinjektion von DNA, Elek- troporation, Konjugation oder Transformation kompetenter Zellen, Chemi- kalien oder Agrobakterien vermittelte Transformation. Als genetische In- formation werden ein Genabschnitt, ein Gen oder mehrere Gene verstan- den. Die genetische Information kann z. B. mit Hilfe eines Vectors oder als freie Nukleinsäure (z. B. DNA, RNA) und auf sonstige Weise in die Zellen eingebracht und entweder durch Rekombination ins Wirtsgenom einge- baut oder in freier Form in der Zelle vorliegen. Besonders bevorzugt ist hierbei die homologe Rekombination.

Bevorzugte Transformationsmethode ist die Agrobacterium tumefaciens- vermittelte Transformation. Hierzu wird zunächst die zu transferierende

Spender-DNA in einen Vektor eingefügt, der (i) flankierend zu der zu transferierenden DNA die T-DNA-Enden trägt, der (ii) einen Selektions- marker enthält und der (iii) ggf. Promotoren und Terminatoren für die Ge- nexpression der Spender-DNA aufweist. Dieser Vektor wird in einen Agro- bacterium-tumefaciens-Stamm übertragen, der ein Ti-Plasmid mit den vir- Genen enthält. vir-Gene sind für den DNA-Transfer in Blakeslea verant- wortlich. Mit diesem Zwei-Vektor-System wird die DNA von Agrobacterium in Blakeslea übertragen. Hierzu werden die Agrobakterien zunächst in Gegenwart von Acetosyringone inkubiert. Acetosyringone induziert die vir- Gene. Anschließend werden Sporen von Blakeslea trispora zusammen mit den induzierten Zellen von Agrobacterium tumefaciens auf Acetosyringo- ne-haltigem Medium inkubiert und dann auf Medium übertragen, das eine Selektion der Transformanten, d. h. der gentechnisch veränderten Stämme von Blakeslea ermöglicht.

Der Begriff Vector wird in der vorliegenden Anmeldung als eine Bezeich- nung für ein DNA-Molekül verwendet, das zum Einschleusen und ggf. zur Vermehrung von Fremd-DNA in eine Zelle dient (siehe auch"Vector"in Römpp Lexikon Chemie-CDROM Version 2.0, Stuttgart/New York : Ge- org Thieme Verlag 1999). In der vorliegenden Anmeldung sollen unter dem begriff"Vector"auch Plasmide, Cosmide usw. verstanden werden, die dem gleichen Zweck dienen.

Unter Expression wird in der vorliegenden Anmeldung die Übertragung einer genetischen Information ausgehend von DNA oder RNA in ein Gen- Produkt (hier vorzugsweise Enzyme zur Herstellung von Carotinoiden und insbesondere Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zea- xanthin und Phytoen oder Bixin) verstanden und soll auch den Begriff der Überexpression beinhalten, womit eine verstärkte Expression gemeint ist, so dass ein bereits in der nicht transformierten Zelle (Wildtyp) hergestell-

tes Genprodukt verstärkt produziert wird oder einen großen Teil des ge- samten Gehaltes der Zelle ausmacht.

Unter gentechnische Veränderung soll die Einschleusung genetischer In- formation in einen Empfängerorganismus, so dass diese stabil exprimiert und bei der Zellteilung weitergegeben wird, verstanden werden. In diesem Zusammenhang ist die Homokaryotisierung, die Herstellung von Zellen, die nur einheitliche Kerne enthalten, d. h. Kerne mit gleichem genetischem Informationsgehalt.

Diese Homokaryotisierung ist nur notwendig, wenn die durch Transforma- tion eingeführte genetische Information rezessiv vorliegt, d. h. nicht zur Ausprägung gelangt. Führt die Transformation aber zu einem dominanten Vorliegen der genetischen Information, d. h. wird sie ausgeprägt, so ist eine Homokaryotisierung nicht unbedingt nötig.

Vorzugsweise wird zur Homokaryotisierung eine Selektion der einkernigen Sporen durchgeführt. Von Natur aus ist ein geringer Anteil der Sporen von Blakeslea trispora einkernig, so dass sich diese ggf. nach spezifischer Markierung z. B. Färbung der Zellkerne aussortieren lassen. Dies wird be- vorzugterweise mittels FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) an- hand der geringeren Fluoreszenz der einkernigen Zellen durchgeführt.

Alternativ kann zur Homokaryotisierung zunächst eine Kernreduktion durchgeführt werden. Hierzu kann ein mutagenes Agens eingesetzt wer- den, wobei es sich insbesondere um N-Methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin (MNNG) handelt. Auch die Verwendung von energiereichen Strahlen, wie UV-oder Röntgen-Strahlen zur Kernreduktion ist möglich. Anschließend kann zur Selektion auf das FACS Verfahren oder rezessive Selektions- marker zurückgegriffen werden.

Unter Selektion wird die Auswahl von Zellen verstanden, deren Kerne die- selbe genetische Information beinhalten, d. h. Zellen die die gleichen Ei- genschaften aufweisen, wie Resistenzen oder die Herstellung bzw. ver- mehrte Herstellung eines Produktes. In der Selektion werden neben der FACS Methode bevorzugt 5-Carbon-5-deazariboflavin (DARF) und Hy- gromycin (hyg) oder 5'-Fluororotat (FOA) und Uracil eingesetzt.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector kann derart gestaltet sein, dass die im Vector enthaltene genetische Information in das Genom min- destens einer Zelle integriert wird. Dabei kann genetische Information in der Zelle ausgeschaltet werden. Dies kann direkt, d. h. durch eine Deletion erfolgen. Es ist aber auch möglich, daß der in der Transformation (i) ein- gesetzte Vector derart ausgestaltet ist, dass die im Vector enthaltene ge- netische Information in der Zelle exprimiert wird, d. h. genetische Informa- tion eingefügt wird, die im korrespondierenden Wildtyp nicht vorhanden ist oder die durch die Transformation verstärkt bzw. überexprimiert wird und deren Produkt das Gen ausschaltet. Die eingeführte genetische Informati- on kann aber auch indirekt eine genetische Information in der Zelle aus- schalten, z. B. durch Produktion eines Inhibitors.

Der eingesetzte Vector enthält genetische Informationen oder Teile der genetischen Information zur Herstellung von Carotinoiden oder deren Vor- stufen, insbesondere Carotinen oder Xanthophyllen oder deren Vorstufen. Der eingesetzte Vector enthält vorzugsweise genetische Informationen zur Herstellung von Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, ß- Carotin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Lycopih, Lutein, Bixin oder Phytoen. Ganz beson- ders bevorzugt enthält der Vector Informationen zur Herstellung von Bixin, Phytoen, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin.

Der Vector kann beliebige genetische Informationen zur genetischen Ver- änderungen von Organismen der Gattung Blakeslea enthalten.

Unter"genetischer Information"werden vorzugsweise Nukleinsäuren ver- standen, deren Einbringung in den Organismus der Gattung Blakeslea zu einer genetischen Veränderung in Organismen der Gattung Blakeslea, also beispielsweise zu einer Verursachung, Erhöhung oder Reduzierung von Enzymaktivitäten im Vergleich zum Ausgangsorganismus führen.

Der Vector kann beispielsweise genetische Information zur Herstellung lipophiler Substanzen enthalten wie z. B. Carotinoide und deren Vorstufen, Phospholipide, Triacylglyceride, Steroide, Wachse, fettlösliche Vitamine, Provitamine und Cofaktoren oder genetische Information zur Herstellung hydrophiler Substanzen wie z. B. Eiweiße, Aminosäuren, Nukleotide und wasserlösliche Vitaminen, Provitamine und Cofaktoren.

Bevorzugterweise enthält der eingesetzte Vector genetische Informationen zur Herstellung von Carotinoiden oder Xanthophyllen oder deren Vorstu- fen.

Bevorzugterweise enthält der Vektor genetische Information, die eine Lo- kalisierung der Carotinoidbiosynthese-Enzyme in dem Zellkompartiment bewirkt, in dem die Carotinoidbiosynthese stattfindet.

Besonders bevorzugt sind genetische Informationen zur Herstellung von Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-und 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, Lutein, ß-Carotin, Phytoen und/oder Phytofluen. Ganz besonders bevorzugt sind genetische Informationen zur Herstellung von Phytoen, Bixin, Lycopin, Zeaxanthin, Canthaxanthin und/oder Astaxanthin.

Entsprechend werden in einer bevorzugten Variante der Erfindung Orga- nismen hergestellt und kultiviert, die über eine erhöhte Syntheserate für Zwischenprodukte der Carotinoidbiosynthese verfügen und folglich eine erhöhte Produktivität für Endprodukte der Carotinoidbiosynthese aufwei- sen. Zur Erhöhung der Syntheserate für Zwischenprodukte der Caroti- noidbiosynthese werden insbesondere die Aktivitäten der Enzyme 3- Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoA- Reduktase), Isopentenylpyrophosphat-Isomerase und Geranylpy- rophosphatsynthase gesteigert.

Entsprechend werden in einer besonders bevorzugten Variante der Erfin- dung Organismen hergestellt und kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen.

Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer HMG- CoA-Reduktase (3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase) verstanden.

Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl- Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. gebildete Menge Mevalonat verstanden.

Bei einer erhöhten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase die umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl- Glutaryl-Coenzym-A bzw. die gebildete Menge Mevalonat erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt min- destens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, besonders bevorzugt mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität des Wildtyp.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der HMG- CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase indem man ein Nukleinsäurekon- strukt, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase in den Organismus einbringt, deren Expression in dem Organismus, ver- glichen mit dem Wildtyp, einer reduzierten Regulation unterliegt.

Unter einer reduzierten Regulation verglichen mit dem Wildtyp, wird eine im Vergleich zum vorstehend definierten Wildtyp verringerte, vorzugsweise keine Regulation auf Expressions-oder Proteinebene verstanden.

Die reduzierte Regulation kann vorzugsweise durch einen im Nukleinsäu- rekonstrukt mit der kodierenden Sequenz funktionell verknüpften Promotor erreicht werden, der in dem Organismus verglichen mit dem Wildtyp- Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.

Beispielsweise unterliegen die Promotoren ptef1 aus Blakeslea trispora und pgpdA aus Aspergillus nidulans nur einer reduzierten Regulation und sind daher insbesondere als Promotoren bevorzugt.

Diese Promotoren zeigen eine annähernd konstitutive Expression in Bla- keslea trispora, so dass die transkriptionelle Regulation nicht mehr über die Intermediate der Carotinoidbiosynthese abläuft.

Die reduzierte Regulation kann in einer weiteren bevorzugten Ausfüh- rungsform dadurch erreicht werden, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expressi- on in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, ortholo- gen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Nukleinsäure, die nur den katalytischen Bereich der HMG-CoA-Reduktase kodiert (trunkierte (t- ) HMG-CoA-Reduktase). Die für die Regulation verantwortliche Membran- Domäne fehlt. Die verwendete Nukleinsäure unterliegt somit einer redu- zierten Regulation und führt zu einer Erhöhung der Genexpression der HMG-CoA-Reduktase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man Nukleinsäu- ren in Blakeslea trispora ein, welche die Sequenz SEQ ID. NO. 75 enthal- ten.

Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Orga- nismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologieverglei- che der Sequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO. 75 leicht auf- finden.

Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von

der Sequenz SEQ ID. NO. 75 aus verschiedenen Organismen deren ge- nomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs-und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die reduzierte Re- gulation dadurch erreicht, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nu- kleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt und einen Promotor verwendet, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.

Entsprechend wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung durch die Transformation die Genexpression der Phytoendesaturase ausgeschaltet, so dass das von den Organismen produzierte Phytoen gewonnen werden kann. Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz co- dierend für ein Fragment des Gens der Phytoendesaturase, insbesondere carB aus Blakeslea trispora mit der SEQ ID NO : 69.

Entsprechend wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung durch Transformation die Genexpression der Lycopincyclase ausgeschaltet, so dass das von den Organismen produzierte Lycopin gewonnen werden kann. Der in der Transformation eingesetzte Vektor umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codie- rend für ein Fragment des Gens der Lycopincyclase, insbesondere carR aus Biakeslea trispora.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Organismen der Gat- tung Blakeslea beispielsweise dadurch in die Lage versetzt Xanthophylle,

wie beispielsweise Canthaxanthin, Zeaxanthin oder Astaxanthin herzustel- len, Bixin oder Phytoen, indem in den genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea im Vergleich zum Wildtyp eine Hydroxylase- Aktivität und/oder Ketolase-Aktivität verursacht wird.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält also in einer weite- ren, bevorzugten Variante der Erfindung genetische Informationen, die nach Expression eine Ketolase-und/oder Hydroxylase-Aktivität entfalten, so dass die Organismen Zeaxanthin oder Astaxanthin produzieren.

Unter Ketolase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Ketolase verstan- den.

Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Keto-Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Canthaxanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Ketolase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Ketolase umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. gebil- dete Menge Canthaxanthin verstanden.

Unter dem Begriff"Wildtyp"wird erfindungsgemäß, der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus der Gattung Blakesleaa verstanden.

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff"Organismus"der Aus- gangsorganismus (Wildtyp) der Gattung Blakesleaa oder ein erfindungs-

gemäßer, genetisch veränderter Organismus der Gattung Blakesleaa oder beides verstanden werden.

Vorzugsweise wird unter"Wildtyp"für die Verursachung der Ketolase- Aktivität und für die Verursachung der Hydroxylase-Aktivität jeweils eine Referenz Organismus verstanden.

Dieser Referenzorganismus der Gattung Blakeslea ist Blakeslea trispora ATCC 14271 oder ATCC 14272, die sich lediglich im Paarungstyp unter- scheiden.

Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakesleaa und in Wildtyp-bzw. Re- ferenzorganismen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in Organismen der Gattung Blakes- lea erfolgt in Anlehnung an die Methode von Frazer et al., (J. Biol. Chem. 272 (10) : 6128-6135,1997). Die Ketolase-Aktivität in Extrakten wird mit den Substraten beta-Carotin und Canthaxanthin in Gegenwart von Lipid (Sojalecithin) und Detergens (Natriumcholat) bestimmt. Substrat/Produkt- Verhältnisse aus den Ketolase-Assays werden mittels HPLC ermittelt.

Der erfindungsgemäße genetisch veränderte Organismus der Gattung Blakesleaa weist in dieser, bevorzugten Ausführungsform im Vergleich zum genetisch nicht veränderten Wildtyp eine Ketolase-Aktivität auf und ist somit vorzugsweise in der Lage, transgen eine Ketolase zu exprimieren.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Ketolase-Aktivität in den Organismen der Gattung Blakesleaa durch Ver- ursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketola- se.

In dieser bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Ge- nexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase vorzugsweise durch Einbringen von Nukleinsäuren, die Ketolasen kodieren in die Aus- gangsorganismus der Gattung Blakesleaa.

Dazu kann prinzipiell jedes Ketolase-Gen, also jede Nukleinsäuren die eine Ketolase codiert verwendet werden.

Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA-oder cDNA-Sequenz sein.

Bei genomischen Ketolase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsorganismus der Gattung Blakesleaa nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Ketolase zu exprimieren, bevorzugt bereits pro- zessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase und die entspre- chenden Ketolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wer- den können sind beispielsweise Sequenzen aus : Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO : X86782 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 11, Protein SEQ ID NO : 12), Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO : D45881 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 13, Protein SEQ ID NO : 14),

Agrobacterium aurantiacum (Accession NO : D58420 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 15, Protein SEQ ID NO : 16), Alicaligenes spec. (Accession NO : D58422 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 17, Protein SEQ ID NO : 18), Paracoccus marcusii (Accession NO : Y15112 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 19, Protein SEQ ID NO : 20).

Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO : NP442491 ; Nukleinsäu- re : SEQ ID NO : 21, Protein SEQ ID NO : 22).

Bradyrhizobium sp. (Accession NO : AF218415 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 23, Protein SEQ ID NO : 24).

Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession NO : AP003592, BAB74888 ; Nu- kleinsäure : SEQ ID NO : 25, Protein SEQ ID NO : 26), Nostoc punctiforme ATTC 29133, Nukleinsäure : Acc.-No.

NZ_AABC01000195, Basenpaar 55,604 bis 55,392 (SEQ ID NO : 27) ; Pro- tein : Acc.-No. ZP 00111258 (SEQ ID NO : 28) (als putatives Protein an- notiert), Nostoc punctiforme ATTC 29133, Nukleinsäure : Acc.-No.

NZAABC01000196, Basenpaar 140,571 bis 139,810 (SEQ ID NO : 29), Protein : (SEQ ID NO : 30) (nicht annotiert), Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene, die im er- findungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, lassen sich bei- spielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Aminosäuresequenzen oder der

entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenban- ken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen und insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO : 12,26 und/oder 33 leicht auffinden.

Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 12, 26 und/oder 30 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Se- quenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich be- kannter Weise leicht auffinden.

Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vor- zugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.

Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in : Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2.

Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y.

(1989), 6.3. 1-6.3. 6 beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes aus- gewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit 2X SSC bei 50_C) und solchen mit hoher Strin- genz (mit 0.2X SSC bei 50 C, bevorzugt bei 65C) (20X SSC : 0,3 M Na- triumcitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0).

Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22°C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65°C angehoben werden.

Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS ein- gesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.

Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben : (1) Hybridiserungsbedingungen mit zum Beispiel (i) 4X SSC bei 65°C, oder (ii) 6X SSC bei 45°C, oder (iii) 6X SSC bei 68°C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder (iv) 6X SSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachs- sperma-DNA bei 68°C, oder (v) 6XSSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachs- sperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C, oder (vi) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, oder (vii) 50 % (vol/vol) Formamid, 0. 1 % Rinderserumalbumin, 0.1 % Ficoll, 0.1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, oder (viii) 2X oder 4X SSC bei 50°C (moderate Bedingungen), oder (ix) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (moderate Be- dingungen).

(2) Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel (i) 0.015 M NaCI/0. 0015 M Natriumcitrat/0.1 % SDS bei 50°C, oder (ii) 0. 1X SSC bei 65°C, oder (iii) 0.1X SSC, 0.5 % SDS bei 68°C, oder (iv) 0. 1X SSC, 0.5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder

(v) 0.2X SSC, 0.1 % SDS bei 42°C, oder (vi) 2X SSC bei 65°C (moderate Bedingungen).

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea bringt man Nukleinsäuren ein, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 12 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, be- vorzugt mindestens 70%, 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, insbesondere 91%, 92% ; 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 12 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die wie vorstehend beschrieben durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus an- deren Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Keto- lase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 12 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder De- letion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthal- tend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 26 oder eine von dieser Se- quenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge- leitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, bevorzugt mindestens 70%, 80%, be- sonders bevorzugt mindestens 90%, insbesondere 91%, 92% ; 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 26 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase auf- weist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ke- tolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 26 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder De- letion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthal- tend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 30 oder eine von dieser Se- quenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge- leitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, 40 %, 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, 70 %, bevor- zugter mindestens 80 %, 85 % besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO 30 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ke- tolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 30 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder De- letion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

Unter dem Begriff"Substitution"ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchge- führt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat

wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch lie, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Iden- tität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr ; 5 (2) : 151- 1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Multiple alignment parameter : Gap penalty 10 Gap length penalty 10 Pairwise alignment parameter : K-tuple Gap penalty 3 Window 5 Diagonals saved 5 Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20% auf Amino- säureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 12 oder 26 oder 30 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich

seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 12 oder 26 oder 30, insbe- sondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 20 %, bevorzugt 30%, 40%, 50%, beson- ders bevorzugt 60%, 70%, 80%, insbesondere 85%, 90,95% aufweist.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rücküber- setzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Blakesleaaspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene von Organismen der Gattung Blakesleaa leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nu- kleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO : 11 in die Organismus der Gattung ein.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO : 25 in die Orga- nismus der Gattung ein.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO : 29 in die Orga- nismus der Gattung ein.

Alle vorstehend erwähnten Ketolase-Gene sind weiterhin in an sich be- kannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in be- kannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage,

Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung syntheti- scher Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allge- meine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codie- rend für eine Ketolase, insbesondere der Ketolase Nostoc punctiforme aus mit der SEQ ID NO : 72.

Unter Hydroxylase-Aktivität die Enzymaktivität einer Hydroxylase verstan- den.

Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymati- sche Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Canta- xanthin in Astaxanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Hydroxyase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstan- den.

Bei einer erhöhten Hydroxylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein

Hydroxylase die umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxantin bzw. die gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität minde- stens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt minde- stens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Hydroxylase-Aktivität des Wildtyp.

Die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität in erfindungsgemäßen gene- tisch veränderten Organismen und in Wildtyp-bzw. ReferenzOrganismen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die Aktivität der Hydroxylase wird nach Bouvier et al. (Biochim. Biophys.

Acta 1391 (1998), 320-328) in vitro bestimmt. Es wird zu einer bestimmten Menge an Organismenextrakt Ferredoxin, Ferredoxin-NADP Oxidoreduc- tase, Katalase, NADPH sowie beta-Carotin mit Mono-und Digalaktosyl- glyzeriden zugegeben.

Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, Keller, d'Harlingue und Ca- mara (Xanthophyll biosynthesis : molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L. ; Bio- chim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0.250 ml Volumen durchge- führt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), 0.025 mg Fer- redoxin von Spinat, 0.5 Einheiten Ferredoxin-NADP+ Oxidoreduktase von Spinat, 0.25 mM NADPH, 0.010 mg beta-Carotin (in 0.1 mg Tween 80 emulgiert), 0.05 mM einer Mischung von Mono-und Digalaktosylglyzeri- den (1 : 1), 1 Einheit Katalyse, 200 Mono-und Digalaktosylglyzeriden, (1 : 1),

0.2 mg Rinderserumalbumin und Organismenextrakt in unterschiedlichem Volumen. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 30C inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden mit organischem Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform/Methanoi (2 : 1) extrahiert und mittels HPLC bestimmt.

Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Mo- lecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition ; Arch. Biochem. Biophys.

346 (1) (1997) 53-64) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 250 Di Volumen durchge- führt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), unterschiedliche Mengen an Organismenextrakt, 20 nM Lycopin, 250 Dg an chromoplasti- därem Stromaprotein aus Paprika, 0.2 mM NADP+, 0.2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 10 mi Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst.

Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/Methanol (2 : 1) beendet. Die in Chloroform extra- hierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.

Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fraser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185 (1) (1992) 9-15).

Die Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulati- onsmechanismen auf Expressions-und Proteinebene oder durch Erhö- hung der Genexpression von Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase gegenüber dem Wildtyp.

Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend eine Hy- droxylase gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene

Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des Hydroxylase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Hydro- xylase-Genkopien, also durch Einbringen mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase in denb Organismus der Gattung Blakesleaa.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genex- pression einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase in den Organismus der Gattung Blakesleaa.

Dazu kann prinzipiell jedes Hydroxylase-Gen, also jede Nukleinsäure, die eine Hydroxylase und jede Nukleinsäure, die eine ß-Cyclase codiert, ver- wendet werden.

Bei genomischen Hydroxylase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entspre- chende Hydroxylase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nu- kleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Ein Beispiel für ein Hydroxylase-Gen ist eine Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis mit der Accession No.

AX038729 (WO 0061764 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 31, Protein : SEQ ID NO : 32), aus Erwinia uredovora 20D3 (ATCC 19321, Accession No.

D90087 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 33, Protein : SEQ ID NO : 34) oder Hy- droxylase aus Thermus thermophilus (DE 102 34 126.5) kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76. sowie Hydroxylasen der folgenden Accession Nummern : jembjCAB55626. 1, CAA70427. 1, CAA70888. 1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289-1, AF296158_1, AAC49443. 1, NP_194300. 1,

NP_200070. 1, AAG10430. 1, CAC06712.1, AAM88619. 1, CAC95130.1, AAL80006. 1, AF1622761, AA053295. 1, AAN85601. 1, CRTZERWHE, CRTZPANAN, BAB79605.1, CRTZALCSP, CRTZAGRAU, CAB56060.1, ZP00094836. 1, AAC44852. 1, BAC77670.1, NP_745389. 1, NP344225. 1, NP_849490. 1, ZP00087019. 1, NP 503072. 1, NP852012. 1, NP_115929. 1, ZP_00013255. 1 In den erfindungsgemäßen bevorzugten transgenen Organismen der Gat- tung Blakeslea liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegen- über dem Wildtyp mindestens ein weiteres Hydroxy ! ase-Gen vor.

In dieser bevorzugten Ausführungsform weist die genetisch veränderte Organismus beispielsweise mindestens eine exogene Nukleinsäure, ko- dierend eine Hydroxylase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Hydroxylase auf.

Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Aus- führungsform als Hydroxylase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 32,34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Se- quenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO : 32,34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76 und die die enzymatische Eigenschaft einer Hydroxylase aufweisen.

Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Se- quenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologieverglei-

che der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO : 31,33 oder 76 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 31,33 oder 76 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs-und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhö- hung der Hydroxylase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Hydroxylä- se der Sequenz SEQ ID NO : 32,34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rücküber- setzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die co- don usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, be- kannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nu- kleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO : 31, 33 oder 76 in den Organismus ein.

Alle vorstehend erwähnten Hydroxylase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender,

komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in be- kannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung syntheti- scher Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allge- meine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in weiteren Ausführungsformen der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codie- rend für eine Hydroxlase, insbesondere eine Hydroxiase aus Haemato- coccus pluvialis mit der SEQ ID NO : 70 oder eine Hydroxiase aus Erwinia uredova mit der SEQ ID NO : 71. oder eine Hydroxylase aus Thermus thermophilus kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.

Vorzugsweise wird durch die Transformation das Gen der Phytoendesatu- rase ausgeschaltet.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält vorzugsweise fer- ner die Expression regelnde und unterstützende Bereiche, insbesondere Promotoren und Terminatoren.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält vorzugsweise den gpd und/oder den ptef1 Promotor und/oder den trpC Terminator. Diese haben sich zur Transformation der Blakeslea besonders bewährt. Auch der Einsatz von dem Fachmann geläufigen"inverted repeats" (IR, Römpp Lexikon der Biotechnologie 1992, Thieme Verlag Stuttgart, Seite 407"In- vers repetitive Sequenzen") zur Regelung der Expression bzw. Transkrip- tion liegt im Rahmen der Erfindung.

Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte gpd Promotor die Se- quenz SEQ ID NO : 1 auf. Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte trpC Terminator die Sequenz SEQ ID NO : 2 auf.

Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte ptef1 Promotor die Sequenz SEQ ID NO : 35 auf.

Insbesondere werden dabei der gpd Promotor und der trpC Terminator aus Aspergillus nidulans und der ptef1 Promotor aus Blakeslea trispora eingesetzt.

Insbesondere enthält der in der Transformation (i) eingesetzte Vector ein Resistenzgen. Bevorzugterweise handelt es sich um ein Hygromycin- Resistenzgen (hph), insbesondere eines aus E. coli. Dieses Resistenzgen hat sich bei dem Nachweis der Transformation und Selektion der Zellen als besonders geeignet herausgestellt.

Als Promotor für hph wird also bevorzugt p-gpdA, der Promotor der Glyce- rinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus Aspergillus nidulans genutzt.

Als Terminator für hph wird bevorzugt t-trpC, der Terminator des Gens trpC, codierend für Anthranilatsynthasekomponenten aus Aspergillus nidu- lans genutzt.

Als Vectoren haben sich Abkömmlinge des pBinAHyg Vectors als beson- ders geeignet herausgestellt. Der zur Transformation eingesetzte Vector umfasst also bevorzugterweise die SEQ ID NO : 3.

Hinzu kommen je nach gewünschtem Carotinoid oder dessen Vorstufe eine Sequenz codierend für eine Hydroxylase, Ketolase, Phytoendesatu- rase usw. wie diese zuvor beschrieben wurden. Die Vectoren umfassen also in einer Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO : 69 codierend für die Phytoendesaturase. Die Vectoren umfassen ferner in

einer weiteren Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO : 72 codierend für eine Ketolase. Die Vectoren umfassen weiter in einer weite- ren Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO : 70 oder 71 oder 76 codierend für eine Hydoxylase. Entsprechende Kombinationen der zuvorgenannten Sequenzen liegen ebenso im Rahmen der Erfindung. So umfasst der Vector in einer Ausführungsform sowohl eine Sequenz SEQ ID NO : 72 codierend für eine Ketolase als auch die Sequenz SEQ ID NO : 70 oder 71 oder 76 codierend für eine Hydoxylase und ermöglicht so die Herstellung von Astaxanthin.

Insbesondere sind Vectoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NO : 37 bis 51 und 62 im Rahmen der Erfindung einsetzbar.

Die genetisch veränderten Organismen können zur Produktion von Caroti- noiden, Xanthophyllen oder deren Vorstufen, insbesondere Bixin, Phy- toen, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin verwendet werden.

Auch können neue, im Wildtyp natürlicherweise nicht vorkommende Caro- tinoide durch Einbringung der entsprechenden genetischen Information von den gezielt genetisch veränderten Zellen bzw. dem durch sie gebilde- ten Mycel erzeugt und anschließend isoliert werden.

Die gentechnisch verändertem Zellen werden nach der Selektion kultiviert, so daß Carotinoiden oder deren Vorstufen bereitgestellt werden können.

Bevorzugterweise ist die Gewinnung von Carotinoiden oder deren Vorstu- fen mit den gezielt genetisch veränderten Zellen bzw. das durch sie gebil- dete Mycel möglich.

Die Kultivierung der Organismen unterliegt keinen Besonderheiten. Vor- teilhafterweise werden, insbesondere bei der Verwendung von Blakeslea

trispora, entgegengesetzte Paarungstypen gemeinsam kultiviert, da dies zu besserem Wachstum und Produktion führt.

Wird die gentechnische Veränderung nur in Zellen eines der vorkommen- den Paarungstypen (bei Blakeslea trispora (+) oder (-)) durchgeführt, so wird zur Kultivierung der entsprechend andere, nicht veränderte Paarungs- typ zugesetzt, da so eine gute Produktion der Carotinoide oder deren Vor- stufen aufgrund der von dem zweiten, nicht veränderten Paarungstyp ab- gegebenen Substanzen (z. B. Trisporsäuren) zu erreichen ist. Vorteilhaft- erweise wird jedoch die gentechnische Veränderung in Zellen beider Paa- rungstypen vorgenommen und diese zusammen kultiviert. Hierdurch wird ein besonders gutes Wachstum und eine optimale Produktion der Caroti- noiden oder deren Vorstufen erreicht. Auch eine (künstliche) Zugabe der Trisporsäuren ist möglich und sinnvoll.

Trisporsäuren sind Sexualhormone in Mucorales Pilzen, wie Blakeslea, welche die Bildung von Zygophoren und die Produktion von ß-Carotin sti- mulieren (van den Ende 1968, J. Bacteriol. 96 : 1298-1303, Austin et al.

1969, Nature 223 : 1178-1179, Reschke Tetrahedron Lett. 29 : 3435- 3439, van den Ende 1970, J. Bacteriol. 101 : 423-428).

Es können alle dem Fachmann geläufigen Medien eingesetzt werden, so weit sich diese zur Kultivierung der eingesetzten Organismen und deren Carotinoid Produktion eigenen. Insbesondere müssen bei Einsatz der GVO keine Carotinoidbiosynthese Inhibitoren eingesetzt werden. Die ein- gesetzten Medien beinhalten vorzugsweise Zusätze, wie eine oder mehre- re Kohlenstoffquellen, eine oder mehrere Stickstoffquellen, Mineralsalze und Thiamine. Bevorzugterweise werden Zusätze eingesetzt, wie sie aus der WO 03/038064 A2, Seite 4, Zeile 30 bis Seite 5 Zeile 7 hervorgehen.

Besonders bevorzugt wird als Kohlenstoffquelle Glukose und als Stick-

stoffquelle Asparagin, pflanzliche oder tierische Extrakte, wie Baumwoll- saatöl, Sojaöl, Baumwollsamenmehl oder Hefe-Extrakt zugesetzt.

Die Kultivierung kann entweder unter aeroben oder anaeroben Bedingun- gen durchgeführt werden. Auch eine gemischte, zunächst aerobe und an- schließend anaerobe Kultivierung, wie sie aus der DE 101 30 323 bekannt ist, ist möglich. Temperatur und Luftfeuchtigkeit werden dabei jeweils zum optimalen Wachstum eingestellt. Bevorzugterweise liegt die Temperatur bei der Kultivierung zwischen ca. 20 und ca. 34 °C, insbesondere zwi- schen ca. 26°C und ca. 28°C. Die Kultivierung kann ferner kontinuierlich, batch-oder satzweise erfolgen.

Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise bis zu einem Feststoffgehalt zwi- schen etwa 1 und etwa 20 %, bevorzugt 3 und 15 % und besonders be- vorzugt 4 und 11 %. Insbesondere ist wichtig dass die Kulturbrühe pump- bar bleibt, so dass sie in den nachfolgenden Verfahrensschritten ver-und bearbeitbar bleibt. Ist der Feststoffgehalt zu klein, so muss ein großer Aufwand bei der Aufkonzentrierung oder Trocknung betrieben werden.

Die Kultivierung bzw. Fermentation kann in den üblichen Apparaturen durchgeführt werden. Hierzu kommen alle für die jeweils eingesetzten Mi- kroorganismen und deren Produkte geeigneten Apparaturen in Betracht.

Insbesondere solche, wie sie aus dem Römpp Lexikon Biotechnologie (1992 Georg Thieme Verlag, Stuttgart) unter dem Stichwort"Bioreaktor" auf Seiten 123-126 angegeben sind. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Rührkesselreaktoren mit versch. Einbauten, Blasensäulen verschie- dener Bauarten, etc.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellten Carotinoiden oder deren Vorstufen, insbesondere Bixin, Phytoen oder Xanthophylle, besonders bevorzugt Astaxanthin oder Zeaxanthin eignen sich besonders

zur Herstellung von Zusätzen für Futter-, Nahrungs-und Nahrungsergän- zungsmittel, kosmetischen, pharmazeutischen oder dermatologischen Zu- bereitungen.

Die Bereitstellung des von den gentechnisch veränderten Zellen produ- zierten Carotinoids oder der von den gentechnischen veränderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe aus der Kultur der gentechnisch veränder- ten Mikroorganismen erfolgt nach zwei Varianten a) oder b), becorzugt ist auch eine Kombination aus a) und b) ; a : I) Abtrennung der Biomasse, IA) ggf. Waschen der Biomasse mit einem Carotinoide nicht lösenden Lösungsmittel, insbesondere Wasser, IB) Sterilisation und Zellaufschluß der Biomasse, IC) ggf. Trocknung und/oder homogene Verteilung und II) partielle Extraktion der Carotinoide aus der aufgeschlosse- nen Biomasse mittels eines Carotinoide lösenden Lösungs- mittels und Trennung des Lösungsmittels von der Biomasse, IIA) 1) Entfernung von Lösemittelresten aus der Carotinoid- haltigen Biomasse, 2) ggf. homogene Suspension der Biomasse mit einem Biomasse-Feststoffgehalt > 2 % und < 50 %, und 3) Trocknung der Biomasse bzw. Suspension zur Her- stellung des Nahrungsmittels, IIB) 1) Kristallisation der Carotinoide aus dem verwendeten Lö- sungsmittel und Isolierung der Carotinoid-Kristalle, insbe- sondere durch Filtration ;

oder b) : I) Homogene Suspendierung der Feststoffe der Kulturbrühe und IIA) bei einem Feststoffgehalt der Kulturbrühe von > 2 % 1) ggf. Konzentration der Kulturbrühe auf einen Fest- stoffgehalt < 50 % und 2) Trocknung der Kulturbrühe zur Herstellung des Nah- rungsmittels oder IIB) bei einem Feststoffgehalt von < 2 % der Kulturbrühe, 1) Konzentration der Kulturbrühe auf einen Feststoffge- halt > 2 % und < 50 % und 2) Trocknung der Suspension zur Herstellung des Nah- rungsmittels, oder IIC) unabhängig vom Feststoffgehalt der Kulturbrühe, 1) Abtrennung der Biomasse, 2) ggf. Waschen der Biomasse mit Carotinoide nicht lö- senden Lösungsmitteln, insbesondere Wasser, 3) Sterilisation und Zellaufschluß, 4) ggf. Trocknung und homogene Verteilung, 5) partielle Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse mittels eines Carotinoide lösendes Lösungsmittels, 5a) Abtrennung der Carotinoid-haltigen Biomasse vom Carotinoid-haltigen Lösungsmittel,

5b) Entfernung von Lösemittelresten aus der Biomasse und 5c) Trocknung der Biomasse zur Herstellung des Nah- rungsmittels, 6) Kristallisation der Carotinoide aus dem in 5a) verwen- deten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid- Kristalle, insbesondere durch Filtration.

Die erfindungsgemäße Bereitstellung des von den gentechnisch veränder- ten Zellen produzierten Carotinoids oder der von den gentechnischen ver- änderten Zellen produzierten Carotinoidvorstufe aus der Kultur der gen- technisch veränderten Mikroorganismen erfolgt nach zwei Varianten a) oder b) ermöglicht die gleichzeitige Herstellung von zwei Produkten.

Durch die erfindungsgemäße Kombination der Herstellung von zwei Pro- dukten, insbesondere bei der Bereitstellung gemäß Variante a), nämlich dem mindestens einem Carotinoid und dem Carotinoid-haltigem Nah- rungsmittel ist keine vollständige Extraktion der Carotinoide aus der Bio- masse nötig, so dass der Aufwand bei der Extraktion geringer ausfällt. Das Carotinoid muss trotz vollständiger Verwertung nur partiell extrahiert wer- den, ohne dass es zu Produktverlusten kommt. Dies bedingt geringere Lösungsmittelmengen und damit einhergehend einen geringeren Aufwand bei den Maßnahmen zu deren Wiederverwendung. Zudem werden Abfälle weitestgehend vermieden, da die Biomasse nicht als Abfall anfällt, son- dern zum hochwertigen Nahrungsmittel weiterverarbeitet wird. Somit er- geben sich geringere Kosten für die Verfahren durch Ausnutzen von Syn- ergien.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Bereitstellung gemäß Vari- ante b) erhältliche Nahrungsmittel enthalten also bereits nach der Herstel-

lung große Mengen an Carotinoiden, die nicht zugesetzt werden müssen.

Dadurch, dass das Nahrungsmittel neben dem mindestens einen Caroti- noid auch Blakeslea trispora enthält ist sein Nährstoffgehalt zudem gestei- gert. Insbesondere ist der Nährstoffgehalt nach den bevorzugten Alternati- ven IIA und IIB stark gesteigert, da es neben dem mindestens einen Caro- tinoid und Blakeslea trispora zusätzlich alle Medienbestandteile der Fer- mentation enthält. Ferner benötigt das Verfahren keine zusätzlichen, auf- wendigen Aufarbeitungs-und Herstellungsschritte, sondern die homogeni- sierte und ggf. entwässerte Blakeslea trispora-haltige Kulturbrühe kann direkt ohne Umwege zur Herstellung des Nahrungsmittels getrocknet wer- den. Es fallen demnach praktisch keine Abfälle an, abgesehen vom wäss- rigem Medium bei der Alternative IIB, welches jedoch unproblematisch in einer Kläranlage gereinigt werden kann. Zusätzlich wird in allen drei Alter- nativen die gesamte Produktionsmenge Carotinoide ohne oder mit nur marginalen Verlusten verwertet, da gemäß IIA und IIB keine verlustreichen Trenn-bzw. Aufarbeitungsschritte vorgenommen werden müssen. Bei der Alternative IIIC wird ebenfalls die gesamte Produktionsmenge Carotinoide ohne oder mit nur marginalen Verlusten verwertet, da ein Teil in der Bio- masse zum Nahrungsmittel verarbeitet wird und der andere Teil zur Ge- winnung reiner Carotinoide extrahiert wird. Durch die erfindungsgemäße Kombination der Herstellung von zwei Produkten gemäß IIC, nämlich dem Carotinoid-haltigem Nahrungsmittel und den Carotinoiden an sich, ist vor- teilhaft, dass wiederum im wesentlichen keine Abfälle entstehen und eine vollständige Extraktion der Carotinoide aus der Biomasse unnötig ist, so dass sonst bei der Extraktion anfallende Aufwand geringer ausfällt. Das oder die wertvollen Carotinoide müssen trotz vollständiger Verwertung nur partiell extrahiert werden, ohne dass es zu Produktverlusten kommt. Dies bedingt geringere Lösungsmittelmengen und damit einhergehend einen geringeren Aufwand bei den Maßnahmen zu deren Wiederverwendung.

Zudem werden Abfälle weitestgehend vermieden, da die Biomasse nicht als Abfall anfällt, sondern zum hochwertigen Nahrungsmittel verarbeitet

wird. Somit ergeben sich geringere Kosten für die Verfahren durch Aus- nutzen von Synergien.

Unter"hochrein"soll in der vorliegenden Anmeldung eine Reinheit des mindestens einen Carotinoids von mindestens 95%, bevorzugt > 95%, vorzugsweise > 96%, besonders bevorzugt > 97%, ganz besonders be- vorzugt > 98%, höchst bevorzugt > 99% verstanden werden.

Als nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbare Carotinoide kommen alle natürlichen und künstlichen Carotine und Xanthophylle in Betracht. Insbesondere ist das mindestens eine Carotinoid aus der Grup- pe bestehend aus Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, ß-Carotin, Lutein, Phytofluen, Bixin und Phytoen ausgewählt. Bevorzugterweise handelt es sich um Astaxanthin oder Zeaxanthin. Die Carotinoide können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einzeln oder als Gemische von zwei oder mehrerer der zuvor genannten Carotinoide erhalten werden. Insbesondere bei Einsatz der weiter unten angegebenen gentechnisch veränderten Organismen (GVO) kann das oder können die Carotinoide gezielt hergestellt werden.

Als Nahrungsmittel werden Zusammensetzungen angesehen, die der Er- nährung dienen. Darunter fallen auch Zusammensetzungen für die Ergän- zung der Ernährung. Insbesondere werden als Nahrungsmittel Tierfutter- mittel und Tierfutterergänzungsmittel angesehen.

Nach der Kultivierung kann, gemäß Variante a) der Bereitstellung, die Biomasse von der Kulturbrühe abgetrennt. Hierzu können alle dem Fach- mann geläufigen und üblicherweise einsetzbaren Methoden zur fest/flüssig-Trennung eingesetzt werden. Hierunter fallen insbesondere die mechanischen Verfahren, wie Filtration und Zentrifugation, die auf der

Ausnutzung von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Druck oder Vakuum beru- hen. Zu den einsetzbaren Verfahren und Apparaten gehören daneben u. a. Querstromfiltration bzw. Mebrantechniken wie Osmose, umgekehrte Osmose, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Kuchenfiltrationsver- fahren (z. B. mittels Pressfilterautomaten, (Membran-, Rahmen-oder Kammer-) Filterpressen, (Rühr-) drucknutschen, Saugnutschen, (Vakuum- ) bandfiltern, (Vakuum-) Trommelfiltern, Drehfiltern, Kerzenfiltern), Zentrifu- gationsverfahren mittels kontinuierlich oder diskontinuierlich betriebener Zentrifugen oder Filterzentrifugen (z. B. Stülpfilterzentrifugen, Schälzentri- fugen, Schubzentrifugen, Siebschneckenzentrifugen, Gleitzentrifugen, Se- paratoren oder Dekantern), Verfahren unter Ausnutzung der Schwerkraft wie Flotation, Sedimentation, Sink-Schwimm-Aufbereitung und Klären.

Bevorzugterweise erfolgt die Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrü- he durch Zentrifugation mittels eines Dekanters oder durch Filtration, mit- tels einer Mebranfiltrationseinheit durchgeführt.

In dem zweiten Schritt der Bereitstellung nach Variante b) wird eine ho- mogen verteilte Suspension der Feststoffe in der Kulturbrühe erzeugt.

Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetz- baren Methoden verwendet werden. Insbesondere kommen dazu Disper- giergeräte, wie ein Ultra-Turrax (íg) (im Labormaßstab) zum Einsatz. Ein Zellaufschluss ist nicht notwendig, kann aber vorgenommen werden.

Falls notwendig, kann die Kulturbrühe entwässert werden, um einen ge- eigneten Feststoffgehalt zwischen > 2 % und < 50 % zu erreichen. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetzbaren Methoden zur fest/flüssig-Trennung eingesetzt werden. Hierunter fallen insbesondere die mechanischen Verfahren, wie Filtration und Zentrifugati- on, die auf der Ausnutzung von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Druck oder Vakuum beruhen. Zu den einsetzbaren Verfahren und Apparaten gehören daneben u. a. Querstromfiltration bzw. Mebrantechniken wie Osmose,

umgekehrte Osmose, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Kuchen- filtrationsverfahren (z. B. mittels Pressfilterautomaten, (Membran-, Rah- men-oder Kammer-) Filterpressen, (Rühr-) drucknutschen, Saugnutschen, (Vakuum-) bandfiltern, (Vakuum-) Trommelfiltern, Drehfiltern, Kerzenfiltern), Zentrifugationsverfahren mittels kontinuierlich oder diskontinuierlich be- triebener Zentrifugen oder Filterzentrifugen (z. B. Stülpfilterzentrifugen, Schälzentrifugen, Schubzentrifugen, Siebschneckenzentrifugen, Gleiten- trifugen, Separatoren oder Dekantern), Verfahren unter Ausnutzung der Schwerkraft wie Flotation, Sedimentation, Sink-Schwimm-Aufbereitung und Klären. Bevorzugterweise erfolgt die Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrühe durch Zentrifugation mittels eines Dekanters oder wird durch Filtration, mittels einer Mebranfiltrationseinheit durchgeführt. An- schließend wird die Kulturbrühe getrocknet. Hierzu können wiederum alle dem Fachmann bekannten Verfahren und Apparate eingesetzt wer- den. insbesondere eignen sich Apparate zur thermischen Trocknung wie Konvektions-, Kontakt-und Strahlungstrocknung, z. B. Horden-, Kammer-, Kanal-, Flachbahn-, Teller-, Drehtrommel-, Rieselschacht-, Siebband-, <BR> <BR> <BR> Strom-, , Wirbelschicht-, Fließbett-, Schaufel-, Kugelbett-,, Heizteller-, Dünnschicht-, Walzen-, Band-, Siebtrommel-, Schnecken-, Taumel-, Kon- takt-Scheiben-, Infrarot-, Mikrowellen-und Gefriertrockner, Sprühtrockner oder Sprühtrockner mit integrierter Wirbelschicht, die durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom ggf. beheizt und ggf. unter Vakuum betrieben werden. Die Betriebsweie kann dabei je nach Apparat kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Daneben oder damit in Kombination können die oben bereits angegeben mechanischen Verfahren zur Fest/flüssig- Trennung verwendet werden.

Eine Granulierung durch Extrusion wie dies aus der WO 97/36996 A2 her- vorgeht ist jedoch nicht notwendig. Durch die Trocknung wird das Nah- rungsmittel haltbar und lagerfähig.

Insbesondere wird die Kulturbrühe sprühgetrocknet. Bevorzugt wird zur Trocknung die Sprühtrocknung eingesetzt, wie sie aus der DE 101 04 494 A1, DE-A-12 11 911 oder EP 0 410 236 A1 bekannt sind. Ergänzend wird auf vgl. Römpp Lexikon Chemie CD-ROM Version 2.0, Georg Thieme Ver- lag, 1999, "Sprühtrocknung"und Römpp Lexikon Biotechnologie, Georg Thieme Verlag, 1992, "Zerstäubungstrocknung"verwiesen. Die Sprüh- trocknung bietet den Vorteil der kurzen Verweilzeit des Produkts in der heißen Zone des Trockners, so dass eine besonders schonende Trock- nung erzielt wird.

Bei der Sprühtrocknung werden Eingangstemperaturen von ca. 115°C- 180°C, bevorzugt 120°C-130°C, und Ausgangstemperaturen von ca.

50°C-80°C, bevorzugt 55°C-70°C gewählt. Als Trocknungsgas wird vorzugsweise Stickstoff eingesetzt.

Gegebenenfalls können zur Erzielung einer besseren Rieselfähigkeit Rie- selhilfsmittel, wie Kieselsäuren etc. zugesetzt werden. Der Einsatz von inerten Trägermaterialien, d. h. niedermolekularen anorganischen Trägern wie NaCI, CaC03, Na2S04 oder MgS04, organischen Trägern wie Glu- cose, Fructose, Saccharose, Dextrine oder Stärkeprodukten (Roggen-, Gersten-, Hafermehl, Weizengrießkleie) ist denkbar.

Das getrocknete Produkt weist bevorzugt eine Restfeuchte von weniger als 10 %, bevorzugt weniger als 5 % bezogen auf die Trockenmasse auf. Sein Carotinoidgehalt liegt zwischen 0,05 und 20 %, insbesondere 1 und 10 % bezogen auf die Trockenmasse.

Das so hergestellte Nahrungsmittel kann entweder direkt verwendet wer- den oder mittels weiterer Zusätze aufbereitet werden, so wie dies eben- falls aus der DE 101 04 494 A1 bekannt ist.

Gemäß der Alternative IIC wird nach der Kultivierung und vor der Trock- nung der Biomasse, die Biomasse von der Kulturbrühe zunächst abge- trennt. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen und üblicherweise einsetzbaren Methoden zur fest/flüssig-Trennung eingesetzt werden, wie sie bereits oben bei der Entwässerung genannt wurden. Bevorzugterweise erfolgt die Abtrennung der Biomasse von der Kulturbrühe durch Zentrifu- gation mittels eines Dekanters oder durch Membranfiltration durchgeführt.

Anschließend erfolgt optional das Waschen der Biomasse mit einem Caro- tinoide nicht lösenden Lösungsmittel, insbesondere Wasser, wodurch ins- besondere Wasser lösliche Komponenten entfernt werden. Dieser Schritt kann gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Carotinoide nicht lösen- den Lösungsmittel (z. B. Alkohole) ergänzt werden, was aber im Rahmen der Erfindung nicht notwendig ist und zur Vermeidung von Abfällen nicht bevorzugt ist.

Anschließend erfolgen die Sterilisation und der sich anschließende oder gleichzeitige Zellaufschluß der Zellen in der Biomasse. Durch die Sterilisa- tion werden die Mikroorganismen abgetötet und gegebenenfalls vorhan- dene Enzymaktivität beendet. Dies ist zur Verhinderung des Abbaus der Biomasse bzw. der darin enthaltenen Stoffe, insbesondere der Carotinoide und für die Haltbarkeit von Bedeutung.

Die Sterilisation kann mit einem üblichen, dem Fachmann geläufigen Ver- fahren durchgeführt werden. Hierzu gehören die Sterilisation mittels Dampf, insbesondere bei Temperaturen größer 120 °C unter Druck (2 : 1 bar) und Zeitdauern von 2 : ca. 20 min. sowie die Behandlung mit energie- reichen Strahlen, wie UV-, Mikrowellen, Gamma-oder Beta-Strahlen. Be- vorzugterweise erfolgt die Sterilisation im Rahmen des erfindungsgemä- ßen Verfahrens mittels Dampf oder Mikrowellenstrahlung.

Durch den nachfolgenden oder gleichzeitigen Zellaufschluß, werden die innerhalb der Zellen vorliegenden Carotinoide freigesetzt. Der Zellauf- schluß kann ebenfalls mit allen dem Fachmann bekannten üblichen Ver- fahren erfolgen. Hierzu gehören mechanische und nicht mechanische Me- thoden. Zu den mechanischen Methoden zählen Trockenmahlen, Naß- mahlen, Rühren, Homogenisieren (z. B. im Hochdruckhomogenisator) und die Verwendung von Ultraschall oder Mikrowellen. Als nicht mechanische Methoden kommen physikalische, chemische und biochemische Metho- den in Betracht. Hierzu gehören Kurzzeiterhitzen, Kurzzeitgefrieren, Os- motischer Schock, Trocknung, Behandlung mit Säuren oder Laugen sowie ein enzymatischer Aufschluss. Günstiger Weise wird zum Zellaufschluss jedoch das zur Sterilisation verwendete Verfahren eingesetzt. Bevorzug- terweise wird also ebenfalls der Zellaufschluss mittels Dampf oder Mikro- wellen Strahlung durchgeführt.

Die Sterilisation und/oder der Zellaufschluss können kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.

Die Sterilisation und/oder der Zellaufschluss können im zur Kultivierung eingesetzten Bioreaktor oder in anderen Apparaturen, wie Autoklaven usw. durchgeführt werden. Bei kontinuierlicher Durchführung kann das aus der WO 01/83437 A1 bekannte Mikrowellen verwendende Verfahren und entsprechende Apparaturen eingesetzt werden.

Vor der Extraktion wird die Biomasse gegebenenfalls getrocknet und/oder homogenisiert. Hierzu können wiederum alle dem Fachmann bekannten üblichen Verfahren und Geräte eingesetzt werden. Insbesondere eignen sich Apparate zur thermischen Trocknung wie Konvektions-, Kontakt-und Strahlungstrocknung, z. B. Horden-, Kammer-, Kanal-, Flachbahn-, Teller-, Drehtrommel-, Rieselschacht-, Siebband-, Strom-, , Wirbelschicht-, Fließ- bett-, Schaufel-, Kugelbett-,, Heizteller-, Dünnschicht-, Walzen-, Band-,

Siebtrommel-, Schnecken-, Taumel-, Kontakt-Scheiben-, Infrarot-, Mikro- wellen-und Gefriertrockner, Sprühtrockner oder Sprühtrockner mit inte- grierter Wirbelschicht, die durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom ggf. beheizt und ggf. unter Vakuum betrieben werden. Die Betriebsweise kann dabei je nach Apparat kontinuierlich oder diskontinuierlich sein.

Daneben oder damit in Kombination können die oben bereits angegeben mechanischen Verfahren zur Fest/flüssig-Trennung verwendet werden.

Eine Granulierung durch Extrusion wie dies aus der WO 97/36996 A2 her- vorgeht ist jedoch nicht notwendig.

Anschließend erfolgt die partielle Extraktion der Carotinoide aus der auf- geschlossenen Biomasse mittels eines Carotinoide lösenden Lösungsmit- tels und Trennung des Lösungsmittels von der Biomasse. Sowohl in dem Lösungsmittel als auch in der Biomasse sind nun Carotinoide enthalten, wobei sich in dem Lösungsmittel bevorzugterweise der Großteil der Caro- tinoide befindet.

Aus dem Lösungsmittel werden anschließend die hochreinen Carotinoide isoliert, wohingegen die Biomasse zu einem hochwertigen, Carotinoid- haltigen Nahrungsmittel weiterverarbeitet wird, welches durch den vorher- gehenden Zellaufschluss auch eine gute Bioverfügbarkeit der Carotinoide aufweist.

Unter partieller Extraktion soll demnach die bewusst unvollständige Extraktion der Carotinoiden aus der Biomasse verstanden werden (vgl. oben). Bevorzugterweise wird im Rahmen der Erfindung durch die Extrak- tion also weniger als 100 % der in der Biomasse enthaltenen Gesamt- menge der Carotinoide aus dieser extrahiert.

Dies ist von großem Vorteil, da der Aufwand zur Extraktion mit der ab- nehmenden Menge Carotinoid in der Biomasse überproportional zunimmt.

Zur Extraktion werden Lösungsmittel eingesetzt, die Carotinoide lösen, wie z. B. Hexan, Ethylacetat, Dichlormethan oder überkritisches Kohlendioxid. Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß als Lösungsmittel Dichlormethan oder überkritisches Kohlendioxid eingesetzt, wobei beim Einsatz von überkritischem Kohlendioxid die darin enthaltenen Carotinoide anschlie- ßend in Dichlormethan überführt werden können oder das Wertprodukt direkt durch Entspannung des Kohlendioxids gewonnen werden kann.

Dabei werden die Mengen der Lösungsmittel und Durchmischungszeiten derart gewählt, dass die gewünschte Menge Carotinoide aus der Bio- masse extrahiert wird. Insbesondere wird der Extraktionsschritt nur einmal durchgeführt, was technisch und wirtschaftlich sinnvoll ist (vgl. oben).

Zur Durchführung der Extraktion können alle üblichen Verfahren und Ap- paraturen eingesetzt werden. Insbesondere wird bei nicht getrockneter, aber aufgeschlossener Biomasse eine flüssig/flüssig (Carotinoid liegt in flüssigen Zellbestandteilen gelöst vor und wird daraus extrahiert und bei getrockneter Biomasse eine fest/flüssig Extraktion durchgeführt. Es kön- nen Kalt-und Heißextraktion in bestimmten Temperaturbereichen, sowohl kontinuierliche (z. B. Soxhlet-Extraktion, Perforation und Perkolation) als auch diskontinuierliche Verfahren, zu denen beispielsweise Ausschütteln, Auslaugen, Auskochen und Digerieren gehören, verwendet werden. Sie können auch im Gegenstromverfahren durchgeführt werden.

Für die flüssig/flüssig Extraktion können beispielsweise Blasensäulen,, pulsierende Kolonnen, Kolonnen mit rotierenden Einbauten, Mixer-Settler- Batterien oder Rührkessel usw. verwendet werden.

Die fest/flüssig Extraktion kann mittels üblicher Apparaturen durchgeführt werden. Vorzugsweise werden Rührkessel oder Mixer-Settler-Apparate eingesetzt.

Alternativ kann der Zellaufschluß ohne vorherige Abtrennung des Fermen- taionsmediums erfolgen und sich dann eine direkte Trennung einer sich bildenden Carotinoidsuspension von der Biomasse z. B. mittels eines De- kanters durchgeführt werden. Anschließend wird die Carotinoidsuspension in Dichlormethan aufgenommen und weiterverarbeitet oder alternativ durch Wäschen mit verschiedenen wässrigen Lösungen aufgereinigt.

Zur Isolierung der hochreinen Carotinoide aus dem Lösungsmittel wird eine Kristallisation der Carotinoide aus dem verwendeten Lösungsmittel und Isolierung der Carotinoid-Kristalle, insbesondere durch Filtration durchgeführt. Die verbleibende Mutterlauge kann nach Destillation dem Verfahren erneut zugeführt werden, so dass Produktverluste trotz gerin- gem Aufwand minimiert werden.

Die Kristallisation kann wie üblich erfolgen. Ergänzend wird auf vgl.

Römpp Lexikon Chemie CD-ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999,"Kristallisation"verwiesen.

Bevorzugterweise erfolgt die Kristallisation durch graduellen Lösungsmit- telaustausch gegen ein Carotinoide nicht lösendes Lösungsmittel. Es wird also kontinuierlich die Löslichkeit der Carotinoide erniedrigt, bis diese als reine Kristalle ausfallen. Hierbei wird vorzugsweise ein"niederer Alkohol" oder Wasser verwendet. Als niederer Alkohol werden aliphatische Alkoho- le mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen angesehen. Hierzu gehören Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, 1-Butanol, tert.-Butanol und sec.-Butanol.

Bevorzugterweise wird Methanol eingesetzt.

Die Carotinoid-Lösung kann dabei erwärmt werden, wobei die Temperatur vorzugsweise < 100 °C, insbesondere < 60 °C gehalten wird, so dass Dichlormethan abdestilliert wird. Auch der Einsatz von Vakuum ist denk-

bar. Anschließend werden die CarotinoidKristalle isoliert, welches durch übliche Maßnahmen, insbesondere durch Filtration erfolgen kann. Es kön- nen sich, falls gewünscht, weitere optional Trocknungs-und/oder Reini- gungsschritte anschließen. Notwendig sind diese jedoch nicht, da die Ca- rotinoid Kristalle bereits hochrein sind.

Die Carotinoide fallen als hochreine Kristalle an und weisen eine Reinheit von mindestens 95%, bevorzugt > 95%, vorzugsweise > 96%, besonders bevorzugt > 97%, ganz besonders bevorzugt > 98%, höchst bevorzugt > 99% auf.

Die erzielbaren Ausbeuten liegen zwischen 45% und 95%, bevorzugt zwi- schen 70% und 95% bezogen auf die in der Kulturbrühe vorliegende Men- ge (0,5-15 g/L, bevorzugt 1-10 g/L).

Zur Weiterverarbeitung der ebenfalls Carotinoid-haltigen Biomasse zu ei- nem hochwertigen Nahrungsmittel wird zunächst eine Entfernung von Lö- semittelresten aus der Carotinoid-haltigen Biomasse vorgenommen. Hier- zu erfolgt bevorzugterweise eine Wasserdampfdestillationen bzw. ein so genanntes Strippen mit Wasserdampf (vgl. Römpp Lexikon Chemie CD- ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999, "Strippen").

Danach kann gegebenenfalls die Biomasse in der oben abgetrennten Kul- turbrühe homogen suspendiert werden, wobei ein Feststoffgehalt > 100 g/L und < 600 g/L eingehalten werden sollte, so daß die nachfolgende Trocknung der Biomasse bzw. Suspension zur Herstellung des Nah- rungsmittels ohne technische Schwierigkeiten erfolgen kann. D. h. die Sus- pension muß pumpbar sein. Als Trocknungsverfahren kommen alle bereits genannten Verfahren und Apparaturen in Frage. Insbesondere wird zur Trocknung die Sprühtrocknung eingesetzt. Dabei kann wie aus der DE 101 04 494 A1 bekannt verfahren werden.

Bei der Sprühtrocknung werden Eingangstemperaturen von ca. 100°C- 180°C, bevorzugt 120°C-130°C, und Ausgangstemperaturen von ca. 50- 80°C, bevorzugt 55°C-70°C gewählt. Als Trocknungsgas wird vorzugs- weise Stickstoff eingesetzt.

Das so hergestellte Nahrungsmittel kann entweder direkt verwendet wer- den oder mittels weiterer Zusätze aufbereitet werden, so wie dies eben- falls aus der DE 101 04 494 A1 bekannt ist.

Als Nahrungsmittel werden Zusammensetzungen angesehen, die der Er- nährung dienen. Darunter fallen auch Zusammensetzungen für die Ergän- zung der Ernährung. Insbesondere werden als Nahrungsmittel Tierfutter- mittel und Tierfutterergänzungsmittel angesehen. Ergänzend wird auf Römpp Lexikon Chemie CD-ROM Version 2.0, Georg Thieme Verlag, 1999,"Nahrungsmittel"verwiesen.

Das trockene Produkt weist bevorzugt eine Restfeuchte von weniger als 5 % bezogen auf die Trockenmasse auf. Sein Carotinoidgehalt liegt zwi- schen 0,05 und 20 %, insbesondere 1 und 10 % bezogen auf die Trok- kenmasse. Der gewünschte Carotinoidgehalt ist über das Ausmaß der Extraktion steuerbar (vgl. oben).

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Nahrungsmittel ent- halten also bereits nach der Herstellung große Mengen an Carotinoiden, die nicht zugesetzt werden müssen. Dadurch, dass das Nahrungsmittel neben dem mindestens einen Carotinoid auch Biomasse enthält ist sein Nährstoffgehalt zudem gesteigert. Insbesondere ist der Nährstoffgehalt nach der bevorzugten Alternative stark gesteigert, im dem es neben dem mindestens einen Carotinoid und Biomasse zusätzlich alle Medienbe- standteile der Fermentation enthält. Es fallen demnach praktisch keine

Abfälle an, abgesehen von wässrigen Medien, welche jedoch unproblema- tisch in einer Kläranlage gereinigt werden können. Zusätzlich wird die ge- samte Produktionsmenge Carotinoide ohne oder mit nur marginalen Ver- lusten verwertet, da keine verlustreichen Trenn-bzw. Aufarbeitungsschrit- te vorgenommen werden müssen, um die gesamte Menge Carotinoid zu extrahieren.

Die in dem oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren einge- setzten Lösungsmittel werden alle soweit wie möglich aufbereitet und an- schließend wieder verwendet bzw. dem Verfahren erneut zugeführt. Ins- besondere wird das eingesetzte Dichlormethan bereits beim Lösungmitte- austausch gereinigt und steht anschließend zur erneuten Verwendung bereit. Der niedere Alkohol bzw. das Methanol wird z. B. destillativ gerei- nigt und ebenfalls wieder verwendet. Als Abfall fallen lediglich der Destilla- tionssumpf an, der zusammen mit den wässrigen Medien gefahrlos einer Kläranlage zugeführt werden kann, wo letztendlich nur eine geringe Men- ge Klärschlamm als tatsächlicher Abfall anfällt. Somit ist das beschriebene Verfahren im wesentlichen abfallfrei.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Beispielen näher ausgeführt.

A) Kultivierung von Blakeslea trispora Folgende Medien wurden zur Fermentation von Blakeslea trispora zur Produktion der Carotinoide eingesetzt : Medium 1 : Glucose 10,00 g/l Baumwollsaatoel 30,00 g/l Sojaoel 30,00 g/l

Dextrin 60, 00 g/1 Baumwollsamenmehl 75,00 g/1 Triton X 100 1,20 g/l Ascorbinsäure 6, 00 g/1 Milchsäure 2,00 g/l KH2P04 0,50 g/l MnSO4 x H2O 100 mg/l Thiamin-HCI 2 mg/l Isoniazid (Isonicotinsäurehydrazid) 0, 75 g/l Der pH wurde auf 6,5 eingestellt.

Medium 2 : Glucose 20 g/l Asparagin 2,00 g/l KH2P04 5,00 g/l MgS04 x 7 H20 0,50 g/l CaCl2 28 mg/l Thiamin-HCI 1,00 mg/l Citronensäure 2,00 mg/l Fe (NO3) 3 x 9 H2O 1,50 mg/l ZnS04 x 7 H20 1,00 mg/l MnS04 x H20 0,30 mg/l CuSO4 x 5 H20 0,05 mg/l Na2MoO4 x 2 H20 0,05 mg/l Medium 3 Glucose 70,00 g/l Asparagin 2,00 g/l Hefe Extrakt 1,00 g/l

KH2P04 1, 50 ! MgS04 x 7 H20 0,50 g/1 Span 20 1,00 g/l Thiamin-HCI 5,0 mg/ ! Der pH wurde auf 5,5 eingestellt.

Mit Sporensuspensionen von Blakeslea trispora ATCC 14272 Mating Type (-) die 108 (für Medium 2) bzw. 107 (für Medium 1 und 3) Sporen enthiel- ten, wurden je 200 ml der beschriebenen Medien angeimpft. Die Kultivie- rung erfolgte jeweils in 1-l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Mit jedem Medium wurden sechs identische Kolben angesetzt und über 7 Tage bei 28°C und 140 UpM im Schüttler inkubiert.

B) Gentechnische Veränderung von Blakeslea Trispora Material und Methoden Molekulargenetische Arbeiten wurden, wenn nicht anders beschrieben, nach den Methoden in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons) durchgeführt.

Stämme und Wachstumsbedingungen Die Blakeslea trispora Stämme ATCC 14271 (Paarungstyp (+)) und ATCC14272 (-) (ein Wildtyp) wurde erhaltenPaarungstyp (-)) wurden von der American Type Culture Collection. erhalten. Die Anzucht von B. trispo- ra erfolgte in MEP-Medium (Malzextrakt-Pepton-Medium) : 30 g/1 Malzex- trakt (Difco), 3 g/1 Pepton (Soytone, Difco), 20 g/l Agar, Einstellung pH 5,5, ad 1000 MI mit H20 bei 28 °C.

Die Anzucht von Agrobacterium tumefaciens LBA4404 erfolgte nach Hoe- kema et al. (1983, Nature 303 : 179-180) bei 28 °C für 24 h in Agrobacteri- en-Minimal Medium (AMM) : 10 mM K2HPO4, 10 mM KH2P04, 10 mM Glu-

cose, MM-Salze (2,5 mM NaCl, 2 mM MgSO4, 700 µM CaCl2, 9 µM Fe- S04,4 mM (NH4) 2SO4).

Transformation von Agrobacterium tumefaciens Das Plasmid pBinAHyg wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303 : 179-180) elektroporiert (Mozo and Ho- oykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16 : 917-918). Zur Selektion wurden bei der Agrobakterienanzucht folgende Antibiotika verwendet : Rifampicin 50 mg/1 (Selektion auf das A. tumefaciens Chromosom), Streptomycin 30 mg/1 (Se- lektion auf das Helferplasmid) und Kanamycin 100 mg/1 (Selektion auf den binären Vektor).

Transformation von Blakeslea trispora Zur Transformation wurden die Agrobakterien nach 24 h Anzucht in AMM auf eine OD600 von 0,15 in Induktionsmedium (IM : MM-Salze, 40 mM MES (pH 5,6), 5 mM Glucose, 2 mM Phosphat, 0,5% Glycerol, 200 pM Acetosy- ringone) verdünnt und erneut über Nacht in IM bis zu einer OD600 von ca.

0, 6 angezogen.

Zur Co-Inkubation von Blakeslea ATCC 14271 bzw. ATCC14272 und Agrobacterium wurden 100 pl Agrobakteriensuspension mit 100 pl Blakes- lea Sporensuspension (107 Sporen/ml in 0,9% NaCl) gemischt und steril auf einer Nylon Membran (Hybond N, Amersham) auf IM-Agarose Platten (IM + 18 g/l Agar) verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bei 26 °C wurde die Membran auf eine MEP-Agarplatte (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) überführt. Zur Selektion auf transformierte Blakesleazel- len enthielt das Medium Hygromycin in einer Konzentration von 100 mg/l sowie zur Selektion gegen Agrobakterien 100 mg/l Cefotaxim. Die Inkuba- tion erfolgte für ca. 7 Tage bei 26 °C. Anschließend erfolgte der Transfer von Mycel auf frische Selektionsplatten. Gebildete Sporen wurden mit 0,9% NaCI abgespült und auf CM17-1-Agar (3 g/1 Glucose, 200 mg/l L-

Asparagin, 50 mg/l MgS04 x 7H20, 150 mg/1 KH2P04, 25 µg/l ThiaminHCl, 100 mg/l Yeast Extract, 100 mg/1 Na-desoxycholat, 100 mg/L Hygromycin, 100 mg/L Cefotaxim, pH 5,5, 18 g/l Agar) ausplattiert. Zur Isolierung ein- zelner gentechnisch veränderter Sporen wurden die Sporen durch ein FACS Gerät der Fa. BectonDickson (Modell Vantage+Diva Option) einzeln auf Selektivmedium. abgelegt.

Mutagenese mit MNNG Zur Reduzierung der Anzahl von Kernen pro Spore wurde eine Behand- lung von Sporensuspensionen mit MNNG (N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin) durchgeführt. Hierfür wurde zunächst eine Sporensus- pension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkonzentration von 100 ug/ml zugegeben. Die Zeit der Inkubation in MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen ca. 5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und plattiert.

Selektion homonukleater Zellen Die Selektion homonukleater Zellen von Blakeslea trispora carB-erfolgte analog zum Versuchsprotokoll für Phycomyces blakesleeanus (Roncero et al., 1984, Mutation Research, 125 : 195-204), modifiziert durch Wachstum in Gegenwart von 5-Carbon-5-Deazariboflavin (1 pg/ml) und Hygromycin 100 (pg/ml).

Herstellung genetisch veränderter Blakeslea trispora durch Agrobac- terium-vermittelte Transformation

Herstellung des rekombinanten Plasmids pBinAHyg Aus dem Plasmid pANsCos1 (Fig. 1, Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26 : 87- 90, SEQ ID NO : 4) wurde die gpdA-hph-trpC-Kassette als Bgill/Hindlll Fragment isoliert und in das mit BamHI/Hindlil geöffnete binäre Plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721) ligiert. Der so erhaltene Vektor wurde als pBinAHyg bezeichnet (Fig. 2, SEQ ID NO : 3) und enthielt das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des gpd Promotors (SEQ ID NO : 1) und des trpC Terminators (SEQ ID NO : 2) aus Aspergillus nidulans sowie die entsprechenden Borderse- quenzen, die für den DNA-Transfer von Agrobacterium notwendig sind.

Die in den weiter unten beschriebenen Ausführungsbeispielen genannten Vektoren sind Abkömmlinge von pBinAHyg.

Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Agrobacterium tumefaciens Nachfolgend wird beispielhaft die Übertragung des Plasmids pBinAHyg in Agrobacterien beschrieben. Die Übertragung der Abkömmlinge erfolgte analog.

Das Plasmid pBinAHyg wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303 : 179-180) elektroporiert (Mozo and Ho- oykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16 : 917-918). Zur Selektion wurden bei der Agrobakterienanzucht folgende Antibiotika verwendet : Rifampicin 50 mg/1 (Selektion auf das A. tumefaciens Chromosom), Streptomycin 30 mg/l (Se- lektion auf das Helferplasmid) und Kanamycin 100 mg/l (Selektion auf den binären Vektor).

Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora Zur Transformation wurden die Agrobakterien nach 24 h Anzucht in AMM auf eine OD660 von 0,15 in Induktionsmedium (IM : MM-Salze, 40 mM MES

(pH 5,6), 5 mM Glucose, 2 mM Phosphat, 0,5% Glycerol, 200 uM Acetosy- ringone) verdünnt und erneut über Nacht in IM bis zu einer ODeeo von ca.

0,6 angezogen.

Zur Co-Inkubation von Blakeslea trispora (B. t. ) und Agrobacterium tume- faciens (A. t. ) wurden 100 pl Agrobakteriensuspension mit 100 pI Blakeslea Sporensuspension (107 Sporen/ml in 0,9% NaCl) gemischt und steril auf einer Nylon Membran (Hybond N, Amersham) auf IM-Agarose Platten (IM + 18 g/l Agar) verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bei 26 °C wurde die Mem- bran auf eine MEP-Agarplatte (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) überführt.

Zur Selektion auf transformierte Blakeslea-Zellen enthielt das Medium Hy- gromycin in einer Konzentration von 100 mg/1 sowie zur Selektion gegen Agrobakterien 100 mg/1 Cefotaxim. Die Inkubation erfolgte für ca. 7 Tage bei 26 °C. Anschließend erfolgte der Transfer von Mycel auf frische Selek- tionsplatten. Gebildete Sporen wurden mit 0,9% NaCl abgespült und auf CM17-1-Agar (3 g/l Glucose, 200 mg/1 L-Asparagin, 50 mg/l MgS04 x 7H2O, 150 mg/1 KH2P04, 25 ug/l Thiamin-HCI, 100 mg/1 Yeast Extract, 100 mg/1 Na-desoxycholat, pH 5,5, 100 mg/1 Cefotaxim, 100 mg/1 Hygro- mycin, 18 g/l Agar) ausplattiert. Die Übertragung von Sporen auf frische Selektionsplatten wurde dreimal wiederholt. Auf diese Weise wurde die Transformante Blakeslea trispora GVO 3005 isoliert. Alternativ erfolgte zur Selektion der GVO (gentechnisch veränderten Organismen) die Einzelab- lage der Sporen durch den BectonDickinson FacsVantage+Diva Option auf CM-17 Agar mit 100 mg/1 Cefotaxim, 100 mg/1 Hygromycin. In diesem Fall wurde nur dort Pilzmycel gebildet, wo die Sporen gentechnisch verän- dert waren.

Nachweis der genetischen Veränderung durch Übertragung von pBi- nAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora

Nachfolgend wird beispielhaft der Nachweis der Übertragung für pBinA- Hyg in Blakeslea trispora beschrieben. Der Nachweis der Übertragung der Abkömmlinge erfolgte analog.

200 ml MEP-Medium (30 g/I Malzextrakt, 3 g/1 Pepton, pH 5,5) wurden mit 105 bis 107 Sporen der Transformante Blakeslea trispora GVO 3005 be- impft und 7 Tage bei 26 °C mit 200 Upm auf einem Rundschüttler inku- biert. Zum Nachweis der erfolgreichen Transformation wurde DNA aus dem Mycel isoliert (Peqlab Fungal DNA Mini Kit) und in einer PCR (Pro- gramm : 94 °C 1 min, dann 30 Zyklen mit 1 min. 94°C, 1 min. 58 °C, 1 min.

72 °C) eingesetzt.

Zum Nachweis des Hygromycinresistenzgens (hph) wurden die Primer hph-forward (5'-CGATGTAGGAGGGCGTGGATA, SEQ ID NO : 5) und hph-reverse (5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT, SEQ ID NO : 6) verwen- det. Das erwartete Fragment von hph wies eine Länge von 800 bp auf.

Zur Amplifikation des Kanamycinresistenzgens nptill und damit als Kon- trolle auf Agrobakterien wurden die Primer nptlil-forward (5'- TGAGAATATCACCGGAATTG, SEQ ID NO : 7) und nptlll-reverse (5'- AGCTCGACATACTGTTCTTCC, SEQ ID NO : 8) verwendet. Das erwarte- te Fragment von nptill wies eine Länge von 700 bp auf.

Zur Amplifikation eines Fragmentes des Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenasegens gpd1 und damit als Kontrolle auf Blakeslea trispora wurden die Primer MAT292 (5'- GTGAATGGAAATCCCATCGCTGTC, SEQ ID NO : 9) und MAT293 (5'- AGTGGGTACTCTAAAGGCCATACC, SEQ ID NO : 10) verwendet. Das erwartete Fragment von gpd1 wies eine Länge von 500 bp auf.

Das Ergebnis der PCR der Blakeslea trispora DNA ist in Fig. 3 anhand eines Standard-Gels gezeigt. Die Spuren des Gels wurden folgenderma- ßen belegt : 1) 100 bp Größenmarker (100 bp-1 kb) 2) B. t. GVO 3005 primer nptill-for/nptill-rev 3) B. t. GVO 3005 primer hph-for/hph-rev 4) B. t. GVO 3005 primer MAT292/MAT293 (gpd) 5) A. t. mit Plasmid pBinAHyg primer nptill-for/nptill-rev 6) A. t. mit Plasmid pBinAHyg primer hph-for/hph-rev 7) B. t. 14272 WT primer nptill-for/nptill-rev 8) B. t. 14272 WT primer hph-for/hph-rev 9) B. t. 14272 WT primer MAT292/MAT293 (gpd) In der DNA von Blakeslea trispora wurde das Hygromycinresistenzgens (hph) und als Positivkontrolle Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenasegen (gpd1) nachgewiesen. nptill konnte dem- gegenüber nicht nachgewiesen werden.

Somit wurde die genetische Veränderung von Blakeslea trispora durch Agrobacterium-vermittelte Transformation nachgewiesen.

Isolierung homokaryotischer GVO von Blakeslea trispora : Herstellung homonukleater Stämme Durch erfolgreichen Transfer des Vectors pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora entstandenentstehen genetisch ver- änderte Organismen. In GVO von Blakeslea trispora. Jedoch liegen in Blakeslea liegen in allen Stadien des vegetativen und des sexuellen Zell- zyklus mehrkernige Zellen vor. Daher erfolgte erfolgt die Insertion der Vec- torFremd-DNA in der Regel nur in einem Kern. Ziel ist es aber, dass,

Stämme von Blakeslea zu erhalten, bei denen die Insertion der Vectör- Fremd-DNA in allen Kernen vorliegt., d. h. Ziel ist ein homonukleates re- kombinantes Pilzmycel.

Zur Herstellung solcher homokaryotischer Zellen wurden zunächst Spo- rensuspensionen der rekombinanten Stämme mit MNNG behandelt. Hier- für wurde eine Sporensuspension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkon- zentration von 100 pg/ml zugegeben. Die Dauer der Inkubation mit MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen-5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und plattiert.

1) Herstellung homonukleater rekombinanter Stämme durch FACS (fluorescence-activated cell sorting) Ein geringer Anteil der Sporen von Blakeslea trispora bzw. der gentech- nisch veränderten Stämme von Blakeslea trispora ist von Natur aus ein- kernig. Zur Herstellung homonukleater rekombinanter Stämme, die Fremd- DNA von pBinAHyg oder pBinAHyg-Abkömmlingen enthielten, wurden die einkernigen Sporen durch FACS aussortiert und auf MEP (30 g/l Malzex- trakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) mit 100 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Hygromycin plattiert. Die hier gebildten Mycelien waren homonukleat.

Zur Sortierung mit FACS wurden die Sporen eines 3 Tage alten Ausstri- ches mit 10 ml Tris-HCI 50mMol + 0, 1% Span20 pro Agar-Platte abge- schwemmt. Die Sporenkonzentration betrug 0,5 bis 0,8 x 107 Sporen pro ml. Zu 9 ml Sporensuspension wurden 1ml DMSO und 10 pl Syto 11 (Farbstoff-Stammlösung in DMSO Molecular Probes Nr. S-7573) zugege- ben. Danach wurde 2 h bei 30°C gefärbt. Die Selektion und Ablage erfolg- te mittels eines BectonDickinson FacsVantage+Diva Option. Die Selektion erfolgt zuerst nach Größe, um einzelne Sporen von Aggregaten und Ver- unreinigungen zu trennen. Dann wurden diese Sporen nach ihrer Fluores-

zenz (Anregung = 488nm Emission = 530 nm) sortiert abgelegt. Die linke Schulter der Gauß-Kurve der Fluoreszenzhäufigkeitsverteilung enthielt die einkernigen Sporen.

Anschließend wurden die Sporen auf MEP-Agarplatten ausplattiert und neue Sporen erzeugt.

Diese Sporen wurden analog zur Vorschrift von Roncero et al. auf Medium mit 5-Carbon-5-deazariboflavin plattiert, das zusätzlich Hygromycin ent- hielt.

Hierdurch wurden homokaryonte Zellen des Genotyps hyg und dar se- lektiert.

2) Herstellung homonukleater Stämme durch Kernreduktion und Se- lektion mit FACS Zur Reduzierung der Anzahl von Kernen pro Spore wurde vor der Selekti- on eine Behandlung von Sporensuspensionen mit MNNG (N-Methyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidin) durchgeführt, und so durch chemische Mutagene- se eine Kernreduktion erzielt.

Hierfür wurde zunächst eine Sporensuspension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkonzentration von 100 pg/ml zugegeben. Die Zeit der Inkuba- tion in MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen ca.

5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und nach der unter 1) beschriebenen Methode sortiert bzw. selektiert.

Alternativ konnten zur Reduktion der Kernzahl in den Sporen auch Rönt- gen-und UV-Strahlen eingesetzt werden, wie es von Cerdä-Olmedo und Patricia Reau in Mutation Res., 9 (1970), 369-384 beschrieben wurde.

3) Herstellung homonukleater Stämme durch Selektion auf rezessive Selektionsmarker Als rezessiver Selektionsmarker zur Selektion homonukleater Mycelien kommt beispielsweise der rezessive Selektionsmarker pyrG in Frage.

Wildtyp-Stämme von Blakeslea trispora sind pyrG+. Diese Stämme können nicht in Gegenwart des Pyrimidin-Analogs 5-Fluororotat (FOA) wachsen, weil sie FOA durch die Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase zu letha- len Metaboliten umsetzen. Gentechnisch veränderte Blakesleaa, die ho- monukleat pyrG-sind, fehlt die Enzymaktivität Orotidin-5'- monophosphatdecarboxylase. Folglich können diese pyrG--Stämme 5- Fluororotat nicht verwerten. Die Stämme wachsen daher in Gegenwart von FOA und Uracil. Im Fall der Kopplung der Mutation pyrG-und der In- sertion von Fremd-DNA auf dem Kern einer einkernigen Spore, kann aus dieser Spore homonukleates rekombinantes Pilzmycel gebildet werden.

Zunächst wurde durch Insertion eines Fragentes von pyrG (SEQ ID NO : 65) aus Blakeslea trispora in pBinAHyg das Plasmid pBinAHygBTpyrG- SCO (SEQ ID NO : 36, Fig. 4) erzeugt. Dieses Plasmid wurde in Blakelea trispora transformiert und führte dort durch homologe Rekombination zur Disruption von pyrG.

Homonukleate GVO von Blakeslea trispora mit dem Phänotyp pyrG-wur- den folgendermaßen selektiert. Zur Agrobakterium-vermittelten Transfor- mation von pBinAHygBTpyrG-SCO wurde wie oben beschrieben auf MEP (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) mit 100 mg/l Cefota- xim und 100 mg/l Hygromycin plattiert. Die Sporen der Transformanten

wurden mit 10 ml Tris-HCI 50mM + 0, 1% Span20 pro Agar-Platte abge- schwemmt. Die Sporenkonzentration betrug 0,5 bis 0,8 x 107 Sporen pro ml. Die Sporen wurden anschließend auf FOA-Medium mit 100 mg/l Cefo- taxim und 100 mg/i Hygromycin ausplattiert. FOA-Medium enthielt pro Li- ter 20 g Glucose, 1 g FOA, 50 mg Uracil, 200 ml Citrat-Puffer (0,5 M, pH 4,5) und 40 mi Spurensalzlösung nach Sutter, 1975, PNAS, 72 : 127). Ho- monukleate pyrG--Mutanten zeigten Wachstum auf dem Uracil-haltigen FOA-Medium ; aber kein Wachstum bei Plattierung auf FOA-Medium ohne Uracil. Auf die gleiche Weise wurden aus den im folgenden beschriebenen GVO von Blakeslea trispora zur Herstellung von Xanthophyllen homo- nukleate GVO hergestellt.

Alternativ ist es möglich die Sporen analog zur Vorschrift von Roncero et al. auf Medium mit 5-Carbon-5-deazariboflavin zu plattieren, das zusätz- lich Hygromycin enthält (Roncero et al., 1984, Mutation Research, 125 : 195-204). Hierdurch werden homokaryonte Zellen des Genotyps hygR und dar selektiert. Nach diesem Prinzip werden homokaryonte Stämme von Blakeslea trispora mit dem Phänotyp hygR und dar erzeugt.

Ausführungsbeispiele zur Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen von Blakeslea trispora für die Herstellung von Caroti- noiden und Carotinoidvorstufen Die Erzeugung der im folgenden genannten Plasmide erfolgte durch die Methode"overlap-extension PCR"und durch anschließende Insertion der Amplifikationsprodukte in das Plasmid pBinAHyg. Die Methode"overlap- extension PCR"erfolgte wie in Innis et al. (Eds. ) PCR protocols : a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego beschrieben. Die Transformation der pBinAHyg-Abkömmlinge und die Herstellung homo- nukleater gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora erfolg- te wie oben beschrieben.

Gentechnisch veränderte Stämme von Blakeslea trispora zur Herstel- lung von Zeaxanthin Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechni- schen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Zea- xanthin verwendet, codieren also u. a. Hydroxylasen (crtZ) : -p-tef1-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ (SEQ ID NO : 70) aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 (Accession No. AF162276) unter Kontrolle des ptef1 Promotors aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpTEF1-HPcrtZ, SEQ ID NO : 37, Fig. 5) ; p-carRA-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ, SEQ ID NO : 38, Fig. 6) p-carB-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Hae- matococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promo- tors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-HPcrtZ, SEQ ID NO : 39, Fig. 7) p-carRA-HPcrtZ-TAG-3'carA-IR, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kon- trolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora. Stromabwärts des Gens der Hydroxylase ist eine Inverted-Repeat-Struktur lokali- siert, die aus dem 3'-Ende von carA und der stromabwärts von carA gelegenen Region stammt (IR, SEQ ID NO : 74,, Inverted Repeat 1' ca. 350 bp von carA, dann ca. 200 bp, Loop'und anschließend ca.

350 bp, Inverted Repeat 2') (Seq. pBinAHyg-BTpcarRA-HPcrtZ- TAG-3'carA-IR, SEQ ID NO : 40, Fig. 8) ; -p-carRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kon- trolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora. Das Gen der

Hydroxylase ist mit einer Inverted-Repeat-Struktur fusioniert, die aus dem 3'-Ende von carA und der stromabwärts von carA gelege- nen Region stammt (IR, SEQ ID NO : 74,, Inverted Repeat 1'ca.

350 bp von carA, dann ca. 200 bp, Loop'und anschließend ca. 350 bp, Inverted Repeat 2'). Das abgeleitete Fusionsprotein besteht folglich aus der Hydroxylase von Haematococcus pluvialis und dem Carboxyterminus von CarA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR, SEQ ID NO : 41, Fig. 9) ; p-tef1-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ (SEQ ID NO : 71) aus Erwinia uredova 20D3 (Accession No. D90087) unter Kontrolle des ptef1 Promotors (Seq. pBinAHygBTpTEF1-EUcrtZ, SEQ ID NO : 42, Fig. 10) ; p-carRA-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwi- nia uredova 20D3 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Bla- keslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-EUcrtZ, SEQ ID NO : 43, Fig. 11) ; p-carB-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwi- nia uredova 20D3 unter Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakes- lea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-EUcrtZ, SEQ ID NO : 44, Fig.

12) ; p-gpdA-HPcrtZ-t-crtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des gpdA Promotors und des Terminators t-crtZ ; d. h. des stromabwärts von crtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 gelegenen Sequenzabschnitts (SEQ ID NO : 73) (Seq. pBinAHyg-gpdA-HPcrtZ- tcrtZ, SEQ ID NO : 45, Fig. 13). p-gpdA-BTcarR-HPcrtZ-BTcarA, enthaltend Genfusion aus Genen der Lycopincyclase carR aus Blakeslea trispora, der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 und der

Phytoensynthase carA aus Blakeslea trispora unter Kontrolle des gpdA Promotors aus Aspergillus nidulans (Seq. pBinAHyg- carR crtZ carA, SEQ ID NO : 46, Fig. 14) ; Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispo- ra zur Herstellung von Canthaxanthin Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechni- schen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Canthaxanthin verwendet, codieren also u. a. Ketolasen (crtW) : -p-tef1-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW (SEQ ID NO : 72) aus Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No. NZAABC01000196) unter Kontrolle des ptef1 Promotors aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpTEF1-NpucrtW, SEQ ID NO : 47, Fig. 15) ; p-carRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 unter der Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO : 48, Fig. 16) ; p-carB-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW aus No- stoc punctiforme PCC73102 unter der Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-NpucrtW, SEQ ID NO : 49, Fig. 17) ; Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispo- ra zur Herstellung von Astaxanthin Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechni- schen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Asta- xanthin verwendet, codieren also u. a. für Hydroxylasen (crtZ) und Ketola- sen (crtW) :

-p-carRA-HPcrtZ-pcarRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Hydroxy- lase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 und das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No. NZAABC01000196) beide jeweils unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBi- nAHygBTpcarRA-HPcrtZ-BTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO : 50, Fig.

18) ; p-carRA-EUcrtZ-pcarRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Hydroxy- lase EUcrtZ aus Erwinia uredova20D3 (Accession No. D90087) und das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 beide jeweils unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-EUcrtZ-BTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO : 51, Fig. 19) ; Klonierung und Sequenzanalyse von Genen und Promotoren, die beispielhaft für die gentechnische Veränderung von Blakeslea trispo- ra genutzt werden können.

Nachfolgend werden beispielhaft die Klonierung und Sequenzierung ver- schiedener Gene und Promotoren aus Blakeslea trispora beschrieben.

Klonierung und Sequenzanalyse ptef1 Die Klonierung von p-tef aus Blakeslea trispora erfolgte auf der Grundlage einer bereits in GenBank veröffentlichten Sequenz des Strukturgens für den Translations-Elongationsfaktor 1-a aus Blakeslea trispora (AF157235). Ausgehend von dem Sequenzeintrag AF157235 wurden Primer für die inverse PCR ausgewählt, um die stromaufwärts des Struk- turgens gelegene Promotoregion zu amplifizieren und zu sequenzieren.

In der inversen nested PCR an 200 ng Xhol-gespaltener und zirkularisier- ter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272 wurde ein 3000- bp-Fragment in folgendem Ansatz erhalten : Matrizen-DNA (1 pg genomi-

sche DNA von Blakeslea trispora ATCC 14272) Primer MAT344 5'- GGCGTACTTGAAGGAACCCTTACCG-3' (SEQ ID NO : 63) und MAT 345 5'-ATTGATGCTCCCGGTCACCGTGATT-3' (SEQ ID NO : 64) je 0,25 pM, 100 uM dNTP, 10 pl Herculase-Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zu- gabe bei 85 °C), H20 ad 100 pl. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zy- klus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 60 °C, 30 s. 72 °C, 60 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus). Der Sequenzabschnitt, der stromauf- wärts des vermutlichen Startcodons des Gens tef1 innerhalb 3000-bp- Fragmentes liegt, wurde als Promotor ptef1 bezeichnet.

Klonierung Sequenzanalyse des Gens der HMG-CoA-Reduktase aus Blakeslea trispora Zunächst wurde mit dem Cosmidvektor pANsCos1 eine Genbank von Bla- keslea trispora ATCC 14272, Mating Type (-) hergestellt. Der Vektor wur- de durch Spaltung mit Xbal linearisiert und anschließend dephosphoryliert.

Eine weitere Spaltung mit mit BamHl schuf die Insertionsstelle, in welche die mit Sau3AI partiell gespaltene und dephosphorylierte genomische DNA von Blakeslea trispora ligiert wurde. Die derart gebildeten Cosmide wurden anschließend in vitro verpackt und in Escherichia coli übertragen.

Auf der Grundlage der bekannten Sequenz eines Fragmentes des HMG- CoA-Reduktase codierenden Gens aus Blakeslea trispora (Eur. J. Bio- chem 220, 403-408 (1994)) wurde eine 315-bp-DNA-Sonde durch folgen- de PCR hergestellt. Reaktionsansatz : 1 pg genomische DNA von Blakes- lea trispora ATCC 14272, Primer MAT314 5'- CCGATGGCGACGACGGAAGGTTGTT-3' [SEQ ID NO 79] und MAT315 5'-CATGTTCATGCCCATTGCATCACCT-3' [SEQ ID NO 80] je 0, 25 uM, 100 uM dNTP, 10 pl Herculase-Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zu- gabe bei 85 °C), H20 ad 100 pI. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zy- klus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 58 °C, 30 s. 72 °C, 30 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus).

Mit dieser DNA-Sonde wurde die Cosmid-Genbank durchmustert. Es wur- de ein Klon identifiziert, dessen Cosmid mit der DNA-Sonde hybridisierte.

Die Insertion dieses Cosmids wurde sequenziert. Die DNA-Sequenz ent- hielt einen Abschnitt, der dem Gen einer HMG-CoA-Reduktase zugeord- net wurde [HMG-CoA-Red. gb].

Klonierung und Sequenzanalyse carB (carB = Gen der Phytoendesaturase aus Blakeslea trispora) Aus dem Sequenzvergleich der Peptidsequenzen von Phytoendesatura- sen und dem Vergleich der zugehörigen DNA-Sequenzen von Phycomy- ces blakesleeanus, Cercospora nicotianae, Phaffia rhodozyma und Neu- rospora crassa wurden die degenerierten Primer MAT182 5'- GCNGARGGNATHTGGTA-3' (SEQ ID 52) und MAT192 5'- TCNGCNAGRAADATRTTRTG-3' (SEQ ID 53) abgeleitet. Die PCR wurde in 100 pl Ansätzen durchgeführt. Diese enthielten 200 ng genomische DNA von Blakeslea trispora ATCC14272,1 pM MAT182,1 pM MAT192, 100 uM dNTP, 10 ul Pfu-Polymerasepuffer 10x, 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 pl.

Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 40 °C, 30 s, 72 °C, 30 s, 95 °C, 30 s (35 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus).

Hiermit wurde ein 358-bp-Fragment erhalten, dessen abgeleitete Peptid- sequenz Ähnlichkeit zu den Sequenzen der Phytoendesaturasen aufwies. Durch die Methode der inversen PCR (Innis et al. in PCR protocols : a guide to methods and applications. 1990. S. 219-227) wurden nach dem Prinzip des Chromosome-Walking die Genregionen stromaufwärts und stromabwärts des 350-bp-Fragmentes folgendermaßen amplifiziert, klo- niert und sequenziert : (i) ein 1,1-kbp-Fragment durch PCR mit den Primern MAT219 5'- AAGTGACACCGGTTACACGCTTGTCTT-3' (SEQ ID 54) und MAT

220 5'-GCTTATCACCATCTGTTACCTCCTTGC-3' (SEQ ID 55) er- halten aus 200 ng EcoRl-gespaltener und zirkularisierter genomi- scher DNA von Blakeslea trispora ATCC14272,0, 25 uM MAT219, 0, 25 uM MAT220, 100 uM dNTP, 10 pl Herculase- Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 ul. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 60 °C, 30 s. 72 °C, 60 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus), (ii) ein 2,9-kbp-Fragment durch PCR mit den Primern MAT219 und MAT220 erhalten aus 200 ng Xbal-gespaltener und zirkularisierter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272,0, 25 uM MAT219,0, 25 pM MAT220, 100 uM dNTP, 10 pl Herculase- Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 ul. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 60 °C, 30 s, 72 °C, 3 min, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus) ; Der klonierte Sequenzabschnitt ist schematisch in Fig. 20 (SEQ ID NO 77) dargestellt. Die Sequenzierung erfolgte in Strang-und Gegenstrangrich- tung mit den klonierten Fragmenten sowie mit den PCR-Produkten. Die Sequenz des klonierten Sequenzabschnitts ist in Fig. 21 (SEQ ID NO 78) gezeigt.

Sequenzvergleiche Die Nukleotidsequenz von carB und die Peptidsequenz des abgeleiteten Proteins CarB wurden mit den bekannten Sequenzen verwandter Proteine verglichen. Zum Sequenzvergleich wurden die Programme GAP und BESTFIT eingesetzt.

CarB-Identische Aminoacylreste nach GAP Programmeinstellungen :

Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2.912 Average Mismatch : -2. 003 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Aminosäuren zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 72,491 Phaffia rhodozyma : 50,460 Neurospora crassa : 47,943 Cercospora nicotianae : 47,740 CarB-Identische Aminoacylreste nach BESTFIT Programmeinstellungen : Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2.912 Average Mismatch : -2. 003 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Aminosäuren zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 73,380 Phaffia rhodozyma : 53,175 Neurospora crassa : 51,896 Cercospora nicotianae : 50,791 carB-Identische Basen nach GAP Programmeinstellungen : Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10.000 Average Mismatch : 0.000

Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Basen zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 64,853 Cercospora nicotianae : 50,143 Phaffia rhodozyma : 43,179 Neurospora crassa : 42,130 carB-ldentische Basen nach BESTFIT Programmeinstellungen : Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10.000 Average Mismatch : -9. 000 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Basen zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 68,926 Phaffia rhodozyma : 62,403 Neurospora crassa : 60,230 Cercospora nicotianae : 56,884 Klonierung zur Expression von carB Zur Klonierung und Expression von carB aus Blakeslea trispora wurden von dem oben beschriebenen klonierten Sequenzabschnitt aus Blakeslea trispora in sechs Leserastern die möglichen Proteinsequenzen abgeleitet.

Diese Proteinsequenzen wurden mit den Sequenzen der Phytoendesatu- rasen aus Phycomyces blakesleeanus, Phaffia rhodozyma, Neurospora crassa, Cercospora nicotianae verglichen. Auf der Grundlage des Se- quenzvergleiches wurden im klonierten Sequenzabschnitt der genomi- schen DNA von Blakeslea trispora drei Exons identifiziert, die zusammen- gefügt eine codierende Region ergeben, deren abgeleitetes Genprodukt über die gesamte Länge 72,7% identische Aminoacylreste mit der Phy-

toendesaturase CarB aus Phycomyces blakesieeanus aufweist. Dieser Sequenzabschnitt aus drei möglichen Exons und zwei möglichen Introns wurde daher als Gen carB bezeichnet. Zur Überprüfung der vorhergesag- ten Genstruktur wurde die codierende Sequenz von carB aus Blakeslea trispora durch PCR mit cDNA von Blakeslea trispora als Matrize und mit den Primern Bol1425 5'- AGAGAGGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGC-3' (SEQ ID 56) und Bol1426 5'-AGAGAGGGATCCATGTCTGATCAAAAGAAGCA-3' (SEQ ID 57) erzeugt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde sequenziert. Die Lokali- sation von Exons und Introns wurde durch Vergleich der cDNA mit der genomischen DNA von carB bestätigt. In Fig. 21 ist die codierende Se- quenz von carB schematisch dargestellt. Zur Expression von carB in Escherichia coli wurde zunächst die Ndel-Schnittstelle in carB durch die Methode overlap extension PCR entfernt sowie am 5'-Ende des Gens eine Ndel-Schnittstelle und am 3'-Ende eine BamHI-Schnittstelle eingefügt.

Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem Vektor pJOE2702 ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pBT4 bezeichnet und zusammen mit pCAR-AE in Escherichia coli XL1-Blue kloniert. Die Expression erfolgte durch Induktion mit Rhamnose. Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte durch Nachweis der Lycopinsynthese via HPLC. Die Klonierungsschritte sind im folgenden beschrieben : PCR 1.1 : Ca. 0, 5 pg cDNA von Blakeslea trispora, 0, 25 uM MAT350 5'- ACTTTATTGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGCTGC-3'(SEQID 58), 0, 25 uM MAT244 5'- GTTCCAATTGGCCACATGAAGAGTAAGACAGGAAACAG-3' (SEQ ID 59), 100 pM dNTP, 10 pl Pfu-Polymerase-Puffer (10x), 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und H20 ad 100pL.

Temperaturprofil :

1.95 °C 10 min, 2.85 °C 5 min, 3. 40 °C 30s, 4.72 °C 1 min 30 s, 5.95 °C 30 s, 6. 50 °C 30 s, 7.72 °C 1 min 30 s, 8. 95 °C 30 s, 9. 72 °C 10min Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 5x, (6-8. ) 25x, (9.) 1x PCR1.2 : Ca. 0,5 pg cDNA von Blakeslea trispora, 0, 25 uM MAT243 5'- CCTGTCTTACTCTTCATGTGGCCAATTGGAACCAACAC-3' (SEQ ID 60), 0, 25 uM MAT353 5'- CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3' (SEQ ID 61), 100 uM dNTP, 10 pI Pfu-Polymerase-Puffer (10x), 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C, "hot start") und H20 ad 100 uL.

Temperaturprofil : 1.95 °C 10 min, 2.85 °C 5 min, 3. 40 °C 30s, 4.72 °C 1 min 30 s, 5.95 °C 30 s, 6. 50 °C 30 s, 7. 72 °C 1 min 30 s, 8. 95 °C 30s, 9. 72 °C 10min Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 5x, (6-8. ) 25x, (9.) 1x Reinigung der PCR-Fragmente aus PCR 1.1, 1.2 Dazu wurde PCR 2 zur Herstellung der codierenden Sequenz von carB aus Blakeslea trispora für die Klonierung in pJOE2702 durchgeführt : Ca. 50 ng Produkt aus PCR 1.1 und ca. 50 ng Produkt aus PCR1.2 mit 0, 25 uM MAT350 5'- ACTTTATTGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGCTGC-3' (SEQ ID NO 58), 0, 25 uM MAT353 5'- CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3' (SEQ ID NO 61), 100 pM dNTP, 10 uL Pfu-Polymerase-Puffer (10x), 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und H20 ad 100 uL.

Temperaturprofil : 1. 95°C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3.59 °C 30 s, 4.72 °C 2 min, 5.95 °C 30 s, 6. 72°C 10 min Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 22x, (6.) 1x

Anschließend erfolgte eine Reinigung des erhaltenen Fragmentes (-1, 7 kbp), eine Ligation in Vektor pPCR-Script-Amp, eine Klonierung in Esche- richia coli XL1-Blue, Sequenzierung der Insertion, Spaltung mit Ndel und BamH1 sowie eine Ligation in pJOE2702. Das erhaltene Plasmid wurde als pBT4 bezeichnet.

Charakterisierung und Nachweis der Enzymaktivität von CarB (Phy- toendesaturase) Das von carB abgeleitete Genprodukt wurde als CarB bezeichnet. CarB weist auf Grundlage der Peptidsequenzanalyse folgende Eigenschaften auf : Länge : 582 Aminoacylreste Molekulare Masse : 66470 Isoelektrische Punkt : 6,7 Katalytische Aktivität : Phytoendesaturase Edukt : Phytoen Produkt : Lycopin EC-Nummer : EC 1.14. 99- Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte in vivo. Wenn das Plasmid (pCAR-AE) in Escherichia coli XL1-Blue übertragen wird, entsteht der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE). Dieser Stamm synthetisiert Phytoen. Wenn zusätzlich das Plasmid pBT4 in Escherichia coli XL1-Blue übertragen wird, entsteht der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR- AE) (pBT4). Da ausgehend von carB eine enzymatisch aktive Phytoende- saturase gebildet wird, produziert dieser Stamm Lycopin.

Die Plasmide pCAR-AE und pBT4 wurden daher in Escherichia coli über- tragen. Nach Wachstum in Flüssigkultur wurden die Carotinoide aus den Zellen extrahiert und charakterisiert (vgl. oben).

Durch HPLC Analyse wurde nachgewiesen, daß der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE) Phytoen und der Stamm Escherichia coli XL1- Blue (pCAR-AE) (pBT4) Lycopin produziert. CarB weist folglich die Enzym- aktivität einer Phytoendesaturase auf.

Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispo- ra zur Herstellung von Phytoen Nachfolgend werden beispielhaft die Herstellung von gentechnisch verän- derten Organismen zur Herstellung von Phytoen beschrieben.

Vector pBinAHygAcarB zur Erzeugung von carB--Mutanten von Bla- keslea trispora Für die Deletion von carB in Blakeslea trispora wurde der Vektor pBinA- HygAcarB (SEQ. ID. NO : 62, Fig. 22) konstruiert. Der Vorläufer von pBi- nAHygAcarB ist pBinAHyg (SEQ. ID. NO : 3, Fig. 2). pBinAHyg wurde fol- gendermaßen konstruiert : Aus dem Plasmid pANsCos1 (SEQ. ID. NO : 4, Fig. 1, Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26 : 87-90) wurde die gpdA-hph Kassette als BgIll/Hindlil Fragment isoliert und in das BamHI/Hindlll geöffnete binäre Plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721) ligiert. Der so erhaltene Vektor wurde als pBinAHyg bezeichnet und enthält das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des gpd Promotors und des trpC Terrminators aus Aspergillus nidulans sowie die entsprechenden Bordersequenzen, die für den DNA-Transfer von Agrobacterium notwen- dig sind.

Die Amplifikation der codierenden Sequenz von carB mit den Primern MAT350 (SEQ ID NO 58) und MAT353 (SEQ ID NO 61) mittels PCR wur- de mit den folgenden Parametern durchgeführt : 50 ng pBT4 mit 0, 25 uM MAT350 5'-ACTTTATTGGATCCTTAAAT- GCGAATATCGTTGCTGC-3', 0,25 uM MAT353 5'-

CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3', 100 pM dNTP, 10 pL Pfu-Polymerase-Puffer, 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und ad 100 pL H20 Temperaturprofil : 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3.58 °C 30s, 4. 72°C 2 min, 5. 95 °C 30s, 6.72 °C 10 min.

Zyklen : (1.-2.) 1x, (3-5. ) 30x, (6.) 1x Anschließend erfolgte eine Reinigung des erhaltenen Fragmentes (~ 1, 7 kbp), eine Spaltung mit Hindlll, eine weitere Reinigung des 364-bp-Hindlll- Fragments-carB, gefolgt von einer Spaltung von pBinAHyg mit Hindlil, eine Ligation von 364-bp-Hindlil-Fragments-carB in pBinAHyg, eine Transfor- mation des Vektors in Escherichia coli und eine Isolierung des Konstruktes und Bezeichnung als pBinAHygAcarB wie oben beschrieben. Alternativ erfolgte eine partielle Spaltung mit Hindlll und die Klonierung eines größe- ren Hindill-Fragmentes aus carB in pBinAHyg zur Herstellung von pBinA- HygAcarB.

Erzeugung von carB--Mutanten von Blakeslea trispora Zunächst wurde das Plasmid pBinAHygAcarB in den Agrobakterienstamm LBA 4404 übertragen, z. B. durch Elektroporation (vgl. oben). Anschlie- ßend wurde das Plasmid von Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 in Biakeslea trispöra ATCC 14272 und in Blakeslea trispora ATCC 14271 übertragen (vgl. oben). Der erfolgreiche Nachweis des Gentransfers in Blakesleslea trispora erfolgte über Polymerase-Kettenreaktion nach fol- gendem Protokoll : Ca. 0,5 ug DNA aus Blakeslea trispora ATCC 14272 carB-bzw. ATCC 14271 carB-wurden mit 0,25 uM Primer hph forward 5'- CGATGTAGGAGGGCGTGGATA-3' (SEQ ID NO 5), 0, 25 uM Primer hph reverse 5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT-3' (SEQ ID NO 6), 100 uM

dNTP, 10 pL Herculase-Polymerase-Puffer, 2,5 U Herculase-DNA- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und ad 100 pI H20 umgesetzt.

Temperaturprofil : 1. 95°C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 1 min, 4. 72 °C 1 min, 5.94 °C 1 min, 6. 72°C 10 min.

Zyklen : (1.-2.) 1x, (3-5. ) 30x, (6.) 1x Als Negativkontrolle wurde eine Amplifikation des Kanamycinresistenz- gens aus Agrobacterium versucht. Dazu wurden folgende PCR- Bedingungen verwendet : Ca. 0,5 pg DNA aus Blakesiea trispora ATCC 14272 carB-bzw. ATCC 14271 carB-wurden mit 0, 25 uM Primer nptill forward 5'- TGAGAATATCACCGGAATTG-3' (SEQ ID NO 7), 0, 25 uM Primer nptlll reverse 5'-AGCTCGACATACTGTTCTTCC-3' (SEQ ID NO 8), 100 pM dNTP, 10 pL Herculase-Polymerase-Puffer, 2,5 U Herculase-DNA- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und ad 100 pL H20 umgesetzt.

Temperaturprofil : 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 1 min, 4.72 °C 1 min, 5.94 °C 1 min, 6.72 °C 10 min- Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 30x, (6.) 1x C) Produktion von Carotinoiden und Carotinoidvorstufen mit Blakes- lea trispora Zur Produktion der Carotinoide Zeaxanthin, Canthaxanthin, Astaxanthin und Phytoen wurden die entsprechenden gentechnisch veränderten Bla- keslea trispora (+) und (-) Stämme fermentiert, das produzierte Carotinoid mittels HPLC Analyse nachgewiesen und isoliert.

Das Flüssigmedium zur Produktion von Carotinoiden enthielt pro Liter : 19 g Maismehl, 44 g Sojamehl, 0,55 g KH2P04, 0,002 g Thiaminhydochlorid, 10 % Sonnenblumenöl. Der pH wurde mit KOH auf 7,5 eingestellt.

Zur Herstellung der Carotinoiden wurden Schüttelkolben mit Sporensus- pensionen von (+) und (-) Stämmen der GVO von Blakeslea trispora be- impft. Die Schüttelkolben wurden bei 26 °C mit 250 rpm für 7 Tage inku- biert. Alternativ wurde zu Mischungen der Stämme nach 4 Tagen Trispor- säuren zugegeben und weitere 3 Tage inkubiert. Die Endkonzentration der Trisporsäuren betrug 300-400 ug/ml.

Extraktion und Analytik Extraktion : 1. Entnahme von 10 ml Kultursuspension 2. Zentrifugation, 10 min, 5.000 x g 3. Verwerfen des Überstandes 4. Resuspendierung des Pellets in 1 ml Tetrahydrofuran (THF) durch Vortexen 5. Zentrifugation, 5 min, 5.000 x g 6. Abnahme der THF-Phase 7. Wiederholung der Schritte 4. -6. (2 x) 8. Vereinigung der THF-Phasen 9. Zentrifugation der vereinigten THF-Phasen 5 min bei 20.000 x g, um Reste der wäßrigen Phase abzutrennen Analytik Messung von Phytoen mittels HPLC Säule : ZORBAX Eclipse XDB-C8,5 um, 150*4,6 mm Temperatur : 40 °C Flußrate : 0,5 ml/min

Injektionsvolumen : 10 ut Detektion : UV 220 nm Stoppzeit : 12 min Nachlaufzeit : 0 min Maximaldruck : 350 bar Eluent A : 50 mM NaH2P04, pH 2,5 mit Perchlorsäure Eluent B : Acetonitril Gradient : Zeit [min] A [%] B [%] Fluß [ml/min] 0 50 50 0,5 12 50 50 0,5 Als Matrix wurden Extrakte der Fermentationsbrühen verwendet. Vor der HPLC wurde jede Probe wird durch ein 0, 22 um Filter filtriert. Die Proben wurden kühl gehalten und vor Licht geschützt. Zur Kalibrierung wurden jeweils 50-1000 mg/ ! eingewogen und in THF gelöst. Als Standard wurde Phytoen verwendet, welches unter den gegebenen Bedingungen eine Re- tentionszeit von 7,7 min. aufweist.

Messung von Lycopin, ß-Carotin, Echinenon, Canthaxanthin, Crypto- xanthin, Zeaxanthin und Astaxanthin mittels HPLC Säule : Nucleosil 100-7 C18, 250*4,0 mm (Macherey & Nagel) Temperatur : 25°C Flußrate : 1, 3 ml/min Injektionsvolumen : 10 pl Detektion : 450 nm Stoppzeit : 15min Nachlaufzeit : 2 min Maximaldruck : 250 bar Eluent A : 10% Aceton, 90% H20 Eluent B : Aceton

Gradient : Zeit [min] A [%] B [%] Fluß [ml/min] 0 30 70 1,3 10 5 95 1,3 12 5 95 1, 3 13 30 70 1,3 Als Matrix wurden Extrakte der Fermentationsbrühen verwendet. Vor der HPLC wurde jede Probe wird durch ein 0, 22 um Filter filtriert. Die Proben wurden kühl gehalten und vor Licht geschützt. Zur Kalibrierung wurden jeweils 10 mg eingewogen und in 100 mi THF gelöst. Als Standard wurden folgende Carotinoide mit folgenden Retentionszeiten eingesetzt ß-Carotin (12,5 min), Lycopin (11,7 min), Echinenon (10,9 min), Cryptoxanthin (10,5 min), Canthaxanthin (8,7 min), Zeaxanthin (7,6 min) und Astaxanthin (6,4 min) [s. Fig. 23].

Produktion von Zeaxanthin mit gentechnisch veränderten Stämmen von Blakeslea trispora Nachfolgend wird beispielhaft die Herstellung von Zeaxanthin mit gen- technisch veränderten Organismen (GVO) von Blakeslea trispora be- schrieben.

Durch Agrobakterium-vermittelte Transformation wurde der Vektor pBinA- HygBTpTEF1-HPcrtZ in Blakeslea trispora übertragen (s. o. ). Ein Hygro- mycin-resistenter Klon wurde isoliert und auf eine Kartoffel-Glucose- Agarplatte (Merck KGaA, Darmstadt) übertragen.

Nach drei Tagen Inkubation bei 26°C wurde ausgehend von dieser Platte ein Sporensuspension hergestellt. Ein 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikanen mit 50 ml Growth-Medium (Maismehl 47 g/I, Sojamehl 23 g/I, KH2P04 0,5 g/I, Thiamin-HCI 2.0 mg/l, pH mit NaOH vor der Sterilisa- tion auf 6,2-6, 7 eingestellt) wurde mit 1x105 Sporen beimpft. Diese Vorkul- tur inkubierte 48 Stunden bei 26 °C und 250 upm. Für die Hauptkultur

wurde ein 250-mi-Erlenmeyerkolben ohne Schikane enthaltend 40 ml Pro- duktionsmedium mit 4 ml der Vorkultur beimpft und 8 Tage bei 26 °C und 150 upm inkubiert. Das Produktionsmedium enthielt Glucose 50 g/l, Ca- sein Acid Hydrolisate 2 g/I, Hefeextrakt 1 g/I, L-Asparagin 2 g/I, KH2P04 1,5 g/I, MgS04 x 7 H20 0,5 g/I, Thiamin-HCI 5 mg/l, Span20 10 g/I, Tween 80 1 g/I, Linolsäure 20 g/I, Maisquellwasser 80 g/i. Nach 72 Stunden er- folgte die Zugabe von Kerosin in einer Endkonzentration von 40 g/l Kero- sin.

Nach der Ernte der Kulturen werden die verbliebenen ungefähr 35 ml Kul- tur mit Wasser auf 40 ml aufgefüllt. Anschließend werden die Zellen im Hochdruckhomogenisator, Typ Micron Lab 40, Fa. APV Gaulin, 3 x bei 1500 bar aufgeschlossen.

Die Suspension mit den aufgeschlossenen Zellen wurde mit 35 ml THF versetzt und 60 min bei RT im Dunkeln bei 250 upm geschüttelt. Danach wurden 2 g NaCI zugegeben und das Gemisch nochmals geschüttelt. Der Extraktionsansatz wurde dann 10 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die ge- färbte THF-Phase wurde abgenommen, die Zellmasse war vollständig ent- färbt.

Die THF-Phase wurde am Rotationsverdampfer bei 30 mbar und 30 °C auf 1 ml eingeengt und danach nochmals in 1 ml THF aufgenommen.

Nach Zentrifugation 5 min bei 20 000 x g wurde ein Aliquot der oberen Phase entnommen und durch HPLC analysiert (Fig. 24, Fig. 23).

D) Aufarbeitung und Isolierung der Carotinoide bzw. des Nahrung- mittels Die oben unter A) angegebenen Kulturbrühen wurden wie nachfolgend aufgearbeitet, um hochreine Carotinoide und ein entsprechendes Nah- rungsmittel zu erhalten.

Der Carotinoidgehalt der Kulturbrühen 1,2, 3 betrug zwischen 0,5 und 1,5 g/L.

D1) Beispiel gemäß Varainte a) IIA und Variante b) IIA bzw. IIB Die Kulturen mit identischen Medien (insgesamt ca. 1 L) wurden am Ende des Kultivierungszeitraums vereinigt und mit Hilfe eines Dispergiergeräts (Ultra. Turrax @) homogenisiert.

Die Feststoffkonzentration in den Medien 1 und 2 betrug 37 g/l bzw. 11 g/L. Die Entwässerung der Kulturbrühe erfolgte durch eine Zentrifuge. Bei hohen Zellkonzentrationen bzw. hohem Feststoffgehalt des Mediums kann dieKulturbrühe auch ohne vorherige fest-flüssig-Trennung weiterverarbei- tet werden (Medium 3 : 127 g Feststoff/L. Nach vorheriger Homogenisation mit einem Dispergiergerät (Ultra-Turrax @) und unter ständigem Rühren der Suspension wurde die Zellmasse über eine Schlauchpumpe auf den Trockner aufgegeben. Die Eindüsung in den Zylinder des Laborsprüh- trockners erfolgte dabei über eine Zweistoffdüse mit dem Durchmesser 2,0 mm. Eingedüst wurde mit 2 bar und 4,5 Nm3/h Stickstoff. Die Temperatur am Eintritt betrug ca. 125°C bis 127°C. Das Trocknungsgas war Stickstoff mit einer Flussrate von 22 Nm3/h. Die Austrittstemperatur betrug zwischen 59°C und 61°C. Bei jeder der drei Fermentationsbrühen konnte am Zyklon des Sprühtrockners rieselfähiges Produkt abgeschieden werden. Die Wandbeläge im Turm (sofern vorhanden) platzte automatisch von der Gefäßwand ab und werden als unproblematisch eingestuft.

Es wurden zwischen 8 und 100 g pulvriges Nahrungsmittel erhalten, wel- ches direkt als Tierfuttermittel verwendet werden könnte. Es enthielt ca. 1- 10 % Carotinoide bezogen auf das Trockengewicht. Die Restfeuchte be- trug weniger als 5%.

Beispiel gemäß Variante b) IIC D2) Extraktion mit Tetrahydrofuran Die Zellen aus je 40 ml der Kulturbrühen 1,2, 3 wurden 3 x bei 1500 bar durch einen Hochdruckhomogenisator, Typ Micron Lab 40, Fa. APV Gau- lin aufgeschlossen. Je 20 ml der Suspensionen mit den aufgeschlossenen Zellen wurden mit 20 ml Tetrahydrofuran versetzt und 30 min, bei 30°C im Rundschüttler bei 200 Upm geschüttelt. Danach wurden 2 g NaCI zuge- setzt und zur Phasentrennung 5 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die THF- Phase wurde abgenommen. Danach wurde die wässrige Phase nochmals mit 20 mi THF extrahiert. Die Extrakte wurde vereinigt. Die Carotinoidkon- zentration wurde durch HPLC quantifiziert.

D3) Extraktion mit Methylenchlorid Die Biomassenabtrennung aus der Kulturbrühe (200 mL) erfolgte durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 10 min. in einer Laborzentrifuge.

Die abgetrennte Biofeuchtmasse (jeweils ca. 10 g bis 100 g) wurde mit 10 - 100 mL Wasser vermischt, um wasserlösliche Komponenten zu entfer- nen. Die Biomasse wurde abgetrennt (Laborzentrifuge) und danach mit Dampf (T = 121, t = 30 min, 1 bar) im Autoklaven sterilisiert und so die Zellen aufgeschlossen.

Zu den Zelltrümmern wurden 25-250 g Methylenchlorid zugegeben und das Carotinoid aus der Biomasse mittels Ausschütteln extrahiert. Die Bio- masse wurde in einer Laborzentrifuge abgetrennt.

Es wurde ein Lösungsmitteltausch von Methylenchlorid zu Methanol durchgeführt, wozu die Carotinoidlösung ca. vier Stunden bei 40°C bis 60°C gehalten und über diesen Zeitraum kontinuierlich mit insgesamt 20- 200 mL Methanol versetzt wurde. Methylenchlorid wurde dabei als Lö-

sungsmittel zurückgewonnen. Erste Carotinoid Kristalle fielen aus. An- schließend wurde langsam, über 6 h auf ca. 10 °C abgekühlt, wobei die Carotinoid Kristalle an Größe und Anzahl zunahmen.. Danach wurde die Mutterlauge abfiltriert und die Carotinoid Kristalle getrocknet. Ein Teil der Mutterlauge kann zum Lösungsmitteltausch wiederverwendet werden. Der andere Teil wird destilliert und das so gereinigte Methanol im Lösungsmit- teltausch wiederverwendet.

Es wurden 0,0, 08 g bis 0,24 g Carotinoid Kristalle erhalten, welche eine Reinheit (HPLC, vgl. oben) von 95 % aufwiesen. Die Ausbeute an Caroti- noid Kristallen betrug 80 % bezogen auf die Konzentration an Carotinoid in der Biomasse.

Die abgetrennte methylenchloridfeuchte Biomasse wurde nach Wasser- dampfdestillation sprühgetrocknet (TE = 125'C, TA = 60 °C) und kann als Tierfuttermitteladditiv eingesetzt werden.

Hierzu wurde nach vorheriger Homogenisation mit einem Dispergiergerät (Ultra-Turrax) und unter ständigem Rühren der Suspension die Zellmasse über eine Schlauchpumpe auf den Trockner aufgegeben.

Die Eindüsung in den Zylinder des Laborsprühtrockners erfolgte dabei über eine Zweistoffdüse mit dem Durchmesser 2,0 mm. Eingedüst wurde mit 2 bar und 4,5 Nm3/h Stickstoff. Die Temperatur am Eintritt betrug ca.

125°C bis 127°C. Das Trocknungsgas war Stickstoff mit einer Flussrate von 22 Nm3/h. Die Austrittstemperatur betrug zwischen 59°C und 61 OC. Bei jeder der drei Fermentationsbrühen konnte am Zyklon des Sprüh- trockners rieselfähiges Produkt abgeschieden werden. Die Wandbeläge im Turm (sofern vorhanden) platzte automatisch von der Gefäßwand ab und wurden als unproblematisch eingestuft.

Es wurden ca. 2,5-25 g pulvriges Nahrungsmittel erhalten, welches di- rekt als Tierfuttermittel verwendet werden könnte. Es enthielt ca. 0,5%- 1,5% Carotinoide bezogen auf das Trockengewicht. Die Restfeuchte be- trug weniger als 5%.

Insgesamt (einschließlich des aufgereinigeten Carotinoid-Nahrungsmittels betrug die Ausbeute an Carotinoid ca, 95 % bezogen auf die Ausgangs- menge Carotinoid in der Kulturbrühe.