Carotinoide sind natürliche Farb-und Wirkstoffe, die im pflanzlichen Organismus als Schutz-oder Farbpigmente gebildet werden.

Im tierischen Organismus werden einige von ihnen in Vitamin A umgewandelt und haben als solche zahlreiche speziellen Wirkungen im zentralen Bau-und Betriebsstoffwechsel. So ist ß-Carotin eine Vorstufe von Vitamin A und wird im tierischen Organismus in das Vitamin umgewandelt. Der tierische Organismus ist nicht in der Lage, Vitamin A ohne die zugeführten Vorstufen zu synthetisieren.

ß-Carotin ist eine fettlösliche Substanz und kann deshalb nur in Verbindung mit Fetten und Ölen in den Körper gelangen. Die speziellen Wirkungen von Vitamin A sind bereits vor 2000 Jahren in China bekannt gewesen, wo z. B. bei Augenbeschwerden oder Nachtblindheit der Verzehr von frischem farbigen Obst und grünen Gemüsen empfohlen wurde.

Mensch und Tier haben einen hohen natürlichen Bedarf von ß-Carotin, da diese Substanz bzw. daraus im Körper gebildete Substanzen die körperliche Leistungsfähigkeit stabilisieren und schädliche Umwelteinwirkungen abwehren.

Der tägliche Mindestbedarf wird mit 0,8 mg-1 mg Vitamin A = 5 mg-6 mg ß-Carotin angegeben (DGE 2000). Nach Heseker et al. (VERA-Schriftenreihe, Bd. III, 2. Aufl., Wiss. Fachverlag Dr. Fleck, Niederkleen, 1994) liegt die tatsächliche tägliche ß-Carotinaufnahme in der Bundesrepublik Deutschland bei 1, 5 mg-2,0 mg. Nach epidemiologischen Studien besteht eine hohe Korrelation zwischen niedrigen ß-Carotin-Plasmaspiegeln und dem Risiko koronarer Herzkrankheiten und Myocardinfarkt (Kardinaal et al., Euramic study, Lancet 342, 1379-84, 1993).

Aber nicht nur als Wirksubstanz ist ß-Carotin bedeutsam, vielmehr wird in kosmetischen und pharmazeutischen Produkten dem Wunsch nach Schönheit und gesunder Lebensweise entsprochen und deshalb auch die Farbeigenschaften des ß-Carotins genutzt.

ß-Carotin ist jedoch nicht nur direkt im Humanbereich bedeutsam. Auch in der Tierernährung spielt ß-Carotin eine wichtige Rolle. Übliche Futtermittel wie Klee, Luzerne enthalten zwar ß-Carotin, jedoch nimmt der Anteil in den Pflanzen durch Degradation der Böden infolge der industriellen Produktionsmethoden immer mehr ab.

ß-Carotin wird in der Natur ausschließlich von pflanzlichen Organismen und von einigen Mikroorganismen synthetisiert. Wesentliche ß-Carotingehalte sind in Karotten (Namensgeber), Paprika, Kirschen, verschiedenen Algen, aber auch in Palmöl und in grünem Tee enthalten. Wesentlich bedeutet in diesem Zusammenhang im Allgemeinen < 0,1 % in der Trockenbiomasse.

Die Gewinnung von natürlichen ß-Carotinproduzenten in technischem Maßstab ist sehr aufwendig und erfordert vor allem sehr große Anbauflächen und die Aufarbeitung großtonnagiger Biomassemengen. Aus diesem Grunde wurde in der Mitte des vorigen Jahrhunderts begonnen, Möglichkeiten einer chemischen Synthese zu suchen und zur Anwendungsreife zu entwickeln.

ß-Carotin wird heute großtechnisch zu 90 % durch chemische Synthese erzeugt.

Zunehmend gewinnen jedoch Verfahren an Bedeutung, in denen aus natürlichen Quellen ß-Carotin gewonnen wird, weil festgestellt wurde, dass die human-und tierphysiologische Wirkung des ß-Carotin trotz deren geringen Anteils am ß-Carotin von teilweise < 1 % wesentlich durch die natürlichen Begleitstoffe des ß-Carotin, die ebenfalls zu den Carotinoiden zählen, positiv beeinflusst wird.

Da der in diesem Bereich entstandene und zunehmende Bedarf an natürlichem ß-Carotin aus der klassischen landwirtschaftlichen Produktion heraus nicht zu decken ist, wird nunmehr seit ca. 20 Jahren an der Möglichkeit der industriellen biotechnologischen Synthese von ß-Carotin gearbeitet, wobei dafür Organismen in Frage kommen, deren Leistungsfähigkeit bezüglich der ß-Carotinsynthese auf deutlich > 1 % der Trockenbiomasse gesteigert werden kann und für die biotechnischen Verfahren hier insbesondere die Fermentation oder die Algenkultivierung zugänglich sind.

Allgemein wurde durch umfangreiche Forschungsarbeiten festgestellt, dass Algen <BR> <BR> (z. B. Dunaliella salina, CAlorella spec, Spiruline spec. etc. ), Mikropilze wie<BR> Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum und Phycomyces blakesleea7zus, Bakterien wie Flavobacterium, Corynebacterium, Mycobacterium und Brevibacterium und Hefen (Rhodotorula) nicht nur ß-Carotin synthetisieren, sondern sogar einen Überschuss an Carotinoiden unter bestimmten Fermentations-und Anzuchtbedingungen erzeugen können (Lampila et al., Mycopatholigia 90,65, 80, pp. 65-80, 1985).

Von den Carotinoiden wurde besonders der Bildung von ß-Carotin Aufmerksamkeit geschenkt. In der Alge Dunaliella kann bis zu 20 % ß-Carotin (De Baets, Vandedrinck, Vandamme, Encyclopedia of Mikrobiology, Vol. 4,837 - 853, 2000) in der Trockenbiomasse angereichert werden. Ihre wirtschaftliche Zucht ist jedoch nur unter tropischen Verhältnissen in salinen Gewässern mit Erfolg möglich. Allerdings bleibt die Algen-Biomassekonzentration im Medium ca. um eine Zehnerpotenz hinter der von Pilz-oder Bakterienkulturen zurück und es müssen große Flächen bewirtschaftet werden, um industriell interessierende ß-Carotin-Ausbeuten zu erlangen.

Aus diesem Grunde konzentriert sich die Entwicklung zunehmend auf Mikroorganismen, die gleichzeitig Biomassekonzentrationen > 20-30 g/1 und eine hohe Anreicherung von ß-Carotin erreichen. Dafür werden im Allgemeinen Wildstämme oder ausgewählte Selektanten verwendet, die einer Mutagenese unterzogen wurden. Die daraus abgeleiteten und selektierten Hochleistungsmutanten werden kultiviert und bei Einstellung optimaler Prozessbedingungen für die fermentative Biosynthese eingesetzt.

Bekannte Verfahren der Mutagenese sind die Behandlung mit Nitrosoguanidinen unterschiedlicher Konzentration allein oder z. B. in Kombination mit UV- Bestrahlung (Cubero et al., 1993, Kuntschikova, 2000).

Die höchste Ausbeute an ß-Carotin (3-4 g/l) erhält man nach Weide, Paca, Knorre ("Biotechnologie", Gustav-Fischer Verlag, 1987) bei der Fermentation einer Mischkultur der Halbstämme von Blakeslea trispora (+) -und (-)-Stämmen<BR> (Hochleistungsmutanten). Die ß-Carotin-Bildung des (-) -Stammes wird durch Trisporsäure gefördert (Bu'Lock et al., Arch. Microbiol. 97,239-244, 1974).

Die Fermentation läuft bei 28°C ab und dauert 6-8 Tage.

Die gemeinsame Züchtung der unterschiedlich sexuellen Halbstämme von Blakeslea trispora wurde ursprünglich von Hesseltine und Anderson entwickelt (US-2 865 814, US-2 890 989) und von verschiedenen Unternehmen weiterentwickelt.

Zusätze von Thiamin, Isoniazid und ß-Ionon fördern die Carotinsynthese (Vandamme E. J., Biotechnology of Vitamins, Pigments and Growth Factors, 31- 33, Elsevier Science Publishers LTD, 1989).

Die Bedeutung der Trisporsäure liegt darin begründet, dass diese Säure gemeinsam mit den genetischen Informationen die Bildung eines Überschusses an ß-Carotin in dem (-)-Halbstamm fördert (Caglioti L., et al., Tetrahedron Suppl., 7,175-187, 1966). Eine gezielte Verminderung der Trisporsäure durch Chemikalien führt zu einer verminderten ß-Carotin-Bildung (Lampila). Eine fördernde Wirkung wird durch Zusatz von Abscissinsäure (wie ß-Carotin ein Terpen), ß-Ionon (Terpen) (siehe u. a. Feofilova, Arbuzov Mikrobiologija Vol. 44, 3, 1975, alpha-Ionon (Terpen) und Vitamin A (Terpen) erzielt (US 005328845 vom 12. Juli 1994). Der Zusatz dieser Substanzen beschleunigt die RNA- Translation und führt zu einer verstärkten Synthese der Enzyme de novo, die Carotinoide bilden. Weitere untersuchte Zusatzstoffe sind Penicillin, Retinol, Kerosin, Aromaten wie Dimethylphthalat und Veratrol, und stickstoffhaltige heterozyklische Verbindungen wie Iproniazid (neben Isoniazid s. o.).

Als Beschleuniger der ß-Carotin-Synthese wirken Substanzen, die einen Sauerstoff-Stress erzeugen. So kann durch Zusatz von oberflächenaktiven Substanzen (z. B. Span 20 : Seon-Won Kim et. al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 84, No. 4 330-332,1997) die Sauerstoffübertragung in das wässrige Medium beschleunigt und damit die Sauerstoffverfügbarkeit erhöht werden. Sauerstoff-Stress kann ebenfalls erzeugt werden, wenn Ozon zugesetzt oder unmittelbar in der Fermentation erzeugt wird. Ebenso ist der Zusatz von Wasserstoffperoxid beschrieben, der eine wesentliche Erhöhung der ß-Carotinbildung bewirkt (Jae-Cheol Jeong et. al., Biotechnology letters 21,683- 686, 1999).

Die Beeinflussung der ß-Carotinsynthese durch Variation der Inhaltsstoffe der Nährlösung wird auch durch einen Mangel an Phosphat (Goncharova, O., Konova, I., Biruzova, V., Biochemical and structural features of Blakeslea trispora dependent on medium composition, Microbiology 65,47, 1996) erreicht, wodurch es zu einer Veränderung der Zellwand bei Blakeslea trispora BS01 (+) und BS01 (-) kommt.

Die Auswahl der Kohlenstoffsubstrate hat ebenfalls Einfluss auf die ß-Carotin- Synthese. So wurde gefunden, dass komplexe Substrate am günstigsten sind, wenn sie Kohlenhydrate und organische Stickstoffverbindungen gleichzeitig enthalten (Soja, Sojamehl, Sojaextraktionsschrot) (Lampila). Auch der Zusatz von Fetten und Ölen verbessert die ß-Carotin-Synthese (US 5 422 247 A, EP 1 367 131 A1).

So wurde durch Zusatz von Sojaöl, Baumwollöl oder Fettsäuren aus diesen Ölen sowie Soapstock (ausgefällte Fettsäuren als Produkt der Ölraffination) eine erhöhte ß-Carotin-Bildung bis zum 80-fachen der Vergleichsprobe erreicht (Lampila). Über den Einfluss verschiedener Lipide auf die Bildung von Carotinoiden des gemischten Paares berichten Pazola et. al., Acta Microbiologica Polonica Vol. 17,1, pp 75-82,1968. Die Zusammensetzung der Lipide ist wichtig für die Bildung des Speicherlipids, des Lösungsmittels für ß-Carotin in der Zelle. Es wurde dabei festgestellt, dass das Fettsäurespektrum entscheidenden Einfluss auf den endogenen Lipidpool besitzt.

Die grundlegenden Untersuchungen zur Sexualität der pilzlichen ß-Carotinproduzenten und zur Carotinoidbiosynthese wurden im Schüttelkolbenmaßstab durchgeführt. Eine anwendungsbezogene Erzeugung von ß-Carotin mit einem großtechnischen Verfahren ist kaum beschrieben, allerdings ist bekannt, dass verschiedene Unternehmen ß-Carotin fermentativ produzieren.

Dafür werden Mutanten von Blakeslea trispora und Phycomyces blakesleeanus eingesetzt.

Die heute verwandten Verfahren gehen auf den von Ninet und Renaut 1979 entwickelten Fermentationsansatz für eine kleintechnische Fermentation im 3201-Maßstab bei einer Fermentationsdauer von 185 Stunden zurück, wobei grundsätzlich der (+) -und der (-) -Halbstamm getrennt voneinander vermehrt und erst in der letzten Stufe zusammengeführt werden. Dazu werden beide Halbstämme in die Nährlösung der Fermentationsstufe dosiert, dort gemeinsam vermehrt und durch Zufügung eines Stimulators zu einem festgelegten Zeitpunkt die Biosynthese des ß-Carotin ausgelöst. Grundsätzlich ist diese Technologie durch die Erzeugung von Antibiotika und Enzymen bekannt. Dort wird immer ein mehrstufiges, aseptisches Verfahren gewählt, in dem aus dem Schüttelkolben in einem ersten Fermentor Biomasse gezüchtet wird, die in einem zweiten Fermentor weiter angereichert wird (Größenstufen 1 : 10). Die eigentliche Synthese des Zielproduktes erfolgt in der dritten Stufe, indem dort erst Biomasse erzeugt wird und durch Änderung der Fermentationsbedingungen die Erzeugung des Zielproduktes (Primärmetabolit oder Sekundärmetabolit) stattfindet. Allen Verfahren ist gemeinsam, dass sie aseptisch ablaufen. Zur Gewährleistung der Sterilität wählt man die diskontinuierliche Betriebsweise. Nach Erreichen des Ziels der Stufe wird der Fermentor entleert und für den wiederholten Einsatz sterilisiert. In jedem oben beschriebenen Verfahren werden Einzelkulturen eingesetzt. Es wird darauf orientiert, dass die eingesetzten Mikroorganismen morphologisch homogen sind, da mit solchen Organismen die Einhaltung der erforderlichen Prozessbedingungen leichter realisierbar ist. Entsprechen sie diesen Forderungen nicht, werden im Allgemeinen chemische und physikalische Maßnahmen durchgeführt, um die Mikroorganismen entsprechend zu beeinflussen.

Der Nachteil aller bekannten Carotinoid-Verfahren ist, dass diese nur bedingt großtechnisch durchführbar sind.

Derzeit ist nur ein technisches Verfahren zur ß-Carotinherstellung bekannt, wobei lediglich in einem 5-1-Fermentor von Mantzouridou et al., im Jahre 2001 (Biochemical Engineering Journal 3561,1-13) der Einfluss der Rührintensität und der Begasungsrate untersucht und durch Modellierung die entscheidenden Einflussparameter bestimmt wurde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung carotinoidhaltiger Biomasse anzugeben, dass aufwandtgering im großtechnischen Umfang antibiotikafrei realisierbar ist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieser Lösung sind in den nachgeordneten Ansprüchen offenbart.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass carotinoidhaltige, insbesondere ß-Carotin enthaltende Biomasse in submerser Kultur durch heterothallische Pilze aus dem Stamm Zygomycota, Ordnung Mucorales, bspw. Blakeslea trispora (Hochleistungsmutanten) großtechnisch unter dem Zusatz von Trisporsäurederivaten und Trisporsäure in kulturlösungshaltigen Fermentern erzeugt wird, indem : aus den (+) -und (-) -Halbstämmen des tropischen Blakeslea trispora erfindungsgemäß nach dem zehn-bis zwölftägigen emersen Wachstum auf einem stickstofflimitierten Komplexmedium unter Verwendung eines ionenfreien Wassers mit einem 1 % igen Tensidzusatz reine Sporensuspensionen gewonnen werden, wobei die Sporensedimente von 10 ml Sporensuspension einer Eprouvettenkultur mit 1 ml ionenfreiem Wasser resuspendiert und dann mit 9 ml Glycerol aufgefüllt werden und diese Sporensuspensionen, die nicht gequollene Sporangiosporen enthalten, in Röhrchen abgefüllt und bei-80°C bis-85°C deponiert werden, dem mehrstufig vermehrten (-) -Halbstamm anstelle des (+)-Halbstammes Trisporsäure und/oder eine Trisporsäure-Cosubstanz zu dem Zeitpunkt zugesetzt wird, zu dem in der bisherigen Verfahrensführung die Biomasse des (+) -Halbstammes zugesetzt wurde und das Gemisch im Anschluss daran einer Reifezeit unterworfen wird, bevor eine erneute Biomasseproduktion ausgelöst wird. nur der (-) -Halbstamm einer üblichen mehrstufigen Biomassevermehrung<BR> unterworfen und zur ß-Carotinsynthese genutzt wird und der (+) -Halbstamm in kontinuierlicher, zyklischer oder diskontinuierlicher Kultur im Labormaßstab gezogen wird, wobei je nach Verfahrensführung aus dieser Kultur Biomasse, Kulturflüssigkeit, Biomassehomogenisat oder die gamonartigen Stimulatoren oder Trisporsäure dem (-) -Halbstamm nach dem Abschluß der exponentiellen Wachstumsphase für die Biomasse, Biomassehomogenisat und Kulturflüssigkeit im Verhältnis 1 : 100 und für die gamonartigen Stimulatoren bzw. für die Trisporsäure im Verhältnis 1 : 1000 bis 1500 als biosynthese- stimulierende Zuschlagstoffe zugefügt werden.

Weiterhin erfindungsgemäß ist : Vorteilhaft ist es Stimulatoren einzusetzen, die die Biosynthese von ß-Carotin unterstützen. Stimulatoren können Vitamine und andere Stoffe sein, die vom chemischen Aufbau dem ß-Carotin verwandte Strukturen aufweisen.

Es wird die Nährlösung im Produktfennentor so zusammengesetzt, dass sie zum Zeitpunkt des Abschlusses der Induktionszeit die Phosphorkonzentration durch Limitation zur Begrenzung des Biomassewachstums in der gesamten Kultur führt und die Synthese von ß-Carotin ausgelöst wird. Diese kann auch in Verbindung mit dem Zeitpunkt der Phosphorlimitation durch einen Sauerstoffschock und/oder eine Temperaturerniedrigung um wenigstens 4 °C eingeleitet werden.

Es wird die Nährlösung so zusammengesetzt, dass sowohl beim Auskeimen der Sporen als auch bei der Biomassevermehrung der Chitinaufbau in den Zellwänden eingeschränkt wird und dadurch eine bessere lösemittelfreie Extrahierbarkeit des ß-Carotin aus den Pilzzellen erreicht wird (wie beispielsweise im Ausführungsbeispiel 1 angegeben).

Vorteilhafter Weise wird die Viskosität der Nährlösung durch einen Zusatz von Enzymen oder Enzymgemischen so eingestellt, dass optimale Durchmischungs-und Gasaustauschbedingungen entstehen und dadurch ein wirtschaftlicher Betrieb der Fermentation als technischer Prozess ermöglicht wird.

Es können zusätzlich Aktivatoren eingesetzt werden, die die Biosynthese von ß-Carotin schützen. Diese können Substanzen sein, die vom chemischen Aufbau dem ß-Carotin verwandte Strukturen aufweisen.

Es werden die Prozesse Biomasseproduktion und ß-Carotinsynthese durch die Phosphorlimitation voneinander getrennt, so dass sie nacheinander ablaufen und dadurch eine deutliche Begrenzung der Fermentationsdauer auf < 90 bis 100 Stunden bei hoher ß-Carotin-Ausbeute von > 25 g/kg Trockenbiomasse erreicht wird.

Die Gewinnung des ß-Carotins aus der Pilzbiomasse erfolgt durch lösemittelfreie Extraktion mit Pflanzenöl auf an sich bekannter Weise.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das unter Nutzung von zur ß-Carotin-Bildung befähigten heterothallischen Pilze aus dem Stamm Zygomycota, Ordnung Mucorales die industrielle Produktion von ß- carotinhaltiger Pilzbiomasse unter optimalen wirtschaftlichen und technischen Bedingungen gestattet.

Dabei wird die Biomasse ausschließlich aus Sporen getrennt nach (+)-und (-)- Paarungstyp mehrstufig vermehrt.

Zur Biomasse des (-) -Paarungstyp werden erst nach Abschluss der letzten Biomassevermehrungsphase vor der Produktfennentation Biomasse des (+)- Paarungstypes oder Kulturflüssigkeit des (+)-Paarungstypes oder homogenisierte Biomasse des (+)-Paarungstypes oder gamonartige Stimulatoren oder Laktone oder Trisporsäure oder Trisporsäurederivate zugesetzt, wobei mit diesem submersen Gemisch nach einer ein-bis mehrstündigen Reifezeit im Impffermenter die Produktfermentation gestartet wird. Die Nährlösung ist so zusammengesetzt, dass zum Zeitpunkt tw die Wachstumsphase der Biomasse durch P-Limitation abgeschlossen ist.

Die Synthese von ß-Carotin kann im Rahmen der Erfindung zusätzlich durch Erzeugung einer kurzfristigen Stress-Situation ausgelöst werden. Zusätzlich wird durch ein phosphorratenlimitiertes Wachstum und eine Phosphorlimitierung während der Wachstumsphase die lösemittelfreie Extraktion des ß-Carotins vermittels pflanzlichem Öl aus der resultierenden Trockenbiomasse von Blakeslea trispora BS01 (-) ermöglicht.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten (+) -Paarungstypen sind nur Induktionsstämme und ihre Biomasse wird in kontinuierlicher oder zyklischer Kultur angezogen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten (-) -Halbstämme hingegen sind nur Produktionsstämme für Carotinoide.

Die Biomassen der (+)-Paarungstypen werden in zyklischer Kultur angezogen. <BR> <BR> <P>Die (-) -Paarungstypen hingegen werden stetig neu mehrstufig vermehrt. Das<BR> Verhältnis von Biomasse des jeweiligen (+) -Paarungstypes zu der des jeweiligen<BR> (-) -Paarungstypes beim Mating beträgt 1 : 10 bis 1 : 200 vorzugsweise 1 : 45 bis<BR> 1 : 75. Die Matingphase d. h. die Dereprimierungsphase des (-) -Halbstammes wird durch den Einsatz von Kulturflüssigkeit, Homogenisaten oder Syntheseprodukten <BR> <BR> des (+) -Halbstammes stammspezifisch bestimmt und beträgt 1-180 Minuten, vorzugsweise 30-90 Minuten.

Die Nährlösung besteht aus polymeren Nährstoffen, weist eine Phosphorlimitierung auf, wobei das polymere Kohlenstoffsubstrat im Verlauf der Mediumssterilisation nach einer Verkleisterung einer enzymbedingten Verflüssigung unterzogen wird, die die Viskosität der Lösung stark herabsetzt, aber keine monomere Kohlenstoffsubstrate entstehen lässt.

Die Nährlösung ist so zusammengesetzt und präpariert, dass das Biomassewachstum in der Kultur gleichmäßig und schnell mit reduzierter Chitinbiosynthese verläuft und nach Wachstumsabschluss infolge der Phosphorlimitierung nur Substrate für die Produktbildung zur Verfügung stehen, so dass nach weiterem enzymatischen Aufschluss durch den produzierenden Pilz eine erneute sekundäre Biomassebildung nicht möglicht wird.

Erfindungsgemäß ist, dass als ß-Carotinbildner heterothallische Pilze mit einem ß-Carotin-Synthesepotential > 2,0 % des Trockengewichtes eingesetzt werden, insbesondere Blakeslea trispora und davon durch Mutagenese abgeleitete Stämme, wobei die unterschiedlichen Paarungstypen auch aus unterschiedlichen Stammlinien stammen können.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren werden die Hochleistungsmutanten BS01 (+) und BS01 (-) von Blakeslea trispora verwendet, die in der Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSZM) hinterlegt sind.

Erfindungswesentlich ist, dass die Produktions-und Hilfskulturen grundsätzlich nur aus Sporen gezogen werden. Bis zu einer Reaktorgröße von 120 1 werden beide Halbstämme in getrennter Anzucht gleich behandelt. Danach wird der <BR> <BR> BS01 (+) -Halbstamm in dem Reaktor als kontinuierliche oder zyklische Kultur<BR> weitergeführt, der BS01 (-) -Halbstamm wird weiter vermehrt bis zu einem<BR> Biomassevolumen von 5 m3. Zum Ende der Wachstumsphase des BS01 (-) - Halbstammes, wenn zu diesem Zeitpunkt die Nährsubstratkonzentrationen im Reaktor abgesenkt sind, werden Trisporsäurederivate und/oder Trisporsäure im <BR> <BR> Verhältnis 1 : 1000-1500 zur BS01 (-) -Biomasse hinzugefügt. Die<BR> Trisporsäurederivate und/oder Trisporsäure werden aus der BS01 (+) -<BR> Halbstammkultur gewonnen. Sie können als BS01 (+) -Biomasse oder Homogenisat (dann im Verhältnis 1 : 10 bis 1 : 100), Kulturlösung oder separiertes Stimulatorgemisch zugefügt werden. Nach einer entscheidenden Kontaktzeit von 30-180 Minuten unter fermentativen Bedingungen wird mit diesem induzierten Myzelgemisch die Nährlösung für die ß-Carotinsynthese im Produktfermentor inokuliert. Die Nährlösung ist so zusammengesetzt, dass nach 24 Stunden der phosphorratenlimitierte Biomassezuwachs durch die Phosphorlimitation abgeschlossen wird und die ß-Carotinsynthese beginnt. Diese wird durch mindestens dreistündigen Sauerstoffstress zusätzlich induziert und wird vorwiegend nach 78-94 Stunden durch sofortige Fest-Flüssigtrennung und anschließende Trocknung beendet.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die Stammhaltung und die Kultivierung der homozygoten Paarungstypen BS01 (+) und BS01 (-) des mutagen behandelten Blakeslea trispora von Wichtigkeit, um die genetische Stabilität zu gewährleisten. Der Stamm wurde durch Mutagenese mit Nitrosoguanidin in einer Konzentration von 500 mg/ml einer Sporensuspension von 0,02-0, 1 % für BS01 (+) und in der Kombination mit einer UV-Bestrahlung bei einer Überlebensfähigkeit der Sporen von 5-7 % und Nitrosoguanidin in der gleichen Konzentration für BS01 (-) gewonnen. BS01 (-) zeichnet sich durch einen reduzierten Chitingehalt der Zellwand aus, beide Halbstämme spalten Öle in Glycerol und Fettsäuren, können aber die Spaltprodukte nicht verwerten.

Außerdem sind sie durch einen hohen Verzweigungsgrad ihrer Hyphen gekennzeichnet. Die asexuelle Reproduktion der Sporangiosporen erfolgt separat für die Halbstämme auf einem stickstofflimitierten Medium, um eine ausreichend hohe Sporulation zu erzielen. Der homogene Sporenrasen beider Halbstämme wird nach morphologischer Ausdifferenzierung der Sporangiosporen nach zwölftägigem Wachstum mit ionenfreiem Wasser unter Verwendung eines 1 % igen Tensidzusatzes abgeschwemmt, das Sporensediment nochmals mit ionenfreiem Wasser gewaschen und mit Glycerol resuspendiert. Diese Suspension wird in Ampullen abgefüllt und bei-80°C bis-85°C deponiert. Solche master- Konserven mit nicht gequollenen Sporen infolge verhinderter Wassereinlagerung durch Ionenfreiheit sind ein Jahr Ausgangsmaterial für die Fermentationen unabhängig von ihrer Volumengröße.

Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ausführungsbeispielen und Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Nachfolgend soll das erfindungsgemäße Verfahren anhand der zwei Ausführungsbeispiele zur Kultivierung von Blakeslea trispora BS01 (+) und BS01 (-) näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diesen Pilz zu beschränken, da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Pilze der Ordnung Mucorales zum Einsatz kommen können. l. Ausführungsbeispiel 0, 3 1 Medium mit der Zusammensetzung Sojapepton 20 g/l, Maisstärke 30 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, Sonnenblumenöl 6,5 ml/l, Vitamin Bl 0,002 g/l, Vitamin B2 0, 001 g/1 nach einer Amylasebehandlung mit 20 mg Amylase (BAN 800 MG, Novo Nordisk) pro 2 1 Medium werden in 2-1-Steilbrustkolben gefüllt und nach der Autoklavierung von 30 min. bis 45 min. bei 125 °C mit 1 ml Sporensuspension mit einer Sporenkonzentration von 2,0 x 106 bis 4,0 x 106/ml Sporensuspension inokuliert. Diese Sporensuspension wurde durch Abschwemmung einer 12 Tage alten Eprouvettenkultur, die mit 0,1 ml master- Konserve beimpft wurde, mit 11 ml ionenfreien Wasser gewonnen.

Die erste Vermehrungsstufe erfolgt im 2-1-Schüttelkolben mit 180 U/min. mit einer Amplitude von 10 cm bei 27 °C +/-1 °C 24 h für beide Halbstämme gleich.

Der Mediumsansatz für einen 30-1-Impffermentor besteht aus Sojamehl 20 g/l, Maisstärke 20 g/l, KH2P04 0,5 g/l, Sonnenblumenöl 1,5 g/l, Vitamin B l 0,002 g/l.

Die Sojamehl-und Maisstärkeeinwaage in 10 1 Leitungswasser wird im Fermentor auf 100 °C erhitzt, nach Abkühlung auf 60 °C das Kaliumdihydrogenphosphat und vorautoklaviertes Sonnenblumenöl zugesetzt und das Volumen auf 22 1 ergänzt. Nach der pH-Einstellung auf pH = 6,5 bis 7,0 erfolgt die Sterilisation bei 121'C für 45 min. Die Inokulation des Impffermenters erfolgt mit 0,6 1 Schüttelkultur des BS01 (-) -Halbstammes.<BR> <P>Parallel zum Start wird der BS01 (+) -Halbstamm in 2-1-Schüttelkolben in der beschriebenen Weise kultiviert. Nach dem 24-Stunden-Wachstum erfolgt die <BR> <BR> Biosyntheseinduktion im BS01 (-) -Stamm durch Zufügen von 0,36 1 BS01 (+)-Kultur im Fermenter für 60 bis 180 Minuten. Die Kultivierung des durch den zugefügten BS01 (+) -Halbstamm biosyntheseinduzierten BS01 (-) -Stammes verläuft mit einer konstanten Rührung von 300 U/min. und einer Belüftung von 0, 5 wm bei 27, 5 °C.

Das Medium des 500-1-Produktfermentors setzt sich aus Sojamehl 25 g/l, Maismehl 10 g/l, Maisstärke 40 g/l, tocopherolhaltige Ölfraktion 2 g/1 zusammen.

Der Mediumsansatz von 22,5 kg wird mit 2,25 g Amylase (BAN 800 MG, Novo Nordisk) in 150 1 Leitungswasser eingerührt, nach der pH-Einstellung auf pH = 6, 8-7, 0 wird dieser auf 73 °C hochgeheizt und nach 10 Minuten wird die Temperatur auf 100 °C geführt. Nach dem Abkühlen auf 60 °C wird die tocopherolhaltige Fraktion zugeführt und das Volumen auf 300 1 eingestellt. Die Autoklavierung des so präparierten Mediums erfolgt 45 min. bei 121 °C. Nach dem Einstellen der Startbedingungen, 250 U/min., Belüftung 0,4 wm und 27, 5 °C wird die fermentierte Induktionskultur durch Drucküberlagerung in den Produktfermenter überführt. Mit der Belüftungsrate (bis 1,0 wm) und der Rührergeschwindigkeit, die 300 U/min. nicht übersteigt, wird der pO2-Abfall beginnend von 100 % nur auf 10 % bis 20 % zugelassen. Von diesem Wert erfolgt in 72 Stunden ein Anstieg des pOz-Wertes auf 40 % bis 60 %. Die pH- Wertführung wird durch Zweipunktregelung bei pH = 7,2 bis 7,4 mit einer 20% igen Lauge bzw. 20% igen Säure realisiert. Das Wachstum mit der Verwertung von Proteinen bis zur Phosphorlimitation zur 24. Stunde erfolgt mit einer Säuerungsphase, die anschließend durch eine Alkalisierungsphase mit einer moderaten NH4-N-Freisetzung abgelöst wird. Das Primärwachstum ist nach 24 Stunden mit 30 g Biomasse/1 durch eine Phosphorlimitation abgeschlossen.

Gleichzeitig ist, bedingt durch die im Impffennentor schon erfolgte Induktion der <BR> <BR> ß-Carotinbiosynthese im BS01 (-) -Halbstamm, die ß-Carotinbildung frühzeitig ab 20. Fermentationsstunde im Produktfermentor induziert. Der ß-Carotingehalt entwickelt sich in Abhängigkeit von der Mediumskomposition und-präparation bis zur 84. Stunde bis zu 4 % der Biotröckenmasse. Zum Abbrucbzeitpunkt ist das tiefrote Pilzmyzel homogen und gut dekantierbar.

2. Ausführungsbeispiel Die Anzucht der beiden mutierten Halbstämme von Blakeslea trispora erfolgt nach der im Beispiel 1 für die erste Vermehrungsstufe angeführten Weise. Das Medium und die Inokulation des 30-1-Impffermenters mit dem BS01 (-) - Halbstamm sind ebenfalls identisch mit den im Beispiel 1 erfolgten Angaben. Die Kultivierung des BS01 (+)-Halbstammes erfolgt unter kontinuierlichen und/oder zyklischen Bedingungen in einem 5-1-Bioreaktor mit einem Nettovolumen von 41 Kultur. Das partikelfreie Medium enthält pflanzliche Gelatine 5 g/l, Maisquellwasser (100% ig) 10 g/l, Glukose 5 g/1 und Rhodigel (Rhodia Food) 0,5 g/l. Die Rhodigelzuführung zum Medium zwecks Einstellung einer Viskosität zur Aufrechterhaltung eines homogenen Pilzwachstums erfolgt mit einer Stammlösung. Zur Herstellung dieser Stammlösung werden 5 g Rhodigel/1 in eine Wasservorlage mit einem Ultraturrax langsam eingerührt. Das Medium wird 35 min. bei 125 °C autoklaviert, nachdem die Einstellung des pH-Wertes pH = 7,0 erfolgte. Die Inokulation des Mediums wird mit 0,3 1 Schüttelkultur des BS01 (+) - Halbstammes vorgenommen. Nach einer diskontinuierlichen Wachstumsphase von 5 Stunden erfolgt der Übergang zu einer kontinuierlichen Kulturführung mit D = 0, 1 h-l. Die Produktivität der Kultur beträgt 0,5 g/1 x h. Für die Biosyntheseinduktion (Mating) im 30-1-Impfreaktor mit einer Biomassekonzentration von 8-10 g/1 werden der 22 1 (-) -Kultur 0,36 1 BS01 (+) - Kultur zugeführt. Auf diese Weise wird die kontinuierliche Kultivierung des BS01 (+) -Halbstammes durch einen Zyklus unterbrochen. Die Induktionsbedingungen entsprechen denen im Beispiel 1, ebenso sind die Produktionsbedingungen identisch. Unabhängig vom periodischen Ablauf der Produktfermentation mit der Induktionskultur steht Biomasse des BS01 (+) - Halbstammes zur Gewinnung von aktiver Biomasse, homogenisierter Biomasse und der gamonartigen und dereprimierenden Substanzen zur Verfügung. INTERNATIONALES FORMBLATT BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 04579 Espenhain LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE I, HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Name : BIOSYNERGY GmbS Von der NTERNATIONALEN H [NTERLEGUNGSSTELLE Margarethenhain 7 zugeteilte EINGANGSNUMMER : 04579 Espenhain Anschrie : DSM 16754 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung' : 2004-09-23 III. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2004-09-27 Z geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X) 3 lebensfäbig () 3 nicht mehr lebensfähig IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DE LEBENSFÄHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST' V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten : Anschrift : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig z2 Datum : 2004-10-06 Angabe des Datums derErsthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung. In den in Regel 10. 2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung. Zutreffendes ankreuzen. Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren. Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 12/2001 INTERNATIONALES FORMBLATT BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7. 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : BS 01 (') DSM 16754 H. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde () eine wissenschaftliche Beschreibung (X) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen). Ill. EINGANG UND ANNAHME Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2004-09-23 (Datum der Erst- hinterlegung)'eingegangen ist. hinterlegung) 1 eingegangen ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten : Anschrift : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig- Datum : 2004-10-06 Falls Regel 6. 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies derZdtpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 INTERNATIONALES FORMBLATT BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 EMPFANGSBESTÄTMUNG BBI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7. 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : BS 01 (-) DSM 16755 II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde () eine wissenschaftiiche Beschreibung eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen). 111. EINGANG UND ANNAHME Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten MikroorganismuJs an, der bei ihr am 2004-09-23 (Datum der Erst- hinterlegung) l eingegangen ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten : Anschrift : MascheroderWeglb D-38124 Braunschweig . Datum : 2004-10-06 Falis Regel 6. 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ « BP/4 (einzige Seite) 12/2001 INTERNATIONALES FORMBLATT BIOSYNERGY GmbH Margarethenhain 7 04579 Espenhain LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. HINTERLEGER n. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Name : BIOSYNERGY GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Margarethenhain 7 zugeteilte EINGANGSNUMMER : 04579 Espenhain Anschrift : DSM 16755 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung' : 2004-09-23 III. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebensfähigkeit des unter n genannten Mikroorganismus ist am 2004-09-27 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X)'lebensfähig (y nicht mehr lebensfähig IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKETI'SPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST° V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) derzur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten : Ansehrift : MascheroderWeg lb D-38124 Braunschweig l Datum : 2004-10-06 Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung. In den in Regel 10. 2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprüfung. Zutreffendes ankreuzen. Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren. Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 12/2001