КЕРАТОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к области косметологии и фармацевтики, а именно к препаратам с кератолитическим действием, эффективным при лечении кератозов различной этиологии и мягком отшелушивании в рамках косметических процедур.

Различают две группы препаратов с кератолитическим действием - полученные путем химического синтеза и природного происхождения. Среди наиболее известных кератолитических препаратов, получаемых химическим синтезом, ■ — резорцин (Бензол-1, 3 -диол; С6Н4(ОН)2). Это вещество в концентрации 5—10 % оказывает кератол итическое и прижигающее действие на роговой слой кожи [Г], Недостатком этого препарата является то, что кожа активно впитывает вещество, а нанесение на большие поверхности или использование высоких концентраций может вызвать выраженные побочные эффекты: головокружение, .шум в ушах, потливость, затруднение дыхания, учащение пульса, судороги, цианоз и др. Также резорцин придает выраженный красноватый оттенок светлым волосам, а в случае недостаточного уровня очистки резорцина кожа в месте нанесения приобретает фиолетовый оттенок.

Известно несколько препаратов природного происхождения с кератолитическим действием. Например, известна композиция для ухода за кожей, которая действует на основе трех протеолитических ферментов, обеспечивающих устранение ороговевших клеток и обновление эпидермиса. Данную композицию получают путем объединения трех протеолитических ферментов - тиоловой протеазы, первичной сериновой протеазы, полученной в результате метаболических процессов Aspergillus melleus, и вторичной сериновой протеазы. Кроме того, в состав препарата также входит шшфа-гидроксикислота растительного происхождения, полученная путем экстрагирования растений, а также антиоксидант, который также может быть растительного или синтетического происхождения [2].

Недостаток этого препарата состоит в высокой цене готового продукта, что определяется получением трех видов протеолитических ферментов с высокой степенью чистоты, а также в высоком раздражающем потенциале препарата, определяемом его составом, особенно присутствием альфа-оксикислот. Также данный состав не содержит компонентов, облегчающих процесс восстановления кожи в местах, подвергшихся кератозам.

Также известен биопрепарат, удаляющий родинки, невусы, полипы, келоиды, карциномы и другие кожные образования [3]. Биопрепарат состоит из 51,7 - 52,0 % специфического белка, который содержит 10 % биологияески активных веществ в пересчете на аминокислоты: Глицин. Аспаразин, Лейцин, Пир. Фенилаланин, Лизин, а также ланолин - 25 %, глицерин - 25 %, глицерин - 25 % сухое молоко, экстракт грецкого ореха 10%, нипагин 0,12%, нипазол 0,08%, вода бидистиллированная 4,8%, проценты выражены по массе. Для получения препарата собирают куколки Lymantria dispar из пораженных лесов. Недостатком данного препарата является то, что биологический материал получают путем сбора из природы, таким образом невозможно контролировать состав действующего вещества. Кроме того, сбор биологического материала из природы не позволяет планировать определенный объем производства, находясь в зависимости от условий среды и колебаний численности вида Lymaniria dispar.

Известей еще один способ получения энтомологического комплекса в пропиленгликоле с кератолитическим действием. Энтомологический комплекс в пропиленгликоле с кератолнтическим действием, получен из насекомых отряда Lepidoptera, семейства Pyralidae. родов Galleria,. Asopia или JgZo&w, содержит субтилизин, полисахариды тина хитозана, аминокислоты и яропиленгликоль, проявляет кератол птичек кое действие, активность 46,5 - 51,0 ЕД/мл, Процедура получения данного энтомологического комплекса заключается в выращивании насекомых из отряда Lepidoptera, семейства Pyralidae, родов Galleria, Asopia или на различных искусственных питательных средах, затем происходит сбор личинок последних возрастов, их промывание, обеззараживание УФ-лучами и их измельчение. Полученную биомассу лиофилизируют и экстрагируют бидисгиллированной водой в течение 2-8 часов, затем экстракт отделяют декантацией, концентрируют, добавляют яропиленгликоль и выпаривают воду; Активный комплекс применяют для изготовления лекарственных средств с кератолнтическим действием в виде мази и геля и косметических средств с кератолнтическим действием в виде крема, тоника, очищающего лосьона и отшелушивающего геля. [4] .

Недостатком этого способа является применение очень сложных питательных сред, состоящих из более чем 30 компонентов. Например, для роста насекомых рода Galleria среда содержит экстракт желтой кукурузы, экстракт красной кукурузы, глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, казеин, ретиол, ацетат токоферола, витамин С, рибофлавин, пантотенат кальция, тиамин, пиридоксин, биотин, ниацин, пинобанксин, пиноцембрин, глицерин, NaNOy, КН2РО , NaCI, СаСЬ, MgSOrTHjO, 2JJSO *7H2O, MnSO^SHjO, CUSC SHSO, ЕеСЬЛбНгО, ЭДТА, желтый воск, очищенная вода. Также биомассу личинок собирают сразу после линьки, период, когда количество ферментов с кератолнтическим действием уменьшается в результате их использования в процессе удаления старого внешнего скелета.

Наиболее близким решением задачи данного изобретения является способ получения биомассы личинок Galleria melloaella с высокой биологической активностью, один из вариантов которого заключается в получении энтомологической биомассы с высокой керато литической активностью. Методика заключается в выращивании личинок Galleria теИопеИа при температуре 27°С и влажности 75% в течение 19 дней с пересевом личинок не менее 2-х раз на свежую питательную среду, состоящую из пшеничной муки; кукурузной муки, отрубей пшеничных, экстракт дрожжей, сухого молока, меда, глицерина, порошока воска, пинобанксина, ниноцембрйна, воды очищенной. [5].

Недостатком данной методики является то, что используются личинки 6-го личиночного возраста, который является предпоследним в нормальном жизненном цикле насекомого, масса личинок ниже максимально возможной и, следовательно, керато литическая активность также ниже максимально возможного уровеня. Задача, которую решает настоящее изобретение, заключается в разработке методики получения энтомологического комплекса из личинок Galleria mellonella, обеспечивающего получение большего количества биомассы с более высокой кератолитической активности за счет использования личинок VII возраста, выращенных в специальные условия, способствующих, накоплению биомассы и повышению ее биологической активиостию

Сущность изобретения состоит в том, что предлагается способ получения активного энтомологического комплекса с высокой кератолитической активностью, заключающийся в выращивании насекомых до достижения 7-го - личиночного возраста (21-23 сутки после вылупления), на питательной среде 1 из ближайшего раствора [5 {; перенос их на другую питательную среду - питательную среду 2, отличающуюся от первой большим количеством, порошка воска и меньшим количеством пчелиного меда, а также наличием стимулятора синтеза белка - ацетата цинка, с последующим состав (на кг среды):

Мука пшеничная 185 - 200

Мука кукурузная 180 — 190

Пшеничные отруби 110 - 130

Дрожевой экстрат 15 - 20

Сухое молоко 120 - 140

Пчелиный мед 40-50

Глицерин 80 - 90

Восковой порошок 65-85

Пинобанксин 0,02 - 0,03

Пииоцембрин 0,02 - 0,03

Цинка ацетат дигидрат (ZnCCHjCO ^HjO) 0,01-0,02

Вода о чищенная до 1000г их выращивание в течение 180 часов, после чего личинок собирают, замораживают при -18°С; промывают и измельчают при температуре 20°С - получая таким оразом активный комплекс Кератолиз Плюс, лиофилизируют; повторно измельчают при крайне низкой температуре (- 55°С); гомогенизируют, уиаковают и хранят в морозильной камере (-18°С).

Кератолитическую активность энтомологического комплекса с кератолитической активностью определяли при помощи спектрофотометрического теста с использованием кератин азура [6], который проводят следующим образом: 5 мг порошка кератин азура суспендируют в 1 мл трис-буфера - 50 мМ НС! (pH 8,0). Реакционная смесь содержит 1 мл кератин-азуровой взвеси и 1 мг комплекса с кератолитической активностью. Реакции проводят при 50°С на водяной бане при постоянном перемешивании 200 об/мин в течение 30 мин. После инкубации реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,4 М трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием при 3000 g в течение 20 мин. Поглощение супернатанта измеряют при 595 нм. Таким же образом готовят контрольб при этом заменяют комплекс с кератолитической активностью кератиназой. Кератолитическая активность, выраженная в единицах активности на мг вещества (Ед/мг), показывает количество фермента, которое вызывает увеличение поглощения на 0,01 между образцом и контролем при 595 нм в заданных условиях.

Полученные результаты представлены в таблице 1

Данные таблицы I доказывают, что применение предлагаемого способа обеспечивает увеличение количества полученной биомассы на удиннцу использованого корма на 23,7% по сравнению с прототипом. Также повышается кератолитаческая активность активного комплекса на 69, 1%.

Технический результат изобретения по сравнению с ближайшим решением заключается в том, что процесс получения активного комплекса, обладающего кератолитической активностью, предусматривает использование двух питательных сред для выращивания личинок. - одной до достижения 7-го личиночного возраста, и другой в течение 180 часов Для личинок 7-го возраста до начала их окукливания. Использование личинок 7-го возраста обеспечивает более высокую биомассу личинок, а среда с низким содержанием меда и высоким содержанием воска, а также с содержанием ацетата цинка стимулирует элиминацию протеаз с кератолитической активностью.

Активный комплекс с кератолитическим действием, полученный по этому способу, может быть использован в качестве активного вещества в косметических и армацевтических продуктах .

Для приготовления косметических средств активный комплекс будет использоваться в количестве 0,3-2, 0%, предпочтительно 1 ,0-1 ,5% от общей массы композиции.

Также косметические композиции будут включать растворители, предпочтительно очищенную воду, которая в зависимости от выбранной физической формы может варьировать от 3% до 87% от массы композиции; или альтернативно - глицерин, бензиловый спирт и д.

Кроме того, косметические продукты (в виде лосьона, крема, геля или сыворотки) будут включать один или несколько эмульгаторов, таких как органические спирты с цепью из 14-22 атомов углерода (спирты С14-22), алкилгликозиды С 14-20, алкйлсульфат, алкилфосфаты, ацил изотионат, цетиловый спирт, стеариновый спирт, глицерилстеарат и т. д, вещества с такими свойствами или комбинации этих веществ. Масса компонентов с эмульгирующими свойствами будет составлять от Г% до 12% от обшей массы композиции.

В качестве стабилизаторов эмульсии косметические продукты будут содержать органические спирты С 14-22, сложные эфиры глицерина, такие как стеарат глицерина; синтетические полимеры или другие компоненты со свойствами стабилизатора эмульсии, в том числе в различных сочетаниях.

Косметические композиции будут содержать обязательно смягчающие вещества, такие как: один или несколько жиров или масел, гидрогенизированных или негидрогенизироваяных, их сложные эфиры или различные комбинации смягчающих веществ, допустимые для данного вида продукции. Содержание этого вида компонентов в рецептурах будет составлять от 0,5 до 10% от обшей массы композиции.

Косметические формулы также будут содержать увлажнители, способные удерживать воду в тканях кожи. В качестве таких .веществ могут быть использованы мочевина, пироглутаминовая кислота, аминокислоты или другие вещества с гигроскопическими свойствами, принятые для такого вида продукции, а также комбинации этих веществ. Количество веществ с гигроскопическими свойствами в рецептурах продуктов будет составлять от 0,1% до 10,0% от массы композиции.

Косметические продукты будут содержать консерванты, такие как феноксиэтанол, ЭДТА, жирные кислоты, конъюгированные с ЭДТА, изотиоазолин, парабены, такие как метилпарабен и пропилпарабен, пропйленгликбль, сорбаты, производные мочевины, такие как диазолидинилмочевина или имидазолидинилмочевина и другие вещества с консервантами . принятых для таких продуктов или их комбинаций. Количество консервантов в составе продуктов составит 0,3% - 2,0% от массы конечной композиции.

Косметические продукты также будут включать хелатирующие агенты, такие как производные ЭДТА или их комбинации. Количество этих компонентов в косметических продуктах будет составлять 0,01% - 0,2% от массы конечной композиции.

Косметические средства также будут включать в себя буферные соединения, обеспечивающие поддержание необходимого уровня pH. В качестве таких веществ могут быть использованы адипиновая кислота, глицин, лимонная кислота, гидроксид кальция, триэтаноламин или другие вещества с аналогичными свойствами, принятые для таких продуктов и их комбинации.

Косметические продукты также будут содержать антиоксидантные вещества, такие как аскорбиновая кислота, токоферол, растительные экстракты, такие как экстракт семян моринги, винограда или любые другие вещества с такими свойствами или их комбинации.

Также все косметические средства на основе активного энтомологического комплекса могут содержать отдушки, красители, факторы защиты от УФ-А и УФ-В- лучей, натуральные растительные экстракты или другое органическое сырье.

Таким образом, можно подобрать самые разнообразные формулы, которые обеспечат максимальную активность активного комплекса, не изменяя его кератолитического действия.

Косметические композиции могут также включать фармацевтические растительные экстракты; .Car a papaya, Ficus carted,: Ananas sp. _t Actmidia. deliciosa и т. д. или/'и другие вещества, такие как очищенные протеолитические ферменты с аналогичным и/или взаимодополняющим действием, которые не изменяют действие активных компонентов энтомологического комплекса.

Физическая форма косметического продукта не может быть ограничена только однородными смесями, а может быть представлена также разделенными фазами.

Фармацевтические препараты, содержащие энтомологический комплекс, могут выпускаться в виде мази, геля, сыворотки, спрея или других физических форм, принятых для фармацевтических продуктов данного типа. Фармацевтические композиции могут включать любые подходящие активные вещества и компоненты, приемлемые для таких составов.

Все фармацевтические продукты по этому патенту будут содержать энтомологический комплекс в количестве 1 ,0-4,0%, предпочтительно 1, 5-2,0% от общей массы композиции.

Фармацевтические композиции на основе активного комплекса энтомологического происхождения в цропиленглиКоле будут включать растворители (в случае данного патента предпочтительна очищенная вода, которая в зависимости от выбранной физической формы может варьироваться от 3% до 87% от массы препарата), композиции или альтернативно - глицерин, бензиловый спирт и т.д.).

Аналогичным образом, фармацевтические продукты (в форме спрея, мази, геля или сыворотки) будут включать один или несколько эмульгаторов, таких как органические спирты с цепью из 14-22 атомов углерода (спирты С14-22), алкилгликозиды С 14-20, алкил сульфат, алкилфосфаты, ацилизотионат, цетиловый спирт, стеариловый спирт, глицерилстеарат и др. вещества с подобными свойствами или комбинации этих веществ. Масса компонентов с эмульгирующими свойствами будет составлять от 1% до 12% от общей массы композиции.

Фармацевтические композиции обязательно содержат смягчающие вещества, такие как: один или несколько жиров или масел, гидрогенизированных или негидрогенизированиых, их сложные эфиры, парафины, вазелин или различные комбинации смягчающих средств, принятые для данного вида продукции. Содержание этого вида компонентов в фармацевтических рецептурах будет составлять от 0,5 до 10% от общей массы композиции.

Фармацевтические составы согласно этому патенту на изобретение будут также содержать увлажнители, способные удерживать воду в тканях кожи. В качестве таких веществ могут быть использованы глицерин, мочевина, пироглутаминовая кислота, аминокислоты или другие вещества с гигроскопическими свойствами, принятые для данного вида продукции, а также комбинации этих веществ. Количество веществ с гигроскопическими свойствами в рецептурах фармацевтических продуктов по этому патенту будет составлять от 0,1% до 10,0% от массы композиции.

Фармацевтические продукты будут содержать консерванты, такие как сорбаты, феноксиэтанол, ЭД 1А, жирные кислоты, конъюгированные с ЭДТА, изотиоазолин, парабены, такие как метияпарабев и пропилпарабен, пропилеигликоль, производные мочевины, такие как диазолидипилмочевяна или имидазояидинилмочевина и другие вещества с консервантами, принятых для таких продуктов или их комбинаций. Количество консервантов в составе фармацевтических продуктов по этому патенту будет составлять 0,3%~2,0% от массы конечной композиции.

Фармацевтические продукты также будут содержать антиоксидантные вещества, такие как бутилгидроксианизол, аскорбиновая кислота, токоферол, растительные экстракты, такие как экстракт семян моринги, винограда или любые другие вещества с аналогичными свойствами или их комбинации.

Таким образом, можно подобрать самые разнообразные рецепт -'ры, которые обеспечат максимальную активность энтомологического комплекса, не изменяя его кератол нти веского действия.

Фармацевтические композиции также могут включать фармацевтические экстракты растений: Calendula officinalis, Aloe vera, Salvia officinalis и т. Д- или/'и другие вещества: аллантоин, витамин Е, антибиотические вещества и т. д. обладающие взаимодополняющими терапевтическими действиями: противовоспалительным, заживляющим, антибиотическим.

Физическая форма фармацевтического продукта не может быть ограничена только гомогенными смесями, и может быть представлена также разделенными фазами.

Примеры реализации изобретения

Пример 1;

Получение энтомологического комплекса с кератолитичеекой активностью из лк чинок Galleria mellonella

Куколки Galleria mellonella вынимают из холодильника, где их выдерживают при температуре 3-5°С, и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. По истечении этого времени куколки пересаживают в контейнеры, накрытые перфорированными крышками, которые содержат небольшое количество питательной среды (1/10 объема контейнера) для дальнейшего развития куколок, перехода их в фазу имаго и откладывания яиц. В целях запуска вылупления личинок из яиц контейнеры выдерживают при температуре 27°С и относительной влажности 75% в темноте. Через 48 часов после помещения куколок в контейнеры появляются личинки первого возраста. Процесс контролируют до достижения 80% выхода, но не более 6 часов.

Питательная среда 1 , следующего состава, г/кг:

Пшеничная мука 185

Кукурузная мука 180 Пшеничные отруби 110

Дрожевой экстракт 15 Сухое молоко 120 Пчелиный мед 75

Глицерин, 80

Восковой порошок 40

Пинобанксин 0,02

Пиноцембрин 0,02

Очищенная вода остальное

Готовят новые контейнеры с питательной средой. Через 6 часов от начала вылупления личинки первого возраста извлекают с помощью пинцета из контейнеров, в которых они появились, и помещают в подготовленные контейнеры.

Рост личинок продолжается до получения личинок седьмого возраста, но не более 23 дней. Температуру в контейнерах поддерживают на уровне 27°С, а относительную влажность 75% в темных условиях. За это время проводят два-три пересева личинок в контейнеры со свежей питательной средой.

Личинок VII возраста пересаживают на питательйую среду 2 следующего состава, г/кг:

Пшеничная мука 185

Кукурузная мука 180

Пшеничные отруби 110

Дрожевой экстракт 15

Сухое молоко 120

Пчелиный мед 45

Глицерин!, 80

Восковой порошок 80

Пинобанксин 0,02

Пиноцембрин 0,02

Ацетат цинка дигидрат (ZnfCHjCO^a'SHiO) 0,015

Очищенная вода остальное

Через 180 часов после переноса, личинки собирают щипцами и переносят в специальные контейнеры для замораживания. Личинки замораживают при ~18°С. В замороженном виде сырье может храниться 24 месяца и использоваться в зависимости от необходимости.

Перед использованием личинки дважды промывают четырьмя объемами 0,9% физиологического раствора и еще два раза четырьмя объемами очищенной воды.

Далее биомассу подвергают измельчению в измельчителе ножами из нержавеющей стали, чтобы размер полученных частиц не превышал 2 мм. Полученный активный комплекс далее подвергают процессу лиофилизации.

Последний этап заключается в измельчении лиофилизированного активного комплекса в криогенной мельнице при экстремально низкой температуре, что обеспечивает получение дисперсных частиц размером до 200 мкм.

Активный комплекс, полученный описанным выше способом, герметично упаковывают в алюминиевые пакеты и хранят до использования (до 24 месяцев) в морозильной камере (t ~ -18±3 ^Q C). Кератолитическая активность энтомологического комплекса, полученного по данному примеру, составляет 6,48 ЕД/мг сухого вещества..

Пример 2

Рецепты изготовления фармацевтических препаратов на основе энтомологического комплекса с кератолитическим действием

* Фармацевтический продукт в виде косметического крема .на основе 'энтомологического комплекса с кератолитическим действием , содержащий :

1 . Энтомологический комплекс с кератолитическим действием 1,0%

2. Дистеарат пояигяицерил-3-метилглюкозы 5,0%.

3. Глицерин 3,0%

4. Изопропилпальмитат 2,0%

5. Масло виноградных косточек 3,0%

6. Кадриловые/каприновые триглицериды 1,0%

7. Butyrospermum Parkii 2,0%

8. Циклопентасилоксан 0,5%

9. Полисорбат 80 2,0%

10. Глицерил стеарат 2,5%

1 1. Глинин из соевого белка 1 ,0%

12. ДиазйЛидинилмочевина 0,6%

13. Метилпарабен 0,3%

14. Проиилпарабен 0,10%

15. Динатриевая соль ЭДТА 0,05%

16. Отдушка 0,20%

17. Вода до 100%

• Фармацевтический продукт в виде тонизирующего и очищающего лосьона на. основе энтомологического комплекса с кератолитическим действием, который содержит:

1 Энтомологический комплекс с кератолитическим действием 1,2%

2. Глицерин 5,0%

3. Пеятиленгликоль 3,0%

4. Д-пантеноя 0,5%

5. .Аллантоин 0,10%

6. Лаурат сульфат натрия 0,10%

7. Диазолидинилмочевина 0,40%

8. Метилпарабен 0,30%

9. Пропил парабен 0,10%

10. Вода до 100% • Фармацевтический продукт в виде отшел^чпивающего геля па основе активного комплекса энтомологического происхождения, который содержит:

1. Активный энтомологический комплекс 1,5%

2. Карбомер 0,8%

3. Триэтаноламин 0,8%

4. Гиалуронат натрия 0,2%

5. Бисаболол 0,1%

6. Диазолидинилмочевина 0,4%

7. Мстилпарабен 0,30%

8. Проийлиарабен 0,10%

9. Вода до 100%

• Фармацевтический продукт в виде мази на основе энтомологического комплекса с кератолитическим действием , Который он содержит:

1 . Энтомологический комплекс с кератолитическим действием 2,0%

2. Бутиягидроксианиэрл 0,1%

3. Спирт цетиловый 4,0%

4. Полисорбат 80 3,0%

5. Сорбат калия 0,50%

6. пиперин 4,0%

7. Парафин жидкий 3 ,0%

8. Белый вазелин 3,0%

9. Очищенная вода до 100%

• Лекарственный препарат в форме геля на основе энтомологического комплекса с кератолитическим действием, содержащий:

1. Энтомологический комплекс с кератолитическим действием 2,0%

2. Карбоной 940 2,0%

3. Глицерин 6,0%

4. Раствор гидроксида натрия 15% 1,0%

5. Пропил енгликоль 6,0%

6. метил-п-гидроксибензоат 0, 10%

7. Пропил п-гидроксибензоат 0,20%

8. Очищенная вода до 100%

Библиография:

1. Marian A.. Barna M.V. Procedeu de fabrivare a rezorcinei. Brevet de invenjie RO

117694 Bl. BOPl nr.6, 2002 .

2. Kusmirek K. Skincare composition comprising a trienzyme activity. UK Patent GB 2440117 В , Ciuhrii M. Preparat biologic pentru lizarea alunijelor, nevilor, polipilor, keloizilor, earcinoamelor §1 a altor farmapuni cutanate, procedeu de oblinere utilizare a acestuia.Brevet de inventie, RO 1 19113 Bl . BOPI nr.4, 2004 . Ciuhrii V. Complex de origine entomologies In propilenglicol cu actiune cheratoiitica, procedeu de oblinere a acestuia, produse farmaceutice §i cosmetics pe baza lui (variants). Brevet de invenpe MD 4198, BOPI nr. 2/2013 , Ciuhrii C. Procedeu de obfinere a biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate biologies inalta. Brevet de inventie MD 4646, BOPI, nr.9/2019 . Cai, C., Chen, J,, Qi, J., Yin, Y,, Zheng, X, Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain. Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 2008, 9(9), 713-720.