On connaît déjà de nombreux procédés de production d'éthanol par voie fermentaire à partir de substrats sucriers.

Le principe général de ces procédés consiste à diviser en deux parties le substrat sucrier. On dilue la première partie par un diluant pour obtenir le « moût faible » et on la met en contact dans un préfermenteur avec une levure du genre Saccharomyces pour obtenir une suspension de levures.

La proportion de diluant, qui est généralement de l'eau et/ou de la vinasse, est telle que le degré alcoolique de la suspension de levures soit inférieur à 6 % en volume, en sorte qu'une concentration trop élevée en alcool n'empche pas les levures de se développer.

La deuxième partie du substrat sucrier est également diluée avec un diluant qui est généralement de l'eau et/ou de la vinasse mais la dilution est plus faible que pour la première partie de façon à obtenir une concentration en sucres plus élevée : c'est le « moût fort ».

On met ensuite cette suspension de levures en contact avec le moût fort dans un fermenteur pendant une durée suffisante pour obtenir un vin ayant une teneur en ethanol supérieure à un seuil donné.

Deux types d'unités peuvent tre distinguées selon que la biomasse est recyclée ou non.

Fermentation sans recyclage de levures : De la biomasse est générée en permanence dans un préfermenteur aéré appelé cuve-mère. Par un temps de séjour suffisant pour que les levures se développent mais pas trop long, par exemple d'environ 5 à 6 heures, ou par dilution, par exemple, avec de l'eau et/ou des vinasses, le moût levure titre environ 4 à 6 % en volume d'alcool. II est utilisé comme levain et est injecté en pied de cuve pour la fermentation proprement dite. Cet apport représente environ 30 à 50 % du volume total de la cuve. Le volume restant est alors progressivement rempli par un moût fort. La teneur finale en alcool atteint 8 à 12% en volume (fonction de la teneur en sucres dans le jus de diffusion) en 20 à 30 h.

La productivité en ethanol d'un tel procédé est relativement faible. Elle peut tre améliorée en recyclant la biomasse.

Fermentation avec recyclage de levures : Dans le cas du recyclage de la biomasse, la levure est concentrée sous forme de crèmes de levures en fin de fermentation. Elle est réutilisée, après un lavage, nécessaire pour diluer les non-sucres, un traitement à I'acide destiné à réduire les risques d'infections bactériennes, et une rapide régénération des levures en cuve-mère aérée.

Les deux techniques évoquées ci-dessus sont applicables à une fermentation discontinue (Batch) comme à une fermentation en continu (multiétagée).

Dans I'article de Delia-Dupuy ML et at « Contamination par les levures Brettanomyces dans les fermentations alcooliques » M. A. N.

MICROBIOLOGIE ALIMENTS NUTRITION., vol. 13,1995, pages 349 à 359 XP002119778 Le PLESSIS-ROBINSON., FR ISSN : 0759-0644, on rappelle que la flore indigène demeure une source fréquente d'accidents de fermentation dans la fermentation alcoolique et que les contaminants les plus fréquents dans la fermentation des jus de betterave sont les levures du genre Brettanomyces. On étudie trois mécanismes susceptibles d'expliquer le déplacement de population des levures pour en exclure deux et retenir que le role de I'acide acétique ne suffit pas à expliquer l'inhibition observée sur

Saccharomyces. On propose les règles suivantes pour éviter la contamination : -contrôler les opérations d'aération accompagnant la propagation en cuve-mère, -suivre attentivement la qualité de la biomasse au cours des recyclages, car ces derniers pourraient permettre aux levures Brettanomyces de « dépasser » leur phase de latence.

Ces règles se sont avérées inefficaces pour lutter contre l'apparition de contaminations levuriennes dans de nombreuses unités françaises de production d'éthanol à partir de substrats sucriers y compris à partir de jus de diffusion. Ces accidents de fermentation, de plus en plus fréquents, n'ont montré aucune corrélation entre les procédés de production, les substrats utilisés et l'apparition du contaminant. Si les conditions de production et la nature du moût varient énormément, on constate une certaine « permanence » du contaminant. II s'agit dans tous les cas du genre Dekkera ou de la levure Brettanomyces, forme imparfaite du genre précédemment cité.

Dans tous les cas, I'accident nécessite un arrt total de I'atelier de fermentation, suivi d'un redémarrage complet après désinfection totale de I'atelier.

L'invention pallie ces inconvénients en évitant t'arrt de I'atelier et par la mme une baisse de la productivité de l'installation de fermentation.

Elle permet de conduire une fermentation en continu tout en s'affranchissant des contaminations levuriennes.

L'invention a pour objet un procédé de production d'éthanol, qui consiste à mettre en contact avec une levure du genre Saccharomyces dans un préfermenteur du jus de diffusion de sucrerie soit pendant une durée suffisamment faible, notamment pendant 5 à 6 heures (fonction de la concentration en sucres dans le jus de diffusion), soit par dilution, par exemple, avec de l'eau et/ou des vinasses pour obtenir une suspension de levures d'un degré alcoolique inférieur à 6% en volume, puis à mettre la suspension de levures en contact avec du jus de diffusion de sucrerie pendant une durée suffisante pour obtenir un vin ayant une teneur en sucres inférieure à 3g/l, de préférence inférieure à 2 g/I et mieux inférieure à 1g/I avec un degré alcoolique du vin de 8 à12% en volume (fonction de la teneur en sucres dans le jus de diffusion) et à distiller le vin pour obtenir de t'éthanot, le procédé

étant caractérisé en ce qu'il consiste à enlever sensiblement toutes les levures présentes dans le préfermenteur et à les y remplacer par des levures fraîches à des intervalles de temps tels que la concentration en micro- organismes, autres que la levure du genre Saccharomyces, dans le préfermenteur reste inférieure à un seuil donné pendant l'intervalle suivant le remplacement des levures.

On a en effet constaté, d'une manière inattendue, que les ralentissements, notamment en installation de fermentation continue, étaient dus au fait qu'en relativement peu de temps la levure du genre Saccharomyces subit une dégénérescence, une mutation et/ou une contamination par un autre micro-organisme, notamment par une levure du genre Brettanomyces bien moins active. En remplaçant toutes les levures par des levures fraîches du genre Saccharomyces avant que ne se produise ce phénomène, et notamment de préférence avant qu'il n'y ait 107 cellules par millilitre, et mieux 106 cellules par millilitre, d'un microorganisme autre que la levure du genre Saccharomyces dans le préfermenteur, on maintient ainsi l'activité des levures de fermentation tout en s'affranchissant du risque de contamination levurienne. La fraîcheur de la suspension de levures joue un rôle primordial sur l'absence d'infection par des levures du genre Brettanomyces. L'apport de levures fraîches aux levures déjà contaminées ne permet pas d'éviter la contamination levurienne. Pour maintenir de manière continue l'absence des levures du genre Brettanomyces, il faut éliminer pratiquement toutes les levures anciennes avant d'introduire les nouvelles levures.

Le procédé suivant l'invention se distingue d'une technique sans préfermenteur, décrite par exemple au US-A 4 419 448, dans laquelle on vidange et nettoie les fermenteurs lorsque le milieu fermentaire est si contaminé que la centrifugation ( « Yeast separator ») n'est pas suffisamment efficace pour séparer les levures des bactéries de sorte qu'une grande quantité de microorganismes est recyclée dans le 1er fermenteur en mme temps que les levures. C'est pourquoi les levures ne sont plus recyclées mais envoyées en totalité à un sécheur et remplacer par des levures fraîches dans la cuve A. L'apport des levures n'est pas un moyen préventif mis en oeuvre systématiquement, mais une conséquence de l'infection des fermenteurs.

Le brevet américain propose un dispositif permettant de réduire les impacts sur l'allure de l'unité d'un traitement curatif (la vidange et le nettoyage des fermenteurs) qui nécessite un renouvellement des levures ; alors que l'invention propose une solution préventive basée sur un remplacement systématique des levures qui évite la vidange des fermenteurs (il n'y a d'ailleurs pas de fermenteur auxiliaire suivant l'invention).

Le procédé suivant l'invention se distingue aussi du procédé décrit au CH 554 414 permettant de combattre la mousse provoquée par un fort dégagement de CO2 induit par une forte activité fermentaire liée à une forte concentration en levures dans un moût de brasserie. Ce brevet antérieur porte sur le dégazage obtenu par une extraction continue de moût en fermentation, une séparation de la phase liquide (moût) et des levures, une maturation (c'est-à-dire en fait un dégazage naturel) du moût et un recyclage des levures. Mais comme la récupération des levures n'est que partielle puisqu'une partie de celle-ci reste dans le moût, on maintient la concentration initiale en levures dans le fermenteur par un apport de levures fraîches. La levure séparée est retournée au fermenteur ce qui est contraire à la présente invention. L'apport de levures fraîches ne constitue pas un procédé permettant de pallier une infection, ni mme d'améliorer la fermentation, mais un moyen de compenser la perte de levures liée au procédé de dégazage (dont le finalité est de réduire la formation de mousse. Ce brevet suisse décrit d'ailleurs un procédé de fermentation de bière complètement différent du point de vue de la température et des temps de fermentation d'un procédé de production d'éthanol. Dans la bière, la fermentation a lieu à une température basse de 6 à 8°C avec des temps de fermentation de 10 à 12 jours ou à une température de 10 à 20° C pendant 3 à 5 jours.

Suivant la présente invention, on peut détecter la présence de Brettanomyces dans le préfermenteur en prélevant un échantillon de la suspension de levures et en l'examinant au microscope. Alors que les Saccharomyces, et notamment Saccharomyces cerevisiae, ont une forme ovoïde, les Brettanomyces ont une forme allongée. On peut également savoir par l'expérience le délai à respecter pour l'ajout des levures fraiches et remplacer systématiquement les anciennes levures par des levures du genre Saccharomyces à un intervalle de temps inférieur à 4 jours.

De préférence, on apporte des levures fraîches au préfermenteur en une quantité telle que l'on obtient dans le préfermenteur une concentration au moins égale à 106 cellules par millilitre environ et de préférence 107 cellules par millilitre. On permet ainsi d'éviter toute contamination levurienne en maintenant la concentration de la population souhaitée de levures du genre Saccharomyces.

De préférence, le procédé consiste à engager de 25 à 50% du poids de jus de diffusion dans le préfermenteur pour obtenir la suspension de levures et à mettre le reste du jus de diffusion en contact avec la suspension de levures.

Préfermentation : La préfermentation ou propagation des levures (ex : Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe...) peut tre avantageusement réalisée pour obtenir une concentration au moins égale à 107 cellules par millilitre dans 4 préfermenteurs (volume des préfermenteurs : 45m3 chacun) fonctionnant en parallèle.

Le jus de diffusion ou jus de betteraves provient du résultat de l'étape de diffusion en sucrerie qui consiste à mettre en contact les cossettes (betteraves coupées en fines lamelles) avec de l'eau à une température de 65 -80°C afin de récupérer le sucre présent dans les cossettes par phénomène d'osmose. La durée de préfermentation est calculée en divisant le volume de remplissage de moûts dans les préfermenteurs par le débit d'alimentation de ces préfermenteurs en jus de diffusion (cette durée est naturellement fonction de la teneur en sucres dans le jus de diffusion, elle est généralement de 5 à 6h).

Le jus ainsi obtenu, généralement appelé jus de diffusion, a la composition suivante en volume : Teneur en matières sèches : 13 à 22% Saccharose 12 à 20% Eau : 78 à 87 % Non-sucre 2 à 4% Matières minorâtes :-Na + 80 à 120 mg/I -K + 120 à 1500 mg/I -Ca++ 30 à 70 mglf -Mg++ 100 à 150 mg/I

-Mn++ 10 à 30 mg/l Le jus de diffusion est distribué dans les 4 préfermenteurs et sert de substrat de croissance aux micro-organismes.

La température dans les préfermenteurs est rigoureusement contrôlée et régulée par un système de plaques de refroidissement dans lequel circule un liquide de refroidissement à l'intérieur ou à l'extérieur des cuves de préfermentation.

Toute multiplication de micro-organismes entraîne une élévation de température. Toute variation de température peut devenir inhibitrice pour la propagation des levures.

La température dans les préfermenteurs est maintenue entre 30 et 35°C.

Afin de favoriser le développement des levures, le milieu nutritif nécessaire à la multiplication de ces micro-organismes comprend : -des sucres fermentescibles -de I'azote apporté sous formes diverses telles que l'urée, I'ammoniac, les sels d'ammonium -du phosphore apporté sous formes diverses telles que l'acide phosphorique, les phosphates -du soufre apporté sous formes diverses telles que I'acide sulfurique, les sulfates -de l'oxygène -des minéraux essentiels si une carence quelconque est détectée.

Ces éléments nutritifs préviennent tout ralentissement de la propagation des levures.

Ces éléments nutritifs et l'oxygène sous forme d'air comprimé (ou d'eau oxygénée) sont régulièrement fournis afin de favoriser le développement des levures et non la fermentation alcoolique.

A titre d'exemple : -Le débit d'air dans chaque préfermenteur est d'environ 30 Nm3/h.

-5 kg de sulfate d'ammonium ayant une teneur en azote minimale de 21 % et en eau de 0,2 % maximum (HOLVOET Chimie Chaussée de Leuze 144, Leuzesesteenweg Belgique ; INTERFERT, 28, rue d'Armenonville, 92200 Neuilly sur Seine...) et 5 kg de phosphate diammonique d'une pureté de 95 % minimum et ayant une pureté en P205 comprise entre 52 et 55 % (RHODIA Chimie, 299, rue du Président Pompidou, BP 202, 59561 La Madeleine Cedex ; PRAYON France, 80-82, rue de Paris, 93804 Epinay sur Seine Cedex) sont versés toutes les heures dans chaque préfermenteur sous forme d'une solution aqueuse.

Afin d'éviter tout risque d'infection par des micro-organismes étrangers, I'installation industrielle se trouvant en plein air ; les préfermenteurs sont nettoyés et désinfectés à tour de rôle par nettoyage à l'eau filtrée de rivière puis injection de vapeur durant une durée prédéterminée de 10 minutes minimum.

Cela permet par ailleurs d'éviter les infections par des levures dites"sauvages"et la dégénérescence progressive de la souche levurienne prédominante.

Une identification de ces micro-organismes contaminants détectés sur le site a été réalisée : il s'agit de Brettanomyces bruxellensis.

Cette levure contaminante a une forme allongée caractéristique très différente de la morphologie de la Saccharomyces cerevisiae utilisée.

Des observations microscopiques quotidiennes (microscope universel à lumière transmise de marque ZEISS à grossissement X 400) des moûts levures ont été mises en place sur le site de fabrication et permettent de détecter instantanément I'apparition de ces levures sauvages de type Brettanomyces.

Des comptages et reconnaissances morphologiques sur boîtes de Petri viennent confirmer à posteriori les observations microscopiques.

Le milieu utilisé pour le comptage sur boîtes de Petri dénommé milieu de MALT WICKERHAM est composé, pour 2 litres de préparation, de : -extrait de malt 3 g (référence Laboratoire Merck 105391) -peptone 5 g (référence Laboratoire Merck 7212) -extrait de levure 3 g (référence Laboratoire Merck 103753) -glucose 10 g

-gélose nutritive 10 g (référence Laboratoire Merck 1614) L'échantillon du moût levure est dilué au dixième successivement dans du sérum physiologique (solution de NaCI à 9 pour mille) jusqu'à obtenir les dilutions suivantes : 10-5 ; 10-6 ; 10-'. 1 ml de ces dilutions est ensemencé en profondeur selon les techniques classiques de microbiologie avec le milieu de MALT WICKERHAM.

L'espacement de la fréquence de rajout de la souche souhaitée pour le processus fermentaire a pour conséquence une contamination prioritaire par l'organisme microbien indésirable entraînant une augmentation du temps de fermentation ainsi qu'une diminution de la productivité alcoolique.

Un retard dans la fréquence impérative de rajout de la souche souhaitée et de remplacement des levures anciennes entraîne par ailleurs la nécessité d'accélérer les adjonctions de levures afin d'éradiquer la persistance de la contamination.

Procédé de remplacement des levures anciennes par des nouvelles levures Lors de la propagation de levures fraîches, par exemple un préfermenteur est choisi pour la réalisation de cette opération, les actions à mener sont les suivantes : Le préfermenteur étant vidangé, le laver à l'eau puis le nettoyer à la vapeur (Par exemple : Pression = 3 bars absolus, température = 130°C) selon une durée prédéterminée de 10 minutes minimum.

On peut également réaliser ce nettoyage avec de l'eau formolée (formol 30,5% : CALDIC France B. P. 722 51056 REIMS) ou tout désinfectant classique tels que : Les familles des composés halogènes : chlore ou iode et leurs dérivés Les agents d'oxydation (peroxyde d'hydrogène, permanganate de potassium) Les composés aminés (Bactanios 95 employé en solution de 0,2 à 0,5 %, Anios Pavé du Moulin 59260 Lilies Hellemmes).

Les acides et alcalis forts (L'acide sulfurique concentré à 96% employé à une dilution de 5 à 10%, Tessenderlo Chemie rue du Trône 130 B Bruxelles), (La lessive de soude concentrée à 30,5 %, employée à chaud à une dilution de 1 à 2 %, CLEMENT RPC Ets LOMME Rue Pelouze, BP 117 59461 LOMME Cedex) (Agrobac employé à des dilutions de 2 à 7,5 % :

MINOT APURA 88 rue de Marquillies 59044 Liftes Cedex), (Agromousse employé à des dilutions de 5 à 7%, MINOT APURA 88 rue de Marquillies 59044 Li ! tes Cedex). (L'Aniosteril acide désinfectant employé à des doses de 1 à 1,5% Anios Pavé du Moulin 59260 Lilles Hellemmes), (GALOR C7 employé à des doses de 1 à 5%, Anios Pavé du Moulin 59260 Lilles Hellemmes).

Les aldéhydes et tensioactifs (Anios W4 employé à 0,5 % en pufvérisation temps de contact 5 à 10 minutes ou en circulation à 0, 4 % temps de contact 20 à 30 minutes, Anios Pavé du Moulin 59260 Lilles Hellemmes).

Les pourcentages indiqués ci-dessus sont exprimés en poids.

La procédure de nettoyage-désinfection peut comporter 5 phases : -prélavage ou pré-nettoyage : élimination mécanique des souillures grossières par jet d'eau, -nettoyage : élimination du reste des souillures à I'aide d'une solution de nettoyage, -rinçage : élimination de la solution de nettoyage dans laquelle les souillures ont été dispersées, -désinfection : destruction chimique de la biocontamination de surface à I'aide d'une solution désinfectante, -rinçage final : élimination de la solution désinfectante résiduelle.

Une combinaison des opérations citées ci-dessus permet dans tous les cas d'aboutir à une désinfection suffisante du préfermenteur destiné à recevoir les levures fraîches sans contamination avec les anciennes levures.

Le préfermenteur est rempli à un tiers environ de sa capacité avec du jus de diffusion.

On régule rigoureusement la température dans le préfermenteur (inférieure à 34°C).

Les 300 kg de levures fraîches à environ 32% en poids de matières sèches sont ajoutées dans le préfermenteur.

Un apport en sels nutritifs et en air est réalisé et régulé.

L'alimentation en jus de diffusion est poursuivie tout en contrôlant la densité et la température dans le préfermenteur.

Ce dernier, une fois rempli, est mis en communication successivement avec les autres préfermenteurs préalablement vidés, nettoyés et stérilisés à la vapeur ou chimiquement de façon à ne pas contaminer les nouvelles levures par les anciennes.

On alimente ainsi progressivement les 4 préfermenteurs avec les nouvelles levures.

Fermentation L'objet de la présente invention est principalement applicable en fermentation dite continue, procédé par lequel les fermenteurs travaillent en cascade, c'est-à-dire que la fermentation n'est que partielle dans chaque fermenteur jusqu'au dernier où la fermentation est achevée.

L'alimentation des fermenteurs en moût levure et jus de diffusion est réalisée en continu sur le ou les deux ou les trois premiers fermenteurs, appelés fermenteurs de tte, les fermenteurs suivants étant nommés fermenteurs de chute. Le nombre de fermenteurs de tte et la répartition des alimentations en moûts dépendent des volumes des fermenteurs.

La température dans les fermenteurs est maintenue entre 30 et 35°C.

La fermentation se poursuit ensuite en cascade dans chaque fermenteur jusqu'à ce que la teneur en sucre du vin obtenu soit inférieure à 3 gui et, de préférence à 2 gll et mieux à 1 g/l, pour un degré alcoolique du vin de 8 à 12% en volume (fonction de la teneur en sucres dans le jus de diffusion), le moût fermenté du dernier fermenteur est alors envoyé, toujours en continu, dans les bacs à vin, avant d'alimenter I'atelier de distillerie.

On détermine le degré alcoolique des vins par voie enzymatique à I'aide de l'analyseur biochimique YSI 2700 SELECT (ROUCAIRE, 2 av. du Pacifique BP 78 Les Ulis 91493 Courtaboeuf cedex). On effectue une dilution au 506m'avec de l'eau déminéralisée de l'échantillon de vin. Cet échantillon dilué et filtré est ensuite passé dans l'analyseur biochimique YSI 2700 SELECT qui donne automatiquement la teneur en ethanol en g/l. Pour obtenir le résultat en degré alcoolique (% volume par volume), il suffit de diviser cette valeur par 7.88 après avoir pris en compte le facteur de dilution.

On détermine la teneur en glucose restant par voie enzymatique à I'aide de I'analyseur biochimique YSI 2300 STAT PLUS (ROUCAIRE, 2 av. du Pacifique BP 78 Les Ulis 91493 Courtaboeuf cedex). On effectue les dilutions nécessaires des échantillons selon la teneur supposée en glucose restant. On filtre l'échantillon et on le passe ensuite dans I'analyseur biochimique YSI 2300 STAT PLUS qui donne une teneur en glucose restant exprimée en mg/dl. Pour l'obtenir en g/l, il suffit de multiplier le résultat par 100 après avoir pris en compte le facteur de dilution éventuel.

Production de flegmes (alcool brut) (La) ou les colonne (s) distillatrice (s) peuvent fonctionner en parallèle ou en série (double effet) sous vide ou sous pression, sont chauffées par de la vapeur soit en injection directe, soit par l'intermédiaire de bouilleurs, soit par thermocompression.

Cette vapeur peut également chauffer les colonnes de Lutter quand elles existent, les vinasses étant généralement recyclées dans 1'6tape de diffusion de la sucrerie.

Le moût fermenté ou « vin » provenant de la fermentation, après passage dans un échangeur thermique, alimente la ou les colonnes distillatrices. Les vapeurs d'alcools des colonnes sont condensées dans des échangeurs thermiques.

L'alcool ou flegme est concentré à 90-96 % volume (selon les contraintes d'investissement) dans la ou les colonnes distillatrices puis refroidi dans des échangeurs avant stockage. Une extraction des impuretés volatiles peut tre réalisée sur la ou les colonnes de distillation afin d'améliorer la qualité des flegmes. Ces mauvais goûts extraits et moins valorisables sont stockés dans une cuve différente.

Exemple illustrant la présente invention On remplace les levures anciennes à une fréquence inférieure à 4 jours par 300 kg de levures fraîches (ex : Saccharomyces cerevisiae) pressées à 32 % de matières sèches ; chaque gramme de produit contient environ 10 milliards de cellules vivantes, ceci pour un jus de diffusion de betteraves à une concentration en sucres égale à 16%. L'utilisation de levures lyophilisées ou de crème concentrée commerciale de levures

(Saccharomyces cerevisiae ou pombe) permet également d'aboutir au mme résultat.

Le remplacement régulier des anciennes levures a permis de s'affranchir totalement des contaminations par des organismes indésirables et d'éviter ainsi un arrt complet de l'installation, comme cela était le cas précédemment et comme cela arrive fréquemment sur d'autres unités de fabrication.