Verfahren zur Herstellung von Glyceriden von H yd roxycarbon säuren

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Ketokörper und des damit zusammenhängenden Stoffwechsels sowie die Therapie von damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure sowie die auf diese Weise erhältlichen bzw. hergestellten Reaktionsprodukte (d. h. Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure) und deren Verwendung, insbesondere in pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Arzneimitteln oder Medikamenten, oder in Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnissen, sowie deren weitere Anwendungen bzw. Verwendungen.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, insbesondere Arzneimittel oder Medikamente, welche die nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen bzw. hergestellten Reaktionsprodukte (d. h. Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure) umfassen, sowie deren Anwendungen bzw. Verwendungen.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnisse, insbesondere Nahrungsergänzungsmittel, funktionelle Lebensmittel ( Functional Food), Novel Food, Lebensmittelzusatzstoffe, Nahrungszusätze, diätetische Lebensmittel, Power-Snacks, Appetitzügler und Kraft- und/oder Ausdauersport-Supplements, welche die nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen bzw. hergestellten Reaktionsprodukte (d. h. Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure) umfassen, sowie deren Anwendungen bzw. Verwendungen.

Im menschlichen Energiestoffwechsel ist Glucose der kurzfristig zur Verfügung stehende Energieträger, welcher in den Mitochondrien unter Freisetzung von Wasser und Kohlendioxid zu Energie verstoffwechselt wird. Bereits durch die Schlafperiode während der Nacht sind aber die Glycogenspeicher der Leber geleert. Jedoch benötigen vor allem das menschliche zentrale Nervensystem (ZNS) und das Herz eine permanente Energieversorgung. Die physiologische Alternative zu Glucose, welche vor allem dem zentralen Nervensystem zur Verfügung steht, sind die sogenannten Ketokörper (synonym auch als Ketonkörper bezeichnet oder Englisch auch als "Keton Bodies" bezeichnet).

Der Begriff der Ketokörper ist insbesondere eine Sammelbezeichnung für drei Verbindungen, welche vor allem in katabolen Stoffwechsellagen (wie z. B. bei Hunger, Reduktionsdiät oder kohlenhydratarmer Ernährung) gebildet werden und unter Umständen zu einer Ketose führen. Unter den Begriff der Ketokörper fasst man insbesondere die drei Verbindungen Acetoacetat (synonym auch Acetacetat genannt) und Aceton sowie 3-Hydroxybuttersäure (nachfolgend synonym auch als beta-Hydroxybuttersäure oder BHB oder 3-BHB bezeichnet) bzw. deren Salz (d. h. 3-Hydroxybutyrat oder beta-Hydroxybutyrat) zusammen, wobei letztere Verbindung die bedeutendste der drei vorgenannten Verbindungen ist. 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salz kommt physiologisch als (R)-Enantiomer vor, d. h. als (R)-3-Hydroxybuttersäure (synonym auch (3R)-3-Hydroxybuttersäure genannt, um das Chiralitätszentrum in 3-Position hervorzuheben) bzw. deren Salz.

Diese Ketokörper werden auch in großer Zahl beim Fasten oder Hungern physiologisch aus im Körper eingelagerten Lipiden durch Lipolyse bereitgestellt und ersetzen den Energieträger Glucose fast vollständig.

Die Ketokörper werden in der Leber aus Acetyl-Coenzym A (= Acetyl-CoA) gebildet, welches aus der beta-Oxidation stammt; sie stellen eine transportable Form des Acetyl-Coenzyms A im menschliche Körper dar. Zur Verwertung der Ketokörper müssen sich Gehirn und Muskeln aber zunächst umstellen, indem sie Enzyme exprimieren, welche zur Rückwandlung von Ketokörpern in Acetyl- Coenzym A benötigt werden. Insbesondere in Hungerzeiten tragen die Ketokörper einen beträchtlichen Anteil zur Energiegewinnung bei. So ist es beispielsweise dem Gehirn nach einiger Zeit möglich, mit nur einem Drittel der Tagesmenge an Glucose auszukommen.

Physiologisch erfolgt die Synthese der Ketokörper aus zwei Molekülen aktivierter Essigsäure in Form von Acetyl-Coenzym A, dem normalen Zwischenprodukt des Fettsäureabbaus, wobei zunächst mit Hilfe der Acetyl-Coenzym A- Acetyltransferase das Acetoacetyl-Coenzym A gebildet wird, welches unter Verwendung einer weiteren Acetyl-Coenzym A-Einheit und des Enzyms HMG-CoA- Synthase zum Zwischenprodukt 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA (HMG-CoA) verlängert wird, wobei schließlich die HMG-CoA-Lyase das Acetoacetat abspaltet. Diese drei Schritte finden ausschließlich in den Mitochondrien der Leber statt (Lynenzyklus), wobei 3-Hydroxybutyrat schließlich im Zytosol durch die D-beta- Hydroxybutyrat-Dehydrogenase entsteht. HMG-CoA ist außerdem ein Endprodukt beim Abbau der Aminosäure Leucin, während Acetoacetat beim Abbau der Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin entsteht.

Durch spontane Decarboxylierung entsteht aus Acetoacetat Aceton; es ist gelegentlich im Atem von Diabetikern und Diäthaltenden wahrzunehmen. Es kann vom Körper nicht weiterverwendet werden. Der Anteil von Aceton an den Ketokörpern ist allerdings gering.

Acetoacetat wird also reduktiv in die physiologisch relevante Form der 3-Hydroxybuttersäure bzw. des 3-Hydroxybutyrats überführt, kann aber auch unter Kohlenstoffdioxidfreisetzung in das physiologisch unbrauchbare Aceton zerfallen, was bei einer schweren Ketose, einer Ketoazidose (z. B. bei Diabetes mellitus Typ 1 -Patienten ohne Insulinsubstitution), im Urin und in der Ausatemluft nachweisbar und olfaktorisch wahrnehmbar ist.

3-Hydroxybuttersäure wird derzeit im Bereich des Kraftsports als Natrium-, Magnesium- oder Calcium-Salz eingesetzt und in den Handel gebracht.

Jedoch ist 3-Hydroxybuttersäure für den Menschen evolutionär nicht oder in nur sehr geringer Menge bekannt, da Pflanzen keine 3-Hydroxybuttersäure produzieren und 3-Hydroxybuttersäure im tierischen Organismus nur bei toten ausgezehrten Tieren in der Ketose vorkommt, so dass 3-Hydroxybuttersäure bei peroraler Verabreichung Brechreiz auslöst. 3-Hydroxybuttersäure in Form der freien Säure sowie deren Salzen schmeckt zudem stark bitter und kann schweres Erbrechen und Übelkeit hervorrufen.

Zudem können Patienten, vor allem Neugeborene, aber auch Erwachsene größere Mengen an Salzen der 3-Hydroxybuttersäure nicht permanent verkraften, da diese Verbindungen nierenschädigend wirken können. Außerdem ist die Plasmahalbwertszeit von 3-Hydroxybuttersäure und deren Salzen derart gering, dass selbst bei Einnahme von mehreren Gramm die Ketose nur für ca. drei bis vier Stunden vorhält, d. h. Patienten können insbesondere während der Nacht daher nicht von einer Therapie mit 3-Hydroxybuttersäure oder deren Salzen kontinuierlich profitieren. Bei Stoffwechselerkrankungen kann dies zu lebensbedrohlichen Situationen führen.

Daher werden im Fall der Therapie derartiger Stoffwechselerkrankungen heute sogenannte mittelkettige Triglyceride, sogenannte MCTs, für die ketogene Therapie eingesetzt, d. h. es wird die metabolische Umwandlung von Capron-, Capryl- und Caprinsäure (d. h. von gesättigten linearen C ₆ -, C ₈ - und Ci ₀ -Fettsäuren) aus den korrespondierenden Triglyceriden beabsichtigt.

Grundsätzlich stellt aber aus pharmazeutischer und klinischer Hinsicht 3-Hydroxy- buttersäure demgegenüber ein wirksameres pharmazeutisch-pharmakologisches Zielmolekül, welches nach den Erkenntnissen des Standes der Technik prinzipiell für die Therapie einer Vielzahl von Erkrankungen zum Einsatz kommen könnte, aber aufgrund seiner mangelnden physiologischen Kompatibilität dort nicht zum Einsatz kommen kann (z. B. bei Erkrankungen im Zusammenhang mit einer Störung des Energiestoffwechsels, insbesondere Ketokörperstoffwechsels, oder neurodegenerativen Erkrankungen wie Demenz, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson etc., Fettstoffwechselerkrankungen usw.).

Die nachfolgende Tabelle veranschaulicht rein beispielhaft, aber keinesfalls beschränkend potentielle Therapiemöglichkeiten bzw. mögliche Indikationen für den Wirkstoff 3-Hydroxybuttersäure.

Daher ist es aus pharmazeutischer und klinischer Hinsicht wünschenswert, wirksame Präkursoren oder Metabolite auffinden zu können, welche physiologisch einen direkten oder indirekten Zugang zu 3-Hydroxybuttersäure oder deren Salzen ermöglichen, insbesondere im physiologischen Stoffwechsel des menschlichen oder tierischen Körpers.

Folglich hat es im Stand der Technik nicht an Versuchen gefehlt, physiologisch geeignete Präkursoren oder Metaboliten für 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salze aufzufinden. Bislang wurden im Stand der Technik jedoch keine effizienten diesbezüglichen Verbindungen aufgefunden. Auch ist ein diesbezüglicher Zugang zu solchen Verbindungen nach dem Stand der Technik bislang nicht bzw. nicht ohne Weiteres möglich. Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem liegt also in der Bereitstellung eines effizienten Herstellungsverfahrens von physiologisch geeigneten bzw. physiologisch kompatiblen Präkursoren und/oder Metaboliten von 3-Hydroxybuttersäure (d. h. beta-Hydroxybuttersäure bzw. BHB bzw. 3-BHB) oder deren Salzen.

Ein solches Verfahren soll insbesondere die betreffenden BHB-Präkursoren und/oder BHB-Metaboliten in effizienter Weise zugänglich machen, insbesondere auch in größeren Mengen und ohne nennenswerte Mengen an toxischen Nebenprodukten. In vollkommen überraschender Weise hat die Anmelderin nunmehr heraus gefunden, dass Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure (beta-Hydroxybuttersäure bzw. BHB bzw. 3-BHB) einen effizienten und physiologisch wirksamen bzw. physiologisch kompatiblen Präkursor und/oder Metaboliten für den Ketokörper 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salze darstellen und hat in diesem Zusammen hang ein effizientes Herstellungsverfahren für diese Verbindungen auffinden bzw. entwickeln können, welches einen direkten und wirksamen, insbesondere ökonomischen wie auch großtechnisch umsetzbaren Zugang zu diesen Verbindungen ermöglicht.

Zur Lösung des zuvor geschilderten Problems schlägt die vorliegende Erfindung daher - gemäß einem e r s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein Verfahren zur Herstellung von Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure (beta- Hydroxybuttersäure bzw. BHB bzw. 3-BHB) gemäß Anspruch 1 vor; weitere, insbesondere besondere und/oder vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der diesbezüglichen Verfahrensunteransprüche.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem z w e i t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Reaktionsprodukt gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 15) bzw. ein diesbezüglich erhältliches Gemisch von mindestens zwei Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure gemäß dem diesbezüglich unabhängigen Anspruch (Anspruch 17); weitere, insbesondere besondere und/oder vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Erfindungsaspekts sind Gegenstand der diesbezüglichen Unteransprüche.

Gleichermaßen betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem d r i t t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - eine pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere Arzneimittel oder Medikament, gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 22); weitere, insbesondere besondere und/oder vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Erfindungsaspekts sind Gegenstand des diesbezüglichen Unteranspruchs. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem v i e r t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein erfindungsgemäßes Reaktionsprodukt bzw. ein erfindungsgemäßes Gemisch zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 24).

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem f ü n f t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - die Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsprodukts bzw. eines erfindungsgemäßen Gemischs zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 25).

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem s e c h s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - die Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsprodukts bzw. eines erfindungsgemäßen Gemischs gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 26).

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem s i e b t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein Nahrungsmittel und/oder Lebensmittelerzeugnis gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 27); weitere, insbesondere besondere und/oder vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnisses sind Gegenstand des diesbezüglichen Unteranspruchs.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem a c h t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - die Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsprodukts bzw. eines erfindungsgemäßen Gemischs in einem Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnis gemäß dem diesbezüglichen unabhängigen Anspruch (Anspruch 29); weitere, insbesondere besondere und/oder vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verwendung sind Gegenstand des diesbezüglichen Verwendungsunteranspruchs. Es versteht sich bei den nachfolgenden Ausführungen von selbst, dass

Ausgestaltungen, Ausführungsformen, Vorteile und dergleichen, welche nachfolgend zu Zwecken der Vermeidung von Wiederholungen nur zu einem Erfindungsaspekt ausgeführt sind, selbstverständlich auch in Bezug auf die übrigen Erfindungsaspekte entsprechend gelten, ohne dass dies einer gesonderten

Erwähnung bedarf.

Des Weiteren versteht es sich von selbst, dass einzelne Aspekte und

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch in beliebiger Kombination mit anderen Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung als offenbart gelten und insbesondere auch eine beliebige Kombination von Merkmalen und Ausführungsformen, wie sie sich aus den Rückbezügen aller Patentansprüche ergibt, umfangreich als offenbart gilt, und zwar im Hinblick auf alle sich ergebenden Kombinationsmöglichkeiten.

Bei allen nachstehend genannten relativen bzw. prozentualen gewichtsbezogenen Angaben, insbesondere relativen Mengen- oder Gewichtsangaben, ist weiterhin zu beachten, dass diese im Rahmen der vorliegenden Erfindung vom Fachmann derart auszuwählen sind, dass sie sich in der Summe unter Einbeziehung aller Komponenten bzw. Inhaltsstoffe, insbesondere wie nachfolgend definiert, stets zu 100 % bzw. 100 Gew.-% ergänzen bzw. addieren; dies versteht sich aber für den Fachmann von selbst.

Im Übrigen gilt, dass der Fachmann - anwendungsbezogen oder aber einzelfall- bedingt - von den nachfolgend angeführten Bereichsangaben erforderlichenfalls abweichen kann, ohne dass er den Rahmen der vorliegenden Erfindung verlässt.

Zudem gilt, dass alle im Folgenden genannten Werte- bzw. Parameterangaben oder dergleichen grundsätzlich mit genormten bzw. standardisierten oder explizit angegebenen Bestimmungsverfahren oder andernfalls mit dem Fachmann auf diesem Gebiet an sich geläufigen Bestimmungs- bzw. Messmethoden ermittelt bzw. bestimmt werden können.

Dies vorausgeschickt, wird die vorliegende Erfindung nunmehr nachfolgend im Detail erläutert. Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem e r s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure (beta-Hydroxybuttersäure bzw. BHB bzw. 3-BHB), wobei mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)

CH ₃ - CH(0H) - CH ₂ - C(0)0R ¹ (I) wobei in der allgemeinen Formel (I) der Rest R ¹ Wasserstoff oder ein CrC ₄ -Alkyl, insbesondere ein CrC ₄ -Alkyl, bevorzugt Methyl oder Ethyl, besonders bevorzugt Ethyl, darstellt,

mit Glycerin (1 ,2,3-Propantriol) der Formel (II)

CH ₂ (OH) - CH(OH) - CH ₂ (OH) (II) umgesetzt wird,

so dass als Reaktionsprodukt ein oder mehrere Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III)

CH ₂ (OR ² ) - CH(OR ³ ) - CH ₂ (OR ⁴ ) (III) erhalten werden, wobei in der allgemeinen Formel (III) die Reste R ² , R ³ und R ⁴ , jeweils unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Rest der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(O) - darstellen, jedoch mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest R ² , R ³ und R ⁴ keinen Wasserstoff darstellt.

Wie zuvor ausgeführt, hat die Anmelderin nämlich vollkommen überraschend herausgefunden, dass die auf diese Weise hergestellten Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure (nachfolgend auch kurz nur als "BHB-Glyceride"/"3-BHB- Glyceride" oder "BHB-Ester"/"3-BHB-Ester" bezeichnet) effiziente, da physiologisch verträgliche Präkursoren und/oder Metabolite der 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salzen darstellen, welche pharmazeutisch bzw. klinisch auch in größeren Mengen zum Einsatz kommen können, da sie physiologisch kompatibel sind.

Die vorgenannten Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure, welche durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren erstmals in effizienter Weise zugänglich sind, stellen eine physiologisch und pharmakologisch relevante Alternative zu der freien 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salzen dar. Die Herstellung von Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure mittels herkömmlicher organischer Synthese ist komplex und aufwendig, da 3-Hydroxybuttersäure verstärkt zur Polymerisation und anderen unerwünschten Nebenreaktionen (z. B. Wasserabspaltung, Zersetzung etc.) neigt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte erstmals ein effizient arbeitendes Herstellungsverfahren bereitgestellt werden, mit welchem sich Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure ohne unerwünschte Nebenreaktionen hersteilen lassen, insbesondere einstufig.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit erstmalig die Bereitstellung untoxischer Ester der 3-Hydroxybuttersäure aus an sich bekannten, kommerziell verfügbaren und vor allem physiologisch unbedenklichen Komponenten bzw. Edukten (Ausgangsverbindungen). Die resultierenden Glyceride können physiologisch, insbesondere im Magen und/oder im Darm, aufgespalten werden und das Zielmolekül "3-Hydroxybuttersäure" bzw. deren Salze als Wirkstoff bzw. Wirkkomponente freisetzen bzw. generieren.

Darüber hinaus weisen die vorgenannten Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure auch einen akzeptablen Geschmack auf, um eine Kompatibilität auch bei oraler Verabreichung größerer Mengen über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten (z. B. Verabreichung von 50 g Tagesdosis oder mehr).

Gleichermaßen ermöglicht es das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren die Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure frei von toxischen Verunreinigungen bereitzustellen.

Darüber hinaus kann bei entsprechenden Ausgangsmaterialien die Herstellung auch enantioselektiv durchgeführt werden. So ermöglicht es beispielsweise das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren, die biologisch relevante Form, d. h. das (R)-Enantiomer anzureichern, insbesondere durch Enzymkatalyse, um bei oraler Verabreichung das renale System von Patienten nicht zu belasten (d. h. Elimination über die Nieren). Grundsätzlich ist es aber auch möglich und kann es unter bestimmten Voraussetzungen zweckdienlich sein, das (S)-Enantiomer anzureichern. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren, einschließlich optionaler Weiterverarbeitungs- bzw. Aufreinigungsverfahrensschritte, wirtschaftlich bzw. ökonomisch betreibbar und auch großtechnisch umsetzbar. Insbesondere verwendet das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kommerziell verfügbare Edukte und ermöglicht darüber hinaus eine relativ einfache Verfahrensführung auch bei großtechnischer Umsetzung. Im Gegensatz zu herkömmlichen Herstellungsverfahren des Standes der Technik, welche über komplexe Ausgangsverbindungen und über entsprechende Schutzgruppenchemie verlaufen, wie z. B. Diketene (z. B. WO 95/09144 A1 oder WO 90/02549 A1 ), oder komplexe mehrstufige Synthesen (z. B. US 6 306 828 B1 ) anwenden, kommt das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ohne derartige komplexe Edukte aus und verläuft nur einstufig. Dennoch werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens exzellente Ausbeuten erzielt, wobei in gleicher Weise die Bildung von Nebenprodukten minimiert bzw. vermieden wird.

Darüber ist das erfindungsgemäßen Verfahren einfach und wirtschaftlich. Insbesondere wird üblicherweise das erfindungsgemäße Verfahren in Abwesenheit von Lösemitteln und/oder ohne jedwedes Lösemittel durchgeführt (d. h. also als Reaktion in Masse bzw. als Reaktion in Substanz bzw. als sogenannte Bulk Reaction)·, folglich sind die erhaltenen Reaktionsprodukte nicht mit Lösemittel verunreinigt und es muss kein Lösemittel nach Durchführung des Verfahrens bzw. der Reaktion aufwendig und energieträchtig entfernt und entsorgt bzw. rezykliert werden. Es werden zudem auch keine toxischen Nebenprodukte gebildet.

Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren führt üblicherweise zu einem Gemisch verschiedener Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure, d. h. von mindestens zwei von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure. Das resultierende Rohreaktionsprodukt bzw. Rohglyceridgemisch kann mit an sich bekannten Methoden aufgereinigt werden, insbesondere von gegebenenfalls noch vorhandenen Edukten und/oder gegebenenfalls vorhandenen Nebenprodukten befreit werden, und - sofern gewünscht - mit ebenfalls an sich bekannten Methoden aufgespalten werden, insbesondere destillativ und/oder chromatographisch (z. B. Fraktionierung in die einzelnen Glyceride, d. h. Mono-, Di- und Triglyceride der 3-Hydroxybuttersäure, oder aber Fraktionierung in Fraktionen mit angereichertem und abgereichertem Anteil einzelner Glyceride oder aber Fraktionierung in ein Mono- und Diglycerid-Gemisch einerseits und das Triglycerid andererseits oder aber Fraktionierung in das Monoglycerid einerseits und ein Di- und Triglycerid-Gemisch andererseits etc.). Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung der allgemeinen Formel (I) entweder in racemischer Form oder aber in Form des (R)-Enantiomers eingesetzt werden. Die (R)-Konfiguration bezieht sich auf das chirale Kohlenstoffatom in 3-Position der Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, wenn in der allgemeinen Formel (I) der Rest R ¹ Ethyl darstellt. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass als Verbindung der allgemeinen Formel (I) 3-Hydroxybuttersäureethylester (Ethyl-3-hydroxybutyrat) der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(0)0C ₂ H eingesetzt wird.

Dies ermöglicht eine besonders effiziente Verfahrensführung und hohe Ausbeuten mit minimierter bzw. unterdrückter Nebenproduktbildung. Zudem ist der 3-Hydroxybuttersäureethylester auch in großen Mengen kommerziell verfügbar und zudem ökonomisch effizienter als die freie Säure (d. h. 3-Hydroxybuttersäure) umsetzbar. Insbesondere kann der 3-Hydroxybuttersäureethylester als Ausgangsverbindung großtechnisch z. B. durch Claisen-Kondensation von Ethylacetat gewonnen werden.

Insbesondere wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Umsetzung in Abwesenheit von Lösemitteln und/oder ohne jedwedes Lösemittel durchgeführt. D. h. die Umsetzung wird also als Reaktion in Masse bzw. als Reaktion in Substanz bzw. als sogenannte Bulk Reaction durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass die erhaltenen Reaktionsprodukte nicht mit Lösemittel verunreinigt sind und kein Lösemittel nach Durchführung des Verfahrens bzw. der Reaktion aufwendig und energieträchtig entfernt und entsorgt bzw. rezykliert werden muss. Überraschenderweise verläuft das Verfahren bzw. die Reaktion dennoch mit hohen Umsätzen und Ausbeuten und zumindest im Wesentlichen ohne signifikante Nebenproduktbildung.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Umsetzung in Gegenwart eines Katalysators, insbesondere eines Enzyms und/oder eines metallhaltigen und/oder metallbasierten sauren oder basischen Katalysators, vorzugsweise in Gegenwart eines Enzyms, durchgeführt werden. Bei dieser besonderen Ausführungsform ist es bevorzugt, wenn der Katalysator nach der Umsetzung rezykliert wird.

Alternativ zu dieser besonderen Ausführungsform ist es aber auch möglich, die Umsetzung autokatalytisch bzw. in Abwesenheit eines Katalysators durchzuführen. Die Verwendung eines Katalysators ist demgegenüber aber bevorzugt.

Wie zuvor ausgeführt, kann gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens die Umsetzung in Gegenwart eines Enzyms als Katalysator durchgeführt werden.

Dabei kann das Enzym insbesondere ausgewählt sein aus Synthetasen (Ligasen), Katalasen, Esterasen, Lipasen und deren Kombinationen. Erfindungsgemäß werden als Synthetasen (synonym Ligasen) insbesondere Enzyme aus der Klasse der Ligasen bezeichnet; Ligasen sind Enzyme, welche das Verknüpfen zweier oder mehrerer Moleküle durch eine kovalente Bindung katalysieren. Katalasen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Enzyme, welche Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser umzusetzen imstande sind. Der Begriff der Esterasen bezeichnet insbesondere Enzyme, welche imstande sind, Ester hydrolytisch in Alkohol und Säure aufzuspalten (Verseifung); es handelt sich somit insbesondere um Hydrolasen, wobei fettspaltende Esterasen auch als Lipasen bezeichnet werden. Lipasen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Enzyme, welche von Lipiden, wie Glyceriden, freie Fettsäuren abzuspalten imstande sind (Lipolyse).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann sich das als Katalysator eingesetzte Enzym insbesondere ableiten von Candida antarctica, Mucor miehei ( Rhizomucor miehei), Thermomyces lanuginosus, Candida rugosa, Aspergillus oryzae, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar und Pseudomonas sp. sowie deren Kombinationen, vorzugsweise von Candida antarctica, Mucor miehei (Rhizomucor miehei) und Thermomyces lanuginosus.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann das Enzym in immobilisierter Form, immobilisiert auf einem Träger, vorzugsweise auf einem polymeren Träger, bevorzugt auf einem polymeren organischen Träger, besonders bevorzugt mit hydrophoben Eigenschaften, ganz besonders bevorzugt auf einem poly(meth)acrylharzbasierten Träger, eingesetzt werden. Wie zuvor im Zusammenhang mit der Verwendung eines Katalysators im Allgemeinen dargelegt, ist es bevorzugt, im Fall der Verwendung eines Enzyms als Katalysator das Enzym nach der Umsetzung zu rezyklieren. Sofern die Umsetzung im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens in Gegenwart eines Enzyms als Katalysator durchgeführt wird, ist es bevorzugt, wenn die Umsetzung bei Temperaturen im Bereich von 10 °C bis 80 °C, insbesondere im Bereich von 20 °C bis 80 °C, vorzugsweise im Bereich von 25 °C bis 75 °C, besonders bevorzugt im Bereich von 45 °C bis 75 °C, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 50 °C bis 70 °C, durchgeführt wird.

Im Fall der Verwendung eines Enzyms als Katalysator kann die Menge des eingesetzten Enzyms in weiten Bereichen variieren. Insbesondere kann das Enzym in Mengen, bezogen auf die Gesamtmenge der Ausgangsverbindungen der Formeln (I) und (II), im Bereich von 0,001 Gew.-% bis 20 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,01 Gew. -% bis 15 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 0,1 Gew.-% bis 15 Gew.-%, bevorzugt im Bereich von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, eingesetzt werden. Dennoch kann es einzelfallbedingt oder anwendungsbezogen erforderlich sein, von den vorgenannten Mengen abzuweichen, ohne dass der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen ist.

Wenn gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Umsetzung in Gegenwart eines Enzyms als Katalysator durchgeführt wird, kann auch der angewendete Druckbereich in weiten Bereichen variieren. Insbesondere kann bei Umsetzung in Gegenwart eines Enzyms als Katalysator die Umsetzung bei einem Druck im Bereich von 0,0001 bar bis 10 bar, insbesondere im Bereich von 0,001 bar bis 5 bar, vorzugsweise im Bereich von 0,01 bar bis 2 bar, besonders bevorzugt im Bereich von 0,05 bar bis 1 bar, ganz besonders bei etwa 1 bar, durchgeführt werden.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Umsetzung in Gegenwart eines metallhaltigen und/oder metallbasierten, sauren oder basischen Katalysators durchgeführt werden. Gemäß dieser alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wonach die Umsetzung in Gegenwart eines metallhaltigen und/oder metallbasierten, sauren oder basischen Katalysators durchgeführt wird, kann der Katalysator insbesondere ausgewählt sein aus (i) basischen Katalysatoren, insbesondere Alkali- oder Erdalkalihydroxyden und Alkali- oder Erdalkalialkoholaten, wie NaOH, KOH, LiOH, Ca(OH) ₂ , NaOMe, KOMe und Na(OBu-tert), (ii) sauren Katalysatoren, insbesondere Mineralsäuren, und organischen Säuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Sulfonsäuren, Methansulfonsäure, para- Toluolsulfonsäure und Carbonsäuren, (iii) Lewis-Säuren, insbesondere Lewis- Säuren auf der Basis von Titan-, Zinn-, Zink- und Aluminiumverbindungen, wie Titantetrabutylat, Zinnsäuren, Zinkacetat, Aluminiumtrichlorid und Aluminiumtri- isopropyl und (iv) heterogenen Katalysatoren, insbesondere auf der Basis von mineralischen Silikaten, Germanaten, Carbonaten und Aluminiumoxiden, wie Zeolithen, Montmorilloniten, Mordeniten, Hydrotalciten und Tonerden, sowie deren Kombinationen.

Bei dieser Ausführungsform kann als Katalysator insbesondere ein Alkali- oder Erdalkalialkoholat eingesetzt werden.

Insbesondere ist es auch bei dieser Ausführungsform bevorzugt, wenn der Katalysator auf Basis des metallhaltigen und/oder metallbasierten sauren oder basischen Katalysators nach der Umsetzung rezykliert wird.

Wenn gemäß der besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Umsetzung in Gegenwart eines metallhaltigen und/oder metallbasierten, sauren oder basischen Katalysators erfolgt, können die Temperaturen in weiten Bereichen variiert werden. Insbesondere kann die Umsetzung in Gegenwart eines metallhaltigen und/oder metallbasierten sauren oder basischen Katalysators bei Temperaturen im Bereich von 20 °C bis 150 °C, insbesondere im Bereich von 50 °C bis 140 °C, vorzugsweise im Bereich von 70 °C bis 130 °C, besonders bevorzugt im Bereich von 80 °C bis 125 °C, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 100 °C bis 120 °C, durchgeführt werden.

Weiterhin kann auch bei dieser Ausführungsform der Katalysator (d. h. der metallhaltige und/oder metallbasierte, saure oder basische Katalysator) in weiten Mengenbereichen variiert werden: So kann der Katalysator auf Basis eines metallhaltigen und/oder metallbasierten, sauren oder basischen Katalysators in Mengen, bezogen auf die Gesamtmenge der Ausgangsverbindungen der Formeln (I) und (II), im Bereich von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,05 Gew. -% bis 15 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 0,1 Gew. -% bis 15 Gew.-%, bevorzugt im Bereich von 0,2 Gew.-% bis 10 Gew.-%, eingesetzt werden. Dennoch ist es anwendungsbezogen oder einzelfallbedingt möglich, von den vorgenannten Mengen abzuweichen, ohne dass der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen ist. Wenn gemäß dieser besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Umsetzung in Gegenwart eines metallhaltigen und/oder metallbasierten, sauren oder basischen Katalysators erfolgt, kann der Druckbereich gleichermaßen in einem weiten Regime variieren: Insbesondere kann die Umsetzung in Gegenwart eines metallhaltigen und/oder metallbasierten, sauren oder basischen Katalysators bei einem Druck im Bereich von 0,0001 bar bis 10 bar, insbesondere im Bereich von 0,001 bar bis 5 bar, vorzugsweise im Bereich von 0,01 bar bis 2 bar, besonders bevorzugt im Bereich von 0,05 bar bis 1 bar, ganz besonders bei etwa 1 bar, durchgeführt werden. Was die Menge an Edukten bzw. Ausgangsverbindungen anbelangt, so kann auch diese in weiten Bereichen variiert werden.

Unter Berücksichtigung von Verfahrensökonomie und Optimierung des Verfahrensablaufs, insbesondere im Hinblick auf die Minimierung von Nebenprodukten, ist es vorteilhaft, wenn die Verbindung der allgemeinen Formel (I), bezogen auf die Hydroxylgruppen des Glycerins der Formel (II), in molaren Mengen in einem Bereich von äquimolarer Menge bis zu einem molaren Überschuss von 200 Mol-%, insbesondere in einem Bereich von äquimolarer Menge bis zu einem molaren Überschuss von 150 Mol-%, vorzugsweise in einem Bereich von äquimolarer Menge bis zu einem molaren Überschuss von 100 Mol-%, eingesetzt wird.

Gleichermaßen unter Berücksichtigung von Verfahrensökonomie und Optimierung des Verfahrensablaufs, insbesondere im Hinblick auf die Minimierung von Nebenprodukten, ist es vorteilhaft, wenn die Verbindung der allgemeinen Formel (I) und das Glycerin der Formel (II) in einem Molverhältnis von Verbindung der allgemeinen Formel (I) / Glycerin der Formel (II) in einem Bereich von 1 :1 bis 10 : 1 , insbesondere in einem Bereich von 2 : 1 bis 8 : 1 , vorzugsweise in einem Bereich von 3 : 1 bis 6 : 1 , eingesetzt werden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure (beta-Hydroxybuttersäure, BHB bzw. 3-BHB), insbesondere wie zuvor beschrieben, wobei mindestens eine Verbindung der Formel (la)

CH ₃ - CH(0H) - CH ₂ - C(0)0C ₂ H ₅ (la) mit Glycerin (1 ,2,3-Propantriol) der Formel (II)

CH ₂ (OH) - CH(OH) - CH ₂ (OH) (II) umgesetzt wird,

so dass als Reaktionsprodukt ein oder mehrere Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III)

CH ₂ (OR ² ) - CH(OR ³ ) - CH ₂ (OR ⁴ ) (III) erhalten werden, wobei in der allgemeinen Formel (III) die Reste R ² , R ³ und R ⁴ , jeweils unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Rest der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(O) - darstellen, jedoch mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest R ² , R ³ und R ⁴ keinen Wasserstoff darstellt.

Die Umsetzung kann dabei insbesondere in Gegenwart eines Katalysators, insbesondere eines Enzyms, insbesondere wie zuvor definiert, durchgeführt werden, insbesondere wie zuvor beschrieben und/oder insbesondere unter den zuvor beschriebenen Bedingungen.

Diese Vorgehensweise führt zu einer besonders guten Verfahrenseffizienz und Verfahrensökonomie, insbesondere verbunden mit hohen Ausbeuten und einer Minimierung der Bildung von Nebenprodukten.

Die erfindungsgemäß besonders bevorzugte Vorgehensweise wird durch das nachfolgende Reaktions- bzw. Syntheseschema veranschaulicht (wobei in diesem Reaktions- bzw. Syntheseschema die Reste R ² , R ³ und R ⁴ , jeweils unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Rest der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(O) - darstellen, jedoch mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest R ² , R ³ und R ⁴ keinen Wasserstoff darstellt): Im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens wird bei der Umsetzung gleichzeitig die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IV)

R ¹ - OH (IV)

gebildet, wobei in der allgemeinen Formel (IV) der Rest R ¹ Wasserstoff oder ein Cr C ₄ -Alkyl, insbesondere ein CrC ₄ -Alkyl, bevorzugt Methyl oder Ethyl, besonders bevorzugt Ethyl, darstellt. Mit anderen Worten werden im Rahmen der Umsetzung in Abhängigkeit von der Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (I) Wasser bzw. CrC ₄ -Alkohole gebildet.

In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt bzw. vorteilhaft, wenn die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IV) (d. h. insbesondere Wasser bzw. C ₁ -C ₄ - Alkohole) der Umsetzung entzogen wird, insbesondere kontinuierlich entzogen wird, insbesondere mittels vorzugsweise kontinuierlicher destillativer Entfernung. Auf diese Weise wird das Reaktionsgleichgewicht in effizienter Weise auf die Seite der Reaktionsprodukte verlagert. Auch wird auf diese Weise die Bildung von Nebenprodukten minimiert bzw. verhindert. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als Reaktionsprodukt ein oder mehrere Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III)

CH ₂ (OR ² ) - CH(OR ³ ) - CH ₂ (OR ⁴ ) (III)

erhalten, wobei in der allgemeinen Formel (III) die Reste R ² , R ³ und R ⁴ , jeweils unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Rest der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(0) - darstellen, jedoch mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest R ² , R ³ und R ⁴ keinen Wasserstoff darstellt. Insbesondere werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens zwei oder drei voneinander verschiedene Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III), wie zuvor definiert, erhalten.

Insbesondere wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Gemisch von mindestens zwei voneinander verschiedenen Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III), wie zuvor definiert, erhalten.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens ein Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure erhalten. Gemäß einer wiederum besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens als Reaktionsprodukt ein Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure erhalten. Insbesondere kann das Gemisch Monoglyceride der 3-Hydroxybuttersäure (3-BHB-MG), Diglyceride der 3-Hydroxybuttersäure (3-BHB-DG) und Triglyceride der 3-Hydroxybuttersäure (3-BHB-TG) in einem gewichtsbezogenen Verhältnis von 3-BHB-MG/3-BHB-DG/3-BHB-TG im Bereich von 10-80 / 10-70 / 0,1 -20, insbesondere im Bereich von 20-70 / 20-60 / 0,5-15, umfassen.

Durch übliche Aufarbeitungs- und/oder Trennverfahren (z. B. Chromatographie, Destillation etc.) lassen sich zudem beliebige Gemische einstellen oder auch die jeweils reinen Glyceride (d. h. reines Monoglycerid der 3-Hydroxybuttersäure oder aber reines Diglycerid der 3-Hydroxybuttersäure oder aber reines Triglycerid der 3-Hydroxybuttersäure) erhalten. Auch Reingemische aus Monoglycerid(en) der 3-Hydroxybuttersäure und Diglycerid(en) der 3-Hydroxybuttersäure lassen sich auf diese Weise erhalten.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens kann die Zusammensetzung des Reaktionsprodukts, insbesondere das Vorhandensein der verschiedenen Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III) und deren Anteil, mittels der Umsetzungsbedingungen kontrolliert und/oder gesteuert werden. Insbesondere kann dies durch Auswahl der

Umsetzungstemperatur (Reaktionstemperatur) und/oder Auswahl des Umsetzungsdrucks (Reaktionsdrucks) und/oder Vorsehen eines Katalysators und dessen Auswahl in Bezug auf Art und/oder Menge und/oder Auswahl der Mengen der Ausgangsverbindungen (Edukte) und/oder Vorsehen der Entfernung der Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (IV), wie zuvor definiert, erfolgen. Im Anschluss an die Umsetzung kann das erhaltene Reaktionsprodukt weiteren Aufreinigungs- bzw. Aufarbeitungsschritten unterzogen werden.

In diesem Zusammenhang kann das erhaltene Reaktionsprodukt nach erfolgter Umsetzung fraktioniert werden, insbesondere destillativ fraktioniert werden. Insbesondere kann bei dieser Ausführungsform das Reaktionsprodukt mindestens aufgetrennt werden in eine erste, insbesondere leichtsiedende Fraktion, welche einen hohen Anteil an Mono- und Diglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure und einen geringen Anteil an Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure umfasst, und eine zweite, insbesondere schwersiedende Fraktion, welche einen geringen Anteil an Monoglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure und einen hohen Anteil an Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure umfasst.

Dabei kann die erste, insbesondere leichtsiedende Fraktion insbesondere ein gewichtsbezogenes Verhältnis von 3-BHB-MG/3-BHB-DG/3-BHB-TG im Bereich von 70-95 / 5-30 / 0,01-2, insbesondere im Bereich von 75-85 / 10-25 / 0-1 , umfassen; insbesondere kann die zweite, insbesondere schwersiedende Fraktion ein gewichtsbezogenes Verhältnis von 3-BHB-MG/3-BHB-DG/3-BHB-TG im

Bereich von 5-30 / 20-80 / 5-40, insbesondere im Bereich von 5-20 / 40-75 / 10-30, umfassen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die nichtumgesetzten Ausgangsverbindungen der Formeln (I) und/oder (II) aus dem Reaktionsprodukt abgetrennt und anschließend rezykliert werden.

Wie zuvor bereits ausgeführt, wird üblicherweise das erfindungsgemäße Verfahren in Abwesenheit von Lösemitteln und/oder ohne jedwedes Lösemittel durchgeführt (d. h. also als Reaktion in Masse bzw. als Reaktion in Substanz bzw. als sogenannte Bulk Reaction ). Dies hat den Vorteil, dass die erhaltenen

Reaktionsprodukte nicht mit Lösemittel verunreinigt sind und kein Lösemittel nach Durchführung des Verfahrens bzw. der Reaktion aufwendig und energieträchtig entfernt und entsorgt bzw. rezykliert werden muss. Überraschenderweise verläuft das Verfahren bzw. die Reaktion dennoch mit hohen Umsätzen und Ausbeuten und zumindest im Wesentlichen ohne signifikante Nebenproduktbildung.

Weiterer Gegenstand - gemäß einem z w e i t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Reaktionsprodukt (d. h. ein (chemisches) Produkt oder Produktgemisch). Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Reaktionsprodukt (d. h. ein (chemisches) Produkt oder Produktgemisch), welches ein oder mehrere Glyceride der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III)

CH ₂ (OR ² ) - CH(OR ³ ) - CH ₂ (OR ⁴ ) (III)

umfasst, wobei in der allgemeinen Formel (III) die Reste R ² , R ³ und R ⁴ , jeweils unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Rest der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(O) - darstellen, jedoch mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest R ² , R ³ und R ⁴ keinen Wasserstoff darstellt.

Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Gemisch von mindestens zwei

Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III)

CH ₂ (OR ² ) - CH(OR ³ ) - CH ₂ (OR ⁴ ) (III)

wobei in der allgemeinen Formel (III) die Reste R ² , R ³ und R ⁴ , jeweils unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Rest der Formel CH ₃ - CH(OH) - CH ₂ - C(O) - darstellen, jedoch mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest R ² , R ³ und

R ⁴ keinen Wasserstoff darstellt.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Gemisch von zwei oder drei voneinander verschiedenen

Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III), wie zuvor definiert.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen

Verfahren erhältliches Gemisch von mindestens zwei voneinander verschiedenen

Glyceriden der 3-Hydroxybuttersäure der allgemeinen Formel (III), wie zuvor definiert. Gemäß einer wiederum weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure. Gemäß einer ebenfalls weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure. Insbesondere kann das Gemisch Monoglyceride der 3-Hydroxybuttersäure (3-BHB-MG), Diglyceride der

3-Hydroxybuttersäure (3-BHB-DG) und Triglyceride der 3-Hydroxybuttersäure (3-BHB-TG) in einem gewichtsbezogenen Verhältnis von 3-BHB-MG/3-BHB-DG/ 3-BHB-TG im Bereich von 10-80 / 10-70 / 0,1-20, insbesondere im Bereich von 20-70 / 20-60 / 0,5-15, umfassen.

Gemäß einer wiederum weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure, wobei das Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure die Mono-, Di- und/oder

Triglyceride der 3-Hydroxybuttersäure in einem gewichtsbezogenen Verhältnis von 3-BHB-MG/3-BHB-DG/3-BHB-TG im Bereich von 70-95 / 5-30 / 0,01 -2, insbesondere im Bereich von 75-85 / 10-25 / 0-1 , umfasst. Dieses spezielle Gemisch kann insbesondere durch fraktionierte Destillation als leichtsiedende Fraktion aus dem Reaktionsproduktgemisch erhalten werden.

Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einer wiederum weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Gemisch, wobei das Gemisch ein Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure umfasst, wobei das Gemisch von Mono-, Di- und/oder Triglyceriden der

3-Hydroxybuttersäure die Mono-, Di- und/oder Triglyceride der 3-Hydroxybuttersäure in einem gewichtsbezogenen Verhältnis von 3-BHB-MG/ 3-BHB-DG/3-BHB-TG im Bereich von 5-30 / 20-80 / 5-40, insbesondere im Bereich von 5-20 / 40-75 / 10-30, umfasst. Dieses spezielle Gemisch kann insbesondere durch fraktionierte Destillation als schwersiedende Fraktion aus dem Reaktionsproduktgemisch erhalten werden.

Wie zuvor ausgeführt, lassen sich durch übliche Aufarbeitungs- und/oder Trennverfahren (z. B. Chromatographie, Destillation etc.) zudem beliebige Gemische einstellen oder auch die jeweils reinen Glyceride (d. h. reines Monoglycerid der 3-Hydroxybuttersäure oder aber reines Diglycerid der 3-Hydroxybuttersäure oder aber reines Triglycerid der 3-Hydroxybuttersäure) erhalten. Auch Reingemische aus Monoglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure und Diglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure lassen sich auf diese Weise erhalten. Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einer wiederum weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Gemisch aus Monoglycerid(en) der 3-Hydroxybuttersäure und Diglycerid(en) der 3-Hydroxybuttersäure. Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einer anderen weiteren besonderen Ausführungsform ist das Triglycerid der 3-Hydroxybuttersäure.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Reaktionsprodukt bzw. Gemisch von Glyceriden weist gegenüber dem Stand der Technik eine Vielzahl von Vorteilen und Besonderheiten auf:

Wie die Anmelderin überraschend herausgefunden hat, eignet sich das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Reaktionsprodukt bzw. Glyceridgemisch als Präkursor bzw. Metabolit von 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salzen, da es einerseits physiologisch, insbesondere im Magen/Darm-Trakt, zu 3-Hydroxybuttersäure bzw. deren Salzen umgesetzt wird und andererseits gleichzeitig eine gute physiologische Kompatibilität bzw. Verträglichkeit aufweist, insbesondere im Hinblick auf Nichttoxizität und akzeptable organoleptische Eigenschaften.

Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Reaktionsprodukt bzw. Glyceridgemisch ohne Weiteres auf synthetischem Wege auch in großtechnischem Maßstab zugänglich bzw. verfügbar, und zwar auch mit der erforderlichen pharmazeutischen bzw. pharmakologischen Qualität.

Zudem kann das erfindungsgemäße Reaktionsprodukt bzw. Glyceridgemisch erforderlichenfalls in enantiomerenreiner bzw. enantiomerenangereicherter Form bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße Reaktionsprodukt bzw. Glyceridgemisch stellt somit ein effizientes pharmakologisches Wirkstoff-Target im Rahmen einer Ketokörper- Therapie des menschlichen oder tierischen Körpers dar. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem d r i t t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere ein Arzneimittel oder Medikament, welche(s) ein nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältliches Reaktionsprodukt, wie zuvor definiert, und/oder ein nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältliches Gemisch, wie zuvor definiert, umfasst.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung gemäß diesem Erfindungsaspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers. Hierbei kann es sich insbesondere um Erkrankungen im Zusammenhang mit einer Störung des Energiestoffwechsels, insbesondere Ketokörperstoffwechsels, wie insbesondere Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, Hypoxien, kardiovaskuläre Erkrankungen wie Myokardinfarkt, Refeeding-Syndrom, Anorexien, Epilepsie, neurodegenerative Erkrankungen wie Demenz, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose und Amyotrophe Lateralsklerose, Fettstoffwechselerkrankungen wie Glukosetransporter-Defekt (GLUT1 -Defekt), VL- FAOD und Mitochondriopathien wie mitochondrialer Thiolase-Defekt, Chorea Huntington, Krebserkrankungen wie T-Zell-Lymphome, Astrozytome und Glioblastome, HIV, rheumatische Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Arthritis urica, Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen, insbesondere Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, lyosomale Speicherkrankheiten wie Sphingolipidosen, insbesondere Niemann-Pick- Erkrankung, Diabetes mellitus und Auswirkungen oder Nebenwirkungen von Chemotherapien, handeln.

Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem v i e r t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist ein nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältliches Reaktionsprodukt, wie zuvor definiert, und/oder ein nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältliches Gemisch, wie zuvor definiert, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit einer Störung des Energiestoffwechsels, insbesondere Ketokörperstoffwechsels, wie insbesondere Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, Hypoxien, kardiovaskuläre Erkrankungen wie Myokardinfarkt, Refeeding-Syndrom, Anorexien, Epilepsie, neurodegenerative Erkrankungen wie Demenz, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose und Amyotrophe Lateralsklerose, Fettstoff wechselerkrankungen wie Glukosetransporter-Defekt (GLUT1 -Defekt), VL-FAOD und Mitochondriopathien wie mitochondrialer Thiolase-Defekt, Chorea Huntington, Krebserkrankungen wie T-Zell-Lymphome, Astrozytome und Glioblastome, HIV, rheumatische Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Arthritis urica, Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen, insbesondere Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, lyosomale Speicherkrankheiten wie Sphingolipidosen, insbesondere Niemann-Pick- Erkrankung, Diabetes mellitus und Auswirkungen oder Nebenwirkungen von Chemotherapien.

Gleichermaßen weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem f ü n f t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist die Verwendung eines nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen Reaktionsprodukts, wie zuvor definiert, und/oder eines nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen Gemischs, wie zuvor definiert, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit einer Störung des Energiestoffwechsels, insbesondere Ketokörperstoffwechsels, wie insbesondere Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, Hypoxien, kardiovaskuläre Erkrankungen wie Myokardinfarkt, Refeeding-Syndrom, Anorexien, Epilepsie, neurodegenerative Erkrankungen wie Demenz, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose und Amyotrophe Lateralsklerose, Fettstoffwechselerkrankungen wie Glukosetransporter-Defekt (GLUT1 -Defekt), VL-FAOD und Mitochondriopathien wie mitochondrialer Thiolase- Defekt, Chorea Huntington, Krebserkrankungen wie T-Zell-Lymphome, Astrozytome und Glioblastome, HIV, rheumatische Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Arthritis urica, Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen, insbesondere Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, lyosomale Speicherkrankheiten wie Sphingolipidosen, insbesondere Niemann-Pick- Erkrankung, Diabetes mellitus und Auswirkungen oder Nebenwirkungen von Chemotherapien. Gleichermaßen weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem s e c h s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist die Verwendung eines nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen Reaktionsprodukts, wie zuvor definiert, und/oder eines nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen Gemischs, wie zuvor definiert, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bzw. zur Anwendung von/bei katabolen Stoffwechsellagen, wie Hunger, Diäten oder kohlenhydratarmer Ernährung.

Gleichermaßen weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem s i e b t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist ein Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnis, welches ein nach dem erfindungsgemäßen

Herstellungsverfahren erhältliches Reaktionsprodukt, wie zuvor definiert, und/oder ein nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältliches Gemisch, wie zuvor definiert, umfasst.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann das Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnis insbesondere ein Nahrungsergänzungsmittel, ein funktionelles Lebensmittel ( Functional Food), ein Novel Food, ein

Lebensmittelzusatzstoff, ein Nahrungszusatz, ein diätetisches Lebensmittel, ein Power-Snack, ein Appetitzügler oder ein Kraft- und/oder Ausdauersport- Supplement sein. Schließlich ist wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem a c h t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - die Verwendung eines nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlichen Reaktionsprodukts, wie zuvor definiert, und/oder eines nach dem erfindungsgemäßen

Herstellungsverfahren erhältlichen Gemischs, wie zuvor definiert, in einem Nahrungsmittel- und/oder Lebensmittelerzeugnis.

Gemäß diesem Erfindungsaspekt kann das Nahrungsmittel- und/oder

Lebensmittelerzeugnis insbesondere ein Nahrungsergänzungsmittel, ein funktionelles Lebensmittel ( Functional Food), ein Novel Food, ein Lebensmittelzusatzstoff, ein Nahrungszusatz, ein diätetisches Lebensmittel, ein Power-Snack, ein Appetitzügler oder ein Kraft- und/oder Ausdauersport- Supplement sein. Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne Weiteres erkennbar oder realisierbar, ohne dass er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verlässt.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken sollen, sondern lediglich die beispielhafte und nichtlimitierende Durchführungs weise und Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung erläutern sollen.

AUSFÜHRUNGSBEISPIELE:

Verwendete Abkürzungen

• 3-BHB-Ethyl = 3-Hydroxybuttersäureethylester (Edukt)

· Glyc. = Glycerin (Edukt)

• 3-BHB-MG = Monoglycerid der 3-Hydroxybuttersäure (erfindungsgemäßes

Reaktionsprodukt)

• 3-BHB-DG = Diglycerid der 3-Hydroxybuttersäure (erfindungsgemäßes

Reaktionsprodukt)

· 3-BHB-TG = Triglycerid der 3-Hydroxybuttersäure (erfindungsgemäßes

Reaktionsprodukt)

• 3-BHB-Dimer-MG = Monoglycerid des Dimers der 3-Hydroxybuttersäure

(Reaktionsnebenprodukt)

• 3-BHB-Dimer-DG = Diglycerid des Dimers der 3-Hydroxybuttersäure

(Reaktionsnebenprodukt)

• 3-BHB-FS = 3-Hydroxybuttersäure (Reaktionsnebenprodukt)

• 3-BHB-Dimer-FS = Dimer der 3-Hydroxybuttersäure (Reaktionsnebenprodukt)

• 3-BHB-Dimer = dimeres 3-Hydroxybutyrat (Reaktionsnebenprodukt)

• n.d. = nicht bestimmt

Herstellungsbeispiele

Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht. Herstellung von 3-BHB-Mono-, Di- und Triglycerid-Gemischen

In einem 500-ml-Mehrhalskolben mit Dephlegmator (Partialkondensator) und Destillationsbrücke werden 300 g (R)/(S)-3-Hydroxybuttersäureethylester (d. h. racemischer Ester), 50 g Glycerin und 3,3 g immobilisiertes Enzym (CALB-Lipase auf Polymerträger, abgeleitet von Candida antarctica, z. B. Novozym 435 von der Fa. Sigma-Aldrich bzw. Merck oder Lipozym 435 von der Fa. Strem Chemicals, Inc.) vorgelegt. Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren bei 70 °C und unter Vakuum (< 500 mbar) für 36 h zur Reaktion gebracht. Danach wird das Enzym abfiltriert und rezykliert und der überschüssige 3-Hydroxybuttersäureethylester unter Vakuum abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wird bei Bedarf für 2 bis 4 h im Hochvakuum dampfbehandelt (Dampftemperatur: 160 °C). Es wird ein Reaktionsprodukt auf Basis eines Gemischs von Mono-, Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure mit folgender Zusammensetzung erhalten: 16 % 3-BHB-Monoglycerid, 58,5 % 3-BHB-Diglycerid und 25 % 3-BHB-Triglycerid, welches noch 0,5 % 3-Hydroxybuttersäure als Reaktionsnebenprodukt enthält. Die Charakterisierung erfolgt mittels GC, GC-MS und NMR.

Im Rahmen der Aufreinigung wird die 3-Hydroxybuttersäure entfernt, so dass das Reingemisch erhalten wird. Ein Teil des Gemischs wird einer Auftrennung mittels Chromatographie unterzogen, so dass die verschiedenen Glyceride jeweils als Reinstoffe erhalten werden (d. h. jeweils reines 3-BHB-Monoglycerid, reines 3-BHB-Diglycerid und reines 3-BHB-Triglycerid). Ein anderer Teil des Gemischs wird einer Auftrennung mittels fraktionierter Destillation unterzogen, so dass einerseits eine erste, leichtsiedende Fraktion, welche einen hohen Anteil an Mono- und Diglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure und einen geringen Anteil an Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure umfasst, und andererseits eine zweite, schwersiedende Fraktion, welche einen geringen Anteil an Monoglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure und einen hohen Anteil an Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure umfasst, erhalten wird.

Die Ergebnisse der Fraktionierung sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst (Kurzwegdestillation, 0,01 mbar Druck, Temperatur Vorlagenbehälter: 20 °C, Manteltemperatur 83 °C):

Synthesen mit Enzym als Katalysator

Zur erfindungsgemäßen Synthese von erfindungsgemäßen 3-BHB-Glycerid- Gemischen sind Enzyme grundsätzlich gut geeignet. Sie sind hochselektiv und können bei milden Reaktionsbedingungen eingesetzt werden. Des Weiteren sind Enzyme häufig enantioselektiv. Da es sich bei 3-BHB-FS bzw. deren Estern um bifunktionale Moleküle (Vorhandensein einer OH-Gruppe sowie einer Carboxylgruppe bzw. Estergruppe) handelt, führen herkömmliche chemische Veresterungs- oder Umesterungs-Bedingungen zu vermehrter und unerwünschter Nebenproduktbildung (z. B. Oligo- oder Polymere, Eliminierungsreaktionen etc.). Enzyme haben dagegen das Potential, diese potentielle Nebenproduktbildung durch ihre hohe Selektivität zu umgehen.

Die nachfolgende Abbildung zeigt exemplarisch das Reaktionsschema einer erfindungsgemäßen enzymatischen Veresterung (d. h. Herstellung eines 3-BHB-MG-, 3-BHB-DG- und 3-BHB-TG-Gemisches mittels Enzymkatalyse).

T riglycerid

Aber auch bei der Verwendung von Enzymen kann es noch zu geringer Neben- bzw. Folgeproduktbildung kommen. Die nachfolgende Abbildung zeigt typische, bei einer Enzymkatalyse gebildete Nebenprodukte.

Dimer-Monoglycerid Dimer-Diglycerid

Bei den in der vorstehenden Abbildung gebildeten Nebenprodukten handelt es sich insbesondere um Folgeprodukte. Ohne sich auf eine Theorie festzulegen, lässt sich die Bildung der jeweiligen Dimer-Glyceride möglicherweise dadurch erklären, dass sich die jeweiligen Dimer-Glyceride aus den Dimeren-Ethylestern bilden oder aber die 3-BHB-Monoglyceride und 3-BHB-Diglyceride weiter an der OH-Gruppe umgeestert werden. Die 3-BHB-Dimer-Säure (3-BHB-Dimer-FS) tritt überhaupt nur in Gegenwart von Wasser auf und spielt z. B. für einen Umesterungs- Produktionsprozess mit 3-BHB-Ethyl aufgrund einer möglichen Vakuum- Verfahrensführung nur eine untergeordnete Rolle.

Testreihen mit Enzymen

Zunächst werden Testreihen mit Enzymen durchgeführt, um geeignete Enzyme bzw. geeignete Enzym-Varianten für die erfindungsgemäße Synthese von 3-BHB- Glycerid-Gemischen zu finden.

Hierzu wird zunächst eine Testreihe zur parallelen Untersuchung von bis zu 4 Ansätzen im Maßstab von 50 g bis 100 g durchgeführt. Die Experimente der Testreihe finden in Erlenmeyer-Kolben statt. Diese werden in einem Wasserbad für 24 h bei der gewünschten Temperatur gehalten. Danach wird das Enzym abfiltriert und gegebenenfalls rezykliert. Der Versuch findet pro Enzym jeweils mit und ohne Deckel statt. Es soll hiermit gezeigt werden, wie groß der Einfluss des sich bildenden Koppelprodukts Ethanol auf die chemische Gleichgewichtslage ist. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse einer Enzym-Testreihe.

Tabelle: Ergebnisse einer Enzym-Testreihe (50 °C, 24 h, 1 Gew.-% Enzym, 40 Mol-%

Überschuss an 3-BHB-Ethylester)

Die Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Reaktionsmischung nach 24 h. Die Tabelle zeigt die prozentuale Zusammensetzung ohne Berücksichtigung der gegebenenfalls noch enthaltenen Edukte. Bei den eingesetzten Enzymen handelt es sich um immobilisierte Enzyme auf polymeren Trägersubstanzen.

Die Ergebnisse der obigen Enzym-Testreihe zeigen, dass Novozym ^® 435 und Lipozym ^® 435 hohe Ausbeuten an 3-BHB-MG, 3-BHB-DG und 3-BHB-TG liefern.

Die Versuche im offenen System zeigen eine verstärkte Bildung von 3-BHB-FS bzw. 3-BHB-Dimer-FS. Dies liegt daran, dass sich - vor allem bedingt durch das verdampfende Wasserbad - unerwünschtes Wasser im Reaktionsgemisch befindet. Diese Nebenproduktbildung spielt aber z. B. für einen Umesterungs- Produktionsprozess mit 3-BHB-Ethyl eine geringere Rolle, da dieser unter Vakuum durchgeführt werden kann. Aufgrund der Erkenntnisse der Hydrolyse-Nebenreaktion werden im Weiteren Testreihen-Experimente unter Verwendung von CaCh-Trockenröhrchen durch geführt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.

Tabelle: Ergebnisse bei Verwendung von Trockenröhrchen (70 °C, 24 h, 1 Gew.-%

Enzym)

Der Vergleich der beiden Enzyme Novozym ^® 435 und Lipozym ^® 435 bei Verwendung eines Trockenröhrchens zeigt, dass die Hydrolyse nur noch in sehr geringem Maße stattfindet. Allerdings unterscheiden sich die Ergebnisse in Bezug auf Ausbeute und Selektivität kaum von vergleichbaren Experimenten im geschlossenen System. Der Druckverlust über das Trockenmittel CaCh ist aber zu hoch, so dass kaum Ethanol entweichen kann. Der Eintrag von Wasser kann jedoch vermieden werden. Die Ergebnisse ohne Enzym zeigen, dass die Reaktion auch autokatalytisch ablaufen kann. Es bilden sich auch hier geringe Mengen an BHB-MG.

Weitergehende Untersuchungen zeigen, dass die Enzyme stereoselektiv sind. Insbesondere kann aus einer weiterführenden Analyse der Dimere abgeleitet werden, dass ein Enantiomer aus der Ausgangsverbindung bevorzugt umgesetzt wird, wahrscheinlich das (R)-Enantiomer, so dass ein deutlich erhöhter Anteil an (R)-3-Hydroxybuttersäure bzw. (R)-3-BHB in den gebildeten Produkten vorhanden ist. Ein NMR-Spektrum des 3-BHB-Dimers (durch Säulenchromatographie auf > 90 % aufgereinigt) bestätigt die Enantioselektivität des Enzym-Prozesses. Gemäß dem NMR-Spektrum wird ein Diasteroemerenverhältnis von 56 : 44 bestimmt; gemäß GC-Analyse beträgt dieses Verhältnis 59 : 41 .

Testreihen mit Edukt-Überschüssen

Um die Aktivität der beiden ausgewählten Enzyme Novozym ^® 435 sowie Lipozym 435 bei unterschiedlichen 3-BHB-Ethylester Überschüssen zu testen, werden beide Enzyme bei 50 °C für 24 h äquimolar und mit 100 Mol. -% Überschuss umgeestert. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen.

Tabelle: Ergebnisse der Edukt-Überschuss-Testreihen; 50 °C, 24 h, 1 Gew.-% Enzym (geschlos senes System=g.S.; offenes System=o.S.; Novozym ^® 435=N. 435; Lipozym ^® 435=L 435)

Die Ergebnisse zeigen, dass die Versuche im offenen System, d. h. beim Abdestillieren von Ethanol, einen höheren Umsatz zu 3-BHB-DG bzw. 3-BHB-TG zeigen. Des Weiteren zeigt sich auch bei dieser Versuchsreihe die verstärkte Hydrolyse bei offenen Reaktionsgefäßen (d. h. im offenen System). Novozym 435 und Lipozym ^® 435 zeigen hierbei unter gleichen Reaktionsbedingungen ähnliche Ergebnisse. Lipozym ^® 435 scheint dabei etwas aktiver zu sein als Novozym ^® 435.

Der Umsatz an Glycerin ist bei den Ansätzen mit 100 Mol-% Überschuss am größten. Der Einfluss auf die Bildung von 3-BHB-Dimeren und der Folgeprodukte (d. h. 3-BHB-Dimer-MG und 3-BHB-Dimer-DG) ist jedoch deutlich zu erkennen.

Diese Produkte werden bei 100 Mol-% Überschuss zwei- bis viermal so viel gebildet, während der Anteil an 3-BHB-TG nur rund zweimal so hoch ist.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei den gewählten Reaktionsbedingungen ein Überschuss von 100 Mol-% einen stärkeren Einfluss auf die Nebenproduktbildung im Vergleich zur Hauptproduktbildung hat.

Testreihen zur Untersuchung von Temperatur- und Substrat-Effekten

Der Einfluss der Temperatur sowie eine erste Abschätzung des Einflusses von Substraten auf die Produktbildung werden ebenfalls in Testreihen-Experimenten untersucht.

Die Reaktionstemperatur wird auf 70 °C eingestellt. Zusätzlich werden bei einigen Ansätzen bzw. Versuchen 1 g einer Schwersieder-Fraktion aus einer KD- Destillation (siehe auch oben) hinzugefügt, um eine erste Abschätzung des Einflusses von Substraten auf die Produktbildung zu untersuchen.

Das mit der Schwersieder-Fraktion gemischte Reaktionsgemisch dieser Ansätze hat nachfolgende Ausgangszusammensetzung:

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Substrat-Testreihen.

Tabelle: Ergebnisse der Substrat-Testreihen (70 °C, 24 h, 1 Gew.-% Enzym) (geschlossenes

System=g.S.; offenes System=o.S.; Novozym ^® 435=N. 435; Lipozym ^® 435=L. 435)

Festzustellen ist zunächst ein Einfluss der Luftfeuchtigkeit bzw. der daraus folgenden Hydrolyse bei den Versuchen im offenen System. Es zeigen sich die Vorteile des Abdestillierens des entstehenden Ethanols zur Gleichgewichtsverschiebung. Lipozym ^® 435 und Novozym ^® 435 liefern sehr ähnliche Ergebnisse mit leicht höherer Aktivität beim Lipozym ^® 435.

Ein Einfluss der zugegebenen Menge an Produkten (1 g einer Schwersieder- Fraktion aus einer KD-Destillation) ist nicht erkennbar. Die Menge addiert sich nahezu vollständig zur gebildeten Produktmenge. Beispielsweise bildet sich 3-BHB-DG bei Novozym ^® 435 (offenes System) mit 35 % ohne Zugabe von Produkten und mit 36,7 % bei Zugabe von Produkten. Diese Erhöhung entspricht genau der zugegebenen Menge an 3-BHB-DG von 1 ,6 % im Rahmen der Messgenauigkeit. Der Summenparameter der Nebenprodukte beinhaltet alle Dimeren bzw. Dimer- Glyceride (siehe auch obige Darstellung). Freie Fettsäure bzw. deren Dimere sind in synthetischer Hinsicht unbeachtlich, da die Hydrolyse in einem

Produktionsprozess eine nur untergeordnete Rolle spielt.

Die Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass eine aus einem Produktions-Prozess stammende, abdestillierte Edukt-Fraktion (3-BHB-Ethylester-Fraktion) dem Prozess wieder zugeführt werden kann, ohne einen signifikanten Einfluss auf die Reaktion zu haben.

In weiteren Testreihen unter Variation der Temperatur kann man den Einfluss der

Temperatur auf die Produktbildung erkennen. Gegenüber einer

Reaktionstemperatur von 50 °C wird beispielsweise etwa 4 % bis 5 % mehr 3-BHB-

TG gebildet (bei einem gleichzeitig um etwa 25 % höherem Glycerin-Umsatz).

Auch ist der Einfluss eines offenen Systems gegenüber einem geschlossenen System erkennbar: Im geschlossenen System ist die Bildung von 3-BHB-MG gegenüber 3-BHB-DG bevorzugt, wohingegen sich dies im offenen System in etwa umkehrt. Die Bildung von 3-BHB-TG und den Nebenprodukten bleibt dagegen hiervon in etwa unbeeinflusst.

Testreihen mit Enzym-Rezyklierungen

In weiteren Testreihen-Experimenten wird die Rezyklierfähigkeit (Recycling- Fähigkeit) der verwendeten Enzyme Novozym ^® 435 und Lipozym ^® 435 untersucht. Hierzu wird das jeweilige Enzym vom vorgehenden Versuch abfiltriert und der Filterrückstand nebst Produktanhaftungen für ein weiteres Experiment eingesetzt.

Es zeigt sich, dass beide Enzyme nach 24 h bei 70 °C rezykliert werden können. Nach dem ersten Rezyklierungs-Zyklus zeigt sich eine kaum verringerte Aktivität, und es werden nahezu identische Zusammensetzungen erhalten. Auffallend ist jedoch, dass beide Enzyme nach Rezyklierung einen geringeren Glycerin-Umsatz aufweisen, aber gleichzeitig weniger Dimere bilden. Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle: Ergebnisse des Enzym-Recyclings (70 °C, 24 h, 1 Gew.-% Enzym, 40 Mol-%

Überschuss BHB-Ethyl-Ester, alle Versuche mit Trockenrohr)

Testreihen mit Untersuchung der Enzym-Konzentration

Der Einfluss der Enzymkonzentration wird in weiteren Testreihen-Experimenten ebenfalls untersucht. Hierzu werden Ansätze mit 0,1 Gew.-%, 1 Gew.-%, 5 Gew.-% und 10 Gew.-% an Enzym angesetzt. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen. Die Versuche wurden je mit Novozym 435 (offenes System) durch geführt.

Die Ergebnisse zeigen, dass die optimale Konzentration im Bereich von etwa 1 Gew.-% Enzym bei 70 °C liegt. Hier wird der höchste Glycerinumsatz erzielt. Bei höheren Enzym-Konzentrationen sinkt der Glycerinumsatz wieder ab. Des Weiteren führen Enzymmengen > 5 % zu einer verstärkten Bildung von Dimer-DG und höheren Dimer-Verbindungen. Bei allen Versuchen ist der erhöhte Anteil an BHB-FS und BHB-Dimer-FS auf die offene Versuchsweise (d. h. im offenen System) im Wasserbad zurückzuführen. Tabelle: Ergebnisse der Enzym-Konzentration-Testreihen (70 °C, 24 h,

Novozym ^® 435, 40 Mol-% Überschuss 3-BHB-Ethylester)

Synthesen mit basischem Metallkatalysator

Eine weitere Möglichkeit zur Synthese von 3-BHB-Glycerid-Gemischen besteht in der chemischen Synthese unter Verwendung von Metallkatalysatoren, Säuren oder Basen. Hierzu wird ausgehend von der freien Fettsäure unter Wasserabspaltung eine Veresterung durchgeführt oder bei Verwendung des z. B. 3-BHB-Ethylesters unter Ethanolabspaltung eine Umesterung durchgeführt (und zwar jeweils in Gegenwart des Katalysators). Durch geeignete Reaktionsführung können im Rahmen der vorliegenden Erfindung die im Stand der Technik üblicherweise auftretenden Nebenreaktionen, insbesondere Oligo- und Polymerisationsreaktio nen, effizient minimiert bzw. vermieden werden.

Das nachfolgende Reaktionsschema zeigt eine mögliche chemische Synthese von 3-BHB-Glyceridgemischen durch Umesterung mit basischem Katalysator nach der vorliegenden Erfindung.

T riglycerid

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse einer Umsetzung von 3-BHB-Ethyl- ester mit Natriummethylat (NaOMe) und Glycerin.

Tabelle: Ergebnisse der Umsetzung von 3-BHB-Ethyl-Ester mit Natriummethylat

(NaOMe) und Glycerin (100 °C, 12 h, 1 Gew.-% NaOMe, 40 Mol-% Überschuss BHB-Ethylester, Vakuum)

Es zeigt sich, dass Polymerisationen nicht sattfinden. Es bilden sich Mono-, Di- und Triglyceride und geringe Mengen an Dimeren. Eine weitergehende Zugabe von NaOMe und/oder die Anwendung von geringerem Vakuum können zwar den Reaktionsfortschritt nicht weiter erhöhen, da offenbar ein Gleichgewichtszustand oder eine kinetische Limitierung erreicht zu sein scheint, lassen aber selektiv nur den Anteil an 3-BHB-Methylester ansteigen, so dass davon auszugehen ist, dass der Katalysator weiterhin aktiv ist und sich auf diese Weise die Reaktion steuern lässt. Physiologische Anwendunasversuche: /n-v/fro-Verdauversuche

Verdauversuche fSoalt- bzw. Soaltunasversuchel von erfindunasaemäßen

3-BHB-Glvcerid-Gemischen

Mittels Spaltungsversuchen wird gezeigt, dass erfindungsgemäß hergestellte 3-BHB-Ester bzw. deren Gemische, einschließlich der Reaktionsnebenprodukte wie Dimeren etc., im menschlichen gastrointestinalen Trakt gespalten werden können. Als Ausgangsgemisch wird eine nicht weiter aufgereinigte, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Roh-Schwersiederfraktion aus der fraktionierten Destillation eingesetzt, welche ein erfindungsgemäß erhaltenes ternäres Gemisch von 3-BHB-MG, 3-BHB-DG und 3-BHB-TG enthält.

Für die Spaltungsversuche unter köpernahen Bedingungen werden zwei Medien untersucht:

· FaSSGF, welches den Magen simuliert

• FaSSIF, welches den Darmtrakt simuliert

Beide Medien stammen von der Firma Biorelevant , Ltd., Großbritannien. Zusätzlich wird in einigen Experimenten Schweine-Pankrease zugesetzt (Panzytrat ^® 40.000, Fa. Allergan).

Die Ergebnisse der Experimente sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst (chromatographisch bestimmt, Prozentangabe jeweils bestimmt als % Fläche im Chromatogramm).

Tabelle: Ergebnisse der Spaltungsversuche in einem FaSSGF- bzw. FaSSIF-Medium mit

Panzytrat ^® (m.P.) und ohne Panzytrat ^® (o.P.) (35 °C, 24 h)

Es zeigt sich, dass die Probe unter FaSSGF-Bedingungen hydrolysiert. Dies liegt hauptsächlich am niedrigen pH-Wert (pH = 1 ,6).

Bei FaSSIF-Bedingungen findet eine geringe Umsetzung bzw. Spaltung (2,6 % 3- BHB-FS) unter Verwendung von Panzytrat statt.

Bei allen Experimenten ist zu erkennen, dass sich die Kaskade (3-BHB-TG wird zu 3-BHB-DG, 3-BHB-DG wird zu 3-BHB-MG, 3-BHB-MG wird zu freier Säure und Glycerin) fortsetzt. Des Weiteren bilden sich auch Dimer-Säuren (3-BHB-Dimer- FS). Daraus lässt sich erkennen, dass auch die Dimer-Glyceride abgebaut werden. Dies lässt sich folglich für einen etwaigen pharmazeutischen bzw. pharmakologischen Retardierungs-Effekt nutzen.

Weitere Verdauversuche fSpaltunasversuchel von erfindunasaemäßen 3-BHB-Glvcerid-Gemischen

1 . Spaltungsversuche mit Pankreatin

2 g eines wie zuvor beschrieben hergestellten Glyceridgemischs auf Basis von Mono-, Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure werden in 50 g Wasser gelöst und mit 0,5 g (1 Gew.-%) Pankreatin versetzt.

Das Pankreatin wird in Form des kommerziell verfügbaren Produkts Panzytrat 40.000 von der Fa. Allergan eingesetzt.

Das Ganze wird auf einer Heizplatte bei 50 °C gerührt; der Reaktionsverlauf wird mittels kontinuierlicher Erfassung der Säurezahl über die Zeit ermittelt und verfolgt.

Die Säurezahl steigt über einen Zeitraum von 1 .250 min von ursprünglich 0,200 mg KOH/g auf über 2,200 mg KOH/g an (Spaltung der 3-BHB-

Glyceride zu der freien Säure).

Der Umsatz/Zeit-Verlauf der wässrigen Spaltung des erfindungsgemäßen Glyceridgemischs mittels Pankreatin, einschließlich Zunahme der Säurezahl über die Zeit, belegt die gewünschte Zersetzung des Eduktgemischs

(Glyceridgemischs) zur freien Säure. Dies wird nachfolgend durch entsprechende Analytik bestätigt.

Der Versuch belegt, dass das erfindungsgemäße Glyceridgemisch aus Mono-, Di- und Triglyceriden von 3-Hydroxybuttersäure ein geeigneter physiologischer Präkursor für 3-Hydroxybuttersäure für die entsprechenden Ketokörpertherapien darstellt. Der Versuch wird anhand der einzelnen Glyceride wiederholt und verifiziert. Es werden vergleichbare Ergebnisse erhalten, d. h. sowohl das Monoglycerid als auch das Diglycerid sowie auch das Triglycerid der 3-Hydroxybuttersäure werden durch Pankreatin jeweils zu der freien 3-Hydroxybuttersäure gespalten. Spaltung mit Magenmedium: FaSSGF-Medium

Ein sogenanntes FaSSGF-Medium wird nach Herstellerangaben aus der kommerziell verfügbaren entsprechenden Zusammensetzung zubereitet (erhältlich von der Fa. Biorelevant, Ltd., Großbritannien).

Die resultierende Probe wird in zwei gleichgroße Chargen aufgeteilt. Jeweils 10 Gew.-% des erfindungsgemäßen ternären Glyceridgemischs auf Basis von Mono-, Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure, wie zuvor beschrieben, werden im FaSSGF-Medium gelöst und für 24 Stunden bei

35 °C im Wasserbad belassen. Einer der beiden Chargen ist zuvor zusätzlich 1 Gew.-% Pankreatin (Panzytrat ^® 40.000) zugesetzt worden.

Zu Zwecken der Analyse werden die Probenlösungen zur Adsorption auf einer CHROMABOND -Xtr-Säule gegeben und > 5 min einwirken gelassen und dann mit 6 ml DCM (Dichlormethan)/lsopropanol (4 : 1 ) eluiert.

Die Ergebnisse des Spaltungsversuchs sowohl mit als auch ohne Pankreatin im FaSSGF-Medium zeigen eine starke Zunahme an freier 3-Hydroxy- buttersäure und eine deutliche Abnahme der Di- und Triglyceriden der

3-Hydroxybuttersäure im FaSSGF-Medium sowohl mit als auch ohne Pankreatin. Die weiterführende Analytik belegt eine wunschgemäße Aufspaltung bzw. Zersetzung der Probe durch das Medium (pH-Wert des Mediums: 1 ,6).

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse des Spaltungsversuchs mit und ohne Panzytrat ^® 40.000 im FaSSGF-Medium. Tabelle: Ergebnisse der Spaltungsversuche mit und ohne Panzytrat 40.000 in einem FaSSGF-Medium.

Spaltung mit Darmmedium: FaSSIF-Medium

Das FaSSIF-Medium wird nach Herstellerangaben zubereitet (Fa. Biorelevant, Ltd., Großbritannien).

Die erhaltene Probe wird in zwei gleichgroße Ansätze aufgeteilt. Jeweils 10 Gew.-% des zuvor genannten Glyceridgemischs auf Basis einer Mischung von Mono-, Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäuren werden im FaSSIF-Medium gelöst und für 24 Stunden bei 35 °C im Wasserbad belassen. Einem der beiden Ansätze ist zuvor zusätzlich 1 Gew.-% Pankreatin (Panzytrat 40.000) zugesetzt worden.

Zu Zwecken der Analyse werden jeweils 0,5 ml Probenlösung zur Adsorption auf eine CHROMABOND -Xtr-Säule gegeben und 5 min einwirken gelassen und dann mit 6 ml DCM/Isopropanol (4 : 1 ) eluiert.

Die Ergebnisse des Spaltungsversuchs mit und ohne Pankreatin im FaSSIF- Medium zeigen eine leichte Zunahme an freier 3-Hydroxybuttersäure und eine entsprechend leichte Abnahme im Gehalt an Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäure des Ausgangsgemischs, was einen enzymatischen Abbau bzw. Zersetzung der Probe belegt, was durch weiterführende Analytik bestätigt wird.

Der pH-Wert des FaSSIF-Mediums liegt bei 6,5. Das FaSSIF-Medium selbst scheint eine Spaltung nicht zu begünstigen.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse des Spaltungsversuchs im FaSSIF-Medium. Tabelle: Ergebnisse des Spaltungsversuchs mit und ohne Panzytrat 40.000 in einem FaSSIF-Medium.

Weitere Spaltung mit Darmmedium: FaSSIF-Medium

Das FaSSIF-Medium wird entsprechend dem vorangehenden Versuch nach Herstellerangaben zubereitet.

Die resultierende Probe wird in zwei gleichgroße Chargen aufgeteilt. Jeweils 10 Gew.-% des erfindungsgemäßen ternären Glyceridgemischs von Mono-, Di- und Triglyceriden der 3-Hydroxybuttersäuren werden im FaSSIF-Medium gelöst und für 24 Stunden bei 35 °C im Wasserbad belassen. Einer Charge ist zuvor 1 Gew.-% einer porcinen Pankreas-Lipase Typ II (PPL Typ II) zugesetzt worden.

Zu Analysezwecken werden 0,5 ml Probenlösung zur Adsorption auf eine

CHROMABOND -Xtr-Säule gegeben und mehr als 5 min einwirken gelassen und dann mit 6 ml DCM/Isopropanol (4 : 1 ) eluiert.

Die Ergebnisse des Spaltungsversuchs mit porciner Pankreas-Lipase im FaSSIF-Medium zeigen eine leichte Zunahme an freier 3-Hydroxybuttersäure und eine entsprechende leichte Abnahme im Gehalt an Triglycerid der 3-Hydroxybuttersäure, was einen enzymatischen Abbau bzw. Zersetzung der Probe belegt, was durch weiterführende Analytik bestätigt wird.

Der pH-Wert des FaSSIF-Mediums liegt bei 6,5. Das FaSSIF-Medium selbst scheint eine Spaltung nicht zu begünstigen.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse des Spaltungsversuchs mit und ohne Pankreas-Lipase Typ II im FaSSIF-Medium. Tabelle: Ergebnisse der Spaltungsversuche mit und ohne porciner Pankreas-Lipase in einem FaSSIF-Medium

Die zuvor geschilderten Spaltungsversuche belegen, dass Mono-, Di- und/oder Triglyceride der 3-Hydroxybuttersäure effiziente Präkursoren bzw. Metabolite der freien Hydroxybuttersäure bzw. deren Salzen darstellen, insbesondere im Hinblick auf ihre beabsichtigte Wirkung, welche in physiologisch verträglicher bzw. physiologisch kompatibler Form vorliegen.