GAO XIANG (CN)
LIU DENG (CN)
GAO FANG (CN)
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上海华工专利事务所 (CN)
| 权 利 要 求 书 1、 一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法， 其特征在于， 在蓝藻中表达异戊二烯合 成酶编码基因。 2、 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述异戊二烯合成酶编码基因来源 自蓝桉或杨树。 3、 如权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述来源自蓝桉或杨树的异戊二烯 合成酶编码基因包括： （a)具有原始全长的核苷酸序列； （b)具有将原始全长的核苷 酸序列删除 N端信号肽的核苷酸序列； （c) 具有将原始全长的核苷酸序列删除 N端 信号肽后进行密码子优化的核苷酸序列。 4、 如权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述来源于蓝桉的、 具有原始全长 的核苷酸序列的异戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 45所示的核苷酸序列。 5、 如权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述来源于杨树的、 具有原始全长 的核苷酸序列的异戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 46所示的核苷酸序列。 6、 如权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述来源于蓝桉的、 具有将原始全 长的核苷酸序列删除 N端信号肽的核苷酸序列的异戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列。 7、 如权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述来源于杨树的、 具有将原始全 长的核苷酸序列删除 N端信号肽的核苷酸序列的异戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 44所示的核苷酸序列。 8、 如权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述来源于蓝桉的、 具有将原始全 长的核苷酸序列删除 N端信号肽后进行密码子优化的核苷酸序列的异戊二烯合成酶 编码基因具有如 SEQ ID NO: 47所示的核苷酸序列。 9、 一种删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因。 10、 如权利要求 9所述的删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因， 其特征 在于， 所述基因来源自蓝桉或杨树。 11、 如权利要求 10所述的删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因， 其特征 在于，所述来源自蓝桉的、删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列。 12、 如权利要求 10所述的删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因， 其特征 在于，所述来源自杨树的、删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 44所示的核苷酸序列。 13、 一种密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因， 其特征在于， 所述基因是根据 蓝藻的密码子偏好性， 在不改变编码的氨基酸序列的基础上， 将来源自蓝桉的、如权 利要求 9所述的异戊二烯合成酶编码基因的核苷酸序列经密码子优化获得。 14、如权利要求 13所述的密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因，其特征在于， 所述基因具有如 SEQ ID NO: 47所示的核苷酸序列。 15、 一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法， 其特征在于， 在蓝藻中表达如权利要求 9-14中任一项所述的异戊二烯合成酶编码基因。 16、 编码藻蓝蛋白的 操纵子的启动子的应用， 其特征在于， 所述启动子在蓝 藻中介导萜类化合物合成酶编码基因的表达。 17、 如权利要求 16所述的应用， 其特征在于， 所述萜类化合物合成酶编码基因 为如权利要求 1-15中任一项所述的异戊二烯合成酶编码基因。 18、 如权利要求 16所述的应用， 其特征在于， 所述启动子具有如 SEQ ID NO: 56所示的核苷酸序列。 19、 一种提高蓝藻生产异戊二烯的方法， 其特征在于， 增强表达异戊二烯基焦磷 酸异构酶编码基因。 20、 如权利要求 19所述的方法， 其特征在于， 所述增强表达异戊二烯基焦磷酸 异构酶编码基因是通过插入至少一个所述异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因的拷贝 至已表达有如权利要求 1-15中任一项所述的异戊二烯合成酶的蓝藻重组菌基因组中。 21、 如权利要求 20所述的方法， 其特征在于， 所述异戊二烯基焦磷酸异构酶编 码基因来源自蓝藻、 酿酒酵母、 枯草芽孢杆菌或 22、 一种融合蛋白， 其特征在于， 所述融合蛋白包含异戊二烯基焦磷酸异构酶和 异戊二烯合成酶。 23、 如权利要求 22所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述异戊二烯基焦磷酸异构 酶来源自酿酒酵母。 24、 如权利要求 22所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述异戊二烯合成酶来源自 杨树、 蓝桉或葛藤。 25、 如权利要求 22所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述异戊二烯基焦磷酸异构 酶位于所述异戊二烯合成酶的 N端。 26、 一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法， 其特征在于， 在蓝藻中表达如权利要求-25中任一项所述的融合蛋白。 |
技术领域
本发明属于基因工程领域， 具体地说， 涉及利用蓝藻生产异戊二烯的方法。 背景技术
异戊二烯是重要的大宗基础原料， 主要用于合成异戊橡胶， 以用于制造轮胎。 同 时用于生产甲基庚烯酮、薰衣草醇等多种精细 化工产品。还用于生产集成电路用的光 刻橡胶以及合成润滑油添加剂等。此外， 最近的研究表明异戊二烯还可以转化成生物 燃料， 如航空燃料。
目前， 工业上异戊二烯主要用石油基原料生产， 即利用溶剂萃取蒸熘法分离炼油 副产物中的 C5熘分。 该制备方法费用高且异戊二烯的纯度低， 随着化石资源的日益 短缺、石油价格的不断上涨， 预计异戊二烯的生产供应将受到限制、成本将 进一步提 高。 还有通过化学合成异戊二烯， 如丙酮和乙烯反应， 丙烯聚合等， 但同样面临着效 率低， 纯度低， 成本高的问题。 另一方面， 随着世界经济的发展， 轮胎的需求量不断 的增加， 而天然橡胶的的生产由于种植土地有限、病虫 害等原因受到限制， 导致异戊 二烯的需求量呈现快速增长。 因此， 迫切需要开发出一种高纯度、低成本的异戊二 烯 制造技术 (Whited, G.M. et al. Ind. Biotechnol. 6, 152-163, 2010)。
异戊二烯是种类繁多的萜类化合物的组成单体 。目前发现的异戊二烯的生物合成 途径有两条 （Ajikumar, P.K. et al. MOLECULAR PHARMACEUTICS.5, 167- 190 ) (图 1 )： ( 1 ) 甲羟戊酸 （MVA) 途径， 以三个乙酰辅酶 A分子为原料， 形成甲羟戊酸， 继而经过焦磷酸化， 脱羧化合成异戊二烯基焦磷酸（IPP)， 再经过异构， 形成二甲丙 烯基焦磷酸 （DMAPP ) , DMAPP在异戊二烯合成酶 （isoprene synthease ) 的作用下 生成异戊二烯。（2 )磷酸甲基赤藓糖（MEP)途径， 以丙酮酸和三磷酸甘油醛为原料， 形成脱氧木酮糖 -5-磷酸， 还原异构生成甲基赤藓糖 -4-磷酸（MEP)， 继而经过一系列 的反应生成羟甲基丁烯 -4-磷酸 （HMDPP ) , 再在 HMDPP还原酶的作用下同时生成 IPP和 DMAPP, DMAPP在异戊二烯合成酶的作用下生成异戊二烯
目前仅有植物来源的异戊二烯合成酶基因 ispS 克隆和鉴定出来， 分别来自杨^ (Populus alba; Populus tremloide ) (MYitQr et.al. Planta 2001 213 :483-487; Sasaki et.al. FEBS Letters 579 (2005) 2514-2518 ) 和葛藤 (Kudzu ( Sharkey et.al. Plant Physiology 137(2005) 700-712)。 植物在特定环境条件下 （如热胁迫等） 会释放异戊二烯， 但收 集植物释放的异戊二烯非常困难， 效率低， 而且植物生长缓慢， 所以远远不能满足需 求。
近年来随着代谢工程和合成生物学技术的迅速 发展，利用微生物发酵法生产萜类 化 合 物 取 得 重 大 进 展 （ Ajikumar, P.K. et al. MOLECULAR PHARMACEUTICS.5, 167-190 )。 美国 Genencor 公司通过遗传改造大肠杆菌 BL21 E.coli BL21 ) , 获得高产异戊二烯工程菌 ( Whited, G.M. et al. Ind. Biotechnol. 6, 152-163, 2010)。 具体来说， 向大肠杆菌中导入改造后的杨树来源的异戊二 烯合成酶
( IspS ) , 进而导入外源的 MVA途径、 并且过表达磷酸葡萄糖酸内酯酶， 最后通过发 酵条件的优化， 使异戊二烯的产量达到 60g/L。然而， 大肠杆菌发酵法合成异戊二烯， 需要消耗大量的葡萄糖和淀粉。
蓝藻等光合微生物能够通过光合作用固定空气 中的 C0 2 ，在光生物反应器中较快 生长。 因此通过对蓝藻进行基因工程改造， 将 C0 2 直接生物转化为异戊二烯， 不仅 能够降低底物成本， 还可以减少 C0 2 的排放， 因而具有重要的现实意义。 Melis et. al.
( P. Lindberg et al. I Metabolic Engineering 12 (2010) 70-79 ) 首次在聚胞藻 i Synechocystis) 中成功表达了葛藤来源的异戊二烯合成酶， 并检测到异戊二烯的合 成， 但产量 （50μ § ) 很低， 远远不能满足工业化生产的要求。 发明内容
为了解决现有的异戊二烯的生产方法中存在的 产量低、成本高的缺陷，本申请的 发明人通过比较蓝桉、杨树、葛藤等不同来源 的异戊二烯合成酶， 并且对其进行密码 子优化后在聚胞藻中表达，进一步通过对异戊 二烯合成途径的代谢流量的优化， 结果 显著地提高了聚胞藻基因工程菌合成异戊二烯 的产量。
因此， 本发明的目的在于提供多种利用蓝藻生产异戊 二烯的方法。
为解决上述的技术问题， 本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一个方面，一种利用蓝藻生产 异戊二烯的方法，在蓝藻中表达异 戊二烯合成酶编码基因。
根据本发明， 所述异戊二烯合成酶编码基因来源自蓝桉或杨 树。
根据本发明， 所述来源自蓝桉或杨树的异戊二烯合成酶编码 基因包括： （a)具有 原始全长的核苷酸序列； （b) 具有将原始全长的核苷酸序列删除 N端信号肽的核苷 酸序列； （c) 具有将原始全长的核苷酸序列删除 N端信号肽后进行密码子优化的核 苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，所述来源于蓝桉的 、具有原始全长的核苷酸序列的异 戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 45所示的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，所述来源于杨树的 、具有原始全长的核苷酸序列的异 戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 46所示的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，所述来源于蓝桉的 、具有将原始全长的核苷酸序列删 除 N端信号肽的核苷酸序列的异戊二烯合成酶编 基因具有如 SEQ ID NO: 42所示 的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，所述来源于杨树的 、具有将原始全长的核苷酸序列删 除 N端信号肽的核苷酸序列的异戊二烯合成酶编 基因具有如 SEQ ID NO: 44所示 的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，所述来源于蓝桉的 、具有将原始全长的核苷酸序列删 除 N端信号肽后进行密码子优化的核苷酸序列的 戊二烯合成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 47所示的核苷酸序列。
根据本发明的第二个方面， 一种删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因。 根据本发明， 所述基因来源自蓝桉或杨树。
根据本发明的优选实施例， 所述来源自蓝桉的、 删除 N端信号肽的异戊二烯合 成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例， 所述来源自杨树的、 删除 N端信号肽的异戊二烯合 成酶编码基因具有如 SEQ ID NO: 44所示的核苷酸序列。
根据本发明的第三个方面， 一种密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因， 所述基 因是根据蓝藻的密码子偏好性，在不改变编码 的氨基酸序列的基础上，将来源自蓝桉 的、 删除 N端信号肽的异戊二烯合成酶编码基因的核苷 序列经密码子优化获得。 根据本发明的优选实施例， 所述基因具有如 SEQ ID NO: 47所示的核苷酸序列。 根据本发明的第四个方面， 一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法， 其特征在于， 在 蓝藻中表达如上所述的异戊二烯合成酶编码基 因。
根据本发明的第五个方面， 编码藻蓝蛋白的 操纵子的启动子的应用， 所述启 动子在蓝藻中介导萜类化合物合成酶编码基因 的表达。
根据本发明的优选实施例，所述萜类化合物合 成酶编码基因为上述的异戊二烯合 成酶编码基因。
根据本发明的优选实施例， 所述启动子具有如 SEQ ID NO: 56所示的核苷酸序 列。
根据本发明的第六个方面，一种提高蓝藻生产 异戊二烯的方法，增强表达异戊二 烯基焦磷酸异构酶编码基因。
根据本发明，所述增强表达异戊二烯基焦磷酸 异构酶编码基因是通过插入至少一 个所述异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因的拷 贝至已表达有上述的异戊二烯合成酶 的蓝藻重组菌基因组。
根据本发明， 所述异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因来源自 蓝藻、酿酒酵母、枯 草芽抱杆菌或 Haematococcus pluialis o
根据本发明的第七个方面，一种融合蛋白，所 述融合蛋白包含异戊二烯基焦磷酸 异构酶和异戊二烯合成酶。
根据本发明的优选实施例， 所述异戊二烯基焦磷酸异构酶来源自酿酒酵母 。 根据本发明， 所述异戊二烯合成酶来源自杨树、 蓝桉或葛藤。
根据本发明的优选实施例，所述异戊二烯基焦 磷酸异构酶位于所述异戊二烯合成 酶的 N端。
根据本发明的第八个方面，一种利用蓝藻生产 异戊二烯的方法，在蓝藻中表达如 上所述的融合蛋白。
本发明的有益效果：
1、 通过比较杨树、 蓝桉、 葛藤等不同来源的异戊二烯合成酶的编码基因 ispS, 并对其序列进行密码子优化， 显著地提高了基因工程蓝藻的异戊二烯产量；
2、 筛选到可以高效表达^^基因的启动子 P ， 并可应用于在蓝藻中高效表达 关键基因；
3、 发现异戊二烯基焦磷酸异构酶（IDI)是蓝藻异 二烯合成途径上的一个限速 步骤，通过比较不同来源的异戊二烯基焦磷酸 异构酶编码基因、并对其进行过量表达， 可以提高基因工程蓝藻的异戊二烯产量；
4、 通过构建表达 Idi-IspS融合蛋白， 发现可以显著提高基因工程蓝藻的异戊二 烯合成， 可应用于蓝藻合成各种萜类化合物的研究。 本发明对蓝藻进行遗传改造， 在蓝藻中表达植物来源的异戊二烯合成酶（Isp S)， 并检测到异戊二烯的生成， 继而通过密码子优化、 启动子筛选、 限速酶筛选、 融合蛋 白表达等多种系统的方法研究， 显著地提高了基因工程蓝藻生产异戊二烯的产 量， 并 且这些研究结果还可以应用于基因工程蓝藻表 达其他外源蛋白，极大地拓展了基因工 程蓝藻的应用范围， 具有广泛的工业应用前景。 附图说明
图 1为异戊二烯的生物合成途径示意图。
图 2为 pKS2的质粒示意图。
图 3为 pKS3的质粒示意图。
图 4为 pKS4的质粒示意图。
图 5A为重组菌株 ss006、 ss007、 ss013和 ss014合成异戊二烯的累积产量图。 图 5B为重组菌株 ssl03、 ss005、 ss007、 ss014和 ss026合成异戊二烯的累积产量 图。
图 5C为重组菌株 ss014和 ss026的异戊二烯生产产率结果图。
图 5D为重组菌株 ss014和 ss026的生长曲线图。
图 6为不同启动子表达 kl ^S重组菌株合成异戊二烯的累积产量图。
图 7为蓝藻合成异戊二烯的 MEP途径示意图。
图 8为重组菌株 ss005、 ss230和 SS 234合成异戊二烯的累积产量图。
图 9为重组菌株 ss217、 ss219、 SS 221和 SS 223合成异戊二烯的累积产量图。 图 10为重组菌株 ss005、 ss231和 SS 236合成异戊二烯的累积产量图。
图 11A为重组菌株 ss005、 ss016和 SS 017合成异戊二烯的累积产量图。
图 11B为重组菌株 SS016的异戊二烯生产产率结果图。
图 11C为重组菌株 ss005、 ss016和 ss017的生长曲线图。
图 12A为重组菌株 ss016、 ss019、 ss020、 ss021合成异戊二烯的累积产量图。 图 12B为重组菌株 ss016、 ss019、 ss020、 ss021的生长曲线图。
图 13为重组菌株 ss016、 ss022和 SS 023合成异戊二烯的累积产量图。 具体实施方式
以下通过具体实施例， 对本发明做进一步详细说明。应理解， 以下实施例仅用于 说明本发明而非用于限定本发明的范围。 本发明涉及异戊二烯合成途径在蓝藻中的构建 、优化及其应用。 具体而言， 通过 对蓝藻进行遗传改造， 在蓝藻中表达植物来源的异戊二烯合成酶 （IspS )， 并检测到 异戊二烯的生成； 通过比较杨树、蓝桉、 葛藤等不同来源的异戊二烯合成酶的编码基 因 ispS, 并对其序列进行密码子优化， 显著地提高了基因工程蓝藻的异戊二烯产量； 利用不同的启动子表达异戊二烯合成酶的编码 基因 ispS, 筛选到可以高效表达 ispS 基因的启动子 P ， 并可应用于在蓝藻中高效表达关键基因； 发现异戊二烯基焦磷 酸异构酶 （IDI ) 是蓝藻异戊二烯合成途径上的一个限速步骤， 通过比较不同来源的 异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因、并对其进 行过量表达，可以提高基因工程蓝藻的 异戊二烯产量； 通过构建表达 Idi-IspS融合蛋白， 发现可以显著提高基因工程蓝藻的 异戊二烯合成，研究了具有不同 Linker (连接肽）的融合蛋白对异戊二烯合成的影响 可应用于蓝藻合成各种萜类化合物的研究。 本发明中所用的菌株和生长条件如下：
克隆宿主大肠杆菌 DH5a和蛋白表达宿主大肠杆菌 BL21(DE3)购自 Novagen公 司。 所有的大肠杆菌在含有相应的抗性 LB培养基中， 37°C培养。
聚胞藻 Synechocystis sp. ) PCC6803由日本国立环境研究所微生物菌种保藏 心 (NIES Microbial Culture Collection) 提供。 聚胞藻 PCC6803在 BG11液体培养基中 培养。固体培养基在 BG11液体培养基中添加 1.5%的琼脂和 0.15%的硫代硫酸钠。发 酵培养基在 BG11液体培养基中添加 O. lmol/L的碳酸氢钠， 调节 pH至 7.5， 过滤除 菌。 培养条件： 30°C， 光强 2000~35001ux。 对于转化后的重组菌添加 20μ § /ιη1的相应 的抗生素；
其中，所述 BG11液体培养基的组成如下： NaNO 3 1.5g/L、MgS(V7H 2 O 0.075g/L、 CaCl 2 -2H 2 0 0.036g/L、 HEPES ( 20mM) 4.76g/L、 Stcok 1 lmL、 Stock 2 ( Trace metal mix A5 ) lmL、 Stock 3 lmL;
Stock 1： 柠檬酸 ·Η 2 0 6.567g/L、 柠檬酸铁铵 6g/L、 EDTANa-2H 2 0 1.107g/L ;
Stock 2： H 3 B0 3 2.86g/L、MnS0 4 -H 2 0 1.545g/L、ZnS0 4 -7H 2 0 0.222g/L CuSO 4 -5H 2 O 0.079g/L、 Na 2 Mo0 4 -2H 2 0 0.391g/L、 CoCl 2 -6H 2 0 0.0404g/L;
Stock 3： K 2 HP0 4 -3H 2 0 52g/L Na 2 CO 3 20g/L。 本发明中所用的质粒信息如下： 所有质粒均为 pBluescript KS+ (购自 Stratagene公司） 衍生质粒， 用于通过同 源重组整合到聚胞藻 PCC6803基因组中表达目的基因。 本发明中所用的引物信息如表 1所示。
表 1、 引物信息
编号 序列 （5'→3' ) SEQ ID
P5 gagagagagctcttagtcactccttttacttgccagggc NO: 1
P6 gagagatctagattgccctccgcagtgtggttaaaga NO: 2
P7 gagagactcgagactcactttttgcggggcattatt NO: 3
P8 gagagaggtaccgggaaatttataaataataccaccggac NO: 4
P9 gagagagagctccttgaaatttccaatgcccc NO: 5
P10 gagagatctagaaaaacgactgggagtacccg NO: 6
P11 gagagactcgagggtaatactgaagccctggg NO: 7
P12 gagagaggtacctagcatcgggcatgatcacc NO: 8
P13 agagcatatgcacatcagcgaactgaccc NO: 9
P14 agagggatccagagagcctaggatctccttcttaaagttaaacagattcctaactaactc caggagc NO: 10 gacaac
P15 agagcctaggatggatagcaccccccaccgtaagtc NO: 11
P16 agagggatccttaaggtttagttaacctttgtc NO: 12
P17 agagcctaggatgactgccgacaacaatagtatgc NO: 13
P18 agagggatccttatagcattctatgaatttgcc NO: 14
P19 agagcctagggtgactcgagcagaacgaaaaagac NO: 15
P20 agagggatccttatcgcacactatagcttgatg NO: 16
P21 agagcatatgactgccgacaacaatagtatgc NO: 17
P22 tagcattctatgaatttgcctgtc NO: 18
P23 gacaggcaaattcatagaatgctaggcggtggctccatgagatgttctgtaagcac NO: 19
P24 agagctgcagttatctctcaaagggtagaataggc NO: 20
P25 agagcatatgactgccgacaacaatagtatgc NO: 21
P26 gtgtatatctccttcttaaagttaaactctagattatagcattctatgaatttgcctgtc NO: 22
P27 tttaactttaagaaggagatatacacatgagatgttctgtaagcac NO: 23 P28 agagctgcagttatctctcaaagggtagaataggc NO: 24
P37 gagagaggatccgcgttccagtggatatttgc NO: 25
P38 gagagactgcaggtcgttgtcatatgttggttataattccttatgtatttg NO: 26
P39 gagagaggatccgttataaaataaacttaacaaatc NO: 27
P40 gagagactgcaggtcgttgtcatatgattaatctcctacttgactttatg NO: 28
P41 gagagaggatcctcaccatttggacaaaacatc NO: 29
P42 gagagactgcaggtcgttgtcatatgggtcagtcctccataaacattgaatagc NO: 30
P43 gagagaggatccaaccactatgctggcgaaac NO: 31
P44 gagagactgcaggtcgttgtcatatgtttgagtaaacgtcgtcacg NO: 32
P45 gagagaggatcccaacaagacaaaagtaatacaagc NO: 33
P46 gagagactgcaggtcgttgtcatatgacctcaaattgggaatttgtcc NO: 34
P47 agagggatcctggtcctgggtgatttgaatac NO: 35
P48 agagcatatgagttcaataaccatcatctc NO: 36
P49 gagagaggatccggttttcaccgtcatcaccgaaac NO: 37
P50 gagagacatatgggtttattcctccttatttaa NO: 38 本发明中聚胞藻 PCC6803转化和传代的方法如下：
野生型（WT)的聚胞藻 PCC6803在液体 BG11培养基中生长 2~3天， 细胞浓度 约为 6 X 10 7 细胞 /mL ( OD 73Q =0.6)， 离心收集细胞， 再用 BG11培养基重悬， 使细胞 密度到达 10 9 细胞 /mL。 每 ΙΟΟμΙ的细胞加入 1μ § 的质粒， 混匀， 暗培养 12h， 再光照 lh， 最后涂布到含有相应抗生素的 BG11固体平板上， 培养 5~6天， 即可看到单克隆 长出。 挑单克隆进行液体培养， 鉴定重组子。 将正确插入的重组菌在含有相应抗生 素的液体培养基中传代， 3~4代后即可得到完全插入基因组上相应位点的 重组菌。 本发明中检测异戊二烯的合成的方法如下：
将纯的重组菌接种到含有 lOOmL发酵培养基的 300mL的盐水瓶中封闭培养。 每 天从盐水瓶内培养基的上方气体中取 ΙΟΟμί的气体， 进行 GC检测。 GC7900购自上 海天美公司， 使用毛细管柱 （TM-PLOT Q:30m*0.53mm*4(^m) 和光离子化检测器 (PID) 。 GC条件： 进样口 150°C， 柱温 150°C， 检测器 150°C。 检测不同浓度梯度 的异戊二烯标准品（购自 Sigma公司）， 绘制标准曲线。 根据标准曲线， 计算出重组 菌合成异戊二烯的产量和产率。 绘制 Time-course曲线。 实施例 1、 整合聚胞藻基因组的表达载体的构建
1.1、 质粒 pKS2的构建
质粒 pKS2为插入在聚胞藻 PCC6803基因组中的 glgX (slr0237) 位点的同源重 组载体。 以聚胞藻 PCC6803基因组为模板， 引物对 P5与 P6扩增上游同源臂 glgX-up 序列 （glgXup), 引物对 P7与 P8扩增下游同源臂 psbA2-down序列 （glgXdn), 依次 装载入 pBluescriptKS+质粒上，再引入壮观霉素标记（Spe) ，同时引入聚胞藻 PCC6803 内源的编码/ ? A2的启动子 （P psbA2 ) 和大肠杆菌的 πτζβ终止子序列 （trrnB), 得到 表达目的基因的同源重组载体 pKS2 (SEQIDNO: 39)， 其质粒示意图如图 2所示。
1.2、 质粒 pKS3的构建
将 pKS2中编码 psbA2的启动子替换为编码 cpc操纵子的的启动子序列 （P cpc )， 则得到表达目的基因的同源重组载体 pKS3 (SEQIDNO: 40)， 其质粒示意图如图 3 所示。
1.3、 质粒 pKS4的构建
质粒 pKS4为插入在聚胞藻 PCC6803基因组中的 /?/^(3ΐι·1993-3ΐι·1994位点之间） 位点的同源重组载体。 以聚胞藻 PCC6803基因组基因组为模板， 引物对 Ρ9与 P10 扩增上游同源臂 phb-up序列 （phbup), 引物对 P11与 P12扩增下游同源臂 phb-down 序列 （phbdn), 依次装载入 pBluescriptKS+质粒上， 再引入氯霉素标记 （Cm)， 同时 引入聚胞藻 PCC6803内源的编码 /^¾42的启动子 （P psbA2 ) 和大肠杆菌的 终止 子序列 （trrnB), 得到表达目的基因的同源重组载体 pKS4 (SEQ IDNO: 41)， 其质 粒示意图如图 4所示。 实施例 2、 密码子优化和表达 N端不同长度的异戊二烯合成酶序列
来源于蓝桉 Eucalypt globulus)的异戊二烯合成酶编码基因 eh'¾?S，原始 DNA 序列来自 GenBank数据库 （GenBank: AB266390.1), 序列如 SEQIDNO: 42所示。 来源于杨树 Populus alba 的异戊二烯合成酶编码基因 ph S， 原始 DNA序列来自 GenBank数据库（GeneBank: AB198180),序列如 SEQIDNO: 43所示。来源于 alba x Populus tremula 的异戊二烯合成酶 p2ispS, 原始序列来自 GenBanK数据库 (GenBank: AJ294819.1), 序列如 SEQ ID NO: 44所示。 其中， el /?S、 plz'^S和 p2z S序列均不含有信号肽， 而 el fulllength (SEQIDNO: 45)和 p2 fulllength (SEQ ID NO: 46) 是含有信号肽的全长序列。 由南京金斯瑞公司合成上述 DNA序列。
通过使用 DNA2.0公司的 GeneDesigner软件， 根据聚胞藻 PCC6803的密码子偏 好性（其密码子使用表来自 KazusaCodon Usage Database), ί elispS, ph'¾?S分别进 行密码子优化， 优化后的序列分别命名为 el*z'¾?S (SEQIDNO: 47)、 pl*ispS (SEQ ID NO: 48)。 由 DNA2.0公司合成上述序列。
将来源于葛藤 PuemriamontanO 的异戊二烯合成酶编码基因 （GenBank: AY316691.1) 经密码子优化， 优化后的序列命名为 kl* /?S (SEQIDNO: 49) 。 由 南京金斯瑞公司合成上述 DNA序列。 在 pKS3质粒的 P cpc 启动子的下游的 Ndel和 Pstl酶切位点之间分别插入 elz'¾?S、 el fullength 5 , plispS, p2ispS, ρ2 fulllength ispS、 el*ispS^ pi* ispS^ kl* ispS, 形成质粒 pP cpc elz'5pS、 pP cpc el fulllength ispS^ pPcpc lispS, pP cpc p2z5pS pP cpc p2 fulllength ispS, pP cpc el*ispS, pPcp C pl*z'5pS、 pP cpc kl*^S 0 将上述质粒分别转化入聚胞藻 PCC6803中， 筛选阳性重组菌株， 如表 2所示。
表 2、 表达不同来源的^ ^的重组菌株
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量，图 5A比较了表达全长序 列 ispS和 N端删除信号肽的序列对异戊二烯产量影响， 其中， 重组菌 SS007的产量 是 ss006的 8倍， 重组菌 ss014的产量是 ss013的 3倍。 说明杨树来源和蓝桉来源的 异戊二烯合成酶 N端删除信号肽之后， 在蓝藻中进行表达， 合成异戊二烯的产量要 显著高于含有信号肽的全长序列。
图 5B、 5C和 5D比较了表达不同来源的异戊二烯合成酶和经 密码子优化的序 列对异戊二烯产量的影响， 发酵第 9天时， 表达 ellspS的重组菌累积产量为
398 g/L， 而表达 el*IspS的重组菌累积产量达到 1124 g/L， 最大产率为 227 g/L/d。 经过对来源于蓝桉的 z'^S基因的密码子优化， 使异戊二烯的产量提高了 3倍。
本实施例通过对聚胞藻 PCC6803进行遗传操作， 成功地在蓝藻中表达了 IspS， 检测到异戊二烯的生成， 通过比较表达全长和 N端删除信号肽的异戊二烯合成酶， 发现 N端删除信号肽的异戊二烯合成酶可以显著提 异戊二烯的产量， 并发现通过 对 ispS基因进行密码子优化， 可以显著提高蓝藻合成异戊二烯的产量。 实施例 3、 启动子筛选
以聚胞藻 PCC6803基因组为模板， 克隆以下启动子： 引物对 P37和 P38克隆 psbA的启动子 P psbA2 (SEQ ID NO: 50) 、 引物对 P41和 P42克隆 rbc operon启动子 Pr c ( SEQ ID NO: 51)、 引物对 P43和 P44克隆 groESL operon 启动子 Pgr。 ESL ( SEQ ID NO: 52) 、 引物对 P45和 P46克隆 Ni 2+ 诱导的启动子 P msB (SEQ ID NO: 53) 、 引物对 P47和 P48克隆 ftsQ operon启动子 P ftsQ (SEQ ID NO: 54) 。 以质粒 pTrcHis
(购自 Invitrogen公司 ) 为模板， 引物对 P49和 P50克隆启动子 P te (SEQ ID NO: 55) 。
将上述启动子分别用于替换实施例 2中的 pP epe kl *ispS质粒中的由引物对 P39和 P40扩增的 P epe 启动子 （SEQIDNO: 56) ， 得到使用不同启动子表达 kl* Z '^S的质 粒。 将上述质粒分别转化入聚胞藻 PCC6803中， 筛选阳性重组菌株， 如表 3所示。
表 3、 在不同的启动子条件下表达 kl ^S的重组菌株
ssl09 P ftsQ 编码细胞分裂蛋白的 ¾2操纵子的启动子 将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 6所示， 发酵 第 11天时， SS103使用 P epe 启动表达 kl*IspS时， 异戊二烯的累积产量高达
324μ § /ί, 是 SS101和 SS104累积产量的 12倍， 而其他启动子表达强度与 P psbA2 相 同， 或更弱。 说明在所有的启动子中， P cpc 可以高效地介 的表达。
本实施例通过启动子的挖掘， 筛选获得聚胞藻 PCC6803中高效表达目的基因的 启动子 Pope, 可应用于在蓝藻中表达关键基因， 为蓝藻合成生物提供重要的启动子元 件。 实施例 4、 限速酶筛选
蓝藻合成异戊二烯的 MEP途径如图 7所示， 其中包含编码脱氧木酮糖 -5-磷酸合成 酶的 s基因以及编码异戊二烯基焦磷酸异构酶的^¾ 因。
4.1、 构建过表达 ίΖο、 ΰ¾和 ΰ¾的重组菌株
以聚胞藻 PCC6803基因组为模板， 引物对 P13与 P14扩增聚胞藻 PCC6803内源 的 ito ss (SEQIDNO: 57)， 引物对 P15与 P16扩增聚胞藻 PCC6803内源的 SS (SEQ ID NO: 58) 。 将 iito ss 和 ^ 依次连接到载体 pKS4上， 得到质粒 p psbA2i fo s z¾ s 。 仅将 ΰ¾ 5 连接到载体 pKS4上， 得到质粒 p psbA2 ^¾ s 。
将质粒 1) 2 ^^和1¾ 2^ 分别转化 SS005 (AglgX: cpc plispS) ， 筛选阳 性重组菌株， 如表 4所示。
表 4、 过表达 iiCT、 zWz P zWz'的重组菌株
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 8所示， 发酵 第 10天， 同时过表达 5 和^¾ 5 两个基因的重组菌 SS234累积产量达到 2666 g/L， 是未表达上游 MEP途径的重组菌 SS005的 2.6倍， 而 SS234的产量与单独过表达 idi ss 的重组菌 SS230几乎相同。 以上结果说明 idi编码的异戊二烯基焦磷酸异构酶是蓝藻 合成异戊二烯的一个重要的限速酶。 4.2、 构建过表达不同来源的^¾的重组菌株
以实施例 3中所述启动子？ 替换质粒 pKS4中的启动子 P psbA2 ， 得到质粒 pKSTrc。 引物对 P13与 P14扩增聚胞藻 PCC6803内源的 ifo s (SEQIDNO: 57)， 装入载体 pKSTrc, 得到载体 P te iito ss 。
以聚胞藻 PCC6803基因组为模板， 引物对 P15与 P16扩增聚胞藻 PCC6803内源 的 z¾ (z¾ s ) (SEQIDNO: 58)。 以酿酒酵母（Sacc/zramyct^ cereWw'ae) S288C (来 源自 ATCC) 的基因组为模板， 弓 I物对 P17与 P18扩增酵母来源的 (SEQ ID NO: 59) 。 以枯草芽孢杆菌 (^Bacillus subtilis 168 (来源自 ATCC) 的基因组为 模板， 引物对 P19与 P20扩增芽孢杆菌来源的 (SEQIDNO: 60) 。 由南 京金斯瑞公司合成 Haematococc pluialis Flotow NIES-144 (来源自日本国立环境研 究所（National Institute for Environmental Studies, NIES) )来源的的 idi (idi HP ) (SEQ ID NO: 61)。 将上述 4种不同来源的 分别装入 P te ii^ ss ， 得到质粒 P te iiCT SS z¾ s 、
将上述质粒分别转化 SS103 (AglgX::V cpc k\*ispS) ， 筛选阳性重组菌株， 如表 5 所示。
表 5、 过表达不同来源的 ^¾的重组菌
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 9所示， 发酵 第 8天时， 与过表达蓝藻内源的 相比， 过表达酿酒酵母来源的 ^¾ 的重组菌 SS219的异戊二烯的累积产量最高， 而过表达其他来源的^¾的重组菌， 合成异戊二 烯的累积产量没有明显差别。 以上结果说明酿酒酵母来源的 idi在蓝藻中的表达活性 最高。
4.3、 构建过表达酿酒酵母来源的 ^¾ 重组菌株 以酿酒酵母的基因组为模板， 弓 I物对 P17与 P18扩增酵母来源的 idiUdi se SE ID NO: 59) ， 装入载体 pKS4， 得到载体 P psbA2 zV¾ c ， 转化 SS005
CAglgX::P cpc plispS) ， 得到重组菌 SS231。
以聚胞藻 PCC6803基因组为模板， 引物对 P13与 P14扩增聚胞藻 PCC6803内源 的 ifosss (SEQIDNO: 57) ， 以酿酒酵母的基因组为模板， 引物对 P17与 P18扩增 酵母来源的 Gi¾ c )(SEQ IDNO : 59)， 依次装入 pKS4， 得到载体 P psbA2 ifo s ^¾ c ， 转化 SS005 CAglgX::P cpc plispS) ， 得到重组菌 SS236。
以上重组菌株信息如表 6所示。
表 6、 过表达酿酒酵母来源的 Z ¾ C 的重组菌株
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 10所示， 发酵 第 10天时， 和对照组 SS005相比， SS231和 SS236的产量相似， 都达到 3263 g/L， 是 SS005的 3.3倍。 以上结果进一步说明了 编码的异戊二烯基焦磷酸异构酶是蓝 藻合成异戊二烯的一个重要的限速酶。 综上所述， 本实施例研究了蓝藻 MEP途径， 发现^编码的异戊二烯基焦磷酸异 构酶是蓝藻合成异戊二烯的一个重要的限速酶 ， 并通过过表达不同来源的 ΰ¾， 发掘 出在蓝藻中表达活性最好的^¾是来自酿酒酵母 ， 为提高蓝藻 ΜΕΡ途径的代谢流量提 供实验依据， 可应用于提高蓝藻中合成其他重要萜类化合物 的产量。 实施例 5、 在聚胞藻 PCC6803中表达 i与 IspS的融合蛋白
5.1、 构建表达 Idi sc 与 plIspS的融合蛋白
以酿酒酵母的基因组为模板， 弓 I物对 P21与 P22扩增 sc 基因。 以质粒 pPcpcplz^S为模板， 弓 I物对 P23与 P24扩增 ρ1φ5基因。 以上述两个纯化的 PCR产 物的混合物为模板， 弓 I物对 P21与 Ρ24扩增得到 -GGGS-pl^S融合 PCR片段
(GGGS为 Idi蛋白和 IspS蛋白之间的连接肽序列， 是短的柔性 linker), 装入 pKS2， 得到质粒 pPcpc -GGGS-ph'¾?S， 转化聚胞藻 PCC6803, 得到重组菌 SS016。 改变 Idi和 IspS的连接顺序， 可得到 pl^S-GGGS- 的融合 PCR片段， 装入 pKS2, 得到质粒 pP cpc plz S-GGGS-zV¾， 转化聚胞藻 PCC6803 , 得到重组菌 SS017。
以酿酒酵母的基因组为模板， 引物对 P25与 P26扩增 基因。 以质粒 pP C p C plz /?S为模板， 引物对 P27与 P28扩增 ph'¾?S基因， 将 idi sc 、 plispS依次装入 pKS2, 得到质粒 pP cpc z ¾ c plz S (非融合蛋白， idi、 ph'¾?S有各自的 rbs序列） ， 转 化聚胞藻 PCC6803 , 得到重组菌 SS018。
以上重组菌株信息如表 7所示。
表 7、 在聚胞藻 PCC6803表达 Idi-IspS融合蛋白的重组菌株
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 1 1A、 1 1B和 1 1C所示， 发酵第 9天时， 表达 Idi-plIspS融合蛋白的重组菌 SS016累计产量高达 6.01mg/L, 并且从第 3天到第 6天， SS016合成异戊二烯的产率达到
1.2mg/L~1.4mg/L。 但是表达 pllspS-Idi融合蛋白的重组菌 SS017的产量只达到
2.0mg/L, 说明 Idi在融合蛋白的 N端效果更好。 证实在蓝藻中表达 Idi-plIspS的融合 蛋白的重组菌可以有效的提高异戊二烯的产量 ， 而且融合蛋白的顺序很关键。
5.2、 构建不同的 Linker (连接肽的氨基酸序列） 表达 Idi sc 与 plIspS的融合蛋 白
改变 Idi sc -plIspS的连接序列， 选用以下连接肽连接融合蛋白： Linkerl :
GSGGGGS (长的柔性 linker)； Linker2: GSGEAAAK (短的刚性 linker)； Linker3 : GSG(EAAAK) 2 (长的刚性 Linker)。 将上述不同连接肽连接的 Idi sc -plIspS融合蛋白 连接到 pKS2， 得到的载体分别转化聚胞藻 PCC6803 , 得到重组菌 SS019、 SS020、 SS021 , 如表 8所示。
表 8、 在聚胞藻 PCC6803中表达不同连接肽连接的 Idi-IspS融合蛋白的重组菌株 ss019 AglgX:： P C p C z z-GSGGGGS-p 1 ispS
ss020 AglgX:： P C p C z z-GSGEAAAK-p 1 ispS ss021 AglgX:： P cpc z z-GSG(EAAAK) 2 -p 1 ispS 将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 12A和 12B所 示， 发酵第 12天时， SS016、 SS019、 SS020、 SS021产量几乎相同， 说明 Linker的 长度和柔性对 Idisc-plIspS融合蛋白的表达和合成异戊二烯的产 量几乎没有影响。
5.3、 构建表达 Idi sc 与 p2IspS或 ellspS的融合蛋白
以同样的方式构建 Idi sc 与 p2IspS的融合 PCR片段， 和 Idi sc 与 ellspS的融合 PCR 片段， Linker序列为： GGGS。 连接到 pKS2， 得到的载体分别转化聚胞藻
PCC6803 , 得到重组菌 SS022、 SS023 , 如表 9所示。
表 9、 在聚胞藻 PCC6803中表达 Idi-p2IspS以及 Idi-ellspS融合蛋白的重组菌株
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二 烯产量， 结果如图 13所示， 表达 不同来源的 IspS的融合蛋白同样可以有效的提高异戊二烯 产量， 说明 Idi-IspS构建 的融合蛋白适用于不同物种来源的 IspS , 具有普遍意义。 综上所述， 本实施例发现在蓝藻中表达 Idi-plIspS的融合蛋白的重组菌可以有效 的提高异戊二烯的产量， 融合蛋白的顺序很关键， 但连接肽序列对产量没有明显影 响， 而且融合蛋白具有通用性， 适用于不同来源的异戊二烯合成酶。
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