Carotinoide werden de novo in Bakterien, Algen, Pilzen und Pflan- zen synthetisiert. Ketocarotinoide, also Carotinoide, die minde- stens eine Keto-Gruppe enthalten, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechi- nenon, Adonirubin oder Adonixanthin sind natürliche Antioxi- dantien und Pigmente, die von einigen Algen und Mikroorganismen als Sekundärmetabolite produziert werden.

Aufgrund ihrer farbgebenden Eigenschaften werden die Ketocaroti- noide und insbesondere Astaxanthin als Pigmentierhilfsstoffe in der Tierernährung, insbesondere in der Forellen-, Lachs-und Shrimpszucht verwendet.

Die Herstellung von Astaxanthin erfolgt heutzutage größtenteils durch chemische Syntheseverfahren. Natürliche Ketocarotinoide, wie beispielsweise natürliches Astaxanthin, werden heutzutage in biotechnologischen Verfahren in kleinen Mengen durch Kultivierung von Algen, beispielsweise Haematococcus pluvialis, oder durch Fermentation von gentechnologisch optimierten Mikroorganismen und anschließender Isolierung gewonnen.

Ein wirtschaftliches biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von natürlichen Ketocarotinoiden ist daher von großer Bedeutung.

WO 98/18910 beschreibt die Synthese von Ketocarotinoiden in Nek- tarien von Tabakblüten durch Einbringen eines Ketolase-Gens in Tabak.

WO 01/20011 beschreibt ein DNA Konstrukt zur Produktion von Keto- carotinoiden, insbesondere Astaxanthin, in Samen von Ölsaatpflan- zen wie Raps, Sonnenblume, Sojabohne und Senf unter Verwendung eines Samen-spezifischen Promotors und einer Ketolase aus Haema- tococcus.

Die im Stand der Technik offenbarten Verfahren liefern zwar gene- tisch veränderte Pflanzen, die in spezifischen Geweben einen Gehalt an Ketocarotinoiden aufweisen, weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Höhe des Gehalts an Ketocarotinoiden und die Rein- heit, insbesondere an Astaxanthin, noch nicht zufriedenstellend ist.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden durch Kultivierung von Pflanzen zur Verfügung zu stellen, bzw. weitere transgene Pflanzen, die Ketocarotinoide herstellen, zur Verfügung zu stel- len, die optimierte Eigenschaften, wie beispielsweise einen höhe- ren Gehalt an Ketocarotinoiden, aufweisen und den geschilderten Nachteil des Standes der Technik nicht aufweisen.

Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden gefunden, indem man genetisch veränderte Pflanzen kultiviert, die in Früchten eine Ketolase-Aktivität aufweisen.

Unter Ketolase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Ketolase verstanden.

Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzyma- tische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-Ionon-Ring von Carotinoiden eine Keto-Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Cantha- xanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Ketolase-Aktivität die in einer be- stimmten Zeit durch das Protein Ketolase umgesetzte Menge ß-Caro- tin bzw. gebildete Menge Canthaxanthin verstanden.

Um in den Früchten der genetisch veränderten Pflanzen eine Keto- laseaktivität aufzuweisen, werden in einer bevorzugten Aus- führungsform genetisch veränderte Pflanzen verwendet, die in- Früchten eine Ketolase exprimieren.

Vorzugsweise werden daher im erfindungsgemäßen Verfahren gene- tisch veränderte Pflanzen verwendet, die in Früchten mindestens eine Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, enthalten.

Es sind keine Pflanzen bekannt, die als Wildtyp in Früchten eine Ketolase-Aktivität aufweisen. Insbesondere weisen die nachstehend beschriebenen, bevorzugten Pflanzen in Früchten als Wildtyp keine Ketolase-Aktivität auf.

In der vorliegenden Erfindung wird die Ketolase-Aktivität in Früchten der genetisch veränderten Pflanzen durch die genetische Veränderung der Ausgangspflanze verursacht. Die erfindungs- gemäße genetisch veränderte Pflanze weist somit, im Vergleich zur genetisch nicht veränderten Ausgangspflanze eine Ketolase- Aktivität in Früchten auf und ist somit vorzugsweise in der Lage, in Früchten eine Ketolase zu exprimieren.

Unter dem Begriff"Ausgangspflanze"oder"Wildtyp"wird die ent- sprechende nicht genetisch veränderte Ausgangspflanze verstanden.

Unter dem Begriff"genetisch veränderte Pflanze"wird vorzugs- weise eine im Vergleich zur Ausgangspflanze genetisch veränderte Pflanze verstanden.

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff"Pflanze"die Aus- gangspflanze (Wildtyp) oder eine erfindungsgemäße, genetisch ver- änderte Pflanze oder beides verstanden werden. zut Die Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, in den Früchten der Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Einbringen von Nukleinsäuren, die Ketolasen kodieren, in die Ausgangspflanze.

Die Erfindung betrifft daher insbesondere das vorstehend be- schriebene Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass man genetisch veränderte Pflanzen verwendet, in die man ausgehend von einer Ausgangspflanze, mindestens eine Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, eingebracht hat.

Dazu kann prinzipiell jedes Ketolase-Gen, also jede Nukleinsäure die eine Ketolase kodiert, verwendet werden.

Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA-oder cDNA-Sequenz sein.

Bei genomischen Ketolase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, dass die Wirtspflanze nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Ketolase zu exprimieren, bevorzugt be- reits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs, zu verwenden.

Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, und die entsprechenden Ketolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in den nachstehend beschriebenen erfindungsgemäßen genetisch ver- änderten Pflanzen verwendet werden können, sind beispielsweise Sequenzen aus Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession No. X86782 ; Nukleinsäure : SEQ ID No. 1, Protein SEQ ID No. 2), Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession No. D45881 ; Nuklein- säure : SEQ ID No. 3, Protein SEQ ID No. 4), Agrobacterium aurantiacum (Accession No. D58420 ; Nukleinsäure : SEQ. ID. No. 5, Protein SEQ ID No. 6), Alicaligenes spec. (Accession No. D58422 ; Nukleinsäure : SEQ ID No. 7, Protein SEQ ID No. 8), Paracoccus marcusii (Accession No. Y15112 ; Nukleinsäure : SEQ ID No. 9, Protein SEQ ID No. 10).

Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession No. S76617, NP442491; Nukleinsäure : SEQ ID No. 11, Protein SEQ ID No. 12).

Bradyrhizobium sp. (Accession No. AF218415, BAB 74888 ; Nuklein- säure : SEQ ID No. 13, Protein SEQ ID No. 14).

Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession No. AP003592 ; Nukleinsäure : SEQ ID No. 15, Protein SEQ ID No. 16).

Haematococcus pluvialis (Accession NO : AF534876, AAN03484 ; Nuk- leinsäure : SEQ ID NO : 37, Protein : SEQ ID NO : 38) Paracoccus sp. MBIC1143 (Accession NO : D58420, P54972 ; Nuk- leinsäure : SEQ ID NO : 39, Protein : SEQ ID NO : 40) Brevundimonas aurantiaca (Accession NO : AY166610, AAN86030 ; Nuk- leinsäure : SEQ ID NO : 41, Protein : SEQ ID NO : 42) Nodularia spumigena NSOR10 (Accession NO : AY210783, AA064399 ; Nu- kleinsäure : SEQ ID NO : 43, Protein : SEQ ID NO : 44) Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Accession NO : NZAABC01000195, ZP_00111258 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 45, Protein : SEQ ID NO : 46)

Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Accession NO : NZAABC01000196 ; Nu- kleinsäure : SEQ ID NO : 47, Protein : SEQ ID NO : 48) Deinococcus radiodurans Rl (Accession NO : E75561, AE001872 ; Nu- kleinsäure : SEQ ID NO : 49, Protein : SEQ ID NO : 50) Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomi- sche Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Amino- säuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nuklein- säuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen und insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO. 2 und/ oder SEQ ID NO. 16 leicht auffinden.

Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene las- sen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID. No 1 und/oder SEQ ID NO. 15 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisie- rungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vorzugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.

Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sam- brook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in : Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Mole- cular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6 be- schrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von sol- chen mit geringer Stringenz (mit 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit 0.2X SSC bei 50°C, bevorzugt bei 65°C) (20X SSC : 0,3 M Natriumcitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0).

Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22°C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65°C angehoben werden.

Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleich- zeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter kon- stant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Bei-

spiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.

Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Wasch- schritt sind infolge gegeben : (1) Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel (i) 4X SSC bei 65°C ; oder (ii) 6X SSC bei 45°C, oder (iii) 6X SSC bei 68°C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma- DNA, oder (iv) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmen- tierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder (v) 6XSSC, 0,5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C, oder (vi) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, oder (vii) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natrium- phosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, oder (viii) 2X oder 4X SSC bei 50°C (moderate Bedingungen), oder (ix) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42° (moderate Bedingungen).

(2) Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel (i) 0,015 M NaC1/0, 0015 M Natriumcitrat/0, 1 % SDS bei 50°C, oder (ii) 0, 1X SSC bei 65°C, oder (iii) 0,1X SSC, 0.5 % SDS bei 68°C, oder (iv) 0,1X SSC, 0.5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder (v) 0,2X SSC, 0.1 % SDS bei 42°C, oder

(vi) 2X SSC bei 65°C (moderate Bedingungen).

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Ver- fahrens bringt man Nukleinsäuren ein, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von die- ser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Ami- nosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevor- zugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase auf- weist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die wie vorstehend beschrieben durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO. 2 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungs- gemäßen Verfahren bringt man man Nukleinsäuren ein, die ein Pro- tein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 16 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter minde- stens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 16 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die wie vorstehend beschrieben durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO. 16 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

Unter dem Begriff"Substitution"ist in der Beschreibung der Aus- tausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Aus- tausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähn- liche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure,

beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid- kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM.

Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcompu- ter. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr ; 5 (2) : 151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : / Multiple alignment parameter : Gap penalty 10 Gap length penalty 10 Pairwise alignment parameter : K-tuple 1 Gap penalty 3 Window 5 Diagonals saved 5 Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 oder 16 auf- weist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 oder 16, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parame- tersatz eine Identität von mindestens 20 % aufweist.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück- übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code er- hältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Kodons verwendet, die entsprechend der pflanzespezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO. 1, in den Pflanze ein.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO. 15, in den Pflanze ein.

Alle vorstehend erwähnten Ketolase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbau- steinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppel- helix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit- methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungs- verfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

In einer besonderes bevorzugten Ausführungsform der erfindungs- gemäßen Verfahrens verwendet man genetisch veränderte Pflanzen, die in Früchten die höchste Expressionsrate einer Ketolase auf- weisen.

Vorzugsweise wird dies dadurch erreicht, dass die Genexpression der Ketolase unter Kontrolle eines fruchtspezifischen Promotors erfolgt. Beispielsweise werden dazu die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, wie nachstehend ausführlich beschrieben, in einem Nukleinsäurekonstrukt, funktionell verknüpft mit einem frucht- spezifischen Promotor, in die Pflanze eingebracht.

Unter Pflanzen werden erfindungsgemäß vorzugsweise Pflanzen verstanden, die als Wildtyp in Früchten Chromoplasten aufweisen.

Weiter bevorzugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Früchten zu- sätzlich Carotinoide, insbesondere-Carotin, Zeaxanthin, Neo- xanthin, Violaxanthin oder Lutein auf.

Weiter bevorzugte Pflanzen weisen als Wildtyp in den Früchten zu- sätzlich eine Hydroxylase-Aktivität auf.

Unter Hydroxylase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Hydro- xylase verstanden.

Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituier- ten, ß-Ionon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzu- führen.

Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Canthaxanthin in Astaxanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Hydroxylase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin oder Canthaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstanden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Hydroxylase-Ak- tivität und/oder ß-Cyclase-Aktivität aufweisen.

Unter Hydroxylase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Hydro- xylase verstanden.

Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die en- zymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-Ionon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Cantaxanthin in Astaxanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Hydroxyase-Aktivität die in einer be- stimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Ca- rotin oder Cantaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstanden.

Bei einer erhöhten Hydroxylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase die umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxantin bzw. die gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevor- zugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevor- zugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, ins- besondere mindestens 600 % der Hydroxylase-Aktivität des Wild- typs.

Unter ß-Cyclase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer ß-Cyclase verstanden.

Unter einer ß-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzyma- tische Aktivität aufweist, einen endständigen, linearen Rest von Lycopin in einen ß-Ionon-Ring zu überführen.

Insbesondere wird unter einer ß-Cyclase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, y-Carotin in ß-Carotin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter ß-Cyclase-Aktivität die in einer be- stimmten Zeit durch das Protein ß-Cyclase umgesetzte Menge 7-Caro- tin bzw. gebildete Menge ß-Carotin verstanden.

Bei einer erhöhten ß-Cyclase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein ß-Cyclase die umgesetzte Menge 7-Carotin bzw. die ge- bildete Menge ß-Carotin erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der ß-Cyclase-Aktivität minde- stens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der ß-Cyclase-Aktivität des Wildtyps.

Unter dem Begriff"Wildtyp"wird erfindungsgemäß die entspre- chende nicht genetisch veränderte Ausgangspflanze verstanden.

Vorzugsweise und insbesondere in Fällen, in denen die Pflanze oder der Wildtyp nicht eindeutig zugeordnet werden kann, wird un- ter"Wildtyp"für die Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität, für die Erhöhung der ß-Cyclase-Aktivität und für die Erhöhung des Gehalts an Ketocarotinoiden jeweils eine Referenzpflanze verstanden.

Diese Referenzpflanze ist vorzugsweise Lycopersicon esculentum.

Die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität in erfindungsgemäßen ge- netisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp-bzw. Referenzpflan- zen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die Aktivität der Hydroxylase wird nach Bouvier et al. (Biochim.

Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) in vitro bestimmt. Es wird zu einer bestimmten Menge an Pflanzenextrakt Ferredoxin, Ferredoxin- NADP Oxidoreductase, Katalase, NADPH sowie beta-Carotin mit Mono- und Digalaktosylglyzeriden zugegeben.

Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Akti- vität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, Keller, d'Harlin- gue und Camara (Xanthophyll biosynthesis : molecular and functio- nal characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L. ; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0.250 ml Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), 0.025 mg Ferredoxin von Spinat, 0.5 Einheiten Ferredoxin-NADP+ Oxidoreduktase von Spinat, 0.25 mM NADPH, 0.010 mg beta-Carotin (in 0.1 mg Tween 80 emulgiert), 0.05 mM einer Mischung von Mono- und Digalaktosylglyzeriden (1 : 1), 1 Einheit Katalyse, 200 Mono- und Digalaktosylglyzeriden, (1 : 1), 0.2 mg Rinderserumalbumin und Pflanzenextrakt in unterschiedlichem Volumen. Die Reaktionsmi- schung wird 2 Stunden bei 30C inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden mit organischem Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform/ Methanol (2 : 1) extrahiert und mittels HPLC bestimmt.

Die Bestimmung der ß-Cyclase-Aktivität in erfindungsgemäßen gene- tisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp-bzw. Referenzpflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die Aktivität der ß-Cyclase wird nach Fraser und Sandmann (Bio- chem. Biophys. Res. Comm. 185 (1) (1992) 9-15) in vitro bestimmt.

Es werden zu einer bestimmten Menge an Pflanzenextrakt Kalium- phosphat als Puffer (ph 7.6), Lycopin als Substrat, Stromaprotein von Paprika, NADP+, NADPH und ATP zugegeben.

Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Akti- vität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition ; Arch.

Biochem. Biophys. 346 (1) (1997) 53-64) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 250 « 1 Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7.6), unterschiedliche Mengen an Pflanzenextrakt, 20 nM Lyco- pin, 250 cog an chromoplastidärem Stromaprotein aus Paprika, 0.2 mM NADP+, 0.2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 10 ml Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/Methanol (2 : 1) beendet. Die in Chloroform extrahierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.

Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fraser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185 (1) (1992) 9-15).

Die Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität und/oder ß-Cyclase-Aktivi- tät kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression von Nu- kleinsäuren kodierend eine Hydroxylase und/oder von Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase gegenüber dem Wildtyp.

Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase und/oder die Erhöhung der Genexpression der Nuklein- säure kodierend eine ß-Cyclase gegenüber dem Wildtyp kann eben- falls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch In- duzierung des Hydroxylase-Gens und/oder ß-Cyclase-Gens durch Akti- vatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Hydroxy- lase-Genkopien und/oder ß-Cyclase-Genkopien, also durch Einbringen mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/oder mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine E-Cyclase in die Pflanze.

Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Hydroxylase und/oder ß-Cyclase wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Pflanzen eigenen, endogenen Hy- droxylase und/oder ß-Cyclase verstanden.

Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor DNA-Se- quenz für Hydroxylasen und/oder ß-Cyclasen kodierende Gene er- reicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expres- sionsrate des Gens zur Folge hat, kann beispielsweise durch Dele- tion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.

Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen Hydroxylase und/oder ß-Cyclase durch die Applikation ex- ogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere physiolo- gische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstan- zen erfolgen.

Des weiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression eines endogenen Hydroxylase-und/oder ß-Cyclase-Gens dadurch erzielt werden, dass ein in der nicht transformierten Pflanze nicht vor- kommendes Regulator-Protein mit dem Promotor dieses Gens in Wech- selwirkung tritt.

Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Do- mäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Ge- nexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/ oder die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine ß-Cyclase durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase und/oder durch Einbringen von minde- stens einer Nukleinsäure kodierend eine ß-Cyclase in die Pflanze.

Dazu kann prinzipiell jedes Hydroxylase-Gen bzw. jedes ß-Cyclase- Gen, also jede Nukleinsäure, die eine Hydroxylase und jede Nu- kleinsäure, die eine ß-Cyclase codiert, verwendet werden.

Bei genomischen Hydroxylase-bzw. ß-Cyclase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das die Wirtspflanze nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechende Hydroxylase bzw.

ß-Cyclase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nuklein- säuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Hydroxylase-Gene sind Nukleinsäuren, t kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis, Accession AX038729, WO 0061764) ; (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 51, Protein : SEQ ID NO : 52), sowie Hydroxylasegene der folgenden Accession Nummern : |emb|CAB55626. 1, CAA70427.1, CAA70888.1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443.1, Nu-194300. 1, NP_200070. 1, AAG10430.1, CAC06712.1, AAM88619.1, CAC95130.1, AAL80006.1, AF162276_1, AA053295. 1, AAN85601.1, CRTZERWHE, CRTZPANAN, BAB79605.1, CRTZALCSP, CRTZAGRAU, CAB56060.1, ZP_00094836. 1, AAC44852.1, BAC77670.1, Nu-745389. 1, NP_344225. 1, NP_849490. 1, ZP_00087019. 1, NP_503072. 1, NP_852012. 1, NP_11592. 1, ZP00013255. 1 Eine besonders bevorzugte Hydroxylase ist weiterhin die Hydroxy- lase aus Tomate) (Nukleinsäure : SEQ. ID. No. 55 ; Protein : SEQ.

ID. No. 56)

Beispiele für b-Cyclase-Gene sind Nukleinsäuren, codierend eine b-Cyclase aus Tomate (Accession X86452). (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 53, Protein : SEQ ID NO : 54), sowie b-Cyclase-Gene der folgenden Accession Nummern : S66350 lycopene beta-cyclase (EC 5.5. 1. -)-tomato CAA60119 lycopene synthase [Capsicum annuum] S66349 lycopene beta-cyclase (EC 5.5. 1. -) -common tobacco CAA57386 lycopene cyclase [Nicotiana tabacum] AAM21152 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] AAD38049 lycopene cyclase [Citrus x paradisi] AAN86060 lycopene cyclase [Citrus unshiu] AAF44700 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] AAG10429 beta cyclase [Tagetes erecta] AAA81880 lycopene cyclase AAB53337 Lycopene beta cyclase AAL92175 beta-lycopene cyclase [Sandersonia aurantiaca] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAM45381 beta cyclase [Tagetes erecta] AA018661 lycopene beta-cyclase [Zea mays] AAG21133 chromoplast-specific lycopene beta-cyclase [Lycopersicon esculentum] AAF18989 lycopene beta-cyclase [Daucus carota] ZP_001140 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str.

MIT9313] ZP_001050 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378] ZP_001046 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378] ZP_001134 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str.

MIT9313] ZP_001150 hypothetical protein [Synechococcus sp. WH 8102] AAF10377 lycopene cyclase [Deinococcus radiodurans] BAA29250 393aa long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] AAL01999 lycopene cyclase [Xanthobacter sp. Py2] ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] ZP_000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans] AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. ORS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] CAA64855 lycopene cyclase [Streptomyces griseus] AAA21262 dycopene cyclase [Pantoea agglomerans] C37802 crtY protein-Erwinia uredovora BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae]

AAA64980 lycopene cyclase [Pantoea agglomerans] AAC44851 lycopene cyclase BAA09593 Lycopene cyclase [Paracoccus sp. MBIC1143] ZP_000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans] CAB56061 lycopene beta-cyclase [Paracoccus marcusii] BAA20275 lycopene cyclase [Erythrobacter longus] ZP_000570 hypothetical protein [Thermobifida fusca] ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAB53337 Lycopene beta cyclase BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] Eine besonders bevorzugte ß-Cyclase ist weiterhin die chromopla- stenspezifische b-Cyclase aus Tomate (AAG21133) (Nukleinsäure : SEQ. ID. No. 57 ; Protein : SEQ. ID. No. 58) In den erfindungsgemäßen bevorzugten transgenen Pflanzen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Hydroxylase-Gen und/oder ß-Cyclase-Gen vor.

In dieser bevorzugten Ausführungsform weist die genetisch verän- derte Pflanze beispielsweise mindestens eine exogene Nuklein- säure, kodierend eine Hydroxylase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine Hydroxylase und/oder mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine ß-Cyclase oder minde- stens zwei endogene Nukleinsäuren, kodierend eine ß-Cyclase auf.

Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Hydroxylase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 52 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Dele- tion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugte- sten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID.

NO : 52, und die die enzymatische Eigenschaft einer Hydroxylase aufweisen.

Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene las- sen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren geno- mische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Ho- mologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden

rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO : 52 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 51 aus verschiedenen Organismen deren genomische Se- quenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybri- disierungs-und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäurese- quenz der Hydroxylase der Sequenz SEQ ID NO : 52.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück- übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code er- hältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO : 51 in den Orga- nismus ein.

Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als ß-Cyclase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine ko- dieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 54 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von min- destens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter minde- stens 70 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, am bevorzugtesten mindestens 95 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 54, und die die enzymatische Eigenschaft einer ß-Cyclase auf- weisen.

Weitere Beispiele für ß-Cyclasen und ß-Cyclase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Se- quenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben durch Homologiever- gleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rücküber- setzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID NO : 54 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für ß-Cyclasen und ß-Cyclase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 53 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht be- kannt ist, durch Hybridisierungs-und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der ß-Cyclase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen ein- gebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der ß-Cyclase der Sequenz SEQ. ID. NO : 54.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück- übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code er- hältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO : 53 in den Orga- nismus ein.

Alle vorstehend erwähnten Hydroxylase-Gene oder ß-Cyclase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Syn- these aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Frag- mentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nuklein- säurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Syn- these von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wi- ley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung syn- thetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen so- wie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al.

(1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Har- bor Laboratory Press, beschrieben.

Besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, ausgewählt aus den Pflanzengattungen Actinophloeus, Aglaeonema, Ananas, Arbutus, Archontophoenix, Area, Aronia, Asparagus, Attalea, Berberis, Bixia, Brachychilum, Bryonia, Caliptocalix, Capsicum, Carica, Celastrus, Citrullus, Citrus, Convallaria, Cotoneaster, Crataegus, Cucumis, Cucurbita, Cuscuta, Cycas, Cyphomandra, Dioscorea, Diospyrus, Dura, Elaeagnus, Elaeis, Erythroxylon, Euonymus, Ficus, Fortunella, Fragaria, Gardinia, Gonocaryum, Gossypium, Guava, Guilielma, Hibiscus, Hippophaea, Iris, Lathy-

rus, Lonicera, Luffa, Lycium, Lycopersicum, Malpighia, Mangifera, Mormodica, Murraya, Musa, Nenga, Palisota, Pandanus, Passiflora, Persea, Physalis, Prunus, Ptychandra, Punica, Pyracantha, Pyrus, Ribes, Rosa, Rubus, Sabal, Sambucus, Seaforita, Shepherdia, Sola- num, Sorbus, Synaspadix, Tabernae, Tamus, Taxus, Trichosanthes, Triphasia, Vaccinium, Viburnum, Vignia oder Vitis.

Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in erfindungsgemäßen gene- tisch veränderten Pflanzen erfolgt in Anlehnung an die Methode von Frazer et al., (J. Biol. Chem. 272 (10) : 6128-6135,1997). Die Ketolase-Aktivität in pflanzlichen Extrakten wird mit den Sub- straten beta-Carotin und Canthaxanthin in Gegenwart von Lipid (Sojalecithin) und Detergens (Natriumcholat) bestimmt. Substrat/ Produkt-Verhältnisse aus den Ketolase-Assays werden mittels HPLC ermittelt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoi- den wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch ver- änderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeich- net, ein Ernten der Pflanzen und ein Isolieren von Ketocarotinoi- den aus den Früchten der Pflanzen angeschlossen.

Die transgenen Pflanzen werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.

Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den geernteten Früchten erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Trock- nung und anschließender Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemischer oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispiels- weise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennver- fahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische Trennver- fahren, wie beispielsweise Chromatographie. Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den Früchten erfolgt beispielsweise bevor- zugt durch organische Lösungsmittel wie Aceton, Hexan, Ether oder tert.-Methylbutylether.

Weitere Isolierverfahren von Ketocarotinoiden sind beispielsweise in Egger und Kleinig (Phytochemistry (1967) 6,437-440) und Egger (Phytochemistry (1965) 4,609-618) beschrieben.

Vorzugsweise sind die Ketocarotinoide ausgewählt aus der Gruppe Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin.

Ein besonders bevorzugtes Ketocarotinoid ist Astaxanthin.

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Transformation der Ausgangspflanzen, mit einem Nuklein- säurekonstrukt, das mindestens eine, vorzugsweise auch mehrere der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren enthält, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.

Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierende Nuklein- säuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktio- nell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten, werden im folgenden auch Expressions- kassetten genannt.

Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren, die die Transkription und Translation in Pflanzen ge- währleisten.

Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevor- zugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromauf- wärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anord- nung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. wei- terer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekon- strukte, Expressionskassetten und Vektoren für Pflanzen und Ver- fahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die trans- genen Pflanzen selbst beschrieben.

Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährlei- stung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vaku- ole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retiku- lum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimen- ten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann.

"Konstitutiver"Promotor meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten.

Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt.

Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21 : 285-294 ; Odell et al. (1985) Nature 313 : 810-812 ; Shewmaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288 ; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6 : 221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352, 605 ; WO 84/02913 ; Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202).

Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der pds Promo- ter (Pecker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 : 4962-4966) oder der"Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962, 028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X0f677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Dop- pelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacter- ium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29 : 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al.

(1992) Plant Mol Biol 18 : 675-689 ; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 : 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalko- holdehydrogenase-Promotor (US 5,683, 439), die Promotoren der va- kuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinrei- chen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), der Pnit-Promoter (Y07648. L, Hillebrand et al. (1998), Plant. Mol. Biol. 36,89-99, Hillebrand et al. (1996), Gene, 170,197-200, der Ferredoxin- NADPH-Oxidoreductase Promotor (Datenbankeintrag AB011474, Posi- tion 70127 bis 69493), der TPT-Promoter (WO 03006660), der"Su- perpromotor" (US-Patent 5955646), der 34S-Promotor (US-Patent 6051753) sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.

Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel : Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 : 89-108), durch den die Ex- pression des Ketolase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186),

ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2 : 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol-oder Cyclohexa- non-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.

Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abio- tischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen- induzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70-oder hsp80-Promo- ter aus Tomate (US 5,187, 267), der kälteinduzierbare alpha-Amy- lase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-indu- zierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Pro- moter (EP375091).

Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispiels- weise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, b-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89 : 245-254 ; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell4 : 645-656 ; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4 : 111-116 ; Mari- neau et al. (1987) Plant Mol Biol 9 : 335-342 ; Matton et al.'(1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2 : 325-342 ; Somssich et al.

(1986) Proc Natl Acad Sci USA 83 : 2427-2430 ; Somssich et al.

(1988) Mol Gen Genetics 2 : 93-98 ; Chen et al. (1996) Plant J 10 : 955-966 ; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 : 2507-2511 ; Warner, et al. (1993) Plant J 3 : 191-201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 : 961-968 (1989).

Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28 : 425-449 ; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14 : 494-498), des wunl und wun2-Gens (US 5,428, 148), des winl-und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215 : 200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225 : 1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 783-792 ; Ekelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323 : 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 (2) : 141-150) und dergleichen.

Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifung- spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spe- zifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Entwick- lungsabhängige Promotoren schließen zum Teil die gewebespezi- fischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe natur- gemäß entwicklungsabhängig erfolgt.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Ketocarotinoiden bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Bevorzugt sind beispielsweise Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Petalen, Sepalen, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Früchte und Kombinationen hieraus.

Knollen-, Speicherwurzel-oder Wurzel-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33) oder der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.

Blattspezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphat- carboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8 : 2445-2451).

Blütenspezifische Promotoren sind beispielsweise der Phytoen Syn- thase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).

Antheren-spezifische Promotoren sind beispielsweise der 5126- Promotor (US 5,689, 049, US 5,689, 051), der glob-1 Promotor oder der g-Zein Promotor.

Fruchtspezifische Promotoren sind beispielsweise der Pds-Promoter aus Tomate (Genbank-ACCESSION U46919 ; Corona, V., Aracri, B., Kosturkova, G., Bartley, G. E., Pitto, L., Gior- getti, L., Scolnik, P. A. and Giuliano, G., Regulation of a caro- tenoid biosynthesis gene promoter during plant development Plant J. 9 (4), 505-512 (1996) ), SEQ ID NO. 17, der 2A11 Promoter aus Tomate (Pear, J. R., Ridge, N., Rasmussen, R., Rose, R. E. and Houck, C. M. Isolation and characterization of a fruit-specific cDNA and the corresponding genomic clone from tomatoPlant Mol. Biol. 13 (6), 639-651 (1989), SEQ ID NO.

18, der Cucumisin Promoter (Yamagata, H., Yonesu, K., Hirata, A. and Aizono, Y., TGTCACA Motif Is a Novel cis-Regulatory Enhancer Element Involved in Fruit-specific Expression of the cucumisin GeneJ. Biol. Chem. 277 (13), 11582-11590 (2002), SEQ ID NO. 19,

der Promoter des Endogalacturonasegens (Redondo-Nevado, J., Me- dina-Escobar, N., Caballero-Repullo, J. L. and Munoz-Blanco, J.

A fruit-specific and developmentally regulated endo-polygalactu- ronase gene from strawberry (Fragaria x ananassa c. v. Chandler), J Experimental Botany 52 (362) 1941-1945 (2001), SEQ ID NO. 20, der Polygalacturonase Promoter aus Tomate (Nicholass, F. J., Smith, C. J., Schuch, W., Bird, C. R. and Grierson, D., High levels of ripening-specific reporter gene expression directed by tomato fruit polygalacturonase gene-flanking regions, Plant Mol. Biol.

28 (3), 423-435 (1995)), SEQ ID NO. 21, die TMF7 und TMF9 Promotoren (US 5608150), der Promotor E4 (Cordes S. Deikman J. Margossian LJ. Fischer RL.

Interaction of a developmentally regulated DNA-binding factor with sites flanking two different fruit-ripening genes from to- mato (1989), Plant Cell 1, 1025-1034) und der Promotor E8 (Deikman and Fisher, Interaction of a DNA binding factor with the 5'-flanking region of an ethylene-responsive fruit ripening gene from tomato (1988), EMBO J. 7,3315-3320).

Weitere zur Expression in Pflanzen geeignete Promotoren sind be- schrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153 : 253-277 ; Schardl et al. (1987) Gene 61 : 1-11 ; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 : 8402-8406) Alle in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Promotoren er- möglichen in der Regel die Expression der Ketolase in Früchten der erfindungsgemäßen Pflanzen.

Besonders bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren sind konstitu- tive sowie insbesondere fruchtspezifische Promotoren.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktionell verknüpft einen fruchtspezifischen Promotor, besonders bevorzugt einen oben beschriebenen fruchtspezifischen Promotor, und eine Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer vorstehend beschriebenen Nukleinsäure kodierend eine Ketolase und vorzugs- weise einer zwischen Promotor und Nukleinsäure-Sequenz inserier- ten Nukleinsäure, die für ein plastidenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen

Rekombinations-und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. En- quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Die vorzugsweise insertierte Nukleinsäuren, kodierend ein plasti- däres Transitpeptid, gewährleisten die Lokalisation in Plastiden und insbesondere in Chromoplasten.

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure-Sequenz für ein Ketolase-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chromoplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Trans- lokation der Ketolase in die Chromoplasten vom Ketolase-Teil enzymatisch abgespalten werden.

Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plasti- dären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transit- peptid (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco (rbcS) oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionel- lem Äquivalent abgeleitet ist.

Besonders bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Trans- ketolase aus Tabak in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Kodon in der NcoI Schnittstelle : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pTP09<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> KpnIGGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTC TGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGC CTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGC CGTCG <BR> <BR> <BR> TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTG CGGGA<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> TCCBamHI<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pTPlO<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTT CTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGC CTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGC CGTCG

TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTG CGCTG<BR> <BR> <BR> <BR> GATCCBamHI<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pTPl1<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> KpnIGGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTC TGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGC CTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGC CGTCG <BR> <BR> <BR> TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTG CGGGG ATCC BamHI Weitere Beispiele für ein plastidäres Transitpeptid sind das Transitpeptid der plastidären Isopentenyl-pyrophosphat Isome- rase-2 (IPP-2) aus Arabisopsis thaliana und das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphospaht Carboxylase (rbcS) aus Erbse (Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cassette for targeting foreign proteins into the chloroplstas. Nucl. Acids Res. 16 : 11380).

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch herge- stellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus syn- thetischen und natürlichen Nukleinsäure-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.

Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleo- tid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden.

Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor-und die Terminator-Regio- nen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion die- ser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions- stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatori- schen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze

sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Ter- minationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ein Beispiel für einen Terminator ist der 35S-Terminator (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res. 16 : 11380), der nos Ter- minator (Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. Nopaline synthase : transcript mapping and DNA sequence.

J Mol Appl Genet. 1982 ; 1 (6) : 561-73) oder der ocs Terminator (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, van Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J. 3 : 835-846).

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt- stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti- onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans- versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese,"primer- repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.

Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion,"chewing- back"oder Auffüllen von Überhängen für"bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, ins- besondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet.

Dazu können an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.

Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Pro- toplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone-die so- genannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro-

injektion und der, vorstehend beschriebene, durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispiels- weise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausge- geben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.

42 (1991), 205-225) beschrieben.

Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans- formieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.

12 (1984), 8711) oder besonders bevorzugt pSUN2, pSUN3, pSUN4 oder pSUN5 (WO 02/00900).

Mit einem Expressionsplasmid transformierte Agrobakterien können in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen verwendet wer- den, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Zur bevorzugten Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, wird die fusio- nierte Expressionskassette, die eine Ketolase exprimiert, in einen Vektor, beispielsweise pBinl9 oder insbesondere pSUN2 klo- niert, der geeignet ist, in Agrobacterium tumefaciens transfor- miert zu werden Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise verwun- dete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung geba- det und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Uti- lization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression einer Nukleinsäure codierend eine Ketolase enthalten.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Ketolase kodierenden Nukleinsäure wird eine Expressionskassette als Inser- tion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise

Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in"Methods in Plant Molecular Bio- logy and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations-und Klonie- rungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vek- toren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pJIT117 (Guerineau et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16 : 11380), pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184, pMC1210, pMcl 210 und pCL1920. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression konstitutiv oder vorzugsweise spezifisch in den Früchten erfolgen.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, dadurch gekenn- zeichnet, dass man ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend funktio- nell verknüpft einen fruchtspezifischen Promotor und Nuklein- säuren kodierend eine Ketolase in das Genom der Ausgangspflanze einführt.

Die Erfindung betrifft ferner die genetisch veränderten Pflanzen, die im Vergleich zur Ausgangspflanze in Früchten eine Ketolase- Aktivität aufweist.

Die Ketolaseaktivität wird in einer bevorzugten Ausführungsform dadurch erreicht, dass die genetisch veränderte Pflanze in den Früchten eine Ketolase exprimiert.

Die bevorzugten, genetisch veränderten Pflanzen enthalten daher in Früchten mindestens eine Nukleinsäure, kodierend eine Keto- lase.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt, wie vorste- hend ausgeführt, die Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, durch Einbringen von Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, in die Ausgangspflanze.

Der Erfindung betrifft daher besonders bevorzugt eine vorstehend beschriebene genetisch veränderte Pflanze, dadurch gekennzeich- net, dass man in die Pflanze ausgehend von einer Ausgangspflanze mindestens eine Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase eingebracht hat.

Die Erfindung betrifft insbesondere genetisch veränderte Pflan- zen, ausgewählt aus den Pflanzengattungen Actinophloeus, Aglaeo- nema, Ananas, Arbutus, Archontophoenix, Area, Aronia, Asparagus, Attalea, Berberis, Bixia, Brachychilum, Bryonia, Caliptocalix, Capsicum, Carica, Celastrus, Citrullus, Citrus, Convallaria, Cotoneaster, Crataegus, Cucumis, Cucurbita, Cuscuta, Cycas, Cyphomandra, Dioscorea, Diospyrus, Dura, Elaeagnus, Elaeis, Erythroxylon, Euonymus, Ficus, Fortunella, Fragaria, Gardinia, Gonocaryum, Gossypium, Guava, Guilielma, Hibiscus, Hippophaea, Iris, Lathyrus, Lonicera, Luffa, Lycium, Lycopersicum, Malpighia, Mangifera, Mormodica, Murraya, Musa, Nenga, Palisota, Pandanus, Passiflora, Persea, Physalis, Prunus, Ptychandra, Punica, Pyra- cantha, Pyrus, Ribes, Rosa, Rubus, Sabal, Sambucus, Seaforita, Shepherdia, Solanum, Sorbus, Synaspadix, Tabernae, Tamus, Taxus, Trichosanthes, Triphasia, Vaccinium, Viburnum, Vignia oder Vitis, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase.

Ganz besonders bevorzugte Pflanzengattungen sind Ananas, Aspara- gus, Capsicum, Citrus, Cucumis, Cucurbita, Citrullus, Lycopersicum, Passiflora, Prunus, Physalis, Solanum, Vaccinium und Vitis, enthaltend mindestens eine transgene Nukleinsäure, kodie- rend eine Ketolase.

Wie vorstehend erwähnt wird in bevorzugten transgenen Pflanzen die Ketolase in den Früchten exprimiert, besonderes bevorzugt ist die Expression der Ketolase in den Früchten am höchsten.

Besonders bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen weisen, wie vorstehend erwähnt, zusätzlich eine erhöhte Hydroxylase-Aktivität und/oder ß-Cyclase-Aktivität gegenüber einer Wildpflanze auf.

Weiter bevorzugte Ausführungsformen sind vorstehend im erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben.

Die transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflan- zenzellen, -gewebe oder-teile, insbesondere deren Früchte sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die genetisch veränderten Pflanzen können, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung von Ketocarotinoiden, insbesondere Astaxanthin, verwendet werden.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Ketocarotinoiden kön- nen auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Pro- zessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter- und Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden. Ferner können die genetisch veränderten Pflanzen zur Herstellung von Ketocaroti-

noid-haltigen Extrakten der Pflanzen und/oder zur Herstellung von Futter-und Nahrungsergänzungsmitteln verwendet werden.

Die genetisch veränderten Pflanzen weisen im Vergleich zum Wild- typ einen erhöhten Gehalt an Ketocarotinoiden auf.

Unter einem erhöhten Gehalt an Ketocarotinoiden wird in der Regel ein erhöhter Gehalt an Gesamt-Ketocarotinoid verstanden.

Unter einem erhöhten Gehalt an Ketocarotinoiden wird aber auch insbesondere ein veränderter Gehalt der bevorzugten Ketocaroti- noide verstanden, ohne dass zwangsläufig der Gesamt-Carotinoidge- halt erhöht sein muss.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Astaxanthin auf.

Unter einem erhöhten Gehalt wird in diesem Fall insbesondere ein verursachter Gehalt an Ketocarotinoiden, bzw. Astaxanthin verstanden.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt : Allgemeine Experimentelle Bedingungen : Sequenzanalyse rekombinanter DNA Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 : Amplifikation einer cDNA, die die gesamte Primär- sequenz der Ketolase aus Haematococcus pluvialis Flo- tow em. Wille kodiert Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis kodiert, wurde mittels PCR aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80 der"Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttin- gen") Suspensionskultur amplifiziert.

Für die Präparation von Total-RNA aus einer Suspensionskultur von Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80), die 2 Wochen mit in- direktem Tageslicht bei Raumtemperatur in Haematococcus Medium (1.. 2 g/1 Natriumacetat, 2 g/1 Hefeextrakt, 0.2 g/1 MgC12x6H20, 0.02 CaC12x2H20 ; pH 6.8 ; nach Autoklavieren Zugabe von 400 mg/1

L-Asparagin, 10 mg/1 FeS04xH20) gewachsen war, wurden die Zellen geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pul- verisiert. Anschließend wurden 100 mg der gefrorenen, pulveri- sierten Algenzellen in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0,8 ml Trizol-Puffer (Life Technologies) aufgenommen. Die Suspension wurde mit 0,2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15minütiger Zentri- fugation bei 12000 g wurde der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol extrahiert. Die RNA wurde mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyro- carbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst.

Die RNA-Konzentration wurde photometrisch bestimmt.

Für die cDNA-Synthese wurden 2. 5 zig Gesamt-RNA für 10 min bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PR1 SEQ ID No. 29) in cDNA umgeschrieben.

Die Nukleinsäure codierend eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR2 SEQ ID No. 30) und eines antisense spezifischen Primers (PR1 SEQ ID No. 29) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 Rl Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 4 l einer Haematococcus pluvialis cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 mM PR1 (SEQ ID No. 29) - 0, 2 mM PR2 (SEQ ID No. 30) - 5 gel 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 Al R Taq Polymerase. (TAKARA) - 25, 8 Al Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 53°C 2 Minuten 72°C 3 Minuten

1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 29 und SEQ ID No. 30 resul- tierte in einem 1155 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (SEQ ID No. 22). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR- Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert und der Klon pGKET02 erhalten.

Sequenzierung des Klons pGKET02 mit dem T7-und dem SP6-Primer bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich in den drei Ko- dons 73,114 und 119 in je einer Base von der publizierten Se- quenz X86782 unterscheidet. Diese Nukleotidaustausche wurden in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentieren somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Hae- matococcus pluvialis Stamm 192. 80 (Abbildung 3 und 4, Sequenzver- gleiche).

Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvek- tor pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16 : 11380) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1027 Bp SpHI-Fragmentes aus pGKET02 und Ligierung in den SpHI geschnitte- nen Vektor pJIT117. Der Klon, der das Haematococcus pluvialis Ke- tolasegen in der korrekten Orientierung als N-terminale transla- tionale Fusion mit der rbcs Transitpeptidsequenz enthält, heißt pJKET02.

Beispiel 2 : Amplifikation einer cDNA, die die Ketolase aus Haema- tococcus pluvialis Flotow em. Wille mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-terminus kodiert Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-Termi- nus kodiert, wurde mittels PCR aus Haematococcus pluvialis Sus- pensionskultur (Stamm 192.80 der"Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen") amplifiziert.

Die Präparation von Total-RNA aus einer Suspensionskultur von Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.

Die cDNA-Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase, aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-Terminus wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense spezifischen

Primers (PR3 SEQ ID No. 31) und eines antisense spezifischen Pri- mers (PR1 SEQ ID No. 29) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein mit um 14 Aminosäuren verkürztem N-Terminus kodiert, erfolgte in einem 50 Rl Reaktionsansatz, in dem enthalten war : -4 Al einer Haematococcus pluvialis cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 mM PR1 (SEQ ID No. 29) - 0, 2 mM PR3 (SEQ ID No. 31) - 5 gel 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 1 R Taq Polymerase (TAKARA) - 25, 8 Al Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 53°C 2 Minuten 72°C 3 Minuten 1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 29 und SEQ ID No. 31 resul- tierte in einem 1111 Bp Fragment, das für ein Ketolase Protein kodiert, bei dem N-terminalen Aminosäuren (Position 2-16) durch eine einzige Aminosäure (Leucin) ersetzt sind.

Das Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert und der Klon pGKET03 erhalten. Sequenzierungen mit den Primern T7-und SP6 bestätigten eine zur Sequenz SEQ ID No. 22 identische Sequenz, wobei die 5'Region (Position 1-53) der SEQ ID No. 22 im Amplikikat SEQ ID No. 24 durch eine in der Sequenz abweichende Nonamersequenz ersetzt wurde. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Guerineau et al.

1988, Nucl. Acids Res. 16 : 11380) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 985 Bp SpHI Fragmen- tes aus pGKET03 und Ligierung mit dem SpHI geschnittenen Vektor pJIT117. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase mit einem um 14 Aminosäuren verkürztem N-Terminus in der korrekten

Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, heißt pJKET03.

Beispiel 3 : Amplifikation einer cDNA, die die Ketolase aus Haema- tococcus pluvialis Flotow em. Wille (Stamm 192.80 der "Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttin- gen") bestehend aus der gesamten Primärsequenz und fusioniertem C-terminalem myc-Tag kodiert Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) bestehend aus der gesamten Primärsequenz und fusioniertem C-terminalem myc-Tag kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pGKET02 (in Beispiel 1 beschrieben) und des Primers PR15 (SEQ ID No. 32) hergestellt. Der Primer PR15 setzt sich zu- sammen aus einer antisense spezifischen 3'Region (Nucleotide 40-59) und einer myc-Tag kodierenden 5'Region (Nucleotide 1-39).

Die Denaturierung (5 min bei 95°C) und Annealing (langsame Abküh- lung bei Raumtemperatur auf 40°C) von pGKET02 und PR15 erfolgte in einem 11,5 jll Reaktionsansatz, in dem enthalten war : l jlg pGKET02 PlasmidDNA -0, 1 ßg PR15 (SEQ ID No. 32) Das Auffüllen der 3'Enden (30 min bei 30°C) erfolgte in einem 20 fl Reaktionsansatz, in dem enthalten war : -11, 5 Rl pGKETO2/PR15-Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) - 50) JM dNTPs - 2 gl IX Klenow Puffer - 2U Klenow Enzym Die Nukleinsäure kodierend eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) bestehend aus der gesamten Primärsequenz und fusioniertem C-terminalem myc-Tag wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR2 SEQ ID No. 30) und eines antisense spezifischen Primers (PR15 SEQ ID No. 32) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein mit fusioniertem C-terminalem myc-Tag kodiert, erfolgte in einem 50 zut Reaktionsansatz, in dem enthalten war :

1 gel einer Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) 0, 25 mM dNTPs -0, 2 fM PR15 (SEQ ID No. 32) 0, 2 WM PR2 (SEQ ID No. 30) - 5 µl 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0, 25 1 R Taq Polymerase (TAKARA) -28, 8 1 Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 53°C 1 Minute 72°C 1 Minute 1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 32 und SEQ ID No. 30 resul- tierte in einem 1032 Bp-Fragment, das für ein Protein kodiert, bestehend aus der gesamten Primärsequenz der Ketolase aus Haema- tococcus pluvialis als zweifache translationale Fusion mit, dem rbcS Transitpeptide am N-Terminus und dem myc-Tag am C-Terminus.

Das Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert und der Klon pGKET04 erhalten. Sequenzierungen mit den Primern T7- und SP6 bestätigten eine zur Sequenz SEQ ID No. 22 identische Sequenz, wobei die 3'Region (Position 993-1155) der SEQ ID No. 22 im Amplifikat SEQ ID No. 26 durch eine in der abweichende Sequenz aus 39 Bp ersetzt wurde. Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Guerineau et al.

1988, Nucl. Acids Res. 16 : 11380) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1038 Bp EcoRI-SpHI Fragmentes aus pGKET04 und Ligierung mit dem EcoRI-SpHI geschnit- tenen Vektor pJIT117. Durch die Ligation entsteht eine trans- lationale Fusion zwischen dem C-Terminus der rbcS Transitpeptid- sequenz und dem N-Terminus der Ketolase Sequenz. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase mit fusioniertem C-termina- lem myc-Tag in der korrekten Orientierung als translationale N-terminale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, heißt pJKET4.

Beispiel 4 : Herstellung von Expressionsvektoren zur konstitutiven Expression der Haematococcus pluvialis Ketolase in vLycopersicon esculentum

Die Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L. esculentum erfolgte unter Kontrolle des konstitutiven Promo- ters d35S aus CaMV (Franck et al. 1980, Cell 21 : 285-294). Die Expression erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Ander- son et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715).

Die Herstellung eines Expressionsplasmides für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der Ketolase aus Haematococcus pluvia- lis in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3KET02 wurde das 2.8 Kb SacI-XhoI Fragment aus pJKET02 mit dem SacI-XhoI ge- schnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 5, Konstruktkarte).

In der Abbildung 5 beinhaltet Fragment d35S den duplizierten 35S Promoter (747 bp), Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp), Fragment KET02 (1027 bp) die gesamte Primär- sequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.

- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3KET03 wurde das 2.7 Kb bp SacI-XhoI Fragment aus pJKET03 mit dem SacI-XhoI ge- schnittenen Vektor pSUN3 ligiert. (Abbildung 6, Konstrukt- karte). In der Abbildung 6 beinhaltet Fragment d35S den dupli- zierten 35S Promoter (747 bp), Fragment abcs das rbcS Transit- peptid aus Erbse (204 bp), Fragment KET03 (985 bp) die um 14 N- terminale Aminosäuren verkürzte Primärsequenz kodierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.

Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3KET04 wurde das 2.8 Kb SacI-XhoI Fragment aus pJKET04 mit dem SacI-XhoI geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert. (Abbildung 7, Konstruktkarte). In der Ab- bildung 7 beinhaltet Fragment d35S den duplizierten 35S Promoter ( (747 bp), Fragment abcs das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp), Fragment KET04 (1038 bp) die gesamte Primärsequenz codierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase mit C-terminalem myc- Tag, Fragment term (761 bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.

Beispiel 5 : Herstellung von Expressionsvektoren zur Expression der Haematococcus pluvialis Ketolase in Lycopersicon esculentum Die Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L. esculentum erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle einer modifizierten Version AP3P des

Promoters AP3 aus Arabidopsis thaliana (AL132971 : Nukleotidregion 9298-10200 ; Hill et al. (1998) Development 125 : 1711-1721).

Das DNA Fragment, das die AP3 Promoterregion-902 bis +15 aus Arabidopsis thaliana beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Arabidopsis thaliana isoliert) sowie der Primer PR7 (SEQ ID No. 33) und PR10 (SEQ ID No. 36) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das AP3-Promoterfragment (-902 bis +15) beinhaltet, erfolgte in einem 50 Rl Reaktionsan- satz, in dem enthalten war : - 100 ng genomischer DNA aus A. thaliana - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 mM PR7 (SEQ ID No. 33) - 0, 2 mM PR10 (SEQ ID No. 36) -5 Al 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0, 25 Rl Pfu Polymerase (Stratagene) - 28, 8 gel Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 1 Minute 1X 72°C 10 Minuten Das 922 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pTAP3 erhalten.

Sequenzierung des Klons pTAP3 bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich in durch eine Insertion (ein G in Position 9765 der Sequenz AL132971) und einen Basenaustausch (ein G statt ein A in Position 9726 der Sequenz AL132971) von der publizierten AP3 Sequenz (AL132971, Nukleotidregion 9298-10200) unterscheidet.

Diese Nukleotidunterschiede wurden in einem unabhängigen Ampli- fikationsexperiment reproduziert und repräsentieren somit die tatsächliche Nukleotidsequenz in den verwendeten Arabidopsis thaliana Pflanzen.

Die modifizierte Version AP3P wurde mittels rekombinanter PCR unter Verwendung des Plasmids pTAP3 hergestellt. Die Region 10200-9771 wurde mit den Primern PR7 (SEQ ID No. 33) und Primern PR9 (SEQ ID No. 35) amplifiziert (Amplifikat A7/9), die Region 9526-9285 wurde mit den PR8 (SEQ ID No. 34) und PR10 (SEQ ID No. 36) amplifiziert (Amplifikat A8/10).

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR-Reaktionen zur Amplifikation der DNA-Fragmente, die die Regionen Region 10200-9771 und Region 9526-9285 des AP3 Promoters beinhalten, erfolgte in 50 Fl Reaktionsansätzen, in de- nen enthalten war : - 100 ng AP3 Amplifikat (oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 mM sense Primer (PR7 SEQ ID No. 33 bzw. PR8 SEQ ID No. 35) - 0,2 mM antisense Primer (PR9 SEQ ID No. 35 bzw. PR10 SEQ ID No. 36) 5 u. l 10X PCR-Puffer (Stratagene) -0, 25 Al Pfu Taq Polymerase (Stratagene) - 28, 8 Al Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 1 Minute 1X 72°C 10 Minuten Die rekombinante PCR beinhaltet Annealing der sich über eine Sequenz von 25 Nukleotiden überlappenden Amplifikate A7/9 und A8/10, Vervollständigung zu einem Doppelstrang und anschließende Amplifizierung. Dadurch entsteht eine modifizierte Version des AP3 Promoters, AP3P, in dem die Positionen 9670-9526 deletiert sind. Die Denaturierung (5 min bei 95°C) und Annealing (langsame Abkühlung bei Raumtemperatur auf 40°C) beider Amplifikate A7/9 und A8/10 erfolgte in einem 17. 6 l Reaktionsansatz, in dem ent- halten war : - 0, 5 Ag A7/9 Amplifikat - 0, 25 gag A8/10 Amplifikat

Das Auffüllen der 3'Enden (30 min bei 30°C) erfolgte in einem 20 =1 Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 17, 6 gl A7/9 und A8/10-Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) 50) JM dNTPs 2 jll IX Klenow Puffer - 2U Klenow Enzym Die Nukleinsäure, kodierend für die modifizierte Promoterversion AP3P, wurde mittels PCR unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR7 SEQ ID No. 28) und eines antisense spezifischen Pri- mers (PR10 SEQ ID No. 36) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation des AP3P Fragmentes erfolgte in einem 50 jll Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 1 µl Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 mM PR7 (SEQ ID No. 33) - 0, 2 mM PR10 (SEQ ID No. 36) -5 Rl 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0,25 µl Pfu Taq Polymerase (Stratagene) - 28,8 µl Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 1 Minute -1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 33 und SEQ ID No. 36 resul- tierte in einem 778 Bp Fragment, das für die modifizierte Promo- terversion AP3P kodiert. Das Amplifikat wurde in den Klonierungs- vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pTAP3P erhalten.

Sequenzierungen mit den Primern T7 und M13 bestätigten eine zur Sequenz AL132971, Region 10200-9298 identische Sequenz, wobei die interne Region 9285-9526 deletiert wurde. Diese Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16 : 11380) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 771 Bp SacI- HindIII Fragmentes aus pTAP3P und Ligierung in den SacI-HindIII geschnittenen Vektor pJIT117. Der Klon, der den Promoter AP3P an- stelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heißt pJAP3P.

Zur Herstellung einer Expressionskassette pJAP3PKET02 wurde das 1027 Bp SpHI-Fragment KET02 (in Beispiel 1 beschrieben) in den SpHI geschnittenen Vektor pJAP3P kloniert. Der Klon, der das Fragment KET02 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heißt pJAP3PKET02.

Zur Herstellung einer Expressionskassette pJAP3PKET04 wurde das 1032 Bp SpHI-EcoRI Fragment KET04 (in Beispiel 3 beschrieben) in den SpHI-EcoRI geschnittenen Vektor pJAP3P kloniert. Der Klon, der das Fragment KET04 in der korrekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heißt pJAP3PKET04.

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten Ketolase aus Haematococcus pluvialis in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3AP3PKET02 wurde das 2.8 KB bp SacI-XhoI Fragment aus pJAP3KET02 mit dem SacI-XhoI geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 8, Konstrukt- karte). In der Abbildung 8 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp), Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp), Fragment KET02 (1027 bp) die gesamte Primärsequenz codierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase, Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.

- Zur Herstellung des Expressionsvektors pS3AP3PKET04 wurde das 2.8 KB SacI-XhoI Fragment aus pJAP3PKET04 mit dem SacI-XhoI geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert. (Abbildung 9, Konstrukt- karte). In der Abbildung 9 beinhaltet Fragment AP3P den modifizierten AP3P Promoter (771 bp), Fragment rbcS das rbcS Transitpeptid aus Erbse (204 bp), Fragment KET04 (1038 bp) die gesamte Primärsequenz codierend für die Haematococcus pluvialis Ketolase mit C-terminalem myc-Tag, Fragment term (761 Bp) das Polyadenylierungssignal von CaMV.

Beispiel 6 : Herstellung transgener Lycopersicon esculentum Pflan- zen

Transformation und Regeneration von Tomatenpflanzen erfolgte nach der publizierten Methode von Ling und Mitarbeitern (Plant Cell Reports (1998), 17 : 843-847). Für die Varietät Microtom wurde mit höherer Kanamycin-Konzentration (100mg/L) selektioniert.

Als Ausgangsexplantat für die Transformation dienten Kotyledonen und Hypokotyle sieben bis zehn Tage alter Keimlinge der Linie Microtom. Für die Keimung wurde das Kulturmedium nach Murashige und Skoog (1962 : Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473-) mit 2 % Saccharose, pH 6,1 verwendet. Die Keimung fand bei 21°C bei wenig Licht (20 bis 100 RE) statt. Nach sieben bis zehn Tagen wurden die Kotyledonen quer geteilt und die Hypokotyle in ca. 5 bis 10 mm lange Abschnitte geschnitten und auf das Medium MSBN (MS, pH 6,1, 3 % Saccharose + 1 mg/1 BAP, 0,1 mg/1 NAA) gelegt, das am Vortag mit suspensionskultivierten Tabakzellen beschickt wurde. Die Tabakzellen wurden luftblasenfrei mit steri- lem Filterpapier abgedeckt. Die Vorkultur der Explantate auf dem beschriebenen Medium erfolgte für drei bis fünf Tage. Zellen des Stammes Agrobakterium tumefaciens LBA4404 wurden einzeln mit den Plasmiden pS3KET02, pS3KET03 bzw. pS3AP3KET02 transformiert. Von den einzelnen mit den Binaervektoren pS3KET02, pS3KET03 bzw. pS3KET02 transformierten Agrobakterium-Stämmen wurde jeweils eine Übernachtkultur in YEB Medium mit Kanamycin (20 mg/l) bei 28 Grad Celsius kultiviert und die Zellen zentrifugiert. Das Bakterien- pellet wurde mit flüssigem MS Medium (3 % Saccharose, pH 6,1) resuspendiert und auf eine optische Dichte von 0,3 (bei 600 nm) eingestellt. Die vorkultivierten Explantate wurden in die Suspension überführt und für 30 Minuten bei Zimmertemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die Explantate mit sterilem Filterpapier getrocknet und für die drei- tägige Co-Kultur (21°C) auf ihr Vorkulturmedium zurück gelegt.

Nach der Co-kultur wurden die Explantate auf MSZ2 Medium (MS pH 6, 1 + 3 % Saccharose, 2 mg/1 Zeatin, 100 mg/1 Kanamycin, 160 mg/1 Timentin) transferiert und für die selektive Regenera- tion bei 21°C unter Schwachlicht Bedingungen (20 bis 100 BE, Lichtrhythmus 16 h/8 h) aufbewahrt. Aller zwei bis drei Wochen erfolgte der Transfer der Explantate bis sich Sprosse bildeten.

Kleine Sprosse konnten vom Explantat abgetrennt werden und auf MS (pH 6,1 + 3 % Saccharose) 160 mg/1 Timentin, 30 mg/1 Kanamycin, 0,1 mg/1 IAA bewurzelt werden. Bewurzelte Pflanzen wurden ins Ge- wächshaus überführt.

Gemäß der oben beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Expressionskonstrukten folgende Linien erhalten : Mit pS3KET02 wurde erhalten : cl3-24, cl3-30, cl3-40.

Mit pS3KET03 wurde erhalten : csl4-2, csl4-3, csl4-9, cl4-19.

Mit pS3AP3PKET02 wurde erhalten : cl6-15, cl6-34, cl6-35, cl6-40.

Beispiel 8 : Charakterisierung der transgenen Früchte Das Fruchtmaterial der transgenen Pflanzen wurde in flüssigem Stickstoff gemörsert und das Pulver (etwa 250 bis 500 mg) mit 100 % Aceton extrahiert (dreimal je 500 ul). Das Lösungs-mit- tel wurde evaporiert und die Carotinoide in 100 ul Aceton resuspendiert.

Mittels einer C30-Reverse phase-Säule konnte zwischen Mono- und Diestern der Carotinoide unterschieden werden. HPLC-Laufbe- dingungen wurden modifiziert nach einer publizierten Me- thode (Frazer et al. (2000), Plant Journal 24 (4) : 551-558).

Folgende HPLC-Bedingungen wurden eingestellt.

Trennsäule : Prontosil C30-Säule, 250 x 4,6 mm, (Bischoff, Leon- berg, Germany) Flussrate : 1.0 ml/min Eluenten : Laufmittel A-100% Methanol Laufmittel B-80% Methanol, 0. 2% Ammoniumacetat Laufmittel C-100% t-Butyl-methylether Gradientenprofil : Zeit Flussrate % Lauf-% Lauf-% Lauf- mittel A mittel B mittel C 1.00 1. 0 95. 0 5. 0 0 12. 00 1. 0 95. 0 5. 0 0 12.10 1. 0 80. 0 5. 0 15. 0 22.00 1. 0 76. 0 5. 0 19. 0 22.10 1. 0 66. 5 5. 0 28. 5 38.00 1.0 15. 0 5. 0 80. 0 45.00 1. 0 95. 0 5. 0 0 46.0 1.0 95.0 5.0 0 Detektion : 300-530 um Die Spektren wurden unter Verwendung eines Photodiodenarray-De- tektors bestimmt. Die Carotinoide wurden über ihre Absorptions-

spektren und ihre Retentionszeiten im Vergleich zu Standardproben identifiziert.

Tabelle 1 zeigt das Carotinoidprofil in Tomatenfrüchten der gemäß der vorstehend beschriebenen Beispiele hergestellten transgenen Tomaten und Kontrolltomatenpflanzen. Im Vergleich zur genetisch nicht veränderten Kontrollpflanze weisen die genetisch veränder- ten Pflanzen einen Gehalt an Ketocarotinoiden und insbesondere einen Gehalt an Astaxanthin auf.

Tabelle 1 Pflanze Lutein Lycopin beta-Carotin Cryptoxanthin Canthaxanthin Adonirubin Astaxanthin Kontrolle + + + Kontrolle + + + (+) - - - CS 13-24-+ + (+) + + CS13-30 - + + (+) + + + CS 13-40-+ + + + + CS14-2-+ + (+) + + + CS 14-3-+ +-+ + + CS 14-9-+ + + + + CS 14-19-+ +-+ + + CS16-15-+ + (+) + + + CS 16-34-+ + + + + CS16-35-+ +-+ + + CS 16-40-+ + + + + bedeutet Carotinoid nachweisbar - bedeutet Carotinoid nicht detektiert (+) bedeutet Carotinoidkonzentration an der Nachweisgrenze Tabelle 2a zeigt die Carotinoidmengen in reifen Früchten von transgenen Tomaten und Kontrollpflanzen. Die Angaben sind Mittel- werte verschiedener Linine und in Prozent des Gesamtcarotinoidge- halt angegeben. Promoter Lycopene Beta-ca-Lutein Cantha-Adoni-Astaxanthin Zeaxanthin used rotene xanthin rubin Control 80. 5 14. 4 2. 8 0. 2 plants CS16 84 9. 4 0.3 0.5 0.2 5.0 0.3 CS13 78 16.5 2.8 0.3 0.2 6. 1 Tabelle 2b zeigt die Carotinoidmengen in reifenden Früchten von transgenen Tomaten und Kontrollpflanzen. Die Angaben sind Mittel- werte verschiedener Linine und in Prozent des Gesamtcarotinoidge- halt angegeben.

Promoter Lycopene Beta-ca-Lutein Cantha-Adonirubin Astaxanthin Zeaxanthin used rotene xanthin Control 59 28. 4 0. 3 plants CS16 61 22. 3 5. 2 1. 6 3. 1 3.9 2.5 CS13 52 19.5 5. 4 1.2 4. 7 6.1 Beispiel 9 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert Die DNA, die für die NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der"American Type Culture Collection") amplifi- ziert.

Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskul- tur von Nostoc punctiforme ATCC 29133, die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 11-Medium (1.5 g/1 NaN03, 0.04 g/1 K2P04x3H20, 0.075 g/l MgS04xH20, 0.036 g/1 CaCl2x2H20, 0.006 g/1 citric acid, 0.006 g/1 Ferric ammonium ci- trate, 0.001 g/1 EDTA disodium magnesium, 0.04 g/1 Na2C03, 1ml Trace Metal Mix"A5+Co" (2.86 g/1 H3B03, 1. 81'g/l MnCl2x4H20, 0.222 g/1 ZnS04x7H20, 0.39 g/1 NaMo04X2H2o, 0.079 g/1 CuS04x5H20, 0.0494 g/1 Co (N03) 2x6H20) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert.

Protokoll für die DNA-Isolation aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 : Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch 10 minütige Zentrifugation bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mör- ser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10mM Tris_HCl (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsge- fäß (2ml Volumen) überführt. Nach Zugabe von 100 jll Proteinase K (Konzentration : 20 mg/ml) wurde die Zell- suspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 fl Phenol extrahiert. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5.2) und 0.6 Volumen Iso- propanol gefällt und anschließend mit 70% Ethanol gewaschen. Das

DNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet, in 25 Al Wasser aufgenommen und unter Erhitzung auf 65°C gelöst.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133, wurde mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Verwendung eines sense-spezi- fischen Primers (NP196-1, SEQ ID No. 59) und eines antisense-spe- zifischen Primers (NP196-2 SEQ ID No. 60) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 1 ul einer Nostoc punctiforme ATCC 29133 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NP196-1 (SEQ ID No. 59) - 0. 2 mM NP196-2 (SEQ ID No. 60) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 59 und SEQ ID No. 60 resul- tierte in einem 792 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NP196, SEQ ID No. 61).

Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNP196 erhalten.

Sequenzierung des Klons pNP196 mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 140.571-139. 810 des Datenbank-eintrages NZ_AABC01000196 identisch ist (inverse orientiert zum veröffentlichen Datenbankeintrag) mit der Ausnahme, daß G in Position 140.571 durch A ersetzt wurde, um ein Standard-Startkodon ATG zu erzeugen. Diese Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert

und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten No- stoc punctiforme ATCC 29133.

Dieser Klon pNP196 wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJAP3P (in Beispiel 5 beschrieben) verwendet.

PJAP3P wurde modifiziert, indem der 35S-Terminator durch den OCS- Terminator (Octopine Synthase) des Ti-Plasmides pTil5955 von Agrobacterium tumefaciens (Datenbankeintrag X00493 von Position 12,541-12, 350, Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 835-846) ersetzt wurde.

Das DNA-Fragment, das die OCS-Terminatorregion beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung des Plasmides pHELLSGATE (Datenban- keintrag AJ311874, Wesley et al. (2001) Plant J. 27 581-590, nach Standardmethoden aus E. coli isoliert) sowie der Primer OCS-1 (SEQ ID No. 63) und OCS-2 (SEQ ID No. 64) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die die Octopin Synthase (OCS) Terminatorregion (SEQ ID 65) beinhaltet, erfolgte in einem'50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten waren : - 100 ng pHELLSGATE plasmid DNA - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM OCS-1 (SEQ ID No. 63) - 0. 2 mM OCS-2 (SEQ ID No. 64) - 5 ul 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0. 25 ul Pfu Polymerase (Stratagene) - 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 1 Minute 1X 72°C 10 Minuten Das 210 bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pOCS erhalten.

Sequenzierung des Klons pOCS bestätigte eine Sequenz, die mit einem Sequenzabschnitt auf dem Ti-Plasmid pTil5955 von Agrobacte- rium tumefaciens (Datenbankeintrag X00493) von Position 12.541 bis 12.350 übereinstimmt.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 210 bp SalI-XhoI Fragmentes aus pOCS und Ligierung in den SalI-XhoI geschnittenen Vektor pJAP3P.

Dieser Klon heisst pJOAP und wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJOAP : NP196 verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 782 Bp SphI-Fragmen- tes aus pNP196 und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJOAP. Der Klon, der die NP196-Ketolase von Nostoc punctiforme in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOAP : NP196.

Beispiel 10 : Herstellung von Expressionsvektoren zur fruchtspezifischen Ueber- expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC J9133 (Stamm der"American Type Culture Collection") in Lycopersicon esculentum Die Expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculentum erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Ander- son et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des Promoters AP3P aus Arabidopsis thaliana (in Beispiel 5 beschrieben).

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP120 wurde das 1.958 KB bp SacI-XhoI Fragment aus pJOAP : NP196 mit dem SacI-XhoI geschnit- tenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 10, Konstruktkarte). In der Abbildung 10 beinhaltet Fragment AP3P PROM den AP3P Promoter (765 bp), Fragment abcs TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 11 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NOST- Ketolase aus Nostoc spp. PCC 7120 codiert Die DNA, die für die NOST-Ketolase aus Nostoc punctiforme PCC 7120 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc PCC 7120 (Stamm der "Pasteur Culture Collection of Cyanobacterium") amplifiziert.

Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskul- tur von aus Nostoc spp. PCC 7120, die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 11-Medium (1.5 g/1 NaN03, 0.04 g/1 K2P04x3H20, 0.075 g/l MgS04xH20, 0.036 g/1 CaCl2x2H20, 0.006 g/1 citric acid, 0.006 g/1 Ferric ammonium ci- trate, 0.001 g/1 EDTA disodium magnesium, 0.04 g/1 Na2C03, 1ml Trace Metal Mix"A5+Co" (2.86 g/l H3BO3, 1.81 g/l MnCl2x4H2o, 0.222 g/1 ZnS04x7H20, 0.39 g/1 NaMo04X2H20, 0.079 g/1 CuS04x5H20, 0.0494 g/1 Co (N03) 2x6H20) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert.

Protokoll für die DNA-Isolation aus aus Nostoc spp. PCC 7120 : Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch 10 minütige Zentrifugation bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mör- ser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10mM Tris_HCl (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsge- fäß (2m1 Volumen) überführt. Nach Zugabe von 100 Rl Proteinase K (Konzentration : 20 mg/ml) wurde die Zell- suspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 Al Phenol extrahiert. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5.2) und 0.6 Volumen Iso- propanol gefällt und anschließend mit 70% Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet, in 25 pl Wasser aufgenommen und unter Erhitzung auf 65°C gelöst.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc PCC 7120, wurde mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc PCC 7120 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NOST-1, SEQ ID No. 66) und eines antisense-spezifischen Primers (NOST-2 SEQ ID No. 67) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 1 ul einer Nostoc PCC 7120 DNA (hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NOST-1 (SEQ ID No. 66) - 0. 2 mM NOST-2 (SEQ ID No. 67) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 66 und SEQ ID No. 67 resul- tierte in einem 809 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (SEQ ID No. 68). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR- Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert und der Klon pNOST erhalten.

Sequenzierung des Klons pNOST mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz des Datenban- keintrages AP003592 identisch ist. Diese Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc PCC 7120.

Dieser Klon pNOST wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJOAP (in Beispiel 9 beschrieben) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 799 Bp SphI-Fragmen- tes aus pNOST und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJOAP. Der Klon, der die NOST-Ketolase von Nostoc PCC7120 in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOAP : NOST

Beispiel 12 : Herstellung von Expressionsvektoren zur fruchtspezifischen Ueber- expression der NOST-Ketolase aus Nostoc spp. PCC 7120 in Lycopersicon esculentum.

Die Expression der NOST-Ketolase aus Nostoc spp. PCC 7120 in L. esculentum erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Ander- son et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des Promoters AP3P aus Arabidopsis thaliana (in Beispiel 5 beschrieben).

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten NOST-Ketolase aus Nostoc spp. PCC 7120 in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP121 wurde das 1.982 KB bp SacI-XhoI Fragment aus pJOAP : NOST mit dem SacI-XhoI geschnit- tenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 11, Konstruktkarte). In der Abbildung 11 beinhaltet Fragment AP3P PROM den AP3P Promoter (765 bp), Fragment abcs TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid'aus Erbse (194 bp), Fragment NOST KETO CDS (774 bp), kodierend für die Nostoc spp. PCC 7120 NOST-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 13 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 codiert Die DNA, die für die NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der"American Type Culture Collection") amplifi- ziert. Die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspen- sionskultur von Nostoc punctiforme ATCC 29133 wurde in Beispiel 9 beschrieben.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133, wurde mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Verwendung eines sense-spezi- fischen Primers (NP195-1, SEQ ID No. 70) und eines antisense-spe- zifischen Primers (NP195-2 SEQ ID No. 71) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden :

Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 1 ul einer Nostoc punctiforme ATCC 29133 DNA (hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NP195-1 (SEQ ID No. 70) - 0. 2 mM NP195-2 (SEQ ID No. 71) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 70 und SEQ ID No. 71 tesul- tierte in einem 819 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (SEQ ID No. 72). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR- Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert und der Klon pNP195 erhalten.

Sequenzierung des Klons pNP195 mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 55,604-56, 392 des Datenbank-eintrages NZ_AABC010001965 identisch ist, mit der Ausnahme, daß T in Position 55.604 durch A ersetzt wurde, um ein Standard-Startkodon ATG zu erzeugen. Diese Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexpe- riment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc punctiforme ATCC 29133.

Dieser Klon pNP195 wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJOAP (in Beispiel 9 beschrieben) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 709 Bp SphI-Fragmen- tes aus pNP195 und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJOAP. Der Klon, der die NP195-Ketolase von Nostoc punctiforme ATCC 29133 in der korrekten Orientierung als N-terminale transla- tionale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOAP : NP195.

Beispiel 14 : Herstellung von Expressionsvektoren zur fruchtspezifischen Ueber- expression der NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum Die Expression der NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der"American Type Culture Collection") in L. escu- lentum erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des Promoters AP3P aus Arabidopsis thaliana (in Bei- spiel 5 beschrieben).

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP122 wurde das 1.992 KB bp SacI-XhoI Fragment aus pJOAP : NP195 mit dem SacI-XhoI geschnit- tenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 12, Konstruktkarte). In der Abbildung 12 beinhaltet Fragment AP3P PROM den AP3P Promoter (765 bp), Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP195 KETO CDS (789 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme ATCC 29133 NP195-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Syn- thase.

Beispiel 15 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NODK- Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 codiert.

Die DNA, die für die Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 ko- diert, wurde mittels PCR aus Nodularia spumignea NSOR10 amplifi- ziert.

Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskul- tur von Nodularia spumignea NSOR10, die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 11-Medium (1.5 g/l NaN03, 0.04 g/1 K2P04x3H20, 0.075 g/1 MgS04xH20, 0.036 g/l CaCl2x2H20, 0.006 g/1 citric acid, 0.006 g/1 Ferric ammonium ci- trate, 0.001 g/1 EDTA disodium magnesium, 0.04 g/1 Na2C03, 1ml Trace Metal Mix"A5+Co" (2.86 g/1 H3BO3, 1.81 g/1 MnCl2x4H2o, 0.222 g/1 ZnS04x7H20, 0.39 g/1 NaMo04X2H20, 0.079 g/l CuSO4x5H2O, 0.0494 g/l Co (N03) 2x6H20) gewachsen war, wurden die Zellen durch

Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert.

Protokoll für die DNA-Isolation aus Nodularia spumignea NSOR10 : Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch 10 minütige Zentrifugation bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mör- ser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10mM TrisHCl (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsge- fäß (2m1 Volumen) überführt. Nach Zugabe von 100 Al Proteinase K (Konzentration : 20 mg/ml) wurde die Zellsuspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 Rl Phenol extrahiert. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reak- tionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wie- derholt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natrium- acetat (pH 5.2) und 0.6 Volumen Isopropanol gefällt und anschlie- ßend mit 70% Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raumtem- peratur getrocknet, in 25 Rl Wasser aufgenommen und unter Erhit- zung auf 65°C gelöst.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10, wurde mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nodu- laria spumignea NSOR10 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NODK-1, SEQ ID No. 74) und eines antisense-spezifischen Primers (NODK-2 SEQ ID No. 75) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 1 ul einer Nodularia spumignea NSOR10 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NODK-1 (SEQ ID No. 74) - 0. 2 mM NODK-2 (SEQ ID No. 75) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute

55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X 72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 74 und SEQ ID No. 75 resul- tierte in einem 720 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NODK, SEQ ID No. 76).

Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNODK erhalten.

Sequenzierung des Klons pNODK mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 2130-2819 des Datenbank-eintrages AY210783 identisch ist (inverse orien- tiert zum veröffentlichen Datenbankeintrag). Diese Nukleotid- sequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment re- produziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im ver- wendeten Nodularia spumignea NSOR10.

Dieser Klon pNODK wurde daher für die Klonierung in den Expres- sionsvektor pJOAP (in Beispiel 9 beschrieben) verwendet.

/ Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 710 Bp SphI-Fragmen- tes aus pNODK und Ligierung in den SphI geschnittenen Vektor pJOAP. Der Klon, der die NODK-Ketolase von Nodularia spumignea NSOR10 in der korrekten Orientierung als N-terminale translatio- nale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJOAP : NODK.

Beispiel 16 : Herstellung von Expressionsvektoren zur fruchtspezifischen Ueber- expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 in Lycopersicon esculentum.

Die Expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 in L. esculentum erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des Promoters AP3P aus Arabidopsis tha- liana (in Beispiel 5 beschrieben).

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium- vermittelte Transformation der AP3P-kontrollierten NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP123 wurde das 1.893 KB bp SacI-XhoI Fragment aus pJOAP : NODK mit dem SacI-XhoI geschnit- tenen Vektor pSUN3 ligiert (Abbildung 13, Konstruktkarte). In der Abbildung 13 beinhaltet Fragment AP3P PROM den AP3P Promoter (765 bp), Fragment rocs TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NODK KETO CDS (690 bp), kodierend für die Nodularia spumignea NSOR10 NODK-Ketolase, Fragment OCS Termi- nator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 17 : Herstellung einer Expressionskassette zur fruchtspe- zifischen Ueberexpression der chromoplastenspezifischen b-Hydro- xylase aus Lycopersicon esculentum.

Die Expression der chromoplastenspezifischen ß-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum in Tomate erfolgt unter Kontrolle des fruchtspezifischen Promoters AP3P aus Arabidopsis (Beispiel 2).

Als Terminatorelement wird LB3 (Datenbank-eintrages AX696005) aus Vicia faba verwendet. Die Sequenz der chromoplastenspezifischen ß-Hydroxylase (Datenbank-eintrages Y14810 & BE354440) wurde durch RNA Isolierung, reverse Transkription und PCR hergestellt.

Das DNA-Fragment, das die LB3-Terminatorregion beinhaltet, wurde mittels PCR isoliert.

Genomische DNA aus Vicia faba-Gewebe nach Standardmethoden wird isoliert und durch genomische PCR unter Verwendung der Primer PR206 (SEQ ID No. 78) und PR207 (SEQ ID No. 79) eingesetzt. Die PCR zur Amplifikation dieses LB3 DNA-Fragmentes, erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 ul genomische DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 uM PR206 (SEQ ID No. 78) - 0. 2 uM PR207 (SEQ ID No. 79) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul. R Taq Polymerase (TAKARA) - 28. 8 ul. Aq. Dest.

Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 78 und SEQ ID No. 79 resul- tiert in einem 307 bp Fragment (SEQ ID No. 80) das für den LB- Terminator enthaelt. Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pLB3 erhalten. Sequenzierung des Klons pLB3 mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 3-298 des Datenbank-eintrages AX696005

identisch ist. Dieser Klon heisst pLB3 und wird daher für die Klonierung in den Vektor pJAP3P (siehe Beispiel 5) verwendet.

Die Expressionskassette pJAP3P wurde modifiziert, indem der 35S- Terminator durch den Legumin LB3-Terminator des Vicia faba (Da- tenbankeintrag AX696005 ; W003/008596) ersetzt wurde (siehe un- ten).

Für die Herstellung der ß-Hydroxylase-Sequenz wird Total-RNA aus Tomate präpariert. Dazu werden 100mg der gefrorenen, pulverisier- ten Blüten in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0.8 ml Trizol- Puffer (LifeTechnologies) aufgenommen. Die Suspension wird mit 0.2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 12 000 g wird der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol ex- trahiert. Die RNA wird mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75% Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyrocarbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst. Die RNA- Konzentration wird photometrisch bestimmt. Für die cDNA-Synthese werden 2.5 ug Gesamt-RNA für 10 min bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go- you-prime-beads, Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PR215 SEQ ID No.

56) in cDNA umgeschrieben.

Die Bedingungen der anschließenden PCR-Reaktionen sind die fol- genden : Die Nukleinsäure, kodierend die ß-Hydroxylase kodiert, wurde mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Tomate unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (VPR204, SEQ ID No. 81) und eines antisense-spezifischen Primers (PR215 SEQ ID No. 82) amplifiziert.

Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein ß-Hydroxylase Pro- tein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 1 ul cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 uM VPR204 (SEQ ID No. 81) - 0. 2 uM PR215 (SEQ ID No. 82) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR-Amplifikation mit VPR204 und PR215 resultiert in einem 1.040 bp Fragment (SEQ ID No. 83) das für die b-Hydroxylase co- diert. Das Amplifikat wird in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert. Dieser Klon heisst pCrtR-b2.

Sequenzierungen des Klons pCrtR-b2 mit den Primern M13-R und M13-R bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 33-558 des Datenbank-eintrages BE354440 identisch ist und mit der DNA-Sequenz von 1-1009 des Datenbank-eintrages Y14810 identisch ist. Der Klon pCrtR-b2 wird daher für die Klonierung in den Vek- tor pCSP02 verwendet (siehe unten).

Der erste Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 1.034 bp HindIII-EcoRI Fragmentes aus pCrtR-b2, abgeleitet vom Klonie- rungsvektor pCR-2.1 (Invitrogen), und Ligierung mit dem HindIII- EcoRI geschnittenen Vektor pJAP3P (siehe Beispiel 5). Der Klon, der das b-Hydroxylase-Fragment CrtR-b2 enthält, heisst pCSP02.

Der zweite Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 301bp EcoRI-XhoI Fragmentes aus pLB3, abgeleitet vom Klonierungsvektor pCR-2.1 (Invitrogen), und Ligierung mit dem EcoRI-XhoI geschnit- tenen Vektor pCSP02. Der Klon, der den 296 bp Terminator LB3 ent- hält, heisst pCSP03. Durch die Ligation entsteht eine transkrip- tionelle Fusion zwischen dem Terminator LB3 und dem b-Hydroxy- lase-Fragment CrtR-b2. Zudem entsteht eine transkriptionelle Fu- sion zwischen dem AP3P Promoter und dem b-Hydroxylase-Fragment.

Beispiel 18 : Herstellung einer Expressionskassette zur fruchtspe- zifischen Ueberexpression des B-Genes aus Lycopersicon esculen- tum.

Die Expression des B-Genes aus Lycopersicon esculentum in Tomat (Lycopene b-cyclase ; Datenbank-eintrages AF254793) erfolgt unter Kontrolle des fruchtspezifischen Promoters PDS (phytoene desatu- rase ; Datenbank-eintrages U46919) aus Lycopersicon esculentum.

Als Terminatorelement wird 35S aus CaMV verwendet. Die Sequenz des B-Genes wurde durch PCR aus genomischer DNA aus Lycopersicon esculentum hergestellt.

Zur Isolation des B-Genes mittels PCR mit genomischer DNA von Lycopersicon esculentum wurden die Oligonukleotid Primer BGEN-1 (SEQ ID No. 85) und BGEN-2 (SEQ ID No. 86) verwendet.

Die genomische DNA wurde aus Lycopersicon esculentum wie be- schrieben (Galbiati M et al. Funct. Integr. Genomics 2000,20 1 : 25-34) isoliert.

Die PCR Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt : 80ng genomische DNA lx Expand Long Template PCR Puffer 2,5 mM MgCl2 je 350 WM dATP, dCTP, dGTP, dTTp 0.3 uM BGEN-1 (SEQ ID No. 85) 0.3 uM BGEN-2 (SEQ ID No. 86) 2,5 Units Expand Long Template Polymerase in einem Endvolumen von 25 Al Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet : 1 Zyklus mit 120 sec bei 94°C 35 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 48°C für 30 sec und 68°C für 3 min 1 Zyklus mit 68°C für 10 min Die PCR-Amplifikation mit BGEN-1 und BGEN-2 resultiert in einem 1.505 kb Fragment (SEQ ID No. 87) das für die b-Hydroxylase co- diert. Das Amplifikat wird in den PCR-Klonierungsvektor pCR-2.1 (Invitrogen) kloniert. Dieser Klon heisst pBGEN.

/ Sequenzierungen des Klons pBGEN mit den Primern M13-R und M13-F bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 1-1497 des Datenbank-eintrages AF254793 identisch ist. Der Klon pCrtR- b2 wird daher für die Klonierung in den Vektor pCSP02 verwendet (siehe unten).

Für die Herstellung der PDS-Promotor-Sequenz aus Lycopersicon esculentum wird genomische DNA aus Lycopersicon esculentum-Gewebe nach Standardmethoden isoliert und durch genomische PCR unter Verwendung der Primer PDS-1 und PDS-2 eingesetzt. Die PCR zur Am- plifikation dieses PDS-PRomotor-Fragmentes, erfolgt in einem 50 ul. Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 ul genomische DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 3 mM dNTPs - 0. 2 uM PDS-1 (SEQ ID No. 89) - 0. 2 uM PDS-2 (SEQ ID No. 90) - 5 ul 10X Pfu-Turbo Polymerase (Stratagene) - 1 ul Pfu-Turbo Polymerase (Stratagene) 28.8 ul Aq. Dest.

Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet : 1 Zyklus mit 120 sec bei 94°C 36 Zyklen mit 94°C für 60 sec, 55°C für 120 sec und 72°C für 4 min

1 Zyklus mit 72°C für 10 min Die PCR-Amplifikation mit PDS-1 und PDS-2 resultiert in einem Fragment das die Sequenz für den PDS-Promotor enthaelt. Das Am- plifikat wird in den pCR4-BLUNT (Invitrogen) kloniert. Dieser Klon heisst pPDS.

Sequenzierungen mit den Primern M13-R und M13-F bestätigen eine zur Sequenz SEQ ID No. 91 identische Sequenz. Dieser Klon heisst pPDS und wird daher für die Klonierung in den Vektor pJBGEN verwendet (siehe unten).

Der erste Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 1.499 bp NcoI/EcoRI Fragmentes aus pBGEN, abgeleitet vom Klonierungs- vektor pCR2.1 (Invitrogen). Zunaechst wird pBGEN mit BamHI ge- schnitten, die 3'Enden nach Standardmethoden (30 min bei 30°C) aufgefuellt (Klenow-fill-in) und dann ein Partialverdau mit NcoI durchgefuehrt, bei dem das entstehende 1.499 kb Fragment iso- liert. Anschliessend wurde dieses Fragment in den pCSP02 klo- niert, welches vorher mit EcoRI geschnitten, die 3Enden nach Standardmethoden (30 min bei 30°C) aufgefuellt (Klenow-fill-in) und dann wird mit NcoI geschnitten. Der Klon, der das 1. 497 bp B-Gen-Fragment BGEN enthält, heisst pJAP : BGEN. Durch die Liga- tion entsteht eine transkriptionelle Fusion zwischen dem 35S-Ter- minator und dem B-Gen.

Der zweite Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 2.078 bp PDS PROM Fragmentes aus pPDS. Zunaechst wird pPDS mit SmaI geschnitten und dann ein Partialverdau mit SacI durchgefuehrt, bei dem das entstehende 2.088 bp Fragment isoliert. Anschlies- send wurde dieses Fragment in den pJAP : BGEN kloniert, welches vorher mit BamHI geschnitten, die 3'Enden nach Standardmethoden (30 min bei 30°C) aufgefuellt (Klenow-fill-in) und dann wird mit SacI geschnitten. Durch die Ligation entsteht eine transkriptio- nelle Fusion zwischen dem Promotor PDS und dem B-Gen. Der Klon, der das 2.078 bp PDS Promotoren BGEN enthält, heisst pJPDS : BGEN.

Beispiel 19 : Herstellung eines Dreifach-Expressionsvektors zur Ueberexpression des B-Genes, der Expression der Nostoc puncti- forme Ketolase NP196, sowie der Ueberexpression der chromo- plastenspezifischen B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum fruchtspezifisch in Lycopersicon esculentum.

Zunaechst erfolgt die Herstellung eines Doppelkonstruktes, das Expressionskassetten zur Ueberexpression der Nostoc punctiforme ATCC 29133 NP196 Ketolase sowie zur Ueberexpression der B-Hydro- xylase enthaelt. Zunaechst wird dem Fragment AP3P : b-Hydroxy-

lase : LB3, das die B-Hydroxylase-Expressionskassette enthaelt, als 2104 bp Ec1136II-XhoI Fragment isoliert aus pCSP03 (in Beispiel 18 beschrieben). Das Auffüllen der 3 Enden (30 min bei 30°C) er- folgt nach Standardmethoden (Klenow-fill-in). Anschliessend, wurde dieses Fragment in der Vektor MSP120 (in Beispiel 10 be- schrieben) mit Ec1136II und EcoRI geschnitten, die 3'Enden nach Standardmethoden (30 min bei 30°C) aufgefuellt (Klenow-fill-in).

Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die zwei Expressionskas- setten enthaelt : erstens eine Kassette zur chromoplastenspezifi- schen Ueberexpression der B-Hydroxylase aus Lycopersicon esculen- tum, und zweitens eine Kassette zur Ueberexpression der Ketolase NP196 aus Nostoc punctiforme. Die B-Hydroxylase-Runterregulie- rungs-Kassette kann in zwei Orientierungen in den Vektor ligie- ren. Bevorzugt wird die Version verwendet, in der beide Expres- sionskassette in ihrer Orientierung uebereinstimmen (siehe Abbil- dung 14). Diese Version kann durch PCR wie beschrieben identifi- ziert werden : Die PCR zur Amplifikation des PR206-PR010 Plasmid-Fragmentes, das die Verbindung von LB3 terminator der B-Hydroxylase-Kassette und des AP3P-Promoters der Ketolase-Kassette enthaelt, erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 ul Plasmid-DNA (nach Standardmethoden hergestellt) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 uM PR010 (SEQ ID No. 92) - 0. 2 uM PR206 (SEQ ID No. 93) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul. R Taq Polymerase (TAKARA) - 28. 8 ul. Aq. Dest.

Die PCR-Amplifikation mit PR010 und PR206 resultiert in einem 1.080 Bp Fragment, das auf das Vorliegen der oben beschriebenen Verbindung von LB3-Terminator und AP3P-Promotor hinweist, und da- mit die bevorzugte Orientierung beider Expressionskassetten. Die- ser Klon heisst pBHYX : NP196.

Zur Klonierung dieser B-Gen-Ueberexpressionskassette in Expres- sionsvektoren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Tomate erfolgt durch Isolierung des 4.362 Bp EcoRV-XhoI Frag- mentes aus pJPDS : BGEN (siehe Beispiel 19) und Ligierung in dem SmaI-XhoI-geschnittenen Vektor pBHYX : NP196 (oben beschrieben).

Durch die Ligation entsteht eine T-DNA die drei Expressionskas- setten enthaelt : erstens eine Kassette zur Ueberexpression des B- Genes, zweitens eine Kassette zur Ueberexpression der Ketolase NP196-1 aus Nostoc punctiforme, und drittens eine Kassette zur chromoplastenspezifischen Ueberexpression der B-Hydroxylase aus

Lycopersicon esculentum (Abbildung 14, Konstruktkarte). Dieser Klon heisst MSP124. In der Abbildung 14 beinhaltet Fragment AP3P PROM (765 bp) den AP3P-Promoter, das Fragment BHYX b2 CDS (2 bp) die B-Hydroxylase CrtRb2, Fragment LB3 TERM (296 bp) den LB3 Ter- minator.

Weiterhin beinhaltet Fragment AP3P PROM (765 bp) den AP3P-Promo- ter, Fragment rbcs TP FRAGMENT (194 bp) das Transitpeptid des rbcS Gens aus Erbse, NP196 KETO CDS (761 bp) die Ketolase aus No- stoc punctiforme ATCC29133, und OCS TERM (192 bp) das Polyadeny- lierungssignal des Octopin-Synthasegens.

Weiterhin beinhaltet Fragment PDS PROM (2078 bp) den PDS Promo- ter, Fragment BGEN CDS (1. 497 bp) die B-Gen Sequenz, und Fragment 35S TERM (746 bp) den 35S Terminator.

Beispiel 20 : Herstellung transgener Lycopersicon esculentum Pflanzen Transformation und Regeneration von Tomatenpflanzen wurde in Bei- spiel 6 beschrieben.

Gemäß der beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgen- den Expressionskonstrukten folgende Linien erhalten : Mit MSP120 wurde erhalten : MSP120-1, MSP120-2, MSP120-3 Mit MSP121 wurde erhalten : MSP121-1, MSP121-2, MSP121-3 Mit MSP122 wurde erhalten : MSP122-1, MSP122-2, MSP122-3 Mit MSP123 wurde erhalten : MSP123-1, MSP123-2, MSP123-3 Mit MSP124 wurde erhalten : MSP124-1, MSP124-2, MSP124-3