LEISHMANIOSES

A presente invenção se refere ao uso dos antígenos recombinantes HSP 83-1 , MAPK e MAPK3, proteínas presentes em protozoários do género Leishmania, na produção de vacinas e kit diagnóstico contra leishmanioses para seres humanos e/ou cães. Esses antígenos foram selecionados por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. A reação de ELISA com anticorpos anti-HSP 83-1 , anti-MAPK e anti- MAPK3 permitiu identificar corretamente os cães não infectados e os cães infectados. Os resultados obtidos foram validados por testes de referência para diagnóstico de Leishmaniose Visceral Canina (LVC) (Kit EIE-LVC - Bio- Manguinhos ^® ).

As Heat shock proteins (HSP) são moléculas altamente conservadas que exercem importante papel no dobramento, montagem de proteínas e translocação de proteínas através de compartimentos celulares. Devido ao fato destas proteínas serem altamente conservados em Leishmania sp, associado ao fato da prevalência de mais de uma espécie de Leishmania em áreas endémicas, o uso destas proteínas como antígeno vacinai poderia gerar uma imunidade protetora contra espécies responsáveis pelas formas cutâneas e visceral da leishmaniose (KAUFMANN S.H.E. Heat shock proteins and the immune response. Immunology Today, v. 1 1 , p. 129-136, 1990). Adicionalmente, estudos tem demonstrado que estas proteínas possuem efeito mitogênico sobre linfócitos B e esplenócitos, sugerindo que possuem papel proliferativo, o qual poderia ser explorado para estratégias vacinais (RICO, A. I. et al. The heat shock proteins, HSP70 and HSP83, of Leishmania infantum are mitogens for mouse B cells. Celi Stress and Chaperones, v.7, 339-346, 2002).

As proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) representam uma família de serina-treonina quinases envolvidas na regμLação de uma ampla variedade de respostas celulares (Cross, T. et al. Serine/threonine protein kinases and apoptosis. Experimental Celi Research, v.256, p.34-41 , 2000). As MAPKs transmitem sinais extracelulares captados por receptores de membrana após variados estímulos, inclusive estresse e, através da fosforilação de substratos específicos em resíduos de serina e treonina essas enzimas podem regular positiva ou negativamente o substrato, modulando, assim, a expressão gênica, mitose, motilidade, metabolismo, proliferação, diferenciação, sobrevivência, interrupção do ciclo celular e apoptose (SU, B. et al. Mitogen-activated protein kinase cascades and regulation of gene expression. Current Opinion in Immunology, v.8, p.402-41 1 , 1996; Wada, T. et al. Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene, v.23, p.2838-2849, 2004).

O projeto genoma de Leishmania revelou que estes parasitos codificam em torno de 197 proteínas MAPKs e MAPKs-//7 e, representando aproximadamente 2% do genoma e sugerindo que estas proteínas apresentam importante papel no ciclo biológico do parasito (Parsons, M. et al. Comparative analysis of the kinomes of three pathogenic trypanosomatids: Leishmania major, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. BMC Genomics, v.6, p.127, 2005). Algumas dessas proteínas foram previamente identificadas como importantes para mecanismos de virulência do parasito, bem como na biogênese flagelar (Rotureau, B. et al. The flagellum-MAP kinase connection in trypanosomatids: a key sensory role in parasite signaling and development- CelluLar Microbiology, v.1 1 , p.710-718, 2009). Adicionalmente, estudos funcionais demonstraram que alterações nas vias que estas proteínas estão envolvidas implicam negativamente na patogenicidade destes parasitos, fato este que torna as MAPKs como possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas (NauLa, C. et al. Protein kinases as drug targets in trypanosomes and Leishmania. Biochimica et Biophysica Acta, v.1754, p.151 -159, 2005). Neste contexto, o amplo número de proteínas desta família e a alta homologia entre estas proteínas associado à importância delas em estágios evolutivos encontrado no hospedeiro vertebrado, pode ser empregado como estratégia para desenvolvimento de testes de diagnóstico e imunobiológicos vacinais para leishmanioses.

Atualmente, são encontrados no estado da arte alguns documentos descrevendo estudos relacionados à família de proteínas HSP 83, principalmente no que se refere ao seu uso no diagnóstico de leishmanioses. Skeiky e colaboradores identificaram que a proteína HSP 83 de Leishmania é um antígeno dominante que contribui para a resposta imunológica específica associada a anticorpos da subclasse lgG4 em pacientes brasileiros com leishmaniose cutânea difusa, sendo assim um potencial antígeno importante no diagnóstico da infecção por L. amazonensis (SKEIKY, Y. A. W. et ai. Association of Leishmania Heat Shock Protein 83 Antigen and lmmunoglobμLin G4 Antibody Titers in Brazilian Patients with Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. Infection and Immunity, v. 65, n. 121997, p. 5368-5370, 1997).

Já o trabalho de Celeste e colaboradores analisou o uso da proteína HSP 83 recombinante em ELISA para o diagnóstico de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Esta proteína foi reconhecida por anticorpos anti-HSP 83 de L. infantum presentes no soro dos pacientes testados, além de não ter exibido reação cruzada com soro de pacientes manifestando doença de Chagas. Assim, a HSP 83 de L. infantum pode ser considerada um bom antígeno para sorodiagnostico de leishmaniose tegumentar (CELESTE, B. J. et al. Leishmania infantum heat shock protein 83 for the serodiagnosis of tegumentary leishmaniasis. Brazilian Journal of Medicai and Biológica! Research, v. 37, p. 1591 -1593, 2004).

Outro exemplo é o estudo realizado por Angel e colaboradores, no qual o gene de HSP 83 de L. infantum foi clonado e caracterizado molecularmente e avaliado como útil no sorodiagnostico de leishmaniose canina (ANGEL, S. O. et ai. During canine leishmaniasis a protein belonging to the 83-kDa heat-shock protein family elicits a strong humoral response. Acta Trópica, v.62, p. 45-56, 1996).

Badaro e colaboradores desenvolveram um estudo no qual pacientes com leishmaniose mucosa e apresentando resistência à medicação foram tratados com uma combinação de antígenos, dentre eles HSP 83 de L. braziliensis, cujo reconhecimento pelo soro de pacientes ou por células in vitro já era relatado no estado da técnica. Todos os pacientes tratados apresentaram remissão clínica da doença e permaneceram assintomáticos algum tempo após o término do tratamento, indicando que a terapia com a combinação de determinados antígenos é segura e eficaz (BADARO, R. et ai Immunotherapy for Drug-Refractory Mucosal Leishmaniasis. The Journal of Infectious Diseases, v. 194, p. 1 151 -1 159, 2006).

Entretanto, são escassos os trabalhos que investigam o padrão de expressão desta família de proteínas HSP 83-1 em parasitos do género Leishmania no sentido de identificar o potencial destas proteínas como composto imunogênico para vacinas. O mesmo é verificado em relação às MAPKs, em que se encontra no estado da arte alguns documentos descrevendo estudos relacionados à família dessas proteínas, mas são encontrados poucos trabalhos com o objetivo pleiteado para a presente invenção, que é o desenvolvimento de kit diagnóstico e vacinas com esta proteína.

Apesar da extensiva busca por imunobiológicos mais sensíveis e específicos para vacinas contra leishmanioses, ainda são necessárias melhorias na eficácia destes métodos em diagnosticar a doença nos principais hospedeiros envolvidos no ciclo de vida do parasito, quais sejam o homem e os cães. Assim, a presente invenção é apresentada como uma alternativa para solucionar este problema. Trata-se do uso da forma recombinante das proteínas HSP 83-1 , MAPK e MAPK3 de Leishmania como antígeno para método diagnóstico e vacinas contra leishmanioses em cães e/ou humanos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral anti-HSP 83-1 de Leishmania (Viannia) braziliensis e do kit EIE-LVC (Bio-Manguinhos®) em soro de cães de área endémica para Leishmaniose Visceral Canina. O eixo X representa os grupos avaliados: cães não infectados (Negativo, n = 51 ) e cães infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi (Positivo, n = 52). Já o eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1 :100. O símbolo ( ^* ) significa cut off obtido pela curva ROC. O símbolo (#) significa cut off obtido de acordo com a recomendação do fabricante (duas vezes a média do valor obtida para o controle negativo que faz parte do kit de diagnóstico). A Figura 2 apresenta um gráfico comparando as curvas ROC obtidas da ELISA para HSP 83-1 (A) e do Kit EIE-LVC (Bio-Manguinhos®) (B). Essas curvas foram utilizadas para determinar o cut off, sensibilidade, especificidade e área abaixo da curva (AUC) da técnica de ELISA.

A Figura 3 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral anti-MAPK e anti-MAPK3 de Leishmania (Viannia) braziliensis e do kit EIE-LVC (Bio-Manguinhos ^® ) em soro de cães de área endémica para Leishmaniose Visceral Canina. O eixo X representa os grupos avaliados: cães não infectados (Negativo, n = 12) e cães infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi (Positivo, n = 18). Já o eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1 :100.

A Figura 4 apresenta um gráfico comparando as curvas ROC obtidas da ELISA de MAPK e MAPK3. Essas curvas foram utilizadas para determinar o cut off, sensibilidade, especificidade e área abaixo da curva (AUC) da técnica de ELISA.

A Figura 5 apresenta um gráfico com os resultados obtidos no ensaio de ELISA para HSP 83-1 que mostra produção de anticorpos após a imunização com adjuvante (MPLA) e adjuvante mais proteína (HSP+MPLA). Diferença significativa de P < 0,0001 .

A Figura 6 apresenta um gráfico com os resultados obtidos nos ensaios de ELISA para as proteínas MAPK1 e MAPK3. Em ambos os ensaios, a produção de anticorpos, após a imunização com adjuvante (MPLA) e adjuvante mais proteína (MAPK1 +MPLA e MAPK3+MPLA), foi maior quando usada a proteína na forrr^Lação. Diferença estatísticas de P = 0,0003 para MAPK1 e P = 0,0022 para MAPK3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao uso dos antígenos recombinantes HSP 83-1 , MAPK e MAPK3, presentes em protozoários do género Leishmania, para diagnóstico e formulação de vacina para as leishmanioses em seres humanos e/ou cães. Esses antígenos foram selecionados por meio de análise de bioinformática, envolvendo algoritmos de imunoproteômica e filogenia. De modo geral, sequências de aminoácidos das proteínas dos parasitos Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) mexicana foram obtidas do proteoma predito, a partir do banco de dados GeneDB (http://www.genedb.org), onde foi gerado um sub- banco após a exclusão de pseudogenes e genes parciais.

Em seguida, as sequências de proteínas selecionadas anteriormente foram submetidas à análise de similaridade contra sequências do banco de dados ImmunoneBase (http://bioinf.uta.fi/lmmunomeBase/home.html), o qual contém sequências de proteínas intrinsecamente relacionadas ao sistema imunológico do hospedeiro e/ou à defesa contra patógenos (RANNIKKO, K. et al. Immunity genes and their orthologs: a multi-species database. International Immunology, v.19, p.1361 -1370, 2007), utilizando o algoritmo BLASTP (Basic Local Aligment Search Tool, Disponível em http://www.genbank.nlm.nih.gov). Proteínas apresentando homologia com proteínas de referência depositadas no ImmunoneBase das espécies Homo sapiens (1375 entradas) e Mus muscμLus (1 181 entradas) foram selecionadas e submetidas ao programa ΜμΙ_ΐίΙ_οο (http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc ) para predição de localização ce^Lar. Para realizar essa classificação, o programa baseia-se na análise da presença de peptídeo sinal N-terminal, na identificação de domínios conservados, os quais estão presentes em famílias de proteínas com localização celular específica, e na composição de aminoácidos (Hõglund, A. et al. Significantly improved prediction of subcellular localization by integrating text and protein sequence data. Pacific symposium on biocomputing, p.16-27, 2006).

As sequências destas proteínas selecionadas foram analisadas no software Pfam 24.0 (http://pfam.sanger.ac.uk/), o qual contém um amplo banco de dados de famílias e domínios conservados de proteínas, bem como informações sobre as funções biológicas dessas ιηοΙέομί35 (PUNTA, M. et al. The Pfam protein families database. Nucleic Acids Research, v. 40, p. 290-301 , 2012). A partir dessa análise, foi identificada a presença de domínios protéicos potencialmente capazes de atuar como proteínas de interação ("protein-protein interaction", 917 entradas) nas sequências, servindo então como critério de seleção de proteínas para serem utilizadas nas etapas seguintes do presente trabalho, dentre elas a HSP 83-1 , MAPK e MAPK3. Todas as análises in silico foram realizadas no servidor do laboratório, onde estão instalados os programas supracitados.

A presente invenção pode ser melhor compreendida, mas de modo não limitante, com os exemplos a seguir.

Exemplo 1 : Clonagem do gene codificador das proteínas HSP 83-1 , MAPK e MAPK3

Prímers específicos para a amplificação por PCR {Polimerase Chain Reaction) dos genes completos de HSP 83-1 , MAPK e MAPK3 foram desenhados (HSP 83-1 : SEQ ID N ^Q 1 e SEQ ID N ^Q 2; MAPK: SEQ ID N ^Q 3 e SEQ ID N ^Q 4; MAPK3: SEQ ID N ^Q 5 e SEQ ID N ^Q 6), de forma a amplificar toda a sua região codificadora. Foram inseridos sítios de restrição para Nhel nas extremidades 5' dos prímers senso das três proteínas (SEQ ID N ^Q 1 , SEQ ID N ^Q 3 e SEQ ID N ^Q 5). Já para os prímers antisenso, foi inserido o sítio de restrição para Hindlll na HSP 83-1 (SEQ ID N ^Q 2), para Xhol na MAPK (SEQ ID N ^Q 4) e para BamHI na MAPK3 (SEQ ID N ^Q 6), todos nas extremidades 5' dos prímers. Isso foi feito para facilitar a transferência dos amplicons entre os vetores de clonagem (pGEM ^® -T, Promega) e de expressão (pET28a-TEV).

As amplificações por PCR foram realizadas utilizando como molde 20- 100 ng de DNA genômico extraído de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) mexicana, além de tampão de reação comercial, 50-200μΜ de dNTP, 2-10 ng de cada um dos prímers senso (SEQ ID N ^Q 1 ) e antisenso (SEQ ID N ^Q 2), e 0,5-1 ,25 U de Taq polimerase de alta fidelidade, em um volume final de 30-50 μΙ_ de reação.

Os amplicons obtidos nas PCRs foram misturados com tampão de amostra de DNA em concentração final de 1 X e submetidos à separação em gel de agarose 1 %, a 100-200 V, em tampão TAE 1 X contendo brometo de etídio. Após a separação, as bandas com tamanho de 21 15 pares de base (pb) (HSP 83-1 ), 1092 pb (MAPK) e 1 167 pb (MAPK3) foram excisadas do gel. O bloco de agarose contendo os amplicons desejados foi submetido à purificação utilizando um kit comercial. O DNA purificado foi, então, clonado no vetor pGEM ^® -T, através de incubação por 12-16 horas, a temperatura de 2-8 ^Q C, com a enzima T4-ligase, seguindo as instruções do fabricante. Este vetor possui gene de resistência à ampicilina para seleção de transformantes positivos.

Cerca de 1 -10 μΙ_ dos sistemas de ligação foram incubados por 5-10 minutos no gelo com 50-100 μΙ_ de bactérias Escherichia coli eletrocompetentes da cepa XL1 -Blue. Após este período, as amostras foram transferidas para cubetas de 0,1 cm e submetidas a um pulso de 2,00-2,50 kV em um eletroporador. Após a eletroporação, foram adicionados 50-300 μΙ_ do meio de cultura 2xYT líquido, seguido por incubação durante 1 hora, a 30-37 ^Q C e sob agitação (180-200 rpm). Após este período, as amostras foram plaqueadas em meio sólido 2xYT-ágar 1 ,5% com ampicilina (20-100 pg/mL). As placas foram colocadas em estufa durante 12-16 horas, para obtenção de colónias isoladas.

Os clones positivos obtidos foram inoculados em 3-10 mL de meio 2xYT, contendo ampicilina e cultivados durante 12-16 horas, a 30-37 ^Q C e sob agitação (180-200 rpm). A extração dos plasmídeos foi realizada utilizando um kit comercial.

Os plasmídeos contendo os insertos {amplicons) foram submetidos a dupla digestão, durante 12-16 horas, a 30-37 ^Q C, com as enzimas de restrição Nhel e Hindlll para HSP 83-1 , Nhel e Xhol para MAPK e Nhel e BamHI para MAPK3, cujos sítios específicos estão presentes nas extremidades do amplicon. Após a digestão, as amostras foram submetidas à eletroforese e os insertos obtidos (21 15 pb da HSP 83-1 , 1092 pb da MAPK e 1 167 pb da MAPK3), foram purificados do gel de agarose.

Exemplo 2: Expressão das proteínas HSP 83-1 , MAPK e MAPK3 em E. coli

A ligação entre os fragmentos clonados, obtidos por digestão enzimática dos plasmídeos, conforme descrito no exemplo anterior, e o vetor pET28a-TEV, que também foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Hindlll para HSP 83-1 , Nhel e Xhol para MAPK e Nhel e BamHI para MAPK3, e possui o gene de resistência à kanamicina para seleção positiva dos transformantes, foi realizada através de suas extremidades coesivas, por incubação a temperatura de 2-8 ^Q C, durante 12-16 horas, com a enzima T4 Ligase em tampão comercial específico. Após a incubação, o produto de ligação foi utilizado na transformação de bactérias Escheríchia coli, cepa BL-21 Star, através de eletroporação.

Colónias isoladas de BL-21 Star apresentando o plasmídeo pET28a-TEV que contém o gene que codifica a proteína HSP 83-1 , MAPK e MAPK3 foram inoculadas em 3 ou 20 mL de meio 2xYT líquido contendo kanamicina (10-50 pg/mL) e incubadas por 12-16 horas sob a agitação (180-200 rpm). Após este período, os inóculos foram diluídos 1 :20 em 10 ou 400 mL de meio 2xYT contendo kanamicina (10-50 pg/mL) e incubados a 30-37 ^Q C, sob agitação (180- 200 rpm) até atingirem densidade óptica (DO600) de 0,6-0,8. Em seguida, a expressão das proteínas recombinantes foi induzida através da adição de 0,5- 1 ,0 mM IPTG, sendo as culturas, então, incubadas por 3-12 horas, a 30-37 ^Q C e sob agitação (180-200 rpm). Finalizado o tempo, as ομίΐυ^ε foram centrifugadas a 3000-6000 rpm, por 10-30 minutos e a 4 ^Q C, o sobrenadante foi descartado e o pellet residual foi imediatamente congelado em nitrogénio líquido e armazenado a -80 ^Q C. Alíquotas das culturas imediatamente antes da adição de IPTG, e após 3-12 horas de expressão, foram também congeladas para confirmar a expressão das proteínas recombinantes.

Os sedimentos celulares mantidos a -80 ^Q C foram descongelados no gelo e ressuspendidos em 5-50 mL de PBS para cada 50-500 mL de cultura inicial, na presença de lisozima (20-100 pg/mL), sendo, então, homogeneizados e deixados em repouso por 15-30 minutos. Após o repouso, as alíquotas foram submetidas a 4-5 ciclos de congelamento em nitrogénio líquido e descongelamento em banho-maria à 37 ^Q C e passadas exaustivamente em seringas de insulina. As amostras foram centrifugadas por 10 a 30 minutos a 10000-14000 rpm, a 4 ^Q C, para separação das frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel {pellet). Amostras destas duas frações foram analisadas em eletroforese gel de poliacrilamida-SDS para avaliar em qual fração a proteína recombinante se encontra. Quando as proteínas se apresentaram insolúveis, foi adicionado ao tampão de ressuspensão 4-8 mol.L ^{" 1} de uréia para torná-las solúveis.

O extrato protéico da fração sobrenadante do teste solubilidade foi aplicado em uma coluna HisTrap HP de 1 mL (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi primeiramente lavada com 5 volumes de coluna com o tampão A (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 30mM). A eluição foi realizada através da adição do tampão B (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 500mM). Todas as frações obtidas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.

As amostras obtidas nas expressões e purificações foram submetidas à separação por eletroforese em gel de poliacrilamida, utilizando Bis-acrilamida 40%. Após a corrida, os géis foram corados por incubação por 12-16 horas com a solução de Coomassie Blue e então, descorados em solução etanol 30% e ácido acético 10%.

As proteínas recombinantes purificadas e peptídeos foram analisados em espectrômetro de massas, tipo MALDI, Bruker Daltonic sautoflex III smartbeam.

Exemplo 3: Teste para imunodiagnóstico de leishmaniose

O teste para imunodiagnóstico de leishmaniose pode ser selecionado do grupo compreendendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão e imunocromatografia. A técnica de ELISA foi escolhida na presente invenção por ser menos invasiva, de fácil execução e automação, permitindo estudos e aplicação em grande número de amostras.

Os ensaios de ELISA foram realizados utilizando as proteínas recombinantes HSP 83-1 , MAPK e MAPK3, obtidas conforme descrito nos exemplos anteriores, ou o extrato bruto dos parasitos como antígeno. Placas de ELISA 96 poços foram sensibilizadas por 12-16 horas a 2-8 ^Q C com 0,005- 0,500 μg de antígeno diluído em tampão carbonato. Após a sensibilização, a placa foi bloqueada com PBS acrescido de 1 ,0-2,5% de BSA durante 30-60 minutos, a 25-37 ^Q C. Após o bloqueio, toda a solução dos poços foi removida por aspiração. A seguir, 50-100 μΐ dos soros diluídos 1 :100 em PBS com 1 ,0- 2,5% de BSA foram adicionados aos poços e incubados a 25-37 ^Q C por 30-60 minutos. As placas foram lavadas 4 vezes com a solução de lavagem (PBS- 0,05% Tween20) e, em seguida, foi adicionado aos poços 50-100 μΙ_ do anticorpo anti-lgG humano ou canino diluído 1 :5000 em PBS-BSA 1 ,0-2,5%. Após incubação a 37 ^Q C por 30-60 minutos, as placas foram novamente lavadas por quatro vezes com a solução de lavagem, e 100 μΙ_ da solução reveladora, contendo ácido cítrico 0,1 M, Na ₂ PO ₄ 0,2 M, TMB 0,05% e H ₂ O ₂ 0,1 % foram adicionados. As placas foram incubadas a 25-37 ^Q C ao abrigo de luz por 10 a 30 minutos com a solução reveladora, quando a reação foi interrompida pela adição de 50-100 μΙ_ de H ₂ SO ₄ 2M. A absorbância de cada proteína foi lida em leitor de ELISA a 450 nm e os resμLtados obtidos podem ser observados nas Figuras 1 e 3.

Avaliando os dados obtidos, a ELISA-HSP 83-1 , ELISA-MAPK e ELISA- MAPK3 apresentaram melhor desempenho na capacidade simultânea de detectar resultados positivos e negativos, avaliados pela sensibilidade e especificidade (Figuras 2 e 4), quando comparado ao Kit EIE-LVC com cut off obtido pela forma recomendada pelo fabricante (Tabela 1 ). Além disso, avaliando a área abaixo da curva (AUC), observou-se que o teste ELISA-MAPK e ELISA-MAPK3 apresentaram valores próximos de 1 ,0 (0,9872 e 1 ,000 respectivamente), sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios (Tabela 1 ).

Tabela 1 : Performance de diagnóstico em amostras de soro de cães portadores de LVC utilizando ELISA-MAPK e ELISA-MAPK3 e EIE-LVC Kit. Símbolos: ^* cut off obtido pela curva ROC; ^# cut off obtido de acordo com o fabricante. Abreviações: NA: não aplicável; FN: falso negativo; FP: falso positivo;Se: sensibilidade; Es: especificidade; AUC: área abaixo da curva; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo; RP+ (Razão de probabilidade positiva); RP- (Razão de probabilidade negativa); J: índice Youden: AC: acurácia Teste de diagnóstico F FP Se (% ) Ep (% ) AUC VPP VPN RP+ RP- AC

HSP 83-1 3/52 5/130 94,23 96,15 0,9861 90,74 97,66 >10,00 0,06 0,9560

EIE-LVC Kit* 2/52 7/51 96,15 86,27 NA 87,72 96,65 7,01 0,04 0,9126

EIE-LVC Kit* 6/52 2/51 88,46 96,08 0,9815 95,83 89,09 >10,00 0,12 0,9223

MAPK1 2/18 0/12 88,89 100,00 0,9872 100,00 85,71 >10,00 0,11 0,9333

MAPK3 0/18 0/12 100,00 100,00 1,000 100,00 100,00 >10,00 0,00 1,000

Conforme descrito na Tabela 1 , o resultado dos valores preditivos positivo (VPP), negativo (VPN), razão de probabilidade positiva (RP+) se apresentaram maiores também na ELISA-HSP 83-1 (90,74 e 97,66), ELISA- MAPK 1 (100,00 e 85,71 ) e ELISA-MAPK3 (100,00 e 100,00), em comparação ao Kit EIE-LVC* (87,72 e 96,65) e Kit EIE-LVC ^* (95,83 e 89,09). Os valores para a razão de probabilidade positiva (RP+) se apresentaram maiores para ELISA-HSP 83-1 (>10,0), ELISA-MAPK1 (>10,0) e ELISA-MAPK3 (>10,0) quando comparado ao kit EIE-LVC* (7,01 ) com cut-off ajustado de acordo com fabricante e menores valores para razão de probabilidade negativa (RP-) para ELISA-HSP 83-1 (0,06), MAPK1 (0,01 1 ) e MAPK3 (0,00) quando comparado ao kit EIE-LVC ^* (0,12), sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pela ELISA-HSP 83-1 , ELISA-MAPK1 e ELISA-MAPK3 estar correto é significativamente maior do que os resultados obtidos pelo teste de referência Kit EIE-LVC. Em adição, os valores para acurácia para ELISA-HSP 83-1 (0,9560), ELISA-MAPK (0,9333) e ELISA-MAPK3 (1 ,0000) estão mais próximos de 1 ,0000 quando comparado ao obtido pelo kit EIE-LVC* (0,9126) e kit EIE-LVC ^* (0,9223), indicando menor proporção total de erros de classificação no diagnóstico, classificando ELISA-HSP 83-1 , ELISA-MAPK e ELISA-MAPK3 como melhores opções para diagnóstico da LVC.

Adicionalmente, através da análise de concordância utilizando o índice Kappa entre as técnicas avaliadas (Tabela 2), observou-se que a técnica de ELISA-MAPK e ELISA-MAPK3 apresentaram concordância considerada boa com a técnica EIE-LVC Kit* Entre as técnicas EIE-MAPK e EIE-MAPK3 a concordância foi considerada muito boa

Tabela 2: índice Kappa (k) entre os resultados dos testes de diagnóstico utilizando a proteína recombinante Mitogen-activated protein kinase e Mitogen- activated protein kinase 3 e análise comparativa com o kit de diagnóstico EIE- LVC. Símbolos: ^* cut o obtido pela curva ROC; cut off obtido de acordo com o fabricante. Abreviações: P: positivo; N: negativo; T: total; IC: Intervalo de confiança.

Teste de diagnóstico EIE-LVC* Mitogen-activated prot ein kinase 3*

P N T P N T

P 16 1 17 16 0 16

Mitogen-activated

prole i li kinase* N 2 11 13 2 12 14

T 18 12 30 18 12 30

K índex (95% IC) 0,575 (0,575-1,014) - Boa 0,865 (0,686-1,044) - Muito boa

P 16 1 17

Mitogen-activated

prole i li kinase 3* N 2 11 13

T 18 12 30

K índex (95% IC) 0,575 (0,575-1,014) - Boa

Portanto, a reação de ELISA mostrou-se útil em identificar corretamente os cães não infectados e os cães infectados, validado por testes de referência para diagnóstico para LVC Kit EIE-LVC (Bio-Manguinhos ^® ). Estes dados permitem concluir pela validade das reações sorológicas utilizadas para o diagnóstico da LVC.

Exemplo 4: Imunização de camundongos com formulação contendo proteína HSP 83-1 recombinante

Camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas foram utilizadas de acordo com as diretrizes éticas institucionais para o experimento vacinai. As imunizações foram administradas por via subcutânea e o esquema do ensaio foi de 3 doses a cada 15 dias. Os animais foram divididos em dois grupos, para cada proteína, com 12 animais cada, sendo um grupo imunizado somente com o adjuvante (MPLA) e o outro com o adjuvante mais as proteínas recombinantes e purificadas (HSP+MPLA, MAPK1 +MPLA ou MAPK3+MPLA) obtida conforme descrito no Exemplo 2. As formulações continham 50 ng a 50 μg de proteína. Antes de cada dose ser administrada, o sangue era coletado e centrifugado para a separação do soro, que foi usado para os ensaios de ELISA.

Os ensaios de ELISA foram realizados utilizando placas de ELISA Half Área (Greiner-Bio-One) que foram sensibilizadas por 12-16 horas a 4 ^Q C com 1 ug da proteína purificada em 25μΙ_ de água MilliQ autoclavada. Após a sensibilização, a placa foi bloqueada com 150μΙ_ de PBS acrescido de 5% de BSA durante 1 hora a 37 ^Q C. Após o bloqueio, toda a solução dos poços será removida por aspiração. A seguir, 50μΙ_ dos soros dos animais imunizados diluídos 1 :100 em PBS com BSA 2,5% foram adicionados aos poços e incubados a 37 ^Q C por 1 hora. As placas foram lavadas 4 vezes com a solução de lavagem (PBS-0,05% Tween20) e 50μΙ_ o anticorpo anti-lgG anti-mouse diluído 1 :2.000 em PBS-BSA 2,5% foi adicionado. Após a incubação a 37 ^Q C por 1 hora, as placas foram novamente lavadas por quatro vezes com a solução de lavagem, e 100μΙ_ da solução reveladora, contendo ácido cítrico 0,1 M, Na ₂ PO ₄ 0,2 M, OPD 0,05% e H ₂ O ₂ 0,1 % foram adicionados. As placas foram incubadas a 37 ^Q C ao abrigo de luz por 15 minutos com a solução reveladora, quando a reação foi interrompida pela adição de 50 μΙ_ de H ₂ SO ₄ . A absorbância resultante foi lida em leitor de ELISA a 492 nm.

Conforme se observa nas Figuras 5 e 6, as reações de ELISA com anticorpos anti-HSP 83-1 , anti-MAPK1 e anti-MAPK3 permitiram demonstrar que há reconhecimento destas proteínas recombinantes produzidas pelo soro de camundongos, indicando que a HSP 83-1 , MAPK e MAPK3 são importantes candidatas a antígeno vacinai contra leishmanioses.