Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure- Bibliothek mit mindestens zwei benachbarten variablen Codon- Tripletts.

In der biomedizinischen Forschung werden häufig DNAs mit definierten Sequenzen benötigt, um bestimmte Zusammenhänge besser erforschen zu können. Beispielsweise werden Genbibliotheken für Antikörper benötigt, die Codon- Tripletts für unterschiedliche Aminosäuren an speziellen Schlüsselpositionen aufweisen, um optimierte Antikörper für bestimmte Zwecke identifizieren zu können. Hierbei werden häufig synthetisch hergestellte DNAs bevorzugt, die jeweils definierte Sequenzbereiche und variable Sequenzbereiche umfassen.

EP 21 10435 B1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure- Bibliothek mit einer Vielzahl von Elementen, wobei jedes Element einen ersten, einen zweiten und einen dritten Nukleotid- Abschnitt umfasst. Die Sequenz des ersten und des dritten Nukleotid- Abschnitts sind in den verschiedenen Elementen jeweils identisch, während sich die Elemente der Nukleinsäure- Bibliothek in der Sequenz des zweiten Abschnitts unterscheiden. Das Verfahren verwendet ein erstes zumindest teilweise doppelsträngiges Oligonukleotid mit einem einzelsträngigen Überhang, der die Sequenz des ersten oder dritten Nukleotid- Abschnitts umfasst. Dieses wird mit einer

Oligonukleotid- Bibliothek verbunden. Diese besteht aus zweiten zumindest teilweise doppelsträngigen Oligonukleotiden, die einen komplementären Überhang aufweisen. Das Ligationsprodukt wird geschnitten und mit einer zweiten Oligonukleotid- Bibliothek zu einem zweiten Ligationsprodukt kombiniert. Diese Schritte werden so oft durchgeführt, bis der variable mittlere Teil mit der gewünschten Anzahl variabler Codon- Tripletts vollständig synthetisiert ist. Nachteilig ist insbesondere, dass in jedem Schritt die

Verlängerung nur um jeweils ein Codon- Triplett erfolgt. Zudem muss jedes erste

Ligationsprodukt aus der ersten Oligonukleotid- Bibliothek mit jedem Oligonukleotid der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek kombiniert werden. Dies bedingt einen hohen apparativen und rechnerischen Aufwand.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure- Bibliotheken mit mindestens zwei benachbarten variablen Codon- Tripletts bereitzustellen, bei dem der apparative Aufwand gegenüber herkömmlichen Methoden verringert ist. Die obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale in dem Patentanspruch 1 umfasst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen werden durch die Unteransprüche beschrieben.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer DNA- Sequenz für eine Nukleinsäure- Bibliothek mit einer Vielzahl von Elementen. Die DNA- Sequenz umfasst jeweils mindestens drei Bereiche. Der erste und der dritte Bereich weisen jeweils eine definierte Sequenz auf, die in allen Elementen der Nukleinsäure- Bibliothek jeweils identisch ist. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Nukleinsäure- Bibliotheken, bei denen im mittleren zweiten Bereich jeweils mindestens zwei benachbarte variable Codon- Tripletts angeordnet sind. Dies ist insbesondere wichtig, um den Austausch benachbarter Aminosäuren, beispielsweise im aktiven Zentrum von Proteinen, gezielt untersuchen zu können.

Das Verfahren wird mit mindestens zwei Oligonukleotid- Bibliotheken und mindestens zwei weitgehend komplementären einzelsträngigen Oligonukleotiden oder Komplementär- Oligonukleotid- Bibliotheken durchgeführt, die die nachfolgend

beschriebenen Eigenschaften aufweisen:

Eine erste Oligonukleotid- Bibliothek besteht aus Oligonukleotiden mit jeweils einer Teilsequenz, die dem definierten ersten Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek entspricht. Danach ist mindestens ein erstes variables Codon- Triplett und daran anschließend ein erster Teilbereich eines Spacer- Elementes und ein definierter 3' Überhang angeordnet.

Ein erstes komplementäres Oligonukleotid ist zumindest weitgehend komplementär zu den Oligonukleotiden der ersten Oligonukleotid- Bibliothek aufgebaut. Insbesondere weist es eine Teilsequenz auf, die komplementär zum ersten Teilbereich des Spacer- Elementes der ersten Oligonukleotid- Bibliothek ausgebildet ist. Weiterhin umfasst das erste komplementäre Oligonukleotid mindestens ein erstes weitgehend komplementärvariables Codon- Triplett und eine Teilsequenz, die komplementär zum definierten ersten Bereich der Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek aufgebaut ist. Das komplementär- variable Codon- Triplett wird vorzugsweise durch drei so genannte „Universal- Basen" oder durch ein Gemisch aus allen vier kanonischen Nukleotiden gebildet. Unter„Universal- Basen" versteht man Nukleotide, die jede der vier üblichen

Nukleotide Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin ersetzen können, ohne benachbarte Basenpaar-Wechselwirkungen signifikant zu destabilisieren oder deren biochemische Wirkungsweise im modifizierten Oligonukleotid zu stören. Oligonukleotide mit einem universellen Nukleotid können problemlos als Primer bei der DNA- Sequenzierung etc. eingesetzt werden und stören auch nicht bei enzymatischen Reaktionen mit Polynukleotidkinase, DNA- Ligase und anderen Enzymen. Solche„Universal- Basen" sind beispielsweise bekannte Analoga zu den kanonischen Basen der natürlichen

Nukleinsäuren, die mit allen natürlichen Basen aus DNA und RNA komplementäre Basenpaarungen ausbilden können. Inzwischen wurden auch schon synthetisch „Universal- Basen" hergestellt, die mit den Nukleotiden dA, dC, dG oder dT

Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden, ohne die Watson- Crick- dsDNA- Struktur zu destabilisieren. Zu den inzwischen bekannten„Universal- Basen" zählen Nukleoside des 3-Methyl-7-Propinylisocarbostyril (PIM), 3-Methylisocarbostyril (MICS), 5- Methylisocarbostyril (5MICS), 3-Nitropyrrol, 5-Nitroindol und 2'-Desoxyinosine (dl).

Eine zweite Oligonukleotid- Bibliothek umfasst Oligonukleotide mit einer

Teilsequenz, die den zweiten Teilbereich des Spacers bildet, mindestens einem zweiten variablen Codon- Triplett und eine Teilsequenz, die dem definierten zweiten Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek entspricht. Ein zweites komplementäres Oligonukleotid ist weitgehend komplementär zu den Oligonukleotiden der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek ausgebildet, mit jeweils einer Teilsequenz, die komplementär zum zweiten Bereich der Oligonukleotide der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek ausgebildet ist, mindestens einem zweiten komplementär- variablen Codon- Triplett, einer Teilsequenz, die komplementär zum zweiten Teilbereich des Spacers der Oligonukleotide der weiten Oligonukleotid- Bibliothek ausgebildet ist und einen daran anschließenden definierten 3' Überhang.

Anstelle der beschriebenen Oligonukleotid- Bibliotheken und entsprechenden weitgehend komplementären Oligonukleotiden können auch eine erste Oligonukleotid- Bibliothek und ein zweites komplementäres Oligonukleotid ohne 3' Überhang verwendet werden. Stattdessen werden zwei Oligonukleotide und zwei Oligonukleotid- Bibliotheken verwendet, wobei das erste komplementäre Oligonukleotid und die zweite Oligonukleotid- Bibliothek jeweils einen 5' Überhang aufweisen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die definierten 3' Überhänge der Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek und des zweiten komplementären Oligonukleotids bzw. die definierten 5' Überhänge der Oligonukleotide der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek und des ersten komplementären Oligonukleotids jeweils dieselbe Anzahl von Nukleotiden und sind zueinander zumindest weitgehend komplementär.

Zur Herstellung der gewünschten Nukleinsäure mit mindestens zwei benachbarten variablen Codon- Tripletts werden folgende Verfahrensschritte durchgeführt: Zuerst hybridisiert man die Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek jeweils mit dem weitgehend komplementären ersten Oligonukleotid und die Oligonukleotide der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek mit dem weitgehend komplementären zweiten Oligonukleotid. Dabei entstehen jeweils erste und zweite doppelsträngige DNA- Bibliotheken. Diese werden miteinander über die komplementären Überhänge der Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek und des zweiten komplementären Oligonukleotids durch Ligation verbunden, wobei eine Bibliothek aus doppelsträngigen DNA-

Ligationsprodukten entsteht. Die DNA- Ligationsprodukte umfassen jeweils folgende Teilbereiche: definierter ersten Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek, mindestens ein erstes variables Codon- Triplett, Spacer- Sequenz, mindestens ein zweites variables Codon- Triplett und definierter zweiter Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek. Durch Entfernen der Spacer- Sequenz aus den doppelsträngigen DNA- Ligationsprodukten wird die Bibliothek aus fertigen, doppelsträngige DNA- Produkten gebildet. Diese umfassen jeweils folgende Teilbereiche: definierter ersten Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek, mindestens ein erstes variables Codon- Triplett, mindestens ein zweites variables Codon- Triplett und definierter zweiter Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die oben

beschriebenen Oligonukleotide einer erste Oligonukleotid- Bibliothek jeweils mit entsprechend weitgehend komplementären Oligonukleotiden einer ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek hybridisiert, wobei die Oligonukleotide der ersten

Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek jeweils folgende Teilsequenzen aufweisen: erste Teilsequenz, die komplementär zum ersten Teilbereich des Spacer- Elementes der ersten Oligonukleotid- Bibliothek ausgebildet ist, komplementäres Codon- Triplett zu einem der Oligonukleotide aus der ersten Oligonukleotid- Bibliothek und eine Teilsequenz, die komplementär zum definierten ersten Bereich der Oligonukleotide der ersten

Oligonukleotid- Bibliothek aufgebaut ist. Zu jedem Oligonukleotid der ersten

Oligonukleotid- Bibliothek gibt es in der ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek ein weitgehend komplementäres Oligonukleotid. Die jeweiligen Oligonukleotide werden aufgrund des oben beschriebenen 3' oder 5' Überhangs jeweils nur als weitgehend komplementär bezeichnet. Wie bereits beschrieben wurde, weisen die Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek vorzugsweise einen komplementären 3' Überhang gegenüber den jeweils komplementären Oligonukleotiden der zweiten Komplementär-

Oligonukleotid- Bibliothek auf. Alternativ weisen die Oligonukleotide der ersten

Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek einen 5' Überhang gegenüber den

Oligonukleotiden der ersten Oligonukleotid- Bibliothek auf.

Bei dieser Ausführungsform werden also jeweils zwei, bis auf die Überhänge komplementäre Oligonukleotide miteinander hybridisiert. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn nur wenige unterschiedliche Codon- Tripletts getestet werden sollen. Die jeweils hybridisierten Oligonukleotide bilden zusammen die erste doppelsträngige DNA- Bibliothek. Anstelle des so genannten zweiten komplementären Oligonukleotids kann analog eine zweite Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek verwendet werden.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weisen die Oligonukleotide der ersten

Oligonukleotid- Bibliothek und das zweite komplementäre Oligonukleotid jeweils definierte, zueinander komplementäre 3' Überhänge auf und das erste komplementäre Oligonukleotid und die Oligonukleotide der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek weisen ebenfalls jeweils definierte 3' Überhänge auf. Vorzugsweise sind diese 3' Überhänge unterschiedlich lang und nicht komplementär zueinander ausgebildet. Insbesondere sind die 3' Überhänge des ersten komplementären Oligonukleotids und die 3' Überhänge der Oligonukleotide der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek jeweils unterschiedlich lang und nicht komplementär zu den definierten 3' Überhängen der Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek und des zweiten komplementären Oligonukleotids. Die unterschiedliche Ausbildung der 3' Überhänge der Oligonukleotide bzw. Oligonukleotid- Bibliotheken gewährleistet eine korrekte Ausrichtung derselben bei der Hybridisierung und anschließender Ligation.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die Oligonukleotide jeweils definierte 5' Überhänge auf. Vorzugsweise sind diese 5' Überhänge der

Oligonukleotide der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek und des ersten komplementären Oligonukleotids gleich lang und komplementär zueinander ausgebildet, während die 5' Überhänge des zweiten komplementären Oligonukleotids und die 5' Überhänge der Oligonukleotide der ersten Oligonukleotid- Bibliothek jeweils unterschiedlich lang und nicht komplementär sind. Die unterschiedliche Ausbildung der 5' Überhänge der

Oligonukleotide bzw. Oligonukleotid- Bibliotheken gewährleistet eine korrekte Ausrichtung derselben bei der Hybridisierung und anschließender Ligation.

Die Spacer- Sequenz umfasst mindestens eine Erkennungssequenz für mindestens eine Typ IIS Restriktionsendonuklease. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Spacer- Sequenz zwei Erkennungssequenzen für mindestens eine, vorzugsweise zwei Typ IIS Restriktionsendonukleasen. Typ IIS

Restriktionsendonukleasen erkennen die zu schneidende DNA an der jeweils für sie spezifischen Erkennungssequenz und schneiden die DNA an einer Restriktionsstelle in einem definierten Abstand zur Erkennungssequenz. Die Spacer- Sequenz ist derart gewählt, dass die mindestens eine Typ IIS Restriktionsendonuklease das doppelsträngige DNA- Ligationsprodukt 3' nach dem dritten Nukleotid des ersten variablen Codon- Tripletts und / oder 5' vor dem ersten Nukleotid des zweiten variablen Codon- Tripletts schneidet. Somit kann die Spacer- Sequenz einfach aus dem DNA- Ligationsprodukt herausgeschnitten werden.

Gemäß einer Ausführungsform wird eine Typ IIS Restriktionsendonuklease verwendet, die die DNA„blunt", d.h. ohne Überhänge schneidet. Nach Religation des geschnittenen Ligationsproduktes erhält man eine DNA mit folgender Sequenz: definierter ersten Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek, mindestens ein erstes variables Codon- Triplett, mindestens ein zweites variables Codon- Triplett und definierter zweiter Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek. Verwendet man dagegen eine Typ IIS

Restriktionsendonuklease, die beim Schneiden 3' oder 5' Überhänge erzeugt, dann müssen diese Überhänge erst durch Standardmethoden zu glatten Enden aufgefüllt oder abgebaut werden. Hierfür können beispielsweise Klenow Polymerase, T4 DNA

Polymerase etc. verwendet werden. Nach Religation des geschnittenen und geglätteten Ligationsproduktes erhält man eine DNA mit oben beschriebener Sequenz.

Weiterhin kann vorgesehen sein, dass ein Oligonukleotid der ersten Oligonukleotid-

Bibliothek jeweils zwei benachbarte oder weitgehend benachbarte variable Codon- Tripletts und / oder ein Oligonukleotid der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek ebenfalls jeweils zwei benachbarte oder weitgehend benachbarte variable Codon- Tripletts aufweist. Dementsprechend weisen das erste und / oder das zweite komplementäre Oligonukleotid jeweils zwei benachbarte oder weitgehend benachbarte komplementärvariable Codon- Tripletts aus jeweils drei„Universal- Basen" auf. Wie bereits oben beschrieben wurde, können anstelle des ersten und / oder zweiten komplementären Oligonukleotids auch jeweils Komplementär- Oligonukleotid- Bibliotheken verwendet werden. Nach dem oben beschriebenen Verfahren kann nunmehr eine Nukleinsäure- Sequenz mit jeweils drei oder vier benachbarten oder weitgehend benachbarten variablen

Codon- Tripletts konstruiert werden.

Weitere Abwandlungen bei der Wahl der Oligonukleotide sind möglich, die jeweils so konstruiert sind, das nach Hybridisierung und Ligation das entsprechende

doppelsträngige DNA- Ligationsprodukt entsteht. Beispielsweise kann die erste

Oligonukleotid- Bibliothek aus jeweils zwei Oligonukleotiden bestehen, wobei das erste

Oligonukleotid folgende Teilsequenzen aufweist: 5'- definierter erster Bereich D1 - erstes variables Codon- Triplett Tvi-ix und wobei das zweite Oligonukleotid folgende

Teilsequenzen aufweist: zweites variables Codon- Triplett Tv-i-iy - erster Teilbereich S1 eines Spacers S und definierter 3' Überhang U1 . Das erste komplementäre Oligonukleotid oder die erste Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek weist dementsprechend folgende Teilsequenzen auf: 5'- komplementäre Teilsequenz - zweites weitgehend komplementär variables Codon- Triplett - erstes weitgehend komplementär variables Codon- Triplett - zur definierten Sequenz komplementäre Sequenz - definierter 3' Überhang. Nach

Hybridisierung und Ligation der drei Oligonukleotide entstehen dementsprechend DNA- Ligationsprodukte mit der Sequenz: definierter erster Bereich - erstes variables Codon- Triplett - zweites variables Codon- Triplett - erster Teilbereich eines Spacers. Die beschriebenen Verfahrensschritte werden vorzugsweise nicht mit linearen DNA

Fragmenten, sondern jeweils in einem geeigneten Klonierungsvektor durchgeführt.

Insbesondere wird die Bibliothek aus doppelsträngigem DNA- Ligationsprodukt, welches zwischen den mindestens zwei variablen Codon- Tripletts noch die Spacer- Sequenz enthält, über die definierten 3' Überhänge des ersten komplementären Oligonukleotids und die definierten 3' Überhänge der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek durch Ligation in einen entsprechend vorbereiteten Klonierungsvektor integriert. Die dabei entstandenen Ligationsprodukt- Vektoren werden mit mindestens einer Typ IIS

Restriktionsendonuklease behandelt, wobei die Spacer- Sequenz herausgeschnitten wird. Die Bibliothek aus geschnittenem Ligationsprodukt- Vektor wird anschließend durch Religation zu einer Produkt- Vektor- Bibliothek recyclisiert.

Durch Kombinationen mehrerer entsprechend konstruierter Bibliotheken von ersten, zweiten usw. Produkt- Vektoren mit Sequenzen für weitere Spacer Elemente anstelle des definierten ersten oder zweiten Bereichs der Nukleinsäure- Bibliothek, können somit Nukleinsäure- Sequenzen mit eine beliebigen Anzahl nebeneinander angeordneter variabler Codon- Tripletts erzeugt werden. Gemäß einer Ausführungsform umfasst eine erste Bibliothek von Produktvektor mit einem ersten variablen Nukleinsäure- Bereich mindestens zwei unterschiedliche Selektionsmarker. Eine zweite Bibliothek von

Produktvektor mit einem zweiten variablen Nukleinsäure- Bereich umfasst mindestens zwei weitere unterschiedliche Selektionsmarker. Die zwei Produkt- Vektor- Bibliotheken werden jeweils an zwei Stellen mittels geeigneter Restriktionsendonukleasen geschnitten und die dabei entstandenen Fragmente werden miteinander durch Religation neu kombiniert. Die dabei entstehenden neue Produkt- Vektoren weisen beispielsweise zweimal den ersten variablen Nukleinsäure- Bereich, zweimal den zweiten variablen

Nukleinsäure- Bereich, die Kombination aus Nukleinsäure- Bereich eins und

Nukleinsäure- Bereich zwei oder die Kombination aus Nukleinsäure- Bereich zwei und Nukleinsäure- Bereich eins auf. Die Produkt- Vektoren mit der gewünschten

Nukleinsäure- Kombination können durch gezielte Doppel- Selektion anhand der

Selektionsmarker identifiziert werden. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen insbesondere darin, dass dieses gut automatisierbar ist. Die Anzahl der notwendigen Verfahrensschritte gegenüber dem oben beschriebenen Verfahren nach dem Stand der Technik ist wesentlich reduziert. Zudem werden weniger Oligonukleotide benötigt, was wiederum die Kosten des

Verfahrens verringert. Im beschriebenen Verfahren werden jeweils Bibliotheken aus hybridisierten Oligonukleotiden miteinander verknüpft, die jeweils mindestens einen Überhang aufweisen, der nach dem Entfernen des mittleren Spacer- Bereichs nicht mehr im Nukleinsäurebibliothek- Produkt zu finden ist. D.h. die den Überhang bildenden Teile der Oligonukleotid- Einzelstränge werden nachträglich entfernt und sind somit nicht Bestandteil des Endprodukts. Aus diesem Grund können für die Hybridisierungs- und Ligationsreaktion optimierte Überhänge verwendet werden. Insbesondere müssen die Überhänge nicht variabel entsprechend der gewünschten Mutation gestaltet werden. Dies vermindert den Verfahrensaufwand und verbessert die Qualität des entstehenden Endproduktes.

Bei dem Verfahren werden für die Herstellung von vier aufeinander folgenden

Positionen mit einer Mutationsrate von 20 Varianten insgesamt (4-20 + 2) = 82

Oligonukleotide als Gemische bereitzustellen. Somit werden bei dem Verfahren gegenüber herkömmlich bekannten Verfahren weniger Ausgangs- Oligonukleotide benötigt, wodurch das Verfahren wesentlich kostengünstiger ist. Weiterhin ist der Arbeits- bzw. Pipettieraufwand sowie Zeitaufwand deutlich reduziert. Weiterhin können die

Verknüpfungsreaktionen im beschriebenen Verfahren parallel durchgeführt werden, so dass mehrere Prozesse gleichzeitig ausgeführt werden können. Nur die

Entfernungsreaktionen sind sequentiell. Diese Reaktionen sind unter Annahme sättigend hoher Enzym- und Koenzymkonzentrationen (quasi) unimolekular und damit nur von der Konzentration des Substrats abhängig. Das Substrat kann nach der Verknüpfungsreaktion durch Klonierung nahezu beliebig vervielfältigt werden.

Im Folgenden sollen Ausführungsbeispiele die Erfindung und ihre Vorteile anhand der beigefügten Figuren näher erläutern. Die Größenverhältnisse der einzelnen Elemente zueinander in den Figuren entsprechen nicht immer den realen Größenverhältnissen, da einige Formen vereinfacht und andere Formen zur besseren Veranschaulichung vergrößert im Verhältnis zu anderen Elementen dargestellt sind.

Figur 1 bis Figur 1 1 zeigen die Herstellung einer Nukleinsäure- Bibliothek mit zwei benachbarten variablen Codon- Tripletts.

Figur 12 bis Figur 16 zeigen die Herstellung einer Nukleinsäure- Bibliothek mit drei benachbarten variablen Codon- Tripletts. Figuren 17 bis 21 zeigen die Herstellung einer Nukleinsäure- Bibliothek mit vier benachbarten variablen Codon- Tripletts.

Figuren 22 bis 24 zeigen die Herstellung von Nukleinsäure- Bibliotheken mit einer Mehrzahl an benachbarten variablen Codon- Tripletts.

Figur 25 zeigt eine weitere Ausführungsform der beim erfindungsgemäßen

Verfahren verwendeten Oligonukleotide.

Figur 26 zeigt eine weitere Ausführungsform der beim erfindungsgemäßen

Verfahren verwendeten Oligonukleotide.

Für gleiche oder gleich wirkende Elemente der Erfindung werden identische

Bezugszeichen verwendet. Ferner werden der Übersicht halber nur Bezugszeichen in den einzelnen Figuren dargestellt, die für die Beschreibung der jeweiligen Figur erforderlich sind. Die dargestellten Ausführungsformen stellen lediglich Beispiele dar, wie das erfindungsgemäße Verfahren ausgestaltet sein kann und stellen keine abschließende Begrenzung dar.

Figur 1 bis Figur 1 1 zeigen die Herstellung einer Nukleinsäure- Bibliothek mit zwei benachbarten variablen Codon- Tripletts Tvi und Tv2. Figur 1 zeigt die unterschiedlichen Oligonukleotide 02 und 04 bzw. Oligonukleotid- Bibliotheken 01 b und 03b, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Eine erste Oligonukleotid- Bibliothek 01 b umfasst erste Oligonukleotide 01 -x mit jeweils vier definierten Teilbereichen. Eine erste Teilsequenz D1 entspricht dem definierten ersten Bereich der Nukleinsäure- Bibliothek. Daran anschließend findet sich ein erstes variables Codon- Triplett Tvi .

Abhängig davon, welche unterschiedlichen Aminosäuren exprimiert werden sollen, werden entsprechend viele unterschiedliche Oligonukleotide 01 -x mit unterschiedlichen Codon- Tripletts verwendet. Im Extremfall werden vierundsechzig unterschiedlichen Oligonukleotide 01 -x verwendet, um das gesamt mögliche Spektrum an Aminosäuren bzw. vorzeitigen Abbrüchen der Proteinkette durch Stop- Codons abzudecken.

Anschließend an das variable Codon- Triplett Tvi ist eine erste Teilsequenz S1 eines Spacers S angeordnet. Zudem weisen die Oligonukleotide 01 -x der ersten

Oligonukleotid- Bibliothek 01 b einen definierten 3' Überhang U1 aus fünf Nukleotiden auf.

Das zweite Oligonukleotid 02 ist weitgehend komplementär zu den

Oligonukleotiden 01 -x der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b aufgebaut. Es umfasst eine Teilsequenz S1 k, die komplementär zur ersten Teilsequenz S1 des Spacers S der ersten Oligonukleotide 01 -x aufgebaut ist. Daran schließt sich ein erstes variables Codon- Triplett Tvu an, das drei„Universal- Basen" (vgl. Beschreibung) umfasst und eine Teilsequenz D1 k, die komplementär zum ersten Bereich D1 der ersten Oligonukleotide 01 -x ausgebildet ist. Weiterhin weist das zweite Oligonukleotid 02 einen 4er Nukleotid- Überhang U2 am 3' Ende auf. Dieser entspricht vorzugsweise einem Überhang, der auch beim Schneiden durch bestimmte Restriktionsenzyme entstehen würde.

Eine zweite Oligonukleotid- Bibliothek 03b umfasst dritte Oligonukleotide 03-x mit jeweils vier definierten Teilbereichen. Eine erste Teilsequenz bildet die zweite Teilsequenz S2 des Spacers S. Daran anschließend befindet sich ein zweites variables Codon- Triplett Tv2 und eine Teilsequenz, die dem definierten zweiten Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek entspricht. Wie auch in Fall der Oligonukleotide 01 -x der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b wird eine Reihe von unterschiedlichen dritten Oligonukleotiden 03-x verwendet, je nachdem, welche Aminosäuren exprimiert werden sollen. Weiterhin weisen die Oligonukleotide 03-x der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek 03b einen 3er Nukleotid- Überhang U3 am 3' Ende auf. Dieser entspricht vorzugsweise einem Überhang, der auch beim Schneiden durch bestimmte Restriktionsenzyme entstehen würde.

Weiterhin ist ein viertes Oligonukleotid 04 dargestellt, das weitgehend

komplementär zu den Oligonukleotiden 03-x der zweiten Oligonukleotid- Bibliothek 03b ausgebildet ist. Es umfasst eine Teilsequenz D2k, die komplementär zum zweiten Bereich D2 der dritten Oligonukleotide 03-x ausgebildet ist. Daran schließt sich ein zweites variables Codon- Triplett Tvu, das drei„Universal- Basen" umfasst, und eine Teilsequenz S2k, die komplementär zur zweiten Teilsequenz S2 des Spacers S des dritten

Oligonukleotids 03 ausgebildet ist. Weiterhin weist das Oligonukleotid 04 einen 3' Überhang U4 aus fünf Nukleotiden auf, der komplementär zu den 3' Überhangen der ersten Oligonukleotide 01 -x ausgebildet ist.

In einem ersten Verfahrensschritt werden die Oligonukleotide 01 -1 , 01 -2, 01 -3 bzw. 01 -x der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b jeweils mit dem zweiten

Oligonukleotid 02 hybridisiert, indem ein Oligonukleotid 1 -x - Oligonukleotid 2 - Gemisch zuerst auf 95^ erhitzt und anschließend langsam wieder abgekühlt wird. Entsprechend werden die dritten Oligonukleotide 03-1 , 03-2, 03-3 bzw. 03-x jeweils mit dem vierten Oligonukleotid 04 hybridisiert. Die dabei entstehenden doppelsträngigen 01 x02 bzw. 03x04 - DNA- Produkt- Bibliotheken sind schematisch in Figur 2 dargestellt.

In einem zweiten Verfahrensschritt (vgl. Figur 3) werden die Oligonukleotid 1 -x - Oligonukleotid 2 - DNAs 01 x02 mit den Oligonukleotid 3-x - Oligonukleotid 4- DNAs 03x04 über die komplementären Überhänge U1 und U4 der Oligonukleotide 1 und 4 mit einer Ligase 1 verbunden. Einige der dabei entstehenden doppelsträngigen

Ligationsprodukte LPx sind in Figur 4 dargestellt. Die Ligationsprodukte LPx umfassen folgende Teilbereiche: definierter erster Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, erstes variables Codon- Triplett Tvi , Spacer- Sequenz S, zweites variables Codon- Triplett Tv2 und definierter zweiter Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek.

Das doppelsträngige DNA- Ligationsprodukt LPx verfügt über die definierten 3' Überhänge U2 und U3 des zweiten und der dritten Oligonukleotide 02, 03-x. Ein

Klonierungsvektor pK wird vorbereitet, indem er beispielsweise mit zwei

Restriktionsendonukleasen geschnitten und dephosphoryliert wird (vgl. Figur 5). Die Restriktionsendonukleasen sind so gewählt, das korrespondierende Überhänge U2 ^* und U3 ^* zu den definierten Überhängen U2, U3 der Ligationsprodukte LPx gebildet werden. Anschließend werden die Ligationsprodukte LPx mit Ligase 1 in den vorbereiteten

Klonierungsvektor pK integriert, wodurch eine Bibliothek an Ligationsprodukt- Vektoren pK-LPx gebildet wird (Figur 6).

Die Spacer- Sequenz S der Ligationsprodukte LPx umfasst mindestens eine, vorzugsweise zwei Erkennungssequenzen 3a, 3b für mindestens eine Typ IIS

Restriktionsendonuklease 2a, 2b (vgl. Figur 7). Typ IIS Restriktionsendonukleasen schneiden DNA„blunt", d.h. ohne Überhang, an einer Stelle in einem definierten Abstand zur Erkennungssequenz 3a, 3b. Die Erkennungssequenzen 3a, 3b für die Typ IIS

Restriktionsendonukleasen 2a, 2b sind so innerhalb der Spacer- Sequenz S angeordnet, dass die erste Restriktionsendonuklease 2a direkt nach dem ersten variablen Codon- Triplett Tvi und die zweite Restriktionsendonuklease 2b direkt vor dem zweiten Codon- Triplett Tv2 schneidet, so dass die Spacer- Sequenz S komplett aus dem

Ligationsprodukt- Vektor pK-LPx herausgeschnitten wird. Dabei wird ein lineares

Fragment pK-LPx-S gebildet, das aus Klonierungsvektor und Ligationsprodukt LPx minus Spacer- Sequenz S besteht (vgl. Figur 8). Das lineare Fragment pK-LPx-S wird mittels einer Ligase 1 zum Produktvektor pK-Px religiert (vgl. Figur 9 und 10). Der Produktvektor pK-Px umfasst nunmehr das gewünschte DNA- Fragment mit folgenden Teilbereichen: definierter erster Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, erstes variables Codon- Triplett Tvi , zweites variables Codon- Triplett Tv2 und definierter zweiter Bereich D2 der

Nukleinsäure- Bibliothek.

Wie in Figur 1 1 dargestellt, werden in einem letzten Verfahrensschritt die Universal-

Nukleotide durch„normale" Nukleotide A, T, C und G ersetzt. Die ist beispielsweise durch herkömmlich bekannte Klonierungsmethoden, so genannter nick replication, rolling circle, PCR o.ä. möglich. Eine weitere einfache Möglichkeit besteht darin, das Plasmid in einem geeigneten Wirt, beispielsweise in E. coli zu vervielfältigen. Dabei werden die Universal- Nukleotide der variablen Codon-Tripletts Tvu durch die Reparaturmaschinerie des Wirtes durch die komplementären„normalen" Nukleotide A, T, C und G ersetzt und bilden somit die komplementär variablen Codon- Tripletts Tvik und Tv2k.

Figur 12 bis Figur 16 zeigen die Herstellung einer Nukleinsäure mit drei

benachbarten variablen Codon- Tripletts. Die dabei verwendeten sechs Oligonukleotide sind tabellarisch aufgelistet:

Für die definierten Überhange gilt: U1 ist komplementär zu U4; U3 ist komplementär zu U6; U2 und U5 sind komplementär zu den durch Restriktion o.ä. hergestellten

Überhängen eines Klonierungsvektors pK. Diese Überhänge können beispielsweise über unvollständige PCR, Ligation, independent cloning mit entsprechenden Polymerasen etc. hergestellt werden.

Die Oligonukleotide bzw. Oligonukleotid- Bibliotheken 01 x und 02, 03x und 04 sowie 05x und 06 werden jeweils miteinander hybridisiert. Anschließend werden die Oligonukleotid 1 - Oligonukleotid 2 - DNAs 01 x02 mit den Oligonukleotid 3 - Oligonukleotid 4- DNAs 03x04 und den Oligonukleotid 5 - Oligonukleotid 6- DNAs 05x06 mit einer Ligase 1 zur Bibliothek aus doppelsträngigem Ligationsprodukt LP2 verbunden (Figur 12). Die Ligationsprodukte LP2 umfassen jeweils folgende Teilbereiche: definierter erster Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, erstes variables Codon- Triplett Tvi , erste Spacer- Sequenz Sx, zweites variables Codon- Triplett Tv2, zweite Spacer- Sequenz SY, drittes variables Codon- Triplett Tv3 und definierter zweiter Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek. Die Ligationsprodukte LP2 werden über die Überhänge U2 und U5 in einen entsprechend vorbereiteten Klonierungsvektor pK integriert, wodurch Ligationsprodukt- Vektoren pK-LP2 gebildet werden (Figur 13). Die Spacer- Sequenzen Sx und SY der Ligationsprodukte LP2 umfassen jeweils mindestens eine, vorzugsweise zwei

Erkennungssequenzen 3a - 3d für mindestens eine Typ IIS Restriktionsendonuklease 2a - 2d (vgl. Figur 14 und Figur 15). Die Erkennungssequenzen 3a- 3d für die Typ IIS

Restriktionsendonukleasen 2a - 2d sind so innerhalb der Spacer- Sequenzen Sx und SY angeordnet, dass die eine Restriktionsendonuklease 2a, 2c direkt nach dem ersten variablen Codon- Triplett Tvi bzw. direkt nach dem zweiten variablen Codon- Triplett Tv2 und die andere Restriktionsendonuklease 2b, 2d direkt vor dem zweiten bzw. dritten

Codon- Triplett Tv2, Tv3 schneidet, so dass die Spacer- Sequenzen Sx und SY in zwei auf einander folgenden Verfahrensschritten aus den Ligationsprodukt- Vektoren pK-LP2 herausgeschnitten werden können. Wichtig ist hierbei jedoch, dass die Spacer- Sequenzen Sx und SY jeweils unterschiedliche Erkennungssequenzen 3a bis 3d für die Restriktionsendonukleasen 2a bis 2d aufweisen, damit gezielt zuerst eine Spacer-

Sequenz Sx oder SY und anschließend die zweite Spacer- Sequenz SY oder Sx entfernt werden kann.

Figur 14 zeigt, dass zuerst die Spacer- Sequenz Sx mit Hilfe der Typ IIS

Restriktionsendonukleasen 2a und 2b aus den Ligationsprodukt- Vektoren pK-LP2 herausgeschnitten werden. Der geschnittene Vektor wird zum Vektor pK-LP2-Sx (vgl.

Figur 15) religiert. Die zweite Spacer- Sequenz SYwird nunmehr aus dem Vektor pK-LP2- Sx mit Hilfe von zwei anderen Typ IIS Restriktionsendonukleasen 2c und 2d

herausgeschnitten. Nach Religation mit Ligase 1 erhält man den Produktvektor pK-P2 mit dem gewünschten DNA Fragment. Dieses umfasst insbesondere drei

aufeinanderfolgende variable Codon- Tripletts. Das im Produktvektor pK-P2 enthaltene

DNA- Fragment weist folgende Teilbereiche auf: definierter erster Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, erstes variables Codon- Triplett Tvi , zweites variables Codon- Triplett Tv2, drittes variables Codon- Triplett Tv3 und definierter zweiter Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek (Figur 16). Analog zu Figur 1 1 , werden in einem letzten

Verfahrensschritt die Universal- Nukleotide im Produktvektor pK-P2 durch die„normalen"

Nukleotide ersetzt (nicht dargestellt).

Figuren 17 bis 21 zeigen eine Möglichkeit, zwei erfindungsgemäß hergestellte Bibliotheken aus DNA- Fragmenten miteinander zu einer Bibliothek mit einem größeren DNA- Fragment mit folgender Sequenz zu verbinden: definierter erster Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, erstes variables Codon- Triplett Tvi , zweites variables Codon- Triplett Tv2, drittes variables Codon- Triplett Tv3, viertes variables Codon- Triplett Tv4 und definierter zweiter Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek (Figur 21 ). Zuerst werden zwei Bibliotheken pk-P1 a und pK-P1 b mit jeweils zwei benachbarten variablen Codon- Tripletts gemäß den in den Figuren 1 bis 1 1 beschriebenen Verfahrensschritten hergestellt, wobei pk-P1 a einen definierten erster Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, ein erstes variables Codon- Triplett Tvi , ein zweites variables Codon- Triplett Tv2, und eine erste Teilsequenz S1 einer Spacer- Sequenz S umfasst und wobei

pK-P1 b eine zweite Teilsequenz S2 einer Spacer- Sequenz S, ein drittes variables Codon- Triplett Tv3, ein viertes variables Codon- Triplett Tv4 und einen definierten zweiten Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek umfasst.

Die Ausgangsplasmide der ersten Bibliothek pK-P1 a umfassen jeweils mindestens ein erstes Resistenzgen MARKER 1 , beispielsweise eine Ampicillin (Amp)- Resistenz. Die Ausgangsplasmide der zweiten Bibliothek pK-P1 b Pi a umfassen jeweils mindestens ein zweites Resistenzgen MARKER 2, beispielsweise eine Cam- Resistenz. Die Vektoren der ersten Bibliothek pK-P1 a werden mit zwei Restriktionsendonuklease 4a und 4b geschnitten, wobei die erste Restriktionsendonuklease 4a vorzugsweise blunt nach dem letzten Nukleotid der ersten Teilsequenz S1 der Spacer- Sequenz S schneidet. Zudem werden die Vektoren der ersten Bibliothek pK-P1 a mit einer zweiten

Restriktionsendonuklease 4b im Origin of Replication geschnitten. Dabei entsteht die Fragment- Bibliothek F(pK-P1 a), mit jeweils dem o.g. ersten DNA- Fragment und dem ersten Resistenz- Markergen Amp. Die Vektoren der zweiten Bibliothek pK-P1 b werden mit einer dritten Restriktionsendonuklease 4c vorzugsweise blunt vor dem ersten

Nukleotid der zweiten Teilsequenz S2 der Spacer- Sequenz S geschnitten. Zudem werden die Vektoren der zweiten Bibliothek pK-P1 b wird mit einer vierten

Restriktionsendonuklease 4d im Origin of Replication geschnitten. Dabei entsteht die

Fragment- Bibliothek F(pK-P1 b), mit dem o.g. zweiten DNA- Fragment und dem zweiten Resistenz- Markergen Cam. Als Restriktionsnukleasen 4b, 4d, die die Vektoren pK-P1 a und pK-P1 b jeweils im Origin of Replication schneiden, werden vorzugsweise dieselben Restriktionsendonukleasen verwendet, d.h. Restriktionsendonuklease 4b =

Restriktionsendonuklease 4d.

Die beiden Fragment- Bibliotheken F(pK-P1 a) und F(pK-P1 b) werden nunmehr mittels Ligase 1 miteinander verbunden (Figur 18). Dabei entsteht eine Bibliothek aus Ligationsprodukt- Vektor pK-LP3 (Figur 19). Dieser umfasst ein DNA- Sequenz, bestehend aus einem definierten ersten Bereich D1 der Nukleinsäure- Bibliothek, erstes variables Codon- Triplett Tvi , zweites variables Codon- Triplett Tv2, Spacer- Sequenz S, drittes variables Codon- Triplett Tv3, viertes variables Codon- Triplett Tv4 und definierter zweiter Bereich D2 der Nukleinsäure- Bibliothek sowie die beiden Resistenz- Markergene Amp und Cam. Über die Ligation werden die durch die Restriktion mit den

Restriktionsendonukleasen 4b, 4d entstandenen Teilfragmente der geschnittenen Origin of Replication wiederum zu einem funktionalen Origin of Replication zusammengefügt. Die Ligationsprodukt- Vektoren pK-LP3 können über Doppelselektion auf Amp und Cam gezielt selektioniert werden. Da die Ligationsprodukt- Vektoren pK-LP3 einen funktionalen Origin of Replication umfassen, können diese einfach in einem geeigneten Organismus, beispielsweise in E.coli, repliziert werden.

Die Spacer- Sequenz S wird anschließend über Typ IIS Restriktionsendonuklease 2a, 2b und Religation mit Ligase 1 aus den Ligationsprodukt- Vektoren pK-LP3 entfernt (Figur 20), wodurch die Produktvektoren pK-P3 mit der gewünschten DNA- Sequenz gebildet werden (Figur 21 ).

Alternativ können auch in einem Verfahren gemäß den Figuren 1 bis 1 1 vier Oligonukleotide 05b, 06, 07b und 08 (siehe Tabelle) verwendet werden, die jeweils direkt zwei benachbarte variable Codon- Tripletts umfassen, d.h.

Sequenz entsprechend Figur 21 .

Figur 22 bis 24 zeigen schematisch das Erstellen von Nukleinsäure- Bibliotheken, bei denen eine Mehrzahl von variablen Codon- Tripletts nebeneinander angeordnet sind. Dies erfolgt durch Kombinationen mehrerer Bibliotheken aus entsprechend konstruierten Produktvektoren pK-Px1 , pK-Px2, die jeweils Sequenzen für weitere Spacer- Elemente anstelle des definierten ersten oder zweiten Bereichs der Nukleinsäure- Bibliothek enthalten. Insbesondere ist hierfür auch die Verwendung mehrerer unterschiedlicher Markergene M1 - M4 notwendig bzw. sinnvoll. Durch Kombinationen mehrerer entsprechend konstruierter Bibliotheken von ersten, zweiten usw. Produktvektoren pK-Px1 , pK-Px2 mit Sequenzen für weitere Spacer Elemente anstelle des definierten ersten oder zweiten Bereichs der Nukleinsäure- Bibliothek, können somit Nukleinsäure- Sequenzen mit eine beliebigen Anzahl nebeneinander angeordneter variabler Codon- Tripletts erzeugt werden. Gemäß einer Ausführungsform umfasst eine erste Bibliothek von Produktvektor pK-Px1 mit einem ersten variablen Nukleinsäure- Bereich mindestens zwei unterschiedliche

Selektionsmarker M1 und M2. Eine zweite Bibliothek von Produktvektor pK-Px2 mit einem zweiten variablen Nukleinsäure- Bereich umfasst mindestens zwei weitere

unterschiedliche Selektionsmarker M3 und M4. Die zwei Produkt- Bibliotheken pK-Px1 , pK-Px2 werden jeweils an zwei Stellen mittels geeigneter Restriktionsendonukleasen geschnitten und die dabei entstandenen Fragmente werden miteinander durch Religation neu kombiniert (vgl. auch Figuren 17 bis 21 ). Dabei entstehen Bibliotheken von Produkt- Vektoren (vgl. Figur 23), die beispielsweise zweimal den ersten variablen Nukleinsäure- Bereich, zweimal den zweiten variablen Nukleinsäure- Bereich, die Kombination aus

Nukleinsäure- Bereich eins und Nukleinsäure- Bereich zwei (= Bibliothek pK-Px3) oder die Kombination aus Nukleinsäure- Bereich zwei und Nukleinsäure- Bereich eins (= Bibliothek pK-Px4) aufweisen. Die Bibliotheken mit der gewünschten Nukleinsäure- Kombination können durch gezielte Selektion anhand der Selektionsmarker M1 - M4 identifiziert werden. Beispielsweise kann die Produkt- Bibliothek pK-Px1 durch Doppelselektion auf Marker M1 und Marker M2 und Produkt- Bibliothek pK-Px1 durch Doppelselektion auf Marker M3 und Marker M4 selektiert werden.

Durch weitere Kombination können somit Nukleinsäure- Bibliotheken mit einer Vielzahl von benachbarten variablen Codon- Tripletts konstruiert werden (Figur 24).

Figur 25 zeigt eine weitere Ausführungsform von beim erfindungsgemäßen

Verfahren verwendeten Oligonukleotiden. Hierbei werden die oben beschriebenen Oligonukleotide 01 -1 bis 01 -x einer erste Oligonukleotid- Bibliothek 01 b jeweils mit den entsprechenden weitgehend komplementären Oligonukleotiden 02-1 bis 02-x einer ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek 02b hybridisiert, wobei die

Oligonukleotide 02-1 bis 02-x der ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek 02b jeweils folgende Teilsequenzen aufweisen: erste Teilsequenz S1 k, die komplementär zum ersten Teilbereich S1 des Spacer- Elementes S (vgl. Figur 1 ) der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b ausgebildet ist, komplementäres Codon- Triplett Tv2-1 bis Tv2-x zu einem der Oligonukleotide 01 -1 bis 01 -x aus der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b und eine Teilsequenz D1 k, die komplementär zum definierten ersten Bereich D1 der Oligonukleotide 01 -1 bis 01 -x der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b aufgebaut ist. Zu jedem Oligonukleotid 01 -1 bis 01 -x der ersten Oligonukleotid- BibliothekOI b gibt es in der ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek 02b ein weitgehend

komplementäres Oligonukleotid 02-1 bis 02-x. Die Oligonukleotide 01 -x und 02-x werden jeweils nur als weitgehend komplementär bezeichnet, da zumindest die

Oligonukleotide 01 -x der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b einen 3' Überhang U1 gegenüber den jeweils komplementären Oligonukleotiden 02-x der ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek 02b aufweisen. Weiterhin weisen die Oligonukleotide 02-x der ersten Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek 02b vorzugsweise einen 3' Überhang gegenüber den jeweils komplementären Oligonukleotiden 01 -x der ersten Oligonukleotid- Bibliothek 01 b auf.

Bei dieser Ausführungsform werden also jeweils zwei, bis auf die 3' Überhänge komplementäre Oligonukleotide 01 -x und 02-x miteinander hybridisiert. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn nur wenige unterschiedliche Codon- Tripletts getestet werden sollen. Die Vielzahl der jeweils hybridisierten Oligonukleotide 01 -x / 02-x bilden zusammen die erste doppelsträngige DNA- Bibliothek 01 x02. Anstelle des so genannten zweiten komplementären Oligonukleotids 04 (vgl. Figuren 1 bis 1 1 ) kann analog eine zweite Komplementär- Oligonukleotid- Bibliothek 04b (nicht dargestellt) verwendet werden.

Figur 26 zeigt ebenfalls eine weitere Ausführungsform der beim erfindungsgemäßen

Verfahren verwendeten Oligonukleotide, wobei die Ausgangs- Oligonukleotide bereits zwei benachbarte variable Codons- Tripletts umfassen. Hierbei ist vorgesehen, dass die erste Oligonukleotid- Bibliothek 01 b ^* aus jeweils zwei Oligonukleotiden 01 -1 x bis 01 -nx und 01 -1 y bis 01 -ny bestehen, wobei das erste Oligonukleotid 01 -1 x folgende

Teilsequenzen aufweist: 5'- definierter erster Bereich D1 - erstes variables Codon- Triplett

Tvi-i x und wobei das zweite Oligonukleotid 01 -1 y folgende Teilsequenzen aufweist: zweites variables Codon- Triplett Tv-i-iy - erster Teilbereich S1 eines Spacers S und definierter 3' Überhang U1 . Das erste komplementäre Oligonukleotid 02 weist

dementsprechend folgende Teilsequenzen auf: : 5'-komplementäre Teilsequenz S1 k - Codon- Triplett Tvu - Codon- Triplett Tvu - komplementäre Sequenz D1 k - definierter 3'

Überhang U2. Nach Hybridisierung und Ligation der drei Oligonukleotide 01 -nx, 01 -ny und 02 entstehen DNA- Ligationsprodukte mit der Sequenz: definierter erster Bereich D1 - erstes variables Codon- Triplett Tvi-i x - zweites variables Codon- Triplett Tv-i-iy - erster Teilbereich S1 eines Spacers S. Diese werden beispielsweise bei einem Verfahren gemäß Figuren 17 bis 19 eingesetzt. Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch für einen Fachmann vorstellbar, dass Abwandlungen oder Änderungen der Erfindung gemacht werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Insbesondere soll durch die Erfindung auch die Verwendung abgewandelter Oligonukleotide umfasst sein, die nach Hybridisierung und Ligation entsprechende doppelsträngige DNA- Moleküle bilden.

Bezuqszeichenliste

1 Ligase

2 Typ IIS Restriktionsendonuklease

3 Erkennungssequenz

4 Restriktionsendonuklease

D definierter Bereich

A Nukleotid Adenin

Amp Ampicillin Resistenzgen

C Nukleotid Cytosin

Cam Ampicillin Resistenzgen

F Fragment

G Nukleotid Guanin

LP Ligationsprodukt

ori Origin of Replication

0 Oligonukleotid

O b Oligonukleotid- Bibliothek

01 x02 Ligationsprodukt- Bibliothek

P Produkt

pK Klonierungsvektor

pK-LP Ligationsprodukt- Vektor

pK-P Produkt- Vektor

S Spacer- Sequenz

T Nukleotid Thymin

Tv variables Codon- Triplett

I Universal Nukleotid

U1 - U4 3' Überhang

U2 ^* , U3 ^* 3' Überhang