CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve um processo para obtenção de um extrato e de uma fração vegetal. Mais particularmente, uma fração diclorometânica obtida a partir do extrato etanólico de Eleutherine plicata, rica em naftoquinonas . A invenção compreende, ainda, a descrição do método de obtenção desta fração bem como a identificação de uma naftoquinona . Esta fração foi ensaiada e mostrou atividade antiplasmódica, particularmente contra Plasmodium falciparum resistente a cloroquina (clone W2) . ESTADO DA TÉCNICA

A E. plicata é uma planta nativa da América tropical, incluindo os campos secos da Amazónia brasileira, conhecida popularmente como marupazinho, marupari, palmeirinha, coquinho, marupai, marupaú, marupá-piranga, lirio-folha-de- palmeira. Levantamento etnobotânico realizado na cidade de Igarapé-Miri (PA, Brasil), através de entrevistas semiestruturadas , confirmou a utilização do marupazinho (E. plicata) . A população dessa localidade utiliza o chá obtido de seus bulbos para o tratamento de diarreia, amebiase, infecção intestinal, doenças hepáticas, hemorragias e anemia (PINTO, L.N. Plantas medicinais utilizadas por comunidades do município de Igarapé Miri-Pará. Etnofarmácia do município de Igarapé-Miri. 2008. 98 f. Dissertação- Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Pará, Pará 2008) .

Das espécies de Eleutherine foram isoladas naftoquinonas , sendo que substâncias desta classe tem apresentado atividade antimalárica . Um exemplo de naftoquinona ativa no Plasmodium é a atovacona, naftoquinona sintética estruturalmente relacionada ao o lapachol, uma prenil-naftoquinona que é frequente em espécies de Tabebuia, género ao qual pertencem os ipês, árvores que ocorrem na América do Sul (MIRAGLIA, M.C.M. Estudo químico de Tabebuia serratifolia (Vahl.) Nichols (Bignoniaceae) e síntese de piranonaftoquinonas , furanonaftoquinonas e antraquinonas . Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal de Minas Gerais, 1991). A atovacona inibe a enzima diidroorotato desidrogenase que catalisa a síntese do monofosfato de uridina nos parasitos.

Vale ressaltar que muitas naftoquinonas , como por exemplos as isoladas de E. plicata ainda não foram avaliadas no P. falciparum. De E. plicata já foram isolados o eleuterol e a isoeleuterina (MALHEIROS, L.C.S. Isoeleuterol e Isoeleuterina : Potenciais marcadores químicos da tintura de Eleutherine plicata Herb (Iridaceae) e atividades microbiológica e antioxidante. 2008. 67 p. Dissertação- Mestrado em Ciências Farmacêuticas - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Pará, Pará 2008), porém a atividade antiplasmodica do extrato etanólico e de suas frações foi avaliada pela primeira vez no trabalho de mestrado de Edinilza Borges, tendo se mostrando muito promissora.

0 extrato etanólico obtido dos bulbos de E. plicata e suas frações foram submetidos ao ensaio para atividade antiplasmodica utilizando a técnica do HRP-II (NOEDL et al. _r 2002) . O extrato etanólico e as frações diclorometânica e acetato de etila mostraram-se ativos, no ensaio de difusão em ágar na concentração de 500 μg/ mL, no S. aureus. Já a fração metanólica não foi ativa em nenhuma bactéria (S. aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli) e fungo (Cândida albicans) . O extrato e frações ativas foram submetidos ao ensaio da microdiluição, sendo a concentração inibitória (CIM) do extrato etanólico de 500 ]ig/ mL, o CIM da fração acetato de etila de 250 μς/ mL e de fração diclorometânica de 125 μg/ mL. Logo, o fracionamento melhorou a atividade antimicrobiana, sendo a fração mais ativa e rica em naftoquinonas (fração diclorometânica) . Visando avaliar o potencial bactericida o extrato e as frações foram submetidos ao ensaio da microdiluição seguido de sub-cultivo, onde as concentrações bactericidas mínimas (CBM) fora, superiores a lOOC^g/mL, sugerindo que a atividade antimicrobiana seja do tipo bacteriostático .

0 extrato etanólico obtido dos bulbos de E. plicata foi submetido ao ensaio de toxicidade em A. salina, para a contagem de animais mortos e vivos. Após 24h utilizou-se o método Probitos de análise para obtenção das DL50 e respectivos intervalos de confiança (MEYER et al., 1982), com o seguinte resultado (DL50 > 1000 μg/mL) , indicando que o referido extrato possui baixa toxicidade em A. salina. O ensaio de toxicidade em A. salina é um teste biológico bastante usado por ser rápido, confiável, de baixo custo e por ter demonstrado uma boa correlação com várias atividades biológicas (MEYER et al., 1982) .

O pedido de patente JP20080020163 (20080131) (classificação internacional: A61K31/708; A61P35/00; C07H1704; A61K36/18) descreve o isolamento de eleuterinosideo A do extrato metanólico de Eleutherine palmifolia (Iridaceae). O composto é útil para o tratamento do câncer.

O pedido de patente CN20051119690 (20051128) (classificação Internacional: A61K36/28; A61K36/748;

A61P19/00 A61P29/00; C12G3/02) descreve as atividades artrite reumatóide, dormência reumática, artralgia reumática e mialgia, contusão do tecido mole e lesão traumática de Eleutherine plicata.

O pedido de patente JP20050153747 (20050526) (classificação internacional: A23L1/30; A61K36/00; A61K36/18; A61K36/81; A61P25/00; A61P3/02) fornece um novo agente de recuperação de fadiga, este é caracterizado pela presença de pelo menos uma espécie de planta do género Eleutherine (Iridaceae), uma planta do género Solanum (Solanaceae) , uma planta do género Eucalyptus (Myrtaceae ) e uma planta do género Tabebuia (Bignoniaceae) e / ou um extrato da planta como um ingrediente ativo.

O pedido de patente JP20040071888 (20040315/aplicação WO2005JP04415 20050314) (classificação internacional: A23L1/30; A61K36/00; A61K36/185; A61K36/47; A61K36/48; A61 36/53; A61K36/77; A61 36/85; A61K36/88; A61P13/08; A61P43/00; C12N9/99; (IPC1-7): A23L1/30; A61K35/78; A61P13/08; A61P43/00; C12N9/99 e Europeia: A23L1/30B; A61K36/185; A61K36/47; A61K36/48; A61K36/53; A61K36/77; A61K36/85; A61K36/88) destina-se a proporcionar um novo inibidor de testosterona 5 alpha-redutase e uma composição para inibir a hipertrofia prostática. Este produto deve conter uma ou mais plantas pertencentes aos géneros, Allophylus Archidendron, Butea, Dianella, Eleutherine, Horsfieldia,, Millingtonia, Orthosiphon, Phyllanthus, Salacia e Vitex.

O pedido de patente JP20020266273 20020912; (classificação internacional: A23L1/30; A23L2/38; A23L2/52; A61K36/00; A61K36/02; A61K36/18; A61K36/81; A61P3/04; (IPC1-7): A23L1/30; A23L2/38; A23L2/52; A61K35/78; A61K35/80; A61P3/04) teve como objetivo fornecer uma comida e uma bebida para redução da gordura vegetal, sendo eficaz para a prevenção e tratamento da obesidade e de doenças relacionadas. Este produto é constituído por algas, plantas ou extratos (Tabebuia, Eleutherine, Solanum e Myrataceae Eucalyptus).

Além desses documentos, vale ressaltar que E. plicata consta na relação de nacional de plantas medicinais de interesse do Sistema Único de Saúde, porém não existe alegação de uso popular para malária e doenças febris . PROBLEMAS DO ESTADO DA TÉCNICA

O Plasmodium falciparum tem adquirido, rapidamente, resistência aos fármacos disponíveis. A cloroquina foi amplamente utilizada para o tratamento da malária falciparum e a justificativa para o uso da cloroquina foram: o fármaco apresenta baixa toxicidade e é economicamente viável.

Devido à crescente resistência dos parasitos a cloroquina, novos fármacos tiveram que ser introduzidos, como a artemisinina, derivados da artemisinina e a atovacona. Porém, recentemente já foi descrito resistência do P. falciparum aos derivados da artemisina. Há, portanto, necessidade de novos agentes antimaláricos que sejam eficazes contra cepas do P. falciparum resistentes à cloroquina, promovendo a cura em tempo razoável para garantir adesão ao tratamento, além do. fato de que sejam seguros e de baixo custo (FIDOCK, D. A.; ROSENTHAL, P.J.; CROFT, S.L.; BRUN, S. e NWAKA, S. Antimalarial drug discovery: efficacy models for compound screening. Nat Rev Drug Discov, Jun 2004; 3(6): 509-20).

VANTAGENS DA TECNOLOGIA

A planta de onde se obtém a fração diclorometânica é de fácil cultivo. O processo extrativo para obtenção do extrato etanólico é simples, bem como a obtenção da fração e subfrações ativas. Desta forma, seria fácil prosseguir os estudos, obter uma fração padronizada e desenvolver um fitoterápico .

BREVE DESCRIÇÃO DÁS FIGURAS A Figura 1 mostra o processo de obtenção da fração diclometânica e as suas subfrações.

A Figuras 2 mostra os cromatogramas do extrato etanoico obtido dos bulbos de E. plicata e suas frações . Condição em A : Coluna RP-18, Fase móvel: tempo Omin- .95% água e 5% de actonitrila; tempo de 65min- 55 de água é 95% de acetonitrila; tempo de 70min- 5% de água e 95% de acetonitrila;

Temperatura= 40° C, Fluxo= lmL/min; detecção= 350nm.

Maceração por 7dias com álcool etílico 96°.

filtração e concentração em pressão reduzida.

lOg do extrato: Cromatografia em coluna

Fase estacionária: sílica gel

Fases móveis: polaridade crescente

20mg cromatografia em camada preparativa

Eluente: diclorometano

Legenda: a- extrato etanólico obtido dos bulbos de E. plicata; b- fração diclorometânica; c- fração acetato de etila; d- fração metanólica.

A Figura 3 mostra as análises de ressonância Magnética nuclear da subfração 2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

A presente invenção descreve um processo para obtenção de um extrato e de uma fração diclorometânica rica em naftoquinonas da espécie vegetal Eleutherine plicata, além do isolamento e purificação da isoeleuterina, naftoquinonas presente na referida espécie vegetal. A invenção compreende, ainda, a comprovação da atividade antiplasmódica desse extrato/fração . A invenção demonstra que o processo de purificação contribuiu para o aumento da atividade antiplasmódica, e consequente a fração obtida apresenta melhor atividade do que o extrato para o tratamento da malária.

A presente invenção pode ser melhor entendida através dos exemplos a seguir, os quais não são limitante da tecnologia. 1. Obtenção do extrato etanólico dos bulbos de E. pli.ca.ta, rações e subfrações.

Os bulbos pulverizados de E. plicata foram submetidos à extraçâo por maceração (7 dias), com etanol a 96 ^° GL. Na sequência, a tintura foi concentrada em evaporador rotatório, a 50 °C, sob pressão reduzida, até resíduo, o qual foi mantido em dessecador até obtenção de um peso constante.

O extrato etanólico de bulbos de E. plicata (EEBEP) (5,0g) foi submetido ao fracionamento em coluna cromatográfica (tamanho= 69,3cm e diâmetro = 4cm) . Foi utilizada como fase estacionária a sílica gel (flesh 0, 063 a 0,2 mm) e como fase móvel os solventes: hexano (1L), diclorometano (1L), acetato de etila (1L) e metanol (1L) . As frações foram concentradas em evaporador rotatório, a 50 °C, sob pressão reduzida, até resíduo, sendo mantido em dessecador até obtenção de peso constante.

O extrato e as frações foram submetidos aos estudos em Cromatografia líquida de alta eficiência e os espectros obtidos em UV, demonstram a presença de quinonas. O extrato possui uma elevada complexidade química, porém a fração diclorometânica possui 3 picos majoritários. Fato semelhante foi observado em cromatografia em camada delgada, sendo que as análises em espectrometria de ultravioleta sugerem tratar-se de quinonas .

A fração diclorometânica foi submetida ao fracionamento através da cromatografia em camada preparativa, sendo obtidas 3 subfrações, denominadas de SI, S2, S3. As frações SI, S2 e S3 foram submetidas aos estudos em RMN, sendo já identificada a fração S2 como isoeleuterina com alto teor de pureza, demonstrando a eficiência do processo adotado. As identificações de SI e S3 ainda não foram concluídas.

A fração S2 na realidade é constituída maj oritariamente pela isoleuterina, uma naftoquinona já isolada de E. plicata (MALHEIROS, L.C.S. Isoeleuterol e Isoeleuterina : Potenciais marcadores químicos da tintura de Eleutherine plicata Herb (Iridaceae) e atividades microbiológica e antioxidante. 2008. 67 p. Dissertação- Mestrado em Ciências Farmacêuticas Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Pará, Pará 2008) . No RMN1H obtido desta fração observa-se que os hidrogênios 6H, 7H e 8H, do anel aromático, aparecem em δ 7,739 δ 7, 677 e δ 7,26. Os hidrogênios 1-Me e 1-H aparecem como dupleto com δ 1,33 e δ1,54, respectivamente e os hidrogênios 3- Me aparecem como dupletos com δ 1,34.

2. Avaliação da atividade antiplasmódica do extrato e suas frações .

Em relação à atividade antiplasmódica do extrato etanólico de E. plicata, por meio do perfil por CLAE característico apresentado, observou-se elevada atividade, porém o fracionamento levou ao isolamento de uma fração mais ativa, fração diclorometânica e duas frações com atividade antiplasmódica inferior (acetato de etila e metanólica; Tabela 1) .

Tabela 1: Atividade Antiplasmídocado extrato etanólico obtido a partir dos bulbos de E. plicata e suas frações

Estes resultados sugerem que as naftoquinonas são os marcadores farmacológicos. Nesta avaliação utilizou a metodologia descrita por NOEDL, H; WERNSDORFER, W. H; MILLER, R.S; WONGSRICHANALAI , S. Histidine-Rich Protein II: Novel Approach to Malária Drug Sensitivity Testing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, n. 6, p. 1658-1664, 2002. 0 extrato etanólico e a fração diclorometano mostraram-se ativos a P. falciparum (Cl ₅ o<10pg/mL) , sendo esta mais ativa; a fração acetato de etila foi moderadamente ativa (10 g/mL< CI ₅ o< 50 g/mL) e a fração metanólica foi considerada inativa (CI ₅₀ > 50 g/mL) .

Um segundo objetivo da invenção refere-se a composições farmacêuticas compreeendo o extrato etanólico de Eleutherine plicata ou sua fração diclorometânica . Adicionalmente, a referida composição pode ainda compreender ou não uma isoleuterina obtida e seus derivados. Mais particularmente, tais composições compreendem uma fração padronizada rica em naftoquinonas e pelo menos um excipiente farmacêutico e farmacologicamente aceitável.

As referidas composições possuem atividade antiplasmódica e podem ser utilizadas na preparação de um medicamento para tratamento de malária. Referido medicamento sendo preferencialmente administrado ao individuo que precise de tratamento por meio das vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica . Alternativamente, referido medicamento pode ser administrado por meio de dispositivos que possam ser implantados ou injetados ao individuo. Particularmente, a via preferencial de administração é a oral.