SECTOR DE LA TÉCNICA Producción de ácidos grasos poliinsaturados para su utilización en las industrias farmacéuticas, agroalimentarias o cosméticas y como intermedios de síntesis en química fina. Acidos linoleicos conjugados (CLA). Sector de la Biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA.

Para afrontar la demanda creciente de ácidos grasos poliinsaturados en las industrias farmacéuticas, agroalimentarias o cosméticas, ha de recurrirse a la extracción de fuentes naturales donde se encuentran en forma de complejas mezclas de las que es prácticamente imposible o muy laborioso aislar los productos individuales por métodos cromatográficos o ha de aplicarse de manera alternativa la síntesis orgánica. Debido a la estereoespecificidad requerida, los productos sintéticos son generalmente preparados en pequeñas cantidades, su coste es muy elevado y sólo se utilizan en investigación.

Por ello, se ha recurrido a las fuentes naturales para preparar concentrados de ácidos grasos poliinsaturados por métodos diversos tales como destilación molecular de los esteres metílicos, separación con urea, empleo de lipasas para discriminación en la hidrólisis de triglicéridos aprovechando la especificidad respecto a las posiciones esterificadas del glicerol, a la naturaleza del éster, a la longitud de la cadena y a la posición de los dobles enlaces (Lipid Síntesis and Manufacture, Ed. by Frank D.

Gunstone, Sheffield Academic Press, 1999, England).

Asimismo, en la literatura se encuentran descritos procedimientos para la preparación de ácidos grasos diénicos conjugados a partir de ácidos no conjugados.

Entre ellos, los ácidos linoleicos conjugados (CLA) son los más importantes por su capacidad de reducir o eliminar el cáncer (Seidel, MC 2001, US Patent 6,319, 950), de prevención de enfermedades cardiovasculares, de mejora del sistema inmunológico y de ayuda en tratamientos de la obesidad.

Estos ácidos linoleicos conjugados (CLA) se obtienen como mezclas por isomerización del ácido linoleico, ácido cis-9, cis-12-octadienoico, en medio homogéneo mediante la utilización de bases tales como hidróxido alcalino acuoso en un reactor de flujo tubular a una presión de 2300 psi y temperaturas elevadas (Krajca, K. E. 1979, U. S.

Patent 4,164505) o metóxido sódico (Iweta T, et al. 1998, EP0839897 Al) y deprotonación a temperaturas comprendidas entre-78 y-20°C con una base orgánica superfuerte como sec-butillitio, base de Schlosser y trimetilsililmetiluro de potasio (Sih.

Ch and Chen Ch-A., 2001 US Patent 6,316, 645). Se han utilizado también catalizadores homogéneos como tris (trifenilfosfina) clororodio (De Jarlas W., and Gast L.; J. Am. Oil Chem. Soc, 1971,48, 21) y complejos de areno cromiocarbonilo (Frakel, E.; J. Am. Oil Chem. Soc, 1970,47, 33) que facilitan que la reacción de isomerización pueda llevarse a cabo a temperaturas inferiores a los 180-200°C requeridos en el caso anterior. Sin embargo, estos catalizadores son difíciles de eliminar y no son compatibles con el medio ambiente. Por ello, recientemente se ha desarrollado un procedimiento utilizando un catalizador de Ni soportado sobre una zeolita preactivado con hidrógeno que permite llevar a cabo la isomerización en disolución de n-decano ó 1-octanol a temperaturas de 80-120°C (Bernas, A. et. al.; Chem. Común, 2002,1142-3).

Sin embargo, se ha comprobado que el componente responsable de los efectos anticarcinogénicos del CLA es el isómero cis-9, trans-11, por lo que sería preciso desarrollar métodos de isomerización específicos para la obtención de dicho isómero.

Esto se ha intentado por reacción del ácido linoleico con una linoleoato isomerasa de la bacteria del rumen Butyrivibrio fibrisolvesls (Pariza, M. W. and Ha Y. L. 1993.

U. S. Patent 5,208356) y por combinación de una preparación sustancialmente pura de una cepa de Lactobacillus que es capaz de convertir ácidos grasos con dobles enlaces no conjugados en la configuración cis-9, cis-12 en ácidos grasos con dobles enlaces conjugados entre los que por lo menos un 50% contienen dobles enlaces con la configuración cis-9, transll (Pariza, MW and Yang X-Y, 2000 US Patent 6,060, 304).

Además, se ha realizado un estudio sobre la selectividad de lipasas en la esterificación de la mezcla de CLA con n-butanol en n-hexano en el que se observó una preferencia de las lipasas de Candida cylindracea y Mucor miehei en la esterificación del isómero cis- 9, trans-11 deseado (Warwel, S.; Borgdorf, R.; Biotechnology Letters, 2000,22 (14), 1151-55).

Como se describe más adelante en el procedimiento de la presente invención puede obtenerse de manera unívoca este isómero activo por desaturación específica del ácido trans 11-octadecenoico.

Para la producción de ácidos grasos poliinsaturados se ha empleado levadura Saccharomyces cerevisiae transformada genéticamente con incorporación de genes de diversas desaturasas de ácidos grasos de distinta procedencia (Suzuki, O. et al. W. O.

2001075069 Al, Michinaka, Y. et al.; J. of Oleo Science 2001,50 (5) : 359-365.) En la presente invención se utiliza una A-9 desaturasa de Saccharomyces cerevisiae, para la producción selectiva de ácidos grasos poliinsaturados.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.

Descripción breve La presente invención describe un procedimiento de producción de ácidos grasos poliinsaturados mediante la incorporación de ácidos grasos olefínicos o acetilénicos de 13-18 átomos de carbono de longitud de cadena como sustratos a una cepa silvestre haploide o diploide de levadura Saccharomyces cerevisiae W 303a ó hElol que permite la generación de un nuevo enlace de configuración Z en la posición 9 de dichos sustratos. La nueva desaturación sólo se produce si la instauración original en los productos suministrados tiene la configuración E o es un acetileno mientras que si el enlace original tiene la configuración Z el sustrato se recupera inalterado.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención se basa en que los inventores han observado que la adición como sustrato de ácidos grasos monoinsaturados conteniendo una o varias instauraciones a partir de la posición C-11 de la cadena a cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae permite la producción de ácidos grasos poliinsaturados de longitud de cadena C13-C18 con una instauración adicional de configuración Z en la posición 9 de la cadena originada por la A-9 desaturasa de la levadura.

Más específicamente, la presente invención se refiere a la producción de ácidos grasos poliinsaturados de longitud de cadena C13-C18 empleando un procedimiento que consiste en cultivos de cepas de Saccharomyces cerevisiae W303a haploides o diploides (American Type Culture Collection) y AElol (deficiente en elongasa)

modificada genéticamente (EUROSCARF) a los que se han incorporado como sustratos ácidos grasos conteniendo una o varias instauraciones a partir de la posición C-11 de la cadena para producir compuestos con una instauración adicional de configuración Z en la posición 9 de la cadena, entre otros, pertenecientes al siguiente grupo : Z9, E11 : 13; Z9, E11 : 14; Z9, E11 : 15; Z9, E11 : 16; Z9, E11 : 18 ; Z11 : 13; Z11 : 14; Z11 : 15; Z11 : 16 y Z9, 11, 11 : 13 mediante la incubación con las cepas W303a haploides o diploides, y Z9, E11 : 13; Z9, E11 : 14 ; Z9, E11 : 15; Z9, E11 : 16; Z9, E11 : 18; Zll : 13; Zll : 14; Zll : 15; Zll : 16 y Z9, 11,11 : 13 mediante la incubación con la cepa AElol, resoectivamente.

Se ha observado que los sustratos suministrados a la levadura con dobles enlaces con configuración E o trans son desaturados por la A-9 desaturasa de la levadura mucho más rápidamente que los correspondientes isómeros Z o cis con la formación de un nuevo doble enlace de configuración Z o cis en posición 9 de la cadena alifática produciéndose los correspondientes derivados Z9E11 (cis9, trans). Asimismo, tal como se indica más abajo en la Tabla I, se ha comprobado que en los casos de utilización de las cepas haploides y diploides W303a se produce un alargamiento parcial de dos de la cadena del sustrato original manteniéndose la desaturación en la posición 9 del nuevo sustrato, elongación que no se produce cuando se emplean las cepas AElol.

Los productos obtenidos pueden tener aplicación en la industria farmacéutica como anticancerígenos (por ejemplo el compuesto Z9E11), en las industrias agroalimentarias como nutricéuticos, en cosmética y en la industria de química fina como intermedios para la síntesis de feromonas de insectos para su aplicación dentro del control integrado de plagas de insectos por métodos biorracionales.

Sin que ello presuponga una limitación en la aplicación de la presente invención que se define en las reivindicaciones especificadas más adelante vamos a describir un ejemplo concreto de aplicación.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1. -Procedimiento de producción de ácidos grasos poliinsaturados con levaduras por incorporación de sustratos olefínicos o acetilénicos.

Cultivos de levaduras con sustratos.

El crecimiento de colonias de levadura W303a haploide y diploide y AElol (deficiente en elongasa) se realizó en medio sólido con placas de YPD-agar a 37°C

durante 24 h. A partir de una solución etanólica 1M de ácido graso sustrato se añade a una única colonia de levadura en 2 mL de medio líquido YPD-tergitol (1%) de manera que los ácidos grasos estén en una concentración final de 0,25-1 mM de sustrato, preferentemente 0,5 mM. La mezcla se deja crecer durante 24-48 horas, preferentemente 24 horas a 37°C en agitación a 200-300 rpm, preferentemente 200 rpm.

Procedimiento de extracción de los distintos ácidos.

Se trasvasa el medio de cultivo a un vial de tipo eppendorf de 1,5 ml y se centrífuga a 3000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se descarta y se acaba de transvasa el medio de cultivo restante y se centrífuga en-las mismas condiciones anteriores. Se descarta el sobrenadante y se lava con 1 mL de agua y se repiten las operaciones de lavado, centrifugación y eliminación del sobrenadante dos veces más.

Finalmente, se centrifuga a 3000 rpm durante 2 min. para eliminar totalmente el agua.

Se añade 1 mL de CHCl3 : MeOH (2 : 1) y se deja en agitación con un brazo mecánico durante 1 h. Finalmente, se centrifuga a 13200 rpm 15 s. se pasa el extracto orgánico a un vial de 3 mL y se evapora el disolvente.

El residuo de ácidos grasos fue metanolizado por adición de 0,5 mL de una disolución 0, 5N de KOH en MeOH, seguido de neutralización después de 30 min con 0,5 mL de Hui 1N y extracción con 0,5 mL de hexano. La capa orgánica se separa, se concentra hasta un volumen de 20 I1L y se analiza por CG-EM.

Análisis de los ácidos obtenidos.

Los ésteres metílicos se analizan por CG-EM en una columna apolar HP-1 con el siguiente programa de temperaturas 80°C (0) /5/200 (0) 10/300 (10).

La posición de los dobles enlaces conjugados se analizó por CG-EM por formación de los complejos con MTAD (4-metil-1, 2,4-triazolin-3, 5-diona). Estos complejos se forman por adición de 2,5 uL de una disolución de 1,2 mg de MTAD en 1mL de CH2Cl2 sobre 10 VtL de extracto hexánico, agitando y evaporando hasta un volumen final de 2 iL. Se inyecta en CG-EM con el siguiente programa de temperaturas 80° (0)/5/200 (0) /10/300 (25).

La posición de dobles enlaces no conjugados se determinó por formación de complejos con DMDS (sulfuro de dimetilo). Estos complejos se forman por adición sobre 20 pL de extracto hexánico, 50 uL de disulfuro de dimetilo y una gota de solución de yodo en dietil éter (60 mg/mL). La mezcla se calienta a 45-50° durante 72 h.

Pasado este tiempo se diluye con hexano, se elimina el yodo con una solución saturada de Na2S203, se lava con H20 y se separa la fase orgánica. El volumen de hexano se concentra a 20 pL y se analiza por CG-EM inyectando 1 plu bajo las condiciones arriba indicadas.

Resultados.

Los sustratos empleados fueron una serie de ácidos grasos monoinsaturados de 13-18 átomos de carbono en la cadena que en la posición 11 poseían un doble enlace de estereoquímica Z o E o un triple enlace.

Estos ácidos eran accesibles comercialmente o fueron sintetizados en nuestro laboratorio por métodos convencionales. Como se indica en la Tabla I los sustratos con estereoquímica E o trans en el doble enlace o un triple enlace son desaturados por la levadura en la posición 9 dando los correspondientes derivados Z9E11, mientras que bajo las condiciones de la incubación, 24 horas a 37° agitando a 200 rpm, los correspondientes sustratos con estereoquímica Z o cis se recuperan inalterados.

Las cepas W303a haploide y diploide que contienen elongasa son capaces de prolongar la cadena en 2, dependiendo del sustrato. En estos casos los nuevos ácidos grasos formados con insaturaciones en posiciones 13 ó 15 pueden desaturarse a los correspondientes Z9E13 y Z9E15. En el caso de sustratos con dobles enlaces de configuración Zll no se observa una ulterior desaturación a pesar de obtenerse por elongación de la cadena los correspondientes sustratos con dobles enlaces de configuración Z13 y Z15. Además, los dienos Z9E11 formados pueden ser alargados a los correspondientes Z1 lE13 y Z13E15.

Cuando se utilizan cepas de levadura deficientes en elongasa (AElol) sólo se obtienen los dienos Z9E11 resultantes de la desaturación.

En todos los casos se observan ácidos endógenos propios de la levadura como son el palmitoleico (Z9 : 16) y el oleico (Z9 : 18).

TABLA I Ácido sustrato* Cepa levadura Productos detectados Mayoritario Minoritario Ell : 13 W303a haploide o Z9, E11 : 13 Z11, E13 : 15 diploide Z9E13 : 15 E13 : 15 Ell : 13 #Elol Z9,E11 : 13 E11 : 14 W303a haploide o Z9, E11 : 14 Z11E13 : 16 diploide E13 : 16 Ell : 14 #Elo1 Z9,E11 : 14 Ell : 15 W303a haploide o Z9, E11 : 15 Z11E13 : 17 diploide E13 : 17 Z9E13 : 17 Ell : 15 #Elo1 Z9,E11 : 15 E11 : 16 W303 a haploide o Z9, E11 : 16 Z11E13 : 18 diploide Z9E13:18 E13 : 18 Ell : 16 #Elo1 Z9,E11 : 16--------- E11 : 18 W303a haploide o Z9, E11 : 18 diploide E11 : 13 #Elo1 Z9,E11 : 18 Z11 : 13 W303a haploide o Z11 : 13 Z13 : 15 diploide Zll : 13 #Elo1 Z11 : 13 Zll : 14 W303a haploide o Z11 : 14 Z13 : 16 diploide Z11 : 14 #Elo1 Z11 : 14 Z11 : 15 W303a haploide o Z11 : 15 Z13 : 17 diploide Zll : 15 AElol Zll : 15 Z11 : 16 W303a haploide o Z11 : 16 Z13 : 18 diploide Z11:16 #Elo1 Z11 : 16 11,11 : 13 W303a haploide o Z9, 11, 11 : 13 Z111313 : 15 diploide13, 13 : 15 11,11 : 13 AElol Z9, 11, 11 : 13--.-- * Configuración y posición insaturación : longitud cadena.