Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus ei- nem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist. Die Erfindung betrifft weiter eine Portionseinheit, erhältlich durch das Verfahren. Die Erfindung betrifft ferner verschiedene Verwendungen der Portionseinheit. Hintergrund der Erfindung

Bei der Entstehung von Krebs spielen häufig größere strukturelle Veränderungen der Chromosomen, sogenannte Chromosomen- bzw. DNA-Rearrangements, eine entscheidende Rolle. Beispiele für DNA-Rearrangements sind Duplikationen, Translokationen, Inversionen und Deletionen von bestimmten Chromosomenab- schnitten sowie DNA-Strangbrüche und anschließende Fusionen der DNA- Stränge in veränderter Anordnung. Die Identifizierung von DNA-Rearrangements wird zur Diagnose von Krebs eingesetzt und kann als Grundlage für eine personalisierte Krebstherapie dienen. Um DNA-Rearrangements zu identifizieren, wird ein als„molecular combing" (molekulares Kämmen) bekanntes Verfahren eingesetzt. Für das„molecular combing" sind intakte, lange DNA-Fragmente erforderlich, die auf eine Glasoberfläche gekämmt werden. Durch das Kämmen werden die DNA-Fragmente ausgerichtet und gedehnt. Dadurch ist es anschließend möglich, die DNA-Fragmente mit Hybridi- sierungssonden in Kontakt zu bringen und durch eine Bildanalyse der hybridisierten Sonden DNA-Rearrangements zu identifizieren. Dementsprechend wird das „molecular combing" häufig mit Hybridisierungstechniken wie beispielsweise Fluo- reszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert. Für das„molecular combing" werden DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 1000 Kilobasenpaaren benötigt. Solche DNA-Fragmente werden als hochmo- lekulare DNA bezeichnet und gewinnen auch für andere molekularbiologische Techniken wie beispielsweise das Next Generation Sequencing zunehmend an Bedeutung. Um hochmolekulare DNA aus Zellen bzw. Zellkernen zu isolieren, muss die DNA während ihrer Isolierung vor Scherkräften geschützt werden. Scherkräfte können dazu führen, dass die DNA in kleine Fragmente zerbricht, die eine Bildanalyse zur Detektion von DNA-Rearrangements unmöglich machen würden. Zum Schutz vor Scherkräften wird die DNA während der Isolierung aus Zellen immobilisiert, bei- spielsweise in Aga rose. Die Zellen werden manuell in Aga rose eingebettet. Dazu werden die Zellen zunächst mit einer fließfähigen Agaroselösung gemischt. Eine bestimmte Menge des Gemischs wird in ein Zielgefäß gegeben und dort verfestigt, bevor mit der Isolierung der hochmolekularen DNA begonnen wird. Das verfestigte Gemisch kann als Portionseinheit bezeichnet werden.

Für den Einsatz von „molecular combing" in Krebsdiagnoseverfahren ist eine Standardisierung aller Verfahrensschritte und eine hohe Präzision erforderlich, um falsche Ergebnisse oder Misinterpretationen zu verhindern. Das manuelle Herstellen der Portionseinheiten kann diesen Anforderungen nicht durchgehend gerecht werden, da es eine schlechte Reproduzierbarkeit aufweist. Zum einen lässt sich eine gewisse Variabilität der Portionseinheiten von Person zu Person aufgrund von Unterschieden im individuellen Umgang mit den Portionseinheiten nicht vermeiden. Zum anderen sind die Portionseinheiten sehr fragil. Aus diesem Grund können selbst dann Unterschiede zwischen den Portionseinheiten auftreten, wenn sie von ein- und derselben Person hergestellt wurden. Somit ist es schwierig, standardisierte Portionseinheiten für eine Vielzahl von Proben manuell herzustellen. Folglich kommt es auch zu Unterschieden in der Menge und Qualität der hochmolekularen DNA, die aus den Zellen in den Portionseinheiten isoliert wird. Es besteht daher ein Bedarf an einem automatisierbaren Verfahren zur Herstellung der Portionseinheiten. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, das Verfahren umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines fließfähigen, verfestigbaren Gemischs, das das Trägermateria! und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bei einer ersten Reaktionsbedingung,

b) Einbringen einer vorbestimmten Menge des Gemischs in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid, wobei die Öffnung groß genug ist, um die Portionseinheit durch die Öffnung auszubringen,

c) Verfestigen des Gemischs in der Pipettenspitze durch Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei einer zweiten Reaktionsbedingung, bei der sich das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet, und d) Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, erhältlich durch ein Verfahren gemäß der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung einer Nukleinsäure.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung eines Proteins.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, das Verfahren umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines fließfähigen, verfestigbaren Gemischs, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bei einer ersten Reaktionsbedingung,

b) Einbringen einer vorbestimmten Menge des Gemischs in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid, wobei die Öffnung groß genug ist, um die Portionseinheit durch die Öffnung auszubringen,

c) Verfestigen des Gemischs in der Pipettenspitze durch Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei einer zweiten Reaktionsbedingung, bei der sich das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet, und d) Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, hergestellt. Der Begriff „Portionseinheit" wie hier verwendet bezeichnet eine verfestigte vorbestimmte Menge des Trägermaterials, in dem die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell eingebettet ist. Die Zelle oder das Zellorganell ist dabei von dem Trägermaterial umschlossen. Da das Trägermaterial der Portionseinheit verfestigt ist, ist die Zelle oder das Zellorganell in dem Trägermaterial der Portionseinheit immobilisiert. Aufgrund des gelartigen Trägermaterials ist die Portionseinheit elastisch. Das bedeutet, dass die Portionseinheit unter Krafteinwirkung ihre Form verändern und bei Wegfall der einwirkenden Kraft in ihre ursprüngliche Form zurückkehren kann. Der Begriff„biologische Zelle" wie hier verwendet bezeichnet eine Zelle eines Tieres, einer Pflanze, eines Pilzes, eines Bakteriums oder eines Archaeons. Das Tier ist beispielsweise ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch. Eine biologische Zelle weist eine Zellmembran auf, die das Zytoplasma und die darin enthaltenen weite- ren Bestandteile der Zelle wie beispielsweise Zellorganellen umgibt. Der Begriff „Zellorganell" wie hier verwendet bezeichnet einen Bestandteil einer Zelle, der von einer einfachen oder einer doppelten Membran umgeben ist. Zu den Zellorganellen zählen beispielsweise Zellkern und Mitochondrium. Für das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst ein fließfähiges, verfestigbares Gemisch, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bei einer ersten Reaktionsbedingung bereitgestellt. Als Trägermaterial ist jedes gelartige Material geeignet, das in Abhängigkeit einer Reaktionsbedingung als fließfähige, verfestigbare Masse oder in ver- festigter Form vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial Aga rose. Wenn das Trägermaterial als fließfähige Masse vorliegt, können die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell in das Trägermaterial eingemischt werden. In dem resultierenden Gemisch, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bleiben die Eigenschaften des Trägermaterials erhalten, so dass das Gemisch ebenfalls fließfähig und verfestigbar ist.

Der Begriff „Reaktionsbedingung" wie hier verwendet bezeichnet mindestens einen Parameter oder eine Kombination von Parametern, bei dem/der mindestens einer der Verfahrensschritte durchgeführt wird. Die Parameter umfassen vorzugsweise eine Temperatur, eine Salzkonzentration, eine lonenstärke, einen pH-Wert und/oder einen Zusatz von Reagenzien. Die Wahl der Reaktionsbedingung hängt insbesondere davon ab, welches Trägermaterial in dem Verfahren eingesetzt wird. Die Reaktionsbedingung ist insbesondere eine Temperatur.

Die erste Reaktionsbedingung ist die Reaktionsbedingung, bei der das fließfähige, verfestigbare Gemisch, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bereitgestellt wird. Die erste Reaktionsbedingung wird daher so gewählt, dass das Gemisch in einem fließfähigen, verfestigbaren Zustand vorliegt. Dazu wird die erste Reaktionsbedingung so gewählt, dass das Trägermaterial in einem fließfähigen, verfestigbaren Zustand vor- liegt. Die erste Reaktionsbedingung wird demzufolge in Abhängigkeit der Geliertemperatur des eingesetzten Trägermaterials gewählt. Die Geliertemperatur ist die Temperatur, bei der sich das Trägermaterial zu einem Gel oder zu einem gelartigen Körper verfestigt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Reaktionsbedingung eine Temperatur von etwa 45°C.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend eine vorbestimmte Menge des Gemischs in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingebracht. Eine Pipettenspitze weist zwei einander gegenüberliegende Längsenden mit jeweils einer Öffnung auf, von denen das eine Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid und das andere Längsende zum Aufstecken der Pipettenspitze auf einen Pipettenschaft einer Pipette oder auf einen Pipettierkopf eines Pipettierroboters eingerichtet ist. Bei bekannten Pipettenspitzen hat das Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid typischerweise die Form eines Kegelstumpfs, dessen Durchmesser sich zur Öffnung des Längsendes hin verringert. Diese Pipettenspitzen sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Des Weiteren sind Pipettenspitzen mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid ist groß genug, um die Portionseinheit durch die Öffnung aus der Pipettenspitze auszubringen. Aufgrund des gelartigen Trägermaterials ist die Portionseinheit elastisch. Durch die Elastizität lässt sich die Portionseinheit vorübergehend verformen. Somit kann die Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze ver- formt werden und nach dem Ausbringen in ihre ursprüngliche Form zurückkehren. Das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze erfolgt also unter Beibehaltung der ursprünglichen Form der Portionseinheit. Eine vorübergehende Verformung der Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze tritt beispielsweise auf, wenn das Längsende der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid die Form eines Kegelstumpfs hat. In diesem Fall ist die Portionseinheit auch kegelstumpfförmig und der dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte Teil der Portionseinheit muss sich beim Ausbringen aus der Pipettenspitze verformen, damit die Portionseinheit durch die Öffnung der Pipettenspitze gebracht werden kann. Das Verformen der Portionseinheit kann beispielsweise durch Ausüben eines Drucks auf die Portionseinheit in Richtung der Pipettenspitzenöffnung hervorgerufen werden. Je elastischer die Portionseinheit ist, umso weniger Druck ist für das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze bei gleicher Größe der Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid erforderlich. Der Druck ist vor- zugsweise gleichmäßig über die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte Oberfläche der Portionseinheit verteilt.

Die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid muss also eine bestimmte Mindestgröße haben, damit sich die Portionseinheit durch die Öffnung aus der Pipettenspitze ausbringen lässt. Diese Mindestgröße hängt von der Elastizität und der Größe der Portionseinheit ab. Beispielsweise kann die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid umso kleiner sein, je elastischer die Portionseinheit ist. Die Elastizität der Portionseinheit hängt in erster Linie von der Art und Zusammensetzung des Trägermaterials ab.

Die Öffnung der Pipettenspitze muss groß genug sein, um die Portionseinheit unbeschädigt durch die Öffnung auszubringen. Die Portionseinheit darf während des Ausbringens aus der Pipettenspitze nicht beschädigt werden, damit die Portionseinheit nach dem Ausbringen wieder ihre ursprüngliche Form annimmt. Nimmt die Portionseinheit nach dem Ausbringen aus der Pipettenspitze wieder ihre ursprüngliche Form an, so ist davon auszugehen, dass die Zelle oder das Zellorga- nell und deren/dessen Bestandteile, insbesondere DNA, während des Ausbrin- gens der Portionseinheit aus der Pipettenspitze vor Scherkräften geschützt gewesen sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid einen Innendurchmesser von 2 mm bis 5 mm, vorzugsweise von 3 mm bis 4 mm.

Um eine Kontamination der Portionseinheit zu vermeiden, ist die Pipettenspitze vorzugsweise eine Einweg-Pipettenspitze.

Das Einbringen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze kann auf verschiedene Weisen erfolgen, beispielsweise durch Einsaugen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze mit Unterdruck oder durch Eintauchen des Längsendes zum Einbringen und Ausbringen von Fluid in ein Ge- faß, das das Gemisch enthält. Beim Eintauchen der Pipettenspitze in das Gemisch in dem Gefäß wird das Gemisch durch Kapillarkräfte in die Pipettenspitze eingebracht. Dabei ist die Menge des eingebrachten Gemischs von der Dauer des Eintauchens der Pipettenspitze abhängig, so dass die vorbestimmte Menge des Gemischs durch eine vorbestimmte Eintauchdauer erreicht werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Verfestigen des Gemischs in der Pipettenspitze, so dass sich die Portionseinheit bildet. Dieser Verfahrensschritt erfolgt durch Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei einer zweiten Reaktionsbedingung, bei der sich das Gemisch verfestigt. Dazu wird die zwei- te Reaktionsbedingung so gewählt, dass sich das Trägermaterial verfestigt. Die zweite Reaktionsbedingung wird demzufolge in Abhängigkeit der Geliertemperatur des eingesetzten Trägermaterials gewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine Temperatur von etwa 4°C. Das Gemisch, das in das Längsende der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingebracht wurde, wird in der Pipettenspitze verfestigt, so dass sich die Portionseinheit in der Pipettenspitze bildet. Die Portionseinheit entsteht durch das Verfestigen der vorbestimmten Menge des Gemischs.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Ausbringen der Portions- einheit aus der Pipettenspitze. Das Ausbringen der Portionseinheit kann auf verschiedene Weisen erfolgen, beispielsweise durch Ausblasen oder Ausklopfen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze oder durch Zerstören der Pipettenspitze. Das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze erfolgt unter Beibehaltung der ursprünglichen Form der Portionseinheit. Dabei ist es möglich, dass sich die Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze verformt und nach dem Ausbringen in ihre ursprüngliche Form zurückkehrt. Alternativ wird die Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze nicht verformt.

Das verfestigte Trägermaterial schützt die darin eingebettete Zelle oder das darin eingebettete Zellorganell und deren/dessen Bestandteile, insbesondere DNA, vor Scherkräften.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die Portionseinheit in der Pipettenspitze gebildet wird. Es ist bekannt, das verfestigbare Gemisch in ein Zielgefäß einzubringen und das Gemisch in dem Zielgefäß zu verfestigen, so dass sich die Portionseinheit in dem Zielgefäß bildet. Allerdings haftet die Portionseinheit dann auf dem Boden und an den Wänden des Zielgefäßes, so dass die für Reagenzien zugängliche Oberfläche der Portionseinheit verringert ist und für bestimmte Verwendungen der Portionseinheit nicht ausreicht. Im Unterscheid dazu wird die Portionseinheit in dem erfindungsgemäßen Verfahren in der Pipettenspitze gebildet und anschließend aus der Pipettenspitze ausgebracht. Dadurch ist die Portionseinheit von allen Seiten für Reagenzien zugänglich. Dadurch können Re- aktions- und/oder Waschschritte im Rahmen der weiteren Verwendung der Portionseinheit effizienter durchgeführt werden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass das Verfahren automatisierbar ist, so dass die Portionseinheit automatisiert hergestellt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Portionseinheit daher automatisiert hergestellt. Aufgrund der Automatisierbarkeit kann das Verfahren teilweise oder auch vollständig von einem Pipettierroboter ausgeführt werden. Der Pipet- tierroboter ist vorzugsweise eingerichtet, die von ihm auszuführenden Verfahrens- schritte zu vorbestimmten Zeitpunkten durchzuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahrensschritte daher zu vorbestimmten Zeitpunkten durchgeführt.

Ein automatisiertes Ausführen des Verfahrens ermöglicht die parallele Herstellung einer Vielzahl von Portionseinheiten. Dadurch kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Hochdurchsatz-Anwendungen angewendet werden. Beispielsweise kann das Gemisch in einer Mikrotiterplatte mit 96 oder 384 Wells (Näpfchen) bereitgestellt werden. Ein automatisiertes Ausführen des Verfahrens ermöglicht nicht nur die Parallelisie- rung des Verfahrens, durch die Zeit eingespart wird, sondern auch eine weitreichende Kontrolle und Überwachung der einzelnen Verfahrensschritte. Dadurch wird eine reproduzierbare Herstellung der Portionseinheit ermöglicht. Die Kontrolle und Überwachung der Verfahrensschritte ist insbesondere für den Schritt b) vor- teilhaft, da ein Pipettierroboter kontrollieren kann, ob die vorbestimmte Menge des Gemischs in die Pipettenspitze eingebracht wurde, beispielsweise durch Überwachen der aus der Pipettenspitze verdrängten Luft. Durch das kontrollierte und reproduzierbare Einbringen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze lässt sich im Gegensatz zur manuellen Durchführung des Verfahrens- schritte eine reproduzierbare Größe der Portionseinheit sicherstellen. Die reproduzierbare Größe der Portionseinheit ist insbesondere bei molekularbiologischen Untersuchungen von Bedeutung, da die Untersuchungsergebnisse häufig nur unter dieser Voraussetzung korrekt interpretiert werden können. Des Weiteren kann die Geschwindigkeit vorgegeben werden, mit der das Einbringen der vorbestimm- ten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze erfolgt. Dadurch lässt sich die vorbestimmte Menge des Gemischs auf kontrollierte Weise in die Pipettenspitze einbringen. Ferner kann dadurch ein etwaiges Eindringen von Luftblasen in das Ge- misch während Schritt b) vermieden werden. Auch das korrekte und vollständige Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze kann von einem Pipettier- ro boter verifiziert werden. Durch diese technischen Möglichkeiten lässt sich die korrekte und reproduzierbare Herstellung der Portionseinheit sicherstellen, so dass standardisierte Portionseinheiten für eine Vielzahl von Proben von Zellen oder Zellorganellen hergestellt werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt vor Schritt a) ein Mischen des fließfähigen, verfestigbaren Trägermaterials mit der mindestens einen Zelle oder dem mindestens einem Zellorganell bei der ersten Reaktionsbedingung, um das Gemisch herzustellen. Vorzugsweise liegt die Zelle oder das Zellorganell vor dem Einmischen in das Trägermaterial bereits bei der ersten Reaktionsbedingung vor, um ein Verfestigen des Trägermaterials bei Zugabe der Zelle oder des Zellorga- nells zu vermeiden. Beispielsweise kann die Zelle oder das Zellorganell auf die gleiche Temperatur wie das fließfähige Trägermaterial vorgewärmt oder vorgekühlt werden.

Eine Suspension von Zellen oder Zellorganellen wird beispielsweise im Verhältnis 1 :1 (v/v) mit dem Trägermaterial gemischt. Beispielsweise werden 50 μΙ einer Zell- Suspension mit 50 μΙ einer Lösung von 2% Agarose als Trägermaterial gemischt. Der Anteil an Trägermaterial in dem Gemisch kann erhöht werden, um festere und damit mechanisch stabilere Portionseinheiten zu erhalten. Alternativ kann die Konzentration des Trägermaterials erhöht werden, um festere Portionseinheiten herzustellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt b) durch Einsaugen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze mit Unterdruck. Dazu kann beispielsweise eine gewöhnliche Mikroliter- oder Kolbenhubpipette, auf der die Pipettenspitze aufgesteckt ist, eingesetzt werden. In diesem Fall zieht ein beweg- licher Kolben in der Aufwärtsbewegung die unter ihm liegende Luftsäule mit sich nach oben und dadurch auch das Gemisch in die aufgesteckte Pipettenspitze. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt b) bei einer Flussrate von 1 μΙ/s bis 300 μΙ/s, vorzugsweise von 1 μΙ/s bis 100 μΙ/s. Die Flussrate wird in Abhängigkeit der Viskosität des Gemischs, der in die Pipettenspitze einzubringenden vorbestimmten Menge des Gemischs und des Durchmessers der Öffnung des Längsendes der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid gewählt. Durch die Wahl der Flussrate lässt sich die vorbestimmte Menge des Gemischs auf kontrollierte Weise in die Pipettenspitze einbringen. Die Flussrate wird vorzugsweise ausreichend niedrig gewählt, um ein etwaiges Auftreten von Luftblasen in dem Gemisch während Schritt b) zu vermeiden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die vorbestimmte Menge des Gemischs etwa 5 μΙ bis etwa 300 μΙ, weiter bevorzugt etwa 10 μΙ bis etwa 250 μΙ, weiter bevorzugt etwa 50 μΙ bis etwa 200 μΙ, am meisten bevorzugt etwa 75 μΙ bis etwa 150 μΙ. Die vorbestimmte Menge des Gemischs wird in Abhängigkeit der verfügbaren Menge an Zellen oder Zellorganellen und/oder der beabsichtigten Verwendung der Portionseinheit gewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die vorbestimmte Menge des Gemischs etwa 100 μΙ.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei der zweiten Reaktionsbedingung durch Einbringen des Längsendes der Pipettenspitze in eine Lösung, die die Temperatur der zweiten Reaktionsbedingung hat. Das Längsende der Pipettenspitze kann beispielsweise in eine Lösung, die eine Temperatur von etwa 4°C hat, eingetaucht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt d) durch Ausblasen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze. Dazu kann beispielsweise eine gewöhnliche Mikroliter- oder Kolbenhubpipette, auf der die Pipettenspitze aufgesteckt ist, eingesetzt werden. In diesem Fall verdrängt ein beweglicher Kolben beim Herunterdrücken die unter ihm liegende Luftsäule, so dass die Portionseinheit aus der Pi- pettenspitze ausgeblasen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Portionseinheit in ein Zielgefäß mit einer Reaktionslösung oder auf eine feste Oberfläche ausgebracht. Dies hängt vor allem von der beabsichtigten weiteren Verwendung der Portionseinheit ab. Wird die Portionseinheit in ein Zielgefäß mit einer Reaktionslösung ausgebracht, so wird die Reaktionslösung in Abhängigkeit der weiteren Verwendung der Portionseinheit gewählt. Die Reaktionslösung kann beispielsweise ein Lysepuffer zum Ly- sieren der Zelle oder des Zellorganells in der Portionseinheit sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Längsende der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid zylindrisch, wobei das zylindrische Längsende eine vorbestimmte Höhe hat, so dass die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte freie Oberfläche des Gemischs nicht über das zylindrische Längsende der Pipettenspitze hinaus ragt. Somit hängt die minimale vorbestimmte Höhe des zylindrische Längsendes von der vorbestimmten Menge des Gemischs, das in die Pipettenspitze eingebracht wird, und vom dem Durchmesser des zylindrischen Längsendes ab. Das zylindrische Längsende erleichtert das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze, da die Portionseinheit während des Ausbringens nicht verformt werden muss. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial Agarose. Agarose ist ein Polysaccharid, das kostengünstig und einfach in der Handhabung ist. Agarose wird typischerweise als Pulver erworben. Das Pulver wird in eine geeignete wässrige Pufferlösung gegeben und für etwa 1 bis etwa 5 Minuten aufgekocht, um die Agarose zu lösen. Vor der weiteren Verwendung wird die gelöste Agarose in der Regel auf etwa 50°C bis etwa 60°C gekühlt oder abkühlen gelassen. Die Geliertemperatur von Agarose, bei der sich die Agarose zu einem Gel verfestigt, liegt je nach der Quelle, aus der die Agarose stammt, im Bereich von etwa 34°C bis etwa 42°C bei 1 ,5% Agarose. Im verfestigten Zustand liegt Agarose als ein Gel vor, das Poren aufweist. Die Poren ermöglichen den Zugang von Rea- genzien zu der in der Portionseinheit eingebetteten Zelle oder dem in der Portionseinheit eingebetteten Zellorganell. Dies ist für die weitere Verwendung der Portionseinheit von Nutzen. Agarose liegt bei einer Temperatur von etwa 50°C bis etwa 60°C als fließfähige, verfestigbare Masse vor. Daher umfasst die erste Reaktionsbedingung bei der Verwendung von Agarose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 50°C bis etwa 60°C, vorzugsweise von etwa 52°C.

Bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 30°C liegt Agarose in verfestigter Form vor. Daher umfasst die zweite Reaktionsbedingung bei der Verwendung von Aga rose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 0°C bis etwa 30°C, weiter bevorzugt von etwa 0°C bis etwa 10°C, am meisten bevorzugt von etwa 4°C. Eine Temperatur von etwa 0°C bis etwa 10°C ist bevorzugt, da das Verfestigen von Agarose bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 30°C im Vergleich zu niedrigeren Temperaturen länger dauert und unkontrollierter ist. Bei 4°C reichen bereits einige Sekunden für das Verfestigen von Aga rose und damit des Gemischs in der Pipettenspitze.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial von etwa 0,5% bis etwa 10% Agarose. Die Konzentrationsangaben für Agarose sind als Gewicht pro Volumen (w/v) angegeben. Beispielsweise werden für 1 % Agarose 1 ,0 g Aga- rosepulver in 100 ml Pufferlösung gelöst. Je höher die Agarose konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren, die die verfestigte Aga rose in der Portionseinheit aufweist und desto fester ist die Portionseinheit. Die Konzentration der Agarose wird daher in Abhängigkeit der beabsichtigten weiteren Verwendung der Portionseinheit gewählt. Wird 0,5% Agarose als Trägermaterial eingesetzt, ist die Porti- onseinheit sehr weich. Bei höheren Agarosekonzentrationen wie beispielsweise von 0,75% bis 1 % ist die Portionseinheit bereits fester und somit mechanisch stabiler, wodurch die Handhabung der Portionseinheit erleichtert wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial 1 ,5% Agarose. Bei 1 ,5% Agarose ist die Portionseinheit mechanisch ausreichend stabil, so dass die Portionseinheit einfach handzuhaben ist, während die Poren- große der Aga rose eine Vielzahl von weiteren Verwendungsmöglichkeiten der Portionseinheit erlaubt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aga rose eine niedrigschmelzende Agarose. Niedrigschmelzende Agarose hat im Vergleich zu Standard-Agarose eine niedrigere Schmelztemperatur und auch eine niedrigere Geliertemperatur. Die Geliertemperatur von niedrigschmelzender Aga rose liegt im Bereich von etwa 24°C bis etwa 30°C bei 1 ,5% Aga rose. Somit liegt niedrigschmelzende Agarose auch noch bei einer Temperatur von etwa 40°C bis etwa 50°C als fließfähige, ver- festigbare Masse vor. Daher umfasst die erste Reaktionsbedingung bei der Verwendung von niedrigschmelzender Agarose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 40°C bis etwa 50°C, vorzugsweise von etwa 45°C. Dies ist vorteilhaft, da Temperaturen über 45°C zu einer Beschädigung der Zelle oder des Zellorganells in dem Gemisch oder zu einer Beschädigung der Pipettenspitze füh- ren können.

Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass niedrigschmelzende Agarose auch bei Temperaturen, die bis zu 15°C unterhalb von 45°C liegen, noch flüssig bleibt. Dies ist für die Prozesssicherheit von Bedeutung, da es ein vorzeitiges Verfestigen des Gemischs, beispielsweise durch den Kontakt mit der Pipettenspitze, verhindert. Die Pipettenspitze wird vorzugsweise nicht auf die Temperatur des Gemischs vorgewärmt oder vorgekühlt, sondern ohne Vorwärmen bzw. Vorkühlen verwendet, so dass die Pipettenspitze in der Regel Raumtemperatur aufweist. Bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 20°C liegt niedrigschmelzende Agarose in verfestigter Form vor. Daher umfasst die zweite Reaktionsbedingung bei der Verwendung von niedrigschmelzender Aga rose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 0°C bis etwa 20°C, weiter bevorzugt von etwa 0°C bis etwa 10°C, am meisten bevorzugt von etwa 4°C. Bei 4°C reichen bereits einige Sekunden für das Verfestigen von niedrigschmelzender Aga rose und damit des Gemischs in der Pipettenspitze. Im Unterschied zu Aga rose, die bei höheren Temperaturen als fließfähige Masse und bei niedrigeren Temperaturen in verfestigtem Zustand vorliegt, gibt es auch Trägermaterialien, die bei niedrigeren Temperaturen als fließfähige Masse vorliegen und bei höheren Temperaturen ein Gel bilden. Ein Beispiel für ein solches Trägermaterial ist Gelatine. Gelatine liegt beispielsweise bei 4°C als fließfähige Masse vor. Die Geliertemperatur von Gelatine liegt im Bereich von etwa 35°C bis etwa 40°C, wobei verfestigte Gelatine durch weiteres Erwärmen, beispielsweise auf etwa 50°C, wieder flüssig wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Zelle eine tierische Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, weiter bevorzugt eine humane Zelle.

Die Zelle stammt vorzugsweise von einem Krebspatienten. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Portionseinheit eignet sich insbesondere zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus der Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist. Die hochmolekulare DNA wird für die Identifizierung von DNA- Rearrangements zur Diagnose von Krebs benötigt. Darüber hinaus dient die Identifizierung der spezifischen DNA-Rearrangements, die in einem Krebspatienten vorliegen, als wesentliche Voraussetzung für eine personalisierte Krebstherapie.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Dies kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn die mindestens eine Zelle nach der Herstellung der Portionseinheit in derselben kultiviert werden soll.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt eine Konzentration der mindestens einen Zelle in dem Gemisch etwa 50.000 Zellen/ml bis etwa 5.000.000 Zellen/ml, vorzugsweise etwa 1 .000.000 Zellen/ml. Die Konzentration der mindestens einen Zelle in dem Gemisch wird in Abhängigkeit der beabsichtigten weiteren Verwen- dung der Portionseinheit gewählt. Das gleiche gilt für das mindestens eine Zellor- ganell in dem Gemisch, dessen Konzentration in dem Gemisch vorzugsweise et- wa 50.000 Zellorganellen/ml bis etwa 5.000.000 Zellorganellen/ml, vorzugsweise etwa 1.000.000 Zellorganellen/ml beträgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Zellorganell ein Zellkern, ein itochondrium, ein Vesikel, ein endoplasmatisches Retikulum, ein Golgi-Apparat, ein Lysosom, ein Peroxisom, ein Chloroplast, ein Chromoplast, ein Leukoplast, eine Zellsaftvakuole, ein Melanosom oder ein Phagosom.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Zellor- ganeil ein Zellkern oder ein Mitochondrium, vorzugsweise ein Zellkern. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Portionseinheit eignet sich insbesondere zur Isolierung von hochmolekularer DNA. DNA ist in Zellkernen und in Mitochondrien, bei Pflanzen zudem in Chloroplasten zu finden. Für die meisten Anwendungen ist die in den Zellkernen vorliegende chromosomale DNA von Inte- resse, beispielsweise für die Identifizierung von DNA-Rearrangements bei Krebspatienten.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gemisch weiter Magnetpartikel. Dadurch wird eine Portionseinheit hergestellt, in der Magnetpartikel vorliegen. Die Vorliegen von Magnetpartikeln ist bei der weiteren Verwendung der Portionseinheit von Vorteil. Durch die Magnetpartikel ist es möglich, die Portionseinheit durch ein Magnetfeld an einer bestimmten Position zu halten. Dazu kann beispielsweise ein Magnet seitlich oder unterhalb eines Reaktionsgefäßes angebracht werden. Die Portionseinheit bewegt sich dann an die dem Magneten zuge- wandte Seite des Reaktionsgefäßes. Dadurch, dass die Position, an der sich die Portionseinheit befindet, bekannt ist, wird ein Beschädigen oder Zerstören der Portionseinheit während des Bewegens von Flüssigkeiten, beispielsweise während eines Waschens der Portionseinheit, vermieden. Somit können insbesondere Flüssigkeiten aus dem Reaktionsgefäß sicher abgesaugt werden, ohne die Porti- onseinheit zu beschädigen. In einer bevorzugten Ausführungsform interagieren die Magnetpartikel nicht mit Nukleinsäuren. Eine Interaktion der Magnetpartikel mit Nukleinsäuren könnte die Isolierung von Nukleinsäuren wie beispielsweise DNA aus der Zelle oder dem Zel- lorganell in der Portionseinheit stören.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt eine mittlere Partikelgröße der Magnetpartikel etwa 10 nm bis etwa 1000 nm, vorzugsweise etwa 50 nm bis etwa 500 nm. In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, erhältlich durch ein Verfahren gemäß der Erfindung. In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung einer Nukleinsäure. Die Nukleinsäure wird durch das Trägermaterial vor Scherkräften geschützt, so dass intakte, lange Nuk- leinsäure-Fragmente aus der Zelle oder dem Zellorganell isoliert werden können. Die Nukleinsäure kann DNA oder RNA sein. In einer bevorzugten Ausführungs- form ist die Nukleinsäure DNA, weiter bevorzugt hochmolekulare DNA. Der Begriff „hochmolekulare DNA" wie hier verwendet bezeichnet DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 1000 Kilobasenpaaren. Die DNA ist während der Isolierung in der Portionseinheit immobilisiert und vor Scherkräften geschützt. Dadurch ist die Portionseinheit zur Isolierung von hochmolekularer DNA besonders vorteilhaft. Hochmolekulare DNA ist für verschiedene molekularbiologische Verfahren erforderlich, insbesondere für das sogenannte„molecular combing", das zur Identifizierung von DNA-Rearrangements bei der Diagnose von Krebs eingesetzt wird.

Zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus der mindestens einen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, kann die Portionseinheit beispielsweise in ein Zielgefäß ausgebracht werden. Das Zielgefäß enthält vorzugsweise eine Pufferlösung. In einem nächsten Schritt wird die Zelle verdaut bzw. lysiert. Die Lyse der Zelle findet innerhalb der Portionseinheit statt, so dass die DNA weiter durch das Trägermaterial geschützt wird. Die Lyse der Zelle ist häufig temperaturabhängig, so dass dieser Schritt vorzugsweise bei einer konstant gehaltenen, vorbestimmten Temperatur durchgeführt wird. Die Temperatur beträgt beispielsweise 37°C. Der Lyseschritt wird beispielsweise über Nacht, das heißt für etwa 16 Stunden, durchgeführt.

Es folgt ein Waschen der Portionseinheit, um das lysierte Zellmaterial, Zelltrümmer, Enzyme und sonstige Kontaminanten, die die weitere Verwendung der DNA stören könnten, aus der Portionseinheit zu entfernen. Beim Waschen der Portionseinheit muss die Portionseinheit vorsichtig mit der Waschlösung gemischt und in dieser bewegt werden, um ein effizientes Waschen der Portionseinheit zu gewährleisten, ohne dass die Portionseinheit dabei beschädigt oder zerstört wird. Würde die Portionseinheit beim Waschen beschädigt oder zerstört, wäre die DNA Scherkräften ausgesetzt, die die hochmolekulare DNA in kleine Fragmente brechen könnten. Um die Portionseinheit in der Waschlösung zu bewegen, kann das Zielgefäß zum Beispiel einmal oder mehrmals vorsichtig über Kopf und wieder nach oben zurück gedreht werden. Anschließend wird die Waschlösung entfernt. Das Waschen der Portionseinheit kann mehrmals wiederholt, beispielsweise 5 bis 50 Mal wiederholt werden. Vorzugsweise wird das Waschen der Portionseinheit 20 bis 50 Mal, weiter bevorzugt 50 Mal wiederholt.

Nach dem Waschen wird das Trägermaterial der Portionseinheit entfernt. Dazu kann das Trägermaterial beispielsweise wieder in einen fließfähigen Zustand ge- bracht und/oder abgebaut werden. Dieser Schritt ist häufig temperaturabhängig und wird daher vorzugsweise bei einer konstant gehaltenen, vorbestimmten Temperatur durchgeführt. Der Abbau wird vorzugsweise durch einen enzymatischen Verdau des Trägermaterials erreicht. Agarose kann beispielsweise durch Inkubieren mit dem Enzym Beta-Agarase, vorzugsweise bei 42°C, abgebaut werden. Die isolierte hochmolekulare DNA steht nun zur weiteren Verwendung zur Verfügung. Alle Schritte der DNA-Isolierung werden vorzugsweise mittels eines Pipettierrobo- ters durchgeführt, um einen kontrollierten, präzisen und reproduzierbaren Verfahrensablauf zu gewährleisten. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung eines Proteins, vorzugsweise eines Proteins mit mindestens zwei Untereinheiten. Untereinheiten von Proteinen werden durch Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Kräfte und Coulombsche Kräfte zusammengehalten. Das Trägermaterial der Portionseinheit bietet nicht nur Nuklein- säuren, sondern auch Proteinen Schutz vor Scherkräften. Dadurch ist die Portionseinheit auch zur Isolierung von Proteinen und Proteinkomplexen geeignet.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen. Bei der Kokultivierung von Zellen werden mindestens zwei unterschiedliche Arten von Zellen, beispielsweise Krebszellen und Fibroblasten, gemeinsam kultiviert.

Durch die dreidimensionale Umgebung der Zellen in der Portionseinheit eignet sich die Portionseinheit insbesondere zur dreidimensionalen Kultivierung oder Ko- kultivierung von Zellen. Für diese Verwendung wird das Trägermaterial so gewählt, dass es bei der Reaktionsbedingung, bei der die Zellen kultiviert oder kokul- tiviert werden sollen, in einem verfestigten Zustand vorliegt. Menschliche Zellen und andere Säugerzellen werden typischerweise bei 37°C (Körpertemperatur) kultiviert, so dass das Trägermaterial vorzugsweise bei 37°C in einem verfestigten Zustand vorliegt. Das Trägermaterial liegt vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen, beispielsweise bei etwa 4°C, als fließfähige Masse vor. Geeignete Trägermaterialien zur dreidimensionalen Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen sind bekannt. Beispielsweise können Hydrogele aus Strukturproteinen wie Kollagen oder Gelatine-Methacrylat als Trägermaterial eingesetzt werden. Das Trägermate- rial wird in diesem Zusammenhang auch als Matrix bezeichnet und ähnelt in seiner Zusammensetzung vorzugsweise der natürlich vorkommenden, komplexen extrazellulären Umgebung von Zellen in Geweben. In einer bevorzugten Ausführungsform setzen die in der Portionseinheit kultivierten oder kokultivierten Zellen eine Verbindung frei, die durch das Trägermaterial diffundieren und so aus der Portionseinheit austreten kann. Die Zellen können beispielsweise Proteine sezernieren, die das Wachstum und/oder die Proliferation von Krebszellen hemmen. In diesem Fall kann die Portionseinheit zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden.

In einem weiteren Aspekt ist die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Freisetzung einer Verbindung in die Umgebung der Portionseinheit offenbart. Die Portionseinheit ist vorzugsweise von einem Fluid, beispielsweise von einem Medium, umgeben, in das die Verbindung aus der Portionseinheit freigesetzt wird. Wie oben beschrieben wird die Verbindung beispielsweise von der Zelle, die in dem Trägermaterial eingebettet ist, freigesetzt und diffundiert durch das Trägermaterial nach außen. In einer anderen Ausführungsform wird eine Lyse der Zelle, die in dem Trägermaterial eingebettet ist, oder des Zellorganells, das in dem Trägermaterial eingebettet ist, durchgeführt. Während der Lyse wird die Membran, die die Zelle oder das Zellorganell umgibt, aufgelöst, so dass der Inhalt der Zelle oder des Zellorganells in dem Trägermaterial freigesetzt wird und durch das Trägermaterial in die Umgebung der Portionseinheit diffundiert. Durch Steuern der Geschwindigkeit, mit der die Zelle oder das Zellorganell lysiert wird, kann die Geschwindigkeit, mit der die Verbindung in die Umgebung der Portionseinheit freigesetzt wird, gesteuert werden. Dies ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung der Verbindung in die Umgebung der Portionseinheit, beispielsweise eine beson- ders langsame Freisetzung.

Für eine schnelle Freisetzung des Inhalts der Zelle oder des Zellorganells in die Umgebung der Portionseinheit kann das Trägermaterial der Portionseinheit während oder nach der Lyse der Zelle oder des Zellorganells abgebaut und/oder in einen fließfähigen Zustand gebracht werden, beispielsweise indem die Portionseinheit der ersten Reaktionsbedingung ausgesetzt wird. In einem weiteren Aspekt ist die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Freisetzung der Zelle oder des Zellorganells in die Umgebung der Portionseinheit offenbart. Dazu wird das Trägermaterial der Portionseinheit abgebaut und/oder in einen fließfähigen Zustand gebracht, beispielsweise indem die Portionseinheit der ersten Reaktionsbedingung ausgesetzt wird.

In einem weiteren Aspekt ist eine Pipettenspitze mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen von Fluid offenbart, wobei das zylindrische Längsende so hoch ist, dass eine vorbestimmte Menge von Fluid in das zylindrische Längsende einbringbar ist. Somit hängt die minimale vorbestimmte Höhe des zylindrische Längsendes von der vorbestimmten Menge des Fluids, das in die Pipettenspitze eingebracht wird, und vom dem Durchmesser des zylindrischen Längsendes ab.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gesamte Pipettenspitze zylindrisch.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pipettenspitze eine Einweg- Pipettenspitze.

Beispiele

Beispiel 1

Es wird eine Portionseinheit aus niedrigschmelzender Aga rose mit Krebszellen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, hergestellt. Dazu werden Krebszellen, die aus einem Lungentumor eines Krebspatienten stammen, als Suspension mit einer Konzentration von 2.000.000 Zellen/ml in einer wässrigen Pufferlösung, die 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, bereitgestellt. Die Zellsuspension wird für 5 Minuten auf 45°C vorgewärmt. Des Weiteren werden 1 ,5 g niedrigschmelzende Agarose in Pulverform in 100 ml einer wässrigen Pufferlösung, die ebenfalls 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, gegeben und für etwa 3 Minuten aufgekocht, um die niedrig- schmelzende Agarose zu lösen. Die Lösung wird dann auf 45°C abgekühlt. 100 μΙ der vorgewärmten Zellsuspension werden mit 100 μΙ der 1 ,5% Agarose bei 45°C gemischt. Das fließfähige Gemisch wird bei einer Temperatur von 45°C gehalten. 100 μΙ des Gemischs werden von einem Pipettierroboter mit einer Flussrate von 50 μΙ/s in eine Pipettenspitze mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingesaugt. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze ist so hoch, dass die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte freie Oberfläche der 100 μΙ des Gemischs nicht über das zylindrische Längsende der Pipettenspitze hinaus ragen. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze wird von dem Pipettierroboter für 20 Sekunden in eine vorgekühlte Pufferlösung, die eine Temperatur von 4°C hat, eingetaucht. Dadurch wird das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet. Die Portionseinheit wird von dem Pipettier- roboter aus der Pipettenspitze in ein Mikroreaktionsgefäß, das 500 μΙ Lysepuffer zum Lysieren der Zellen enthält, ausgeblasen. Anschließend wird die Portionseinheit zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus den Krebszellen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, verwendet. Beispiel 2

Es wird eine Portionseinheit aus niedrigschmelzender Aga rose mit Zellkernen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, hergestellt. Dazu werden Zellkerne, die aus Leukämie-Zellen eines Leukämiepatienten stammen, als Suspension mit einer Konzentration von 4.000.000 Zellkernen/ml in einer wässrigen Pufferlösung, die 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, bereitgestellt. Die Zellkernsuspension wird für 5 Minuten auf 45°C vorgewärmt. Des Weiteren werden 1 ,5 g niedrigschmelzende Agarose in Pulverform in 100 ml einer wässrigen Pufferlösung, die ebenfalls 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, gegeben und für etwa 3 Minuten aufgekocht, um die niedrigschmelzende Agarose zu lösen. Die Lösung wird dann auf 45°C abgekühlt. 00 μΙ der vorgewärmten Zellkernsuspension werden mit 100 μΙ der 1 ,5% Agarose bei 45°C gemischt. Das fließfähige Gemisch wird bei einer Temperatur von 45°C gehalten. 75 μΙ des Gemischs werden von einem Pipettierroboter mit einer Flussrate von 50 μΙ/s in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingesaugt. Das Längsende der Pipettenspitze hat die Form eines Kegelstumpfs und die Öffnung hat einen Innendurchmesser von 2 mm. Das Längsende der Pipettenspitze wird von dem Pipet- tierroboter für 10 Sekunden in eine vorgekühlte Pufferlösung, die eine Temperatur von 4°C hat, eingetaucht. Dadurch wird das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet. Die Portionseinheit ist elastisch und wird von dem Pipettier- roboter aus der Pipettenspitze in ein Mikroreaktionsgefäß, das 500 μΙ Lysepuffer zum Lysieren der Zellkerne enthält, ausgeblasen. Während des Ausblasens der Portionseinheit aus der Pipettenspitze verformt sich die Portionseinheit, um die Öffnung der Pipettenspitze zu passieren. Nach dem Ausblasen nimmt die Portionseinheit wieder ihre ursprüngliche Form an und wird zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus den Zellkernen, die in der niedrigschmelzenden Agarose ein- gebettet sind, verwendet.

Beispiel 3

Es wird eine Portionseinheit aus Gelatine-Methacrylat mit Krebszellen, die in dem Gelatine-Methacrylat eingebettet sind, hergestellt. Dazu werden Krebszellen, die aus einem Brusttumor einer transgenen Maus stammen, als Suspension mit einer Konzentration von 2.000.000 Zellen/ml bereitgestellt. Die Zellsuspension wird für 5 Minuten auf 4°C vorgekühlt. 100 μΙ der vorgekühlten Zellsuspension werden mit 100 μΙ einer 4°C kalten Lösung von 5% (w/v) Gelatine-Methacrylat in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4°C gemischt. Das fließfähige Gemisch wird bei einer Temperatur von 4°C gehalten. 150 μΙ des Gemischs werden in eine Pipettenspitze mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingesaugt. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze ist so hoch, dass die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte freie Oberfläche der 150 μΙ des Gemischs nicht über das zylindrische Längsende der Pipettenspitze hinaus ragen. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze wird für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Dadurch wird das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet. Die Portionseinheit wird in eine Zellkulturschale, die 5 ml Zellkulturmedium zur Kultivierung der Zellen enthält, ausgeblasen. Anschließend wird die Portionseinheit zur Kultivierung der Krebszellen, die in dem Gelatine-Methacrylat eingebettet sind, verwendet. Es werden Portionseinheiten mit Agarose oder niedrigschmelzender Agarose als Trägermaterial hergestellt. Die vorbestimmte Menge des Gemischs, die in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Aus- bringen von Fluid eingebracht wird, beträgt jeweils 100 μΙ. Tabelle 1 gibt die Mindestgröße des Innendurchmessers der Öffnung der Pipettenspitze für unterschiedliche Konzentrationen von Aga rose oder niedrigschmelzender Aga rose in dem Gemisch an. Die Konzentration ist als Gewicht pro Volumen (w/v) angegeben.

Tabelle 1 :

Mindestgröße des Innendurchmessers

Konzentration von Agarose oder

der Öffnung der Pipettenspitze zum niedrigschmelzender Agarose in

Einbringen und Ausbringen von Fluid dem Gemisch (w/v)

(mm)

0,25 1 ,8

0,5 2,0

0,75 2,2

1 ,0 2,5

1 ,5 3,0

2,0 3,5

2,5 4,0

3,0 4,5

3,5 5,0

4,0 6,0