GLICOPROTEICOS RECOMBINANTES HÍBRIDOS OU NÃO- HÍBRIDOS, HORMÔNIOS GLICOPROTEICOS RECOMBINANTES HÍBRIDOS OU NÂO-HÍBRIDOS, VETORES DE EXPRESSÃO, E USOS

DOS HORMÔNIOS GLICOPROTEICOS RECOMBINANTES CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção pertence ao campo dós processos de produção de hormônios peptídicos; especificamente, ao campo dos processos de produção de hormônios peptídeos contendo mais de 20 aminoácidos; e descreve um processo de produção e purificação de hormônios glicoproíeicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, incluindo seus vetores de expressão, e usos dos mesmos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nos últimos anos inúmeros processos biotecnológicos de produção e purificação de hormônios de natureza proteica e glicoproteica foram desenvolvidos. Todos os processos até então desenvolvidos possuem estratégias próprias que variam de acordo com o hormônio a ser produzido e que visam o aumento da produção do hormônio, ou visam facilitar a etapa de purificação.

Na produção de glicoproteínas recombinantes, o estado da técnica emprega células de mamíferos devido a sua capacidade de promover um correto dobramento e processamento pós-traducional. Diversos fatores estão envolvidos na otimização da expressão proteica em células de mamíferos. Um desses fatores são os vetores de expressão para geração de linhagens celulares recombinantes que utilizam promotores fortes de origem virai ou celular, cómò por exemplo, o promotor de citomegalovírus (CMV) (Gopalkrishnan ei a/;, 1999). Atuaímeníe a maioria dos processos de alta produção de proteínas para a indústria Biofarmacêutica (cerca de 60-70%) é baseada em células cultivadas em suspensão (Moritz, et al, 2015). A Gonadotrofina Coriônica Equina (eCG) é um hormônio

glicoproteico produzido no trofoblasto de éguas prenhas, constituído por 2 subunidades (a e β), com ação similar ao hormônio folículo estimulante (FSH) e ao hormônio luteinizante (LH), ambos oriundos da hipófise e com ação importante nos eventos de indução de crescimento folicular e lute nização, respectivamente (Murphy, 2012). Esta atividade hormonal bi- funcional ocorre após á administração da eCG em espécies de mamíferos distintas dos equinos, como por exemplo em bovinos, suínos, ovinos e caprinos (Murphy, 2012). Os sítios de N-glicosilação da cadeia alfa da eCG é fundamental para a manifestação da sua atividade LH (Min et al. 1996; Min et al., 2004; Bousfield et al., 2004; Murphy, 2012). A região de loops da estrutura proteica da eCG e uma sequência de resíduos de aminoácidos (104-109) da região C-terminal da cadeia beta deste hormônio estão associadas à ação bi-funcional da eCG (atividade LH e FSH) e à sua função FSH, respectivamente (Moyle et al. 1994; Galei et al. 2009).

A eCG é utilizada em diferentes protocolos de da reprodução animal assistida. O uso da eCG em outros mamíferos pode induzir a produção de anticorpos anti-eCG e estes podem diminuir as ações biológicas deste hormônio nestes animais (Hervé et al. 2004, Forcada et al. 201 1). A cadeia alfa da molécula eCG é a principal porção antigênica deste hormônio (Chopineau et ai., 1993).

O gene eCG está presente no cromossomo 10 na espécie Equus caballus, e sua expressão gera as subunidades, (i) gonadotropin alpha 1 subunit (c r 0:39937900-39940069; Gene lD: 100034174), sua

transcrição sofre spiicing de 3 exons gerando um RNA mensageiro

(RNAm) de aproximadamente 2 kb e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,8 kDa, e a (ii) choriogonadotropin subunit beta (chr10:18963366-18964444; Gene ID: 100054774), sua transcrição sofre spiicing de 3 exons gerando um RNAm de aproximadamente 520 kb e sua fase aberta de leitura (ORF) de 510 nucleotídeos é traduzida uma proteína madura de 169 aminoácidos e aproximadamente 17,8 kDa (http://qenome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

O gene CGA da espécie Bos taurus, está presente no cromossomo 9 na posição chr9: 63692501-63694585, e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 280749), sua transcrição sofre splicing de 4 exons gerando um RNAm de

aproximadamente 742 pares de bases (pb) (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,6 kDa (http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

O gene CGA espécie Sus scrofa, está presente no cromossomo 10 na posição chr10: 62246069-62248001 , e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 406869), sua transcrição sofre splicing de 3 exons gerando um RNAm de

aproximadamente 363 pb (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,5 kDa

(http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

O gene CGA da espécie Ovis aries, está presente no cromossomo 8 na posição chr8: 49919904-49921988, e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 443538), sua transcrição sofre splicing de 4 exons gerando um RNAm de

aproximadamente 716 pb (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,5 kDa

(http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

O gene CGA da espécie Capra hircus, está presente no

cromossomo 8 na posição Chr8:499 9901 -49921988, e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 100860817), sua transcrição sofre splicing de 3 exons gerando um RNAm de aproximadamente 366 pb (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,5 kDa

(http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

ESTADO DA TÉCNICA

Diversos documentos de patente tratam de processos de produção da gonadotrofina coriônica equina e de outros mamíferos. Por exemplo:

O documento EP0974599, descreve um hormônio da gonadotrofina coriônica equina recombinante na qual as cadeias□ e□ da gonadotrofina coriônica equina estão ligadas. Essa patente também reivindica os usos veterinários desta molécula recombinante.

Já o documento PI 0108556-5 descreve um processo de

purificação da Gonadotropina Coriônica humana recombinante (rhCG) produzida em culturas de células CHO, que compreende o uso

combinado de cromatografia de troca iônica e HPLC de fase inversa. Tal documento também reivindica uma composição farmacêutica contendo rhCG para administração subcutânea.

Os documentos PI 9814880-0 e PI 9914670-3 tratam de hormônios glicoproteicos recombinantes de cadeia única, o processo de produção destes sem o uso de sistema de purificação por cromatografia de afinidade, de marcador fluorescente e de um polipeptídeo característico de secreção celular.

O documento US5260421 revela um método de promoção da mutagênese sítio dirigido em glicoproteínas em geral, voltado para a produção de hormônios, como por exemplo, hormônio luteinizante, hormônio do folículo estimulante, hormônio estimulante da tireóide, e a gonadotrofina coriônica. US6469139 descreve uma gonadotrofina coriônica humana modificada em sítios específicos da sequência de aminoácidos, e seu uso médico como contraceptivo imunológico.

O documento W09532216 revela um método de produção de hormônios glicoproteicos biologicamente ativos em células procariontes, que emprega um tampão redox tiol para formar subunidades

estruturalmente ativas do hormônio.

Os documentos JPH1036398 e JPH1036399 tratam de processos de produção da gonadotrofina coriônica equina recombinante, nos quais as subunidades□ e□ não são fusionadas em cadeia única. A diferença entre elas deve-se ao fato que a primeira reivindica o uso da r-eCG em procedimentos de IA ou superovulação em bovinos, enquanto a segunda reivindica a atividade de estimular a produção de FSH.

O documento WO2014183175 revela métodos para a produção e purificação do hormônio folículo estimulante (FSH) que utiliza uma plataforma de células HEK 293 parentais ou mutantes destas.

Assim, não foram encontrados relatos no estado da técnica referentes aos métodos de obtenção e ao uso em protocolos de inseminação artificial e superovulação relativos às formas híbridas de gonadotrofina coriônica compostas pela associação de cadeias alfa não equina e cadeia beta equina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção tem por objetivo propor um processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes híbrido ou não-híbrido.

Adicionalmente, a presente invenção propõe hormônios

glicoproteicos recombinantes de origem equina (r-eCG) e outros híbridos contendo porções de origem equina (cadeia β) e de mamíferos alvo (cadeia a), resultando em hormônios glicoproteicos quiméricos e específicos ao tratamento da espécie alvo, visando à obtenção de uma composição hormonal que possua as atividades LH e FSH sem imunotoxicidade para a espécie alvo.

Além disso, a presente invenção propõe ainda o uso de hormônios glicoproteicos recombinantes, híbrido e não-híbrido, obtidos com o uso de seus vetores de expressão e suas composições farmacêuticas, na reprodução animal assistida de espécies alvo de interesse comercial ou 1

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não, mamíferos em geral, tais como, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos, muares, bubalinos, bisontes, antílopes, espécies domésticas e selvagens de caninos e felinos, cetáceos, ursídeos e primatas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIG. 1 mostra a análise eletroforéticá cfo procedimento de amplificação do fragmento gênico referente à SEQ. ID. 16;

A FIG. 2 mostra a análise eletroforéticá de produtos de clivagem de clones recorri binantes (SEQ. ÍD. 16) da SEQ. ID. 38;

A FIG. 3 mostra a análise eletroforéticá de produtos de clivagem de clones recombínantes (SEQ. ID. 16) da SEQ. ID. 39;

A FIG. 4 mostra a análise da expressão da molécula GFP em células CHO-K1 transfectadas com a SEQ. ID. 39, por microscopia de fluorescência, onde (A) e (C) ilustram as imagens DIC (Differential tnterference Contrasf) e mostram um padrão dè crescimento celular semelhante entre as duas populações celulares, enquanto (B) e (D) ilustram a fluorescência relacionada à presença da proteína GFP;

A FIG. 5 mostra a análise eletroforéticá de sobrenadante de cultura celular contendo a SEQ. ID. 17 (r-eCG recombinante não fusionada a molécula GFP); em que é possível observar em MM - Marcador

Molecular; MC - Meio de Cultura (Freestyle Sèrum Free); C - Células HEK 293 após cultivo de 48 horas; SB - Sobrenadante da cultura de células HEK 293 após cultivo de 48 horas, onde é possível observar a banda referente à SEQ. ID. 17;

A FIG. 6 mostra a análise eletroforéticá de preparação purificada de SEQ. ID. 19. SDS-PAGE 12% onde é possível observar em MM - Marcador Molecular; C- - Meio de Cultura (DMEM contendo 0% de soro fetal bovino); S+ - Sobrenadante do cultivo das células; FT - Flow

Through, proteínas que não se ligaram à coluna His-Trap; E a 5 - Frações eluídas da coluna, onde é possível obervar a banda referente à r a SEQ. ID. 19;

A FIG. 7 mostra preparações purificadas de SEQ. ID. 9 induzindo a liberação de estradiol e progesterona no soro de ratas;

A FIG. 8 mostra a análise da atividade in vivo de SEQ. ID. 17 correspondente a eCG recombinante não fusionada a GFP e purificada do sobrenadanté de cultura de células HEK 293 cultivadas na ausência de soro fetal bovino com o uso do meio de cultura Freestyle Serum Free;

A FIG. 9 mostra a análise comparativa funcional entre as formas recombinantes da molécula controle (SEQ. ID: 49), do eCG nativo e da SEQ. ID. 19, onde (A) representa imagens dos ovários de ratas

impúberes tratadas por via intramuscular com PBS (controle negativo), SEQ. ID. 49, eCG nativo e SEQ. ID. 19;

A FIG. 10 mostra a análise comparativa da taxa de prenhez em fêmeas, para a avaliação da atividade de SEQ. ID. 17 em animais de grande porte (Bovinos). Representação gráfica da porcentagem de taxa de prenhez de fêmeas induzidas ao cio através de protocolos hormonais realizados pela administração de eCG 300 Ul e de SEQ. ID. 17 30 pg. A Análise foi realizada por ultrassonografia após 30 dias da inseminação de fêmeas Bos taurus indicus, com grupos homogéneos quanto a categoria animal (raça, idade, paridas pelo menos 1 vez), com n=127 para o grupo eCG e n-50 para o grupo SEQ. ID. 17,

A FIG. 1 1 mostra a representação gráfica de vetores referentes às SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39, que representam todos os vetores descritos nesta invenção.

A FIG. 12 mostra o organograma das etapas do procésso de produção e purificação de hormônios glicopróíeicos recombinantes desta invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes compreendendo as etapas de:

(a) amplificação, modificação e clonagem das moléculas híbridas ou não híbridas; (b) construção dos vetores de expressão de hormônios glicoproteicos recombinantes;

(c) transfecção, expressão e análise das células que expressam os hormônios glicoproteicos recombinantes;

(d) purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes por cromatografia de afinidade;

(e) diálise e esterilização dos hormônios glicoproteicos recombinantes.

O hormônio glicoproteico recómbinante (r-eCG), fusionado ou não à molécula GFP, e as suas formas híbridas da presente invenção são seiecionados do grupo consistido em gonadotrofina coriônica equina recómbinante (r-eCG), gonadotrofina coriônica bovina recómbinante (r- bCG), gonadotrofina coriônica suína recómbinante (r-sCG), gonadotrofina coriônica ovina recómbinante (r-oCG), gonadotrofina coriônica caprina recómbinante (r-cCG), hormônio tireoèstimulante recómbinante (r-TSH), hormônio luteinizante recómbinante (r-LH) e, o hormônio folículo estimulante recómbinante (r-FSH). Preferencialmente, o hormônio glicoproteico eCG, fusionado ou não à molécula GFP, e suas formas híbridas obtidas representam, respectivamente o nucleotídeo e a glicoproteína correspondentes à gonadotrofina coriônica equina recómbinante (r-eCG) e as suas formas híbridas.

(a) Amplificação, modificação e clonagem das moléculas híbridas ou não-híbridas

A etapa de amplificação por PCR dos fragmentos gênicos da r-eCG (SEQ.ID. 16) ou da r-eCG-GFP (SEQ.ID. 18), por PCR (Muiíis et aí, 1986) compreende o uso dos oligonucleotídeos iniciadores das SEQ. ID. 1 , SEQ. ID. 2 e SEQ. ID. 3 complementares as diferentes formas de gonadotrofina coriônica nativa para a obtenção de um fragmento gênico referente à fusão entre a sequência de DNA da subunidade beta da eCG nativa (SEQ. ID. 6) e a sequência de DNA da subunidade alfa da eCG nativa (SEQ. ID. 04), em que as SEQ. ID. 6 e 4, correspondem às subunidades α e β da eCG e sequências adicionais, que correspondem ao seu total na SEQ, ID. 16 ou na SEQ. ID.18 validado por eletroforese em gel de agarose.

As SEQ. ID. 1 , SEQ. ID. 2 e SEQ. ID. 3, além de promoverem a amplificação dos genes referentes às subunidades□ e□ da eCG, apresentam sequências de nucleotídeos adicionais associadas a sítios de clivagem para enzimas de restrição e sequências codificadoras para uma cauda de histidina para a tradução de sequência de poii-histidina (6xHis- Tag), e um sítio proteolítico, ta! como o sítio para a protease do Tobacco Etch Vírus (TÈV-Tag), associadas a clonagem das sequências gênicas, purificação dos hormônios recombinantes e edição proteica destes hormônios, respectivamente, gerando assim um fragmento de DNA com 847 pb.

A amplificação ocorre por PCR, sendo obtido o poli-nucleotídeo da SEQ. ID. 16, que é então purificado em resina quelante (Sambrook et ai, 1989).

(b) Construção dos vetores para a expressão de hormônios qlicoproteicos recombinantes em células eucarióticas (CHO-K1 e HEK 293)

A construção dos vetores para a expressão de hormônios glicoproteicos recombinantes em células eucarióticas (CHO-K1 e HEK 293) tem início pela clonagem da SEQ. ID. 16 ou da SEQ. !D. 18 em células procarióticas (E coli DH5a). Esta etapa de clonagem inicia-se com a inserção das sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18 em um vetor de clonagem comercial que é utilizado para transformar as células DH5a competentes por choque térmico. Finalmente, executa-se a seleção dos clones recombinantes bacterianos contendo o- vetor de clonagem recombinado com as sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18, cujas presenças são validadas por eletroforese em gel de agarose e

sequenciamento químico de DNA. Deve estar claro para um técnico no assunto que diversas técnicas e reagentes podem ser utilizados sem que a diferença entre as técnicas e reagentes possam gerar diferenças significativas no processo final. Na presente invenção, a transformação de células procariontes de E. coli DH5a competentes é feita pela introdução de vetores de clonagem por choque térmico e, a seleção de clones recombinantes é realizada por clivagem para a detecção da SEQ. 1D. 16 e confirmação da sequência por método químico de sequenciamento de nucleotídeos, descrito na literatura (Sanger et al, 1997).

(c) Transfecção. expressão e análise das células produtoras dos hormônios glicoproteicos recombinantes.

Os vetores de expressão obtidos após a etapa de clonagem dos hormônios híbridos e não-híbridos são então usados para transfôctar células eucarióticas de modo transiente com o auxílio de lipossomos. Alternativamente, as sequências gênicas dos hormônios recombinantes utilizadas na composição dos vetores de expressão para transformação instável de células eucariontes poderão ser utilizadas na construção de vetores de expressão para transformação estável destas células com o uso das sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18, via vetores lentivirais ou sistemas biologicamente seguros, de integração gênica não aleatória e sem a necessidade de agentes seletivos (antibióticos e outras

substâncias químicas) tais como o Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), o Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats (CRISPR] e outros sistemas com estas

propriedades, para a geração de linhagens celulares de expressão e suas análises por microscopia de fluorescência para a visualização da expressão da proteína da SEQ. ID. 19 e/ou por outras metodologias (imunodetecção ou sequenciamento gênico) para detecção da expressão da proteína da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID.19. Por outro lado, poderão ser utilizados sistemas de integração estável como o uso de vetores lentivirais para estes mesmos fins.

Na análise em microscópio de fluorescência é possível detectar a alteração da fluorescência das células è do meio de cultivo, uma vez que a SEQ. ID. 19 é exportada para meio de cultura, devido ao seu peptídeo de sinalização da SEQ. ID. 21 , presente entre os aminoácidos 1 -20 da SEQ. ID. 19. Nas células controle, transfectadas com a SEQ. ID. 48, a presença da fluorescência é detectável apenas no citoplasma celular.

(d) Purificação de hormônios glicoproteicos

recombinantes

A purificação ocorre pela coleta do sobrenadante do meio de cultura de células de mamíferos transfectadas com as sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18 e secretoras das sequências SEQ. ID. 17 ou SEQ. ID. 19, por via transiente ou estável, seguido de centrifugação entre 1200 e 1800 g entre 7 e 1 5 minutos a 4 °C para a remoção de células em suspensão e posterior purificação da SEQ. ID 17 ou SEQ. ID 19 por cromatografia de afinidade em resinas de níquel e após eluição, obtém-se um rendimento aproximado de 15 a 17 mg de normônio purificado para cada litro de cultura.

(e) Diálise e esterilização dos hormônios glicoproteicos recombinantes.

O passo final para a obtenção dos hormônios glicoproteicos recombinantes é realizado por diálise em concentradores e/ou por centrifugação tangencial (cut off 10 a 60 kDa), onde há a troca do tampão utilizado nas etapas de produção e purificação de hormônios

glicoproteicos em PBS pH 7,4, seguido da esterilização da solução contendo os hormônios produzidos com o auxílio de filtros (0,22 pm) próprios para o volume final.

A invenção também se refere a um hormônio glicoproteico recombinante que compreende as subunidades□ e□ fusionadas em uma cadeia simples e agentes modificadores de cadeia nas porções amino e carboxi-terminais, tais como, um sítio de fusão a uma fluoresceína, tal como a GFP; um marcador de purificação, tai çomo a cauda poli-His; peptídeo de sinalização da secreção da molécula; peptídeo de interface de dimerização e um sítio proteolítico específico, tal como o sítio proteolítico de clivagem com a enzima proteo!itica TEV (de Tobacco etch vírus), e opcionalmente um marcador fluorescente. Estas modificações proporcionam à molécula recombinante características não apresentadas pelos hormônios selvagens, como afinidade ao níquel, fusão das cadeias alfa e beta e/ou emissão de fluorescência, as quais favorecem seus processos de obtenção e purificação.

Todas as etapas de clonagem, expressão e purificação descritas nas etapas (a) a (d) referentes à obtenção da r-eCG foram eficientes e eficazes e deverão ser utilizadas também nas etapas de clonagem, expressão e purificação das formas híbridas destes hormônios

recombínantes glicoproteicos.

Preferencialmente, este processo de produção é utilizado para a produção da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19, referentes à gonadotrofina coriônica equina recombinante que, em testes in vivo apresentaram uma bioatividade de aproximadamente 10.000 Ul/mg e próximo a bioatividade de preparações de eCG nativo.

Visando uma redução da imunogenicidade da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19 para outras espécies, foi prevista nesta invenção a obtenção de formas híbridas destes hormônios glicoproteicos compostos pela cadeia alfa da espécie alvo e pela cadeia beta equina com e/ou sem a fusão com a molécula GFP.

Exemplos referentes a obtenção e análise funcional da r-eCG

Exemplo 1- Construção do vetor de clonagem da SEQ., ID. 16:

O fragmento gênico elaborado e referente à SEQ. ID. 16 foi sintetizado comercialmente e amplificado por PCR (FIG, 1), utilizando-se os oligonucleotídeos (SEQ. ID. 1 , SEQ: ID. 2 ê SÊQ. ID. 3). A corrida eleíroforética do procedimento de amplificação foi feita em gel de agarose (1 %) e com o uso de marcador de tamanho molecular de 1 Kb. As amostras testadas foram: controle negativo da reação de PCR (pista B); fragmento gênico (SEQ. ID. 16) amplificado de aproximadamente 847pb (pistas 1 , 2 e 3). A SEQ. ID. 16, foi clohada em vetor plasmidial (CloneJet - Thermo) e utilizada para transformar células de E. coli DHõa competentes por choque térmico, e, após a seleção de clones recombinantes por clivagem foi realizada a confirmação da sequência SEQ;. ID. 16, através de método químico de sequenciamento de nucleotídeos.

Exemplo 2 - Construção dos vetores de expressão SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39:

Uma vez confirmada a sequência SEQ.J ID. 16, os clones

recombinantes foram clivados com as enzimas Xho\ e EcoRI, para a remoção do fragmento da SEQ. ID. 16, e clonado para a geração da SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39. A seleção de clones recombinantes foi feita por clivagem das SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39. A eletroforese de produtos de clivagem de clones foi feita em gel de agarose (1 %) com o uso de marcador molecular de 1 Kb. Conforme observado na FIG. 2, o clone após clivagem com Xho\ e EcoRI encontra-se ná pista 1 , onde é observada a banda referente à SÉQ. ID. 16. Na FIG. 3, as amostras testadas foram: controle negativo da reação de PCR (pista B); onde os clones após clivagem da SEQ. ID. 39 encontram-se nas pistas 1 e 2), onde é

observada a banda referente à SÉQ. ID. 16. Fòi realizada a confirmação da sequência perfeita da SEQ. ID. 6, por sequenciamento químico de DNA.

Exemplo 3 - Tra sfecção.de células de mamífero:

Para a geração de linhagens celulares de expressão (HEK 293 e CHO-K1 ), foram utilizadas placas de 6 poços de 500 pl (placas de 24 poços) para a transfecção de 800ng da SEQ. ID. 38 e da SEQ. ID. 39, utilizando 2 μΙ de lipofectamina 2000 (Thermo). Como controle, foram transfectadas células nas mesmas condições com SEQ. ID. 48. As células foram cultivadas em meio Freestyle Seru Free (Thermo) ou em meto DMEM (Sigma) contendo 10% de soro fetal bovino e solução 1x de antibiótico/antimicótico durante 24 horas para posterior adição de 400 Mg/ml de geneticina (G4 8, Sigma-Aidrich). Exemplo 4 - Seleção de clones de células de mamíferos

transfectadas:

As células transfectadas foram selecionadas no período de 3 semanas, com variações da concentração de geneticina (G418) para eliminação de clones não transfectados. As células foram então analisadas com o uso de microscópio de fluorescência quanto à expressão da SEQ. ID. 19 é da SEQ. ID. 49. A análise foi feita pela observação da alteração da fluorescência das células e do meio de cultivo, uma vez que a SEQ. ID. 1 9 é exportada para meio, devido ao seu peptídeo de sinalização presente entre os aminoácidos 1 -20 (SEQ. ID. 21 ). As células controle apresentaram a presença da fluorescência apenas no interior das células, devido à expressão da SEQ. ID. 49 (FIG. 4).

As células transfectadas com a SEQ. ID. 39 expressam e exportam a SEQ. ID. 19 para o meio de cultura (FÍG. 4 (B)). As células

transfectadas com SEQ. ID, 48 expressam a proteína GFP (SEQ. ID. 49) no interior das células {FIG. 4 (D)).

Exemplo 5 - Purificação e análise eletroforética da SEQ. ID. 17 e da SEQ. ID. 19:

As células HEK 293 selecionadas foram transferidas para Spinner com 1 00 ml de meio de cultivo Freestyle (Thermo) contendo geneticina 400mg/ml para a propagação, aumento do número de células em maior volume de cultura e consequentemente da concentração de proteína recombinante expressa durante 96 horas.

As células CHO-K1 selecionadas foram transferidas para garrafas de cultura de 75 cm ² contendo DEMEN (Sigma) conténdo 10% de soro fetal bovino e geneticina 4Q0mg/ml para a propagação, aumento do número de células em maior volume de cultura e consequentemente da concentração de proteína ¹ recombinante expressa durante 8 dias de propagação com coletas do sobrenadante (meio de cultura) a cada 48 horas. Após o cultivo das células HEK 293 e CHO-K1 , procedeu-se a centrifugação (1500xg/10 minJ4°C) dos meios de cultura para a remoção dé células em suspensão, concentração e diálise em concentradores apropriados, e, posterior purificação da SEQ. ÍD. 17 e SEQ. ID. 19 por cromatografia de afinidade em coluna His-Trap em cromatógrafo adequado/Após eluição com gradiente de imidazol (Sigma) (5 a 500 mM), as frações foram analisadas em SDS-PAGE 12%, como observado na F!G. 6. Após a concentração das frações eluídas, quantificação por medida da absorbância em 280 nm e correção pelo Fator de correção (calculado pelo coeficiente de extinção molar), de 1 ,29 para á SEQ. iD. 17 e 1 ,34 para a SEQ. ID. 19, estipulou-se um rendimento aproximado de 15 mg da SEQ. ID. 17 purificada e de 17 mg da SEQ. ID. 19 purificada, para cada litro de cultura.

Exemplo 6 - Verificação da capacidade da SEQ. ID. 19 de induzir a produção de hormônios in vivo:

Os efeitos hormonais da SEQ. ID. 19 fóram avaliados por ensaios em ratas e quantificados pela técnica de quimiluminescência. A FIG. 7 ilustra a indução da produção de estradio! (17p-Estradioi) e de

progesterona medida no soro de ratas (Wistar) imaturas, com 4-6 semanas de idade, após 6 e 18 horas, respectivamente, da injeção intramuscular de doses decrescentes de SEQi ID. 19 (0,012 a 20 pg), utilizando como controle, ratas imaturas com 4-6 semanas de idade injetadas com salina tamponada com fosfato, pH= 7,4 (PBS) ^' ; Os

procedimentos utilizados nos experimentos de indução hormonal em ratas foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (CEUA) - (Protocolo n° 14.1.479.53.0).

Exemplo 7 - Análise da capacidade da SEQ. ID. 17 e de SEQ. ID.19 de induzir o aumento da massa ovariana em ratas:

A avaliação da capacidade da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19 de promover, in vivo, atividade relacionada à função hormonal da gonadotrofina coriônica foi analisada pela medida da massa ovarína de ratas tratadas com a SEQ. !D. 17 [r-eCG sem GFP (10 pg)] e SEQ. ID. 19 [r-eCG com GFP (20 Mg)]. Os efeitos da SEQ. JD. 17 na indução de crescimento ovariano foram então avaliados, mensurando a massa ovariana de ratas (Wistar) com 21 dias de vida, após injeção

intramuscular de 10 pg da SEQ. ID. 17 (FIG. 8). Cada grupo experimental continha 04 animais (total de 8 ovários por grupo). Os procedimentos utilizados nos experimentos de indução de aumento de massa ovariana em ratas foram aprovados pela CEUA (Protocolo n° 14.1.479.53.0).

Da mesma forma, a FIG. 9 ilustra a análise funcional (indução do aumento da massa ovariana) comparativa entre as formas recombinantes da molécula Green Fluorescent Protein (GFP, SEQ. ID. 49), a forma nativa da eCG (SEQ. ID. 5 e SEQ. ID. 7) e da SEQ. ID. 19. Cada grupo experimental continha 04 animais (total de 8 ovários por grupo) e apenas 02 ovários de cada grupo experimental, tomados de modo aleatório, estão representados. A escala associada às imagens está dimensionada em centímetros.

Os resultados estão expressos como massa ovariana em gramas (g) e indicam que as formas recombinantes da eCG (SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19) apresentam bioativídade in vivo semelhante ao eCG nativo (SEQ. ID. 5 e SEQ. ID. 7). Estes exemplos auxiliam na fundamentação da inclusão de formas híbridas do hormônio (composto pela cadeia alfa de animais alvo e beta equina) nesta patente de invenção, pois a SEQ.ID. 17 e 19 apresentam similaridade gênica acima de 97% e semelhanças estruturais com as formas híbridas, as quais poderão ser indicadas para uso em diversas espécies de mamíferos.

Exemplo 8 - Testes a campo para a avaliação da atividade de SEQ. ID. 17 em animais de grande porte (Bovinos):

A atividade hormonal da SEQ. ID. 7 foi avaliada em protocolos de sincronização de cio (IATF) em mamíferos de grande porte (Bovinos) por Ultrassom (GE-Logiq e Transdutor transretal rnod I-739, 8-12 Mhz), em fêmeas induzidas ao cio através de protocolos hormonais realizados pela administração de eCG 300 Ul e de SEQ. ID. 17 30 pg.

O modelo experimental foi baseado em fêmeas da espécie bovina Bos taurus indicus, em grupos homogéneos quanto a categoria animal (raça, idade, paridas pelo menos 1 vez), com n=127 para o grupo eCG e n=50 pára o grupo SEQ. |D. 17. Os sinais de cio foram verificados por avaliação clínica e por comparação das ondas foliculares e ovulação (Ultrassom).

O protocolo de IATF consistiu na introdução do dispositivo vaginal para liberação de progesterona (dia 1 ), administração de doses de eCG 300 Ul e de SEQ. ID. 17 30 pg e avaliação uterina por ultrassonografia (dia 8). A inseminação foi realizada após a análise por ultrassonografia e observação de onda folicular, onde pelo menos um folículo apresentou crescimento (1 ,4 mm/dia) para cada animal dè ambos os grupos (dia 0).

A FIG. 10 mostra comparação da taxa de prenhez que foi realizada 30 dias pós-inseminação por ultrassonografia trans-retal nos animais pertencentes aos grupos inseminados a partir -de protocolo de IATF utilizando a eCG e SEQ. ID.17. Os resultados obtidos mostraram uma taxa de prenhez de 50,23% para o eCG, e de 48% para a SEQ. ID.17, onde a média nacional da taxa de prenhez por IATF é de 42%.

As análises mostraram a formação de cistos em 5,5% e formação de gemelar em 1 ,59% no grupo eCG, onde o grupo SEQ. ID.17 não apresentou a formação de cistos e de gemelares.

Aplicações

A partir de uma quantidade eficaz dos hormônios glicoproteicos recombinantes das SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19, por exemplo, de 0,001 a 10.000 pg, em conjunto com adjuvantes farmáceuticamente aceitáveis, tais como cárreadores hormonais ou permeádores e sistemas de liberação baseados em nanotecnologia é possível propor uma

composição farmacêutica. Esses adjuvantes visam garantir a qualidade da farmacocinética e farmacodinâmíca assegurando a adequada bioatividade destes hormônios recombinantes nos diferentes protocolos da reprodução animal. Tal composição é utilizada para a reprodução assistida animal compreendendo uma quantidade eficaz de hormônios glicoproteicos recombinantes. Tais composições serão utilizadas na indução da ovulação; indução de superovulação; crescimento folicular; indução de cio; reversão de anestro; indução de puberdade em animais de interesse comercial ou não, mamíferos em geral, tais como, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos, muares, bubálinos, bisontes, antílopes, espécies domésticas e selvagens de caninos e felinos, cetáceos, ursídeos e primatas.

Além disso, há ainda a possibilidade da elaboração de kits para indução da ovulação; indução de superovulação; crescimento folicular; indução de cio; reversão de anestro; indução de puberdade; para utilização em protocolos dè IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) FIV (Fertilização in vitro), TETF (Transferência de Embriões por Tempo Fixo) em animais de interesse comercial ou não.

Considerando que as gonadotrofinas coriônicas podem ser imunogênicas (induzir a produção de anticorpòs) e antigênicas (serem reconhecidas por anticorpos) (Hervé et al. 2004, Forcada et al. 201 1 ; Chopineau et al., 1993) é possível propor que os hormônios glicoproteicos recombinantes, em questão, possam ser usados na obtenção de anticorpos nativos (monoclonais e/ou policlonáis) ou recombinantes (Phage Display) e que tanto estes anticorpos quanto os hormônios glicoproteicos recombinantes, e seus derivativos (conjugados a enzimas, radiomarcadores e/ou fluorocromos), possam compor kits de detecção destas duas categorias de moléculas (hormônios e anti-hormônios) em amostras biológicas ou não.

Embora a invenção tenha sido amplamente descrita; é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção. REFERÊNCIAS

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