Heutzutage wird eine Vielzahl von in Medikamenten enthaltenen aktiven Verbindungen nicht mehr durch chemische Synthese oder Gewinnung und Aufreinigung aus den natür- lichen pflanzlichen oder tierischen Quellen hergestellt, sondern mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie erzeugt. Diese Technologie bietet u. a. den Vorteil, daß die Proteine in gut charakterisierten Wirten in praktisch unbegrenzten Mengen erhalten werden können.

Für die Gewinnung von rekombinanten Proteinen ist es von Vorteil, wenn das betreffen- de Protein sezerniert wird, um anschließend aus dem Zellüberstand gewonnen werden zu können. Dies vereinfacht die Aufbereitung in hohem Maße, da das Protein bereits in relativ reiner Form vorliegt und die Anzahl aufwendiger Reinigungsschritte reduziert wer- den kann.

Häufig benutzte Organismen, die zur Gewinnung von sekretorischen Proteinen in gro- ßem Maßstab eingesetzt werden, sind Hefen und filamentöse Pilze. Sie bieten den Vor- teil, daß sie relativ einfach in Zelikultur gehalten werden können und zu guten Ausbeuten an sezernierten Proteinen führen. Darüber hinaus sind sie in der Lage, die produzierten Proteine posttranslational zu modifizieren, z. B. zu glykosylieren.

Die Expression von rekombinanten DNA-Sequenzen wird im aligemeinen dadurch er- reicht, daß Nukleinsauresequenzen, die ein Protein von Interesse kodieren, in einen Vektor kloniert werden, der als funktionelle Elemente einen Promotor und Polyadenylie- rungssignale sowie Terminationselemente enthält. Dieser Vektor wird durch geeignete Verfahren, wie z. B. Elektroporation, Calcium-oder Liposomen-unterstützte Transfektion etc. in eine Wirtszelle inseriert. Eine solche DNA-Sequenz kann weiterhin am 5'-Ende ei- ne Sekretions-Leader-Sequenz enthalten, die veranlaßt, daß das rekombinante Transla- tionsprodukt in den sekretorischen Apparat der Wirtszelle dirigiert wird.

Die Insertion von Fremd-DNA in ein solches Expressionssystem garantiert jedoch nicht eine wirksame Gen-Expression. Häufig auftretende Probleme sind eine ineffiziente Transkription und/oder Translation, rascher Abbau der Boten-RNA (mRNA) oder Instabi- litât des Protein-Produktes. Das rekombinante Protein kann außerdem inkorrekt und/oder ungenügend durch die Wirtszelle prozessiert und modifiziert werden. So wer- den z. B. in der Bäckerhefe Saccharomvces cerevisiae rekombinante Proteine oft sehr ineffizient sezerniert. Dieses Expressionssystem ist daher für viele Anwendungen unzu- länglich. In solchen Fallen kann die Produktion jedoch unter Umständen durch die gleichzeitige Erzeugung weiterer Proteine, die eine effiziente Transkription und/oder Translation, Prozessierung, Stabilisierung, Modifikation und Verteilung in bestimmten Zelikompartimenten erlauben, verbessert werden. So wurden eine Reihe an S. cerevisi- ae-Mutanten hergestellt, die mögliche Engpässe in den von der Translation bis zur Se- zernierung eines rekombinanten Proteins reichenden Prozessen ausräumen können.

Derartige Mutationen sind von Smith et al. z. B. für die Gene ssc1 und ssc2 aus S. cere- visiae und für die Gene rgr1 und ose1 von Sakai et al. 1988, Hinnen et al., 1994 und von Gellissen und Hollenberg, 1997, beschrieben worden. Ein anderer Ansatz verwendet die Überexpression von heterologen Genen, die aus anderen Organismen eingeführt wer- den, wie z. B. die Überproduktion der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) oder des Chape- rons BiP oder die Verwendung von Komponenten des Säugersignalpeptidasekomplexes in Bäckerhefe (Shusta et al. 1998 ; WO 98/13473).

Es ist bereits bekannt, daß methylotrophe Hefen, d. h. Hefen, die in der Lage sind, Me- thanol als einzige Energie-und Kohlenstoffquelle zu nutzen, rekombinante Proteine we- niger stark hyperglykosylieren als S. cerevisiae. Des weiteren bieten methylotrophe He- fen den Vorteil, daß sie heterologe Proteine relativ effizient sezernieren. Das gleiche gilt auch z. B. für Kluvveromvces lactis, Aspergillus nige und Schizosaccharomvces pombe (Giga-Hama und Kumagai, 1997 ; Gellissen und Hollenberg, 1997 ; Hollenberg und Gel- lissen, 1997). Selbst die Verwendung von methylotrophen Hefen als Expressionswirten faßt jedoch die Produktion und Sezernierung nur einer begrenzten Anzahl von rekombi- nanten Proteinen zu. Es besteht daher ein großer Bedarf nach einem System, das die Möglichkeit bietet, jedes sekretorische Protein von Interesse effizient zu sezernieren.

Darüber hinaus werden Verfahren benötigt, die es zulassen, rekombinante Proteine mit weitgehend korrekten sekundären Modifikationen, d. h. Modifikationen, wie sie auch nach Produktion des Proteins in seiner natürlichen Wirtszelle beobachtet werden, zu erzeu- gen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Weg für die effiziente Sezernie- rung von rekombinanten Proteinen und gegebenenfalls für die Produktion und/oder Se- zernierung von rekombinanten Proteinen mit sekundären Modifikationen zur Verfügung zu stellen, welche den im natürlichen Wirt erzeugten sekundären Modifikationen weitge- hend ähnlich sind.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Herstellen eines rekom- binanten sekretorischen Proteins gelost, welches die folgenden Schritte umfaßt : a) Expression einer für das sekretorische Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor 4E (elF4E) und/oder für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Ca2+/Calmodulin-abhängigen Pro- teinkinase (CaM-Kinase) kodierenden Nukleinsäure, wobei die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E oder CaM-Kinase kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P1 steht ; b) Sezernieren des Proteins aus der Zelle und c) Gewinnen des sezernierten Proteins.

Der eukaryontische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) spielt für die Initiation der Translation eine wichtige Rolle. Er ist Bestandteil des"Cap-Binding"-Komplexes (eIF4F) und ist for die Bindung dieses Komplexes und die 5-Cap-Struktur der mRNA (Sonenberg, 1996) ver- antwortlich. Eukaryontische Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinasen (CaM-Kinasen) vom Typ II phosphorylieren einer Reihe verschiedener Zielproteine und sind dadurch an der Regulation des Energiestoffwechsels, des Zellzyklus'und der lonenpermeabilität etc. beteiligt (Schulman, 1993).

Der Begriff"biologische Aktivität"des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 4E und der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase bezieht sich dabei auf die in der Li- teratur beschriebenen Aktivitäten der genannten Enzyme. Die biologische Aktivität von eIF4E wird dabei bestimmt, wie in Altmann & Trachsel (1989) beschrieben, die von CaM- Kinase, wie in Ohya et al. (1991) beschrieben.

Der Promotor P1 kann jeder beliebige Promotor sein, der in der gewähren Wirtszelle als Promotor funktioniert. Beispiele solcher Promotoren finden sich im Stand der Technik reichlich (s. z. B. Sambrook et al., 1989).

Das Verfahren gestattet es, durch die Coexpression der Gene für den Translationsinitia- tionsfaktor 4E und/oder die Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase bzw. Derivaten davon zusammen mit der Expression eines Genes für ein Protein von Interesse eine ef- fiziente Produktion und Sezernierung des betreffenden Proteins zu erzielen.

Es wurde beobachtet, daß durch die starke Überproduktion eines rekombinanten Proteins oft die Transkriptions/Translations-und Sezernierungsmaschinerie der Wirts- zelle überlastet ist, so daß sie ihr Wachstum verlangsamt oder gar einstellt. Ein häufiger Engpaß besteht bei der Initiation der Translation, bei der, wie von den Erfindern festge- stellt, der ATP-abhängige Initiationsfaktor 4E limitierend wirken kann. Durch Coexpressi- on des Genes für diesen Translationsinitiationsfaktor mit einer rekombinanten DNA- Sequenz kann dieser Engpaß behoben werden. Überraschenderweise wirkt sich die Coproduktion des Translationsinitiationsfaktors 4E jedoch auch auf die Sekretionseffi- zienz aus : die Erfinder konnten eine stark erhöhte Sezernierung des erwünschten sekretorischen Proteins beobachten, sobald dieses mit 4E coproduziert wurde. In der vorliegenden Erfindung wird darüber hinaus zum ersten Mal gezeigt, daß auch die ge- meinsame Produktion (Pausch et al., 1991 ; Ohya et al., 1991) von CaM-Kinase mit ei- nem rekombinanten Protein zu einer effizienten Sezernierung des entsprechenden re- kombinanten Proteins führt. Der Wirkmechanismus, der zu einer gesteigerten Proteinse- zernierung führt, ist jedoch in beiden Fällen noch ungeklärt.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit, auch im Fall stark überproduzierter Proteine diese wirksam so sezernieren, so daß auch für sekretorische Proteine extrem hohe Ausbeuten erzielt werden können. Die Produktion kann dabei durch einzelne oder eine Kombination mehrerer Maßnahmen gesteigert worden sein. So kann bereits durch die Wahl des Vektors die Kopienzahl pro Zelle beeinflußt werden. Vektoren auf 2 p-Basis liegen mit 5 bis über 100 Kopien pro Zelle vor ; meistens sind pro Hefezelle 20 bis 40 Ko- pien vorhanden. Integrative Vektoren können sogar in 80 bis 150 Kopien pro Zelle vor- handen sein.

Weiter kann durch die Wahl des Selektionssystems Einfluß auf die Kopienzahl des Vektors genommen werden. Die Verwendung Tryptophan-auxotropher Mutanten, deren Auxotrophie durch den Selektionsmarker TRP1 auf dem Plasmid komplementiert wird, führt zur Amplifizierung des Plasmides in der auxotrophen Zelle. Eine Möglichkeit, die Kopienzahl darüber hinaus zu steigern, bietet die Verwendung von LEU2-auxotrophen Stämmen und deren Komplementierung mit dem Leu2d-Allel. Das Leu2d-Allel ist ein LEU2-Gen mit weitgehend deletiertem Promotor und dementsprechend schwacher Transkription. Der dringende Bedarf der Zelle an LEU2-Protein führt zu einer extremen Amplifizierung des Plasmides einschließlich eines evtl. darauf lokalisierten Strukturgenes für ein gewünschtes rekombinantes Protein.

Ein zusätzlicher Faktor, der die Effizienz des Produktionssystemes betimmt, ist die Star- ke des jeweils dem Strukturgen für das gewünschte zu exprimierende Gen vorange- stellten Promotors P2. Dem Fachmann sind unterschiedlich starke, induzierbare und nicht induzierbare Promotoren bekannt. Siehe dazu das schon erwähnte Handbuch von Sambrook et al., in dem eine Vielzahl von Promotoren beschrieben ist. Für die Produkti- on in Hefe ist es bevorzugt, den GAL1-Promotor oder den PDC1-Promotor zu verwen- den.

Die so hergestellten Proteine können leicht aus dem Zellüberstand gewonnen werden, indem dieser durch Zentrifugation von Zellrückständen befreit wird und durch geeignete Reinigungsverfahren, wie z. B. durch lonenaustauschchromatographie, Affinitatschro- matographie, Gel-Elektrophorese, etc. weiter aufbereitet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist die Nukleinsäure, die für das Polypeptid mit der biologischen Aktivitat des Translationsinitia- tionsfaktors 4E kodiert, ausgewähit aus der folgenden Gruppe : i) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomvces cerevisiae kodiert (CDC33) ; ii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von elF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert, iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert ; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert ; v) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom- plementären Sequenz hybridisieren kann.

Dabei sind unter einem"Homolog"solche Proteine zu verstehen, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Translationsinitiationsfaktors 4E aus Saccharomvces cerevisiae (Brenner et al., 1988) besitzen. In bevorzugten Ausfüh- rungsformen beträgt die Homologie 70% oder 80%, besonders bevorzugt sind 90% oder 95%. Am stärksten bevorzugt ist eine Homologie von 98% oder 99%. Die Homologie kann dabei berechnet werden, wie in Pearson und Lipman, 1988, dargestellt.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck"Homologie"bezeichnet den Grad der Ver- wandtschaft zwischen zwei oder mehr Proteinen, der durch die Übereinstimmung zwi- schen den Aminosäuresequenzen mittels bekannter Verfahren, z. B. der computerge- stützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J.

Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt wird. Der Prozentsatz der"Homologie"ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Be- rücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit Algorithmen eingesetzt, die den besonderen Anforde- rungen Rechnung tragen.

Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Ü- bereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Be- stimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht einge- schränkt auf das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12) : 387 (1984) ; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)) ; BLASTP, BLASTIN, und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215 : 403- 410) (1999)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology In- formation (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Alt- schul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894 ; Altschul, S., et al., Mol. Biol.

215 : 403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Be- stimmung von Homologien verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden : Algorithmus : Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48 : 443-453 (1970) Vergleichsmatrix : BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS USA 89 (1992), 10915-10919 Lücken-Wert (Gap Penalty) : 12 Lückenlängen-Wert : (Gap Length Penalty) : 4 Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity) : 0 Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default parameters) für Aminosäu- resequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie-Wert nicht verringern.

Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur ReferenzSequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100.000 (expectation value) zu erhöhen und gegebe- nenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lücke- nausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten, können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevor- zugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60 % wird im Rahmen dieser Anmeldung als 60 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für hö- here Homologiegrade.

Des weiteren wird die Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Proteins gelöst, welches die folgenden Schritte umfaßt : a) Exprimieren einer für das rekombinante Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase (CaM-Kinase) kodieren- den Nukieinsäure, wobei die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von CaM-Kinase kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P1 steht ; b) Gewinnen des Proteins.

Durch die Coexpression des Genes für ein rekombinantes Protein zusammen mit dem Gen für eine Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase wird das Protein von Interesse effizient produziert und kann entweder aus dem Zellüberstand (im Falle eines sezernierbaren Proteins) oder aus dem Zellumen (im Falle eines nicht sezer- nierbaren, intrazellularen Proteins) gewonnen werden. Neben der effizienten Pro- duktion bietet die Coexpression des Genes für ein gewünschtes Protein mit dem Gen für CaM-Kinase den großen Vorteil, daß die aus vielen Wirtszellen bekannte Hyperglykosylierung eines rekombinanten Proteins reduziert wird, d. h. das Glyko- sylierungsmuster des rekombinanten Proteins von Interesse ist dem Glykosylie- rungsmuster in seinem natürlichen Wirt wesentlich ähnlicher als z. B. dem Glykosy- lierungsmuster nach Produktion in S. cerevisiae ohne die Anwesenheit der über- produzierten CaM-Kinase.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert, ausgewähit aus der folgenden Gruppe : i) einer Nukleinsaure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2) ; ii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak- tivität einer CaM-Kinase kodiert ; iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsäure mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase ; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; v) einer Nukleinsäure, die mit einer zu der in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom- plementaren Sequenz hybridisieren kann.

Geeignete Wirtszellen, in denen die rekombinanten Proteine der oben beschriebenen Verfahren produziert werden können, sind Pflanzenzellen, Tierzellen, Hefezellen, Pilz- zellen oder Schleimpilzzellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Tierzellen Sauger-oder Insektenzellen.

Als Hefezellen sind Zelien der Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Schwanniomyces, Candida und Yarrowia wie z. B.

Pichia pastoris, Pichia sinus. Kluvveromvces lactis, Hansenula polymorphe und Candida boidinii bevorzugt. Die erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugten Pilzzellen gehören den Gattungen Aspergillus, z. B. Aspergillus niaer, Neurospora, Rhizopus und Trichoderma an. Eine als Expressionswirt besonders bevorzugte Schleimpilzzelle ist eine Zelle der Gattung Dictvostelium.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die Expression der Gene für das Polypeptid und das Protein mit der biologischen Aktivität von eIF4E und/oder CaM-Kinase unter der Kontrolle eines Promotors P1, der ein starker Promotor ist, statt.

Dabei ist besonders bevorzugt, daß der Promotor P1 induzierbar ist. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist der GAL1-Promotor (Johnston & Davis, 1984), der durch die beiden Zucker Glukose und Galaktose reguliert werden kann. Wenn das Medium, in o- der auf dem die Wirtszellen wachsen, Glukose enthalt, wird die Promotor-Aktivität von Genen, die unter der Kontrolle des GAL1-Promotors stehen, induziert, so daß relativ viel mRNA als Transkriptionsprodukt entsteht. In der Anwesenheit von Galaktose im Medium hingegen ist die Promotor-Aktivität nur sehr gering, was bedeutet, daß nur relativ wenige mRNA-Moleküle hergestellt werden.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das sekretorische Protein das Enzym Phytase. Phytase ist ein pflanzliches Enzym, das Myo-Inosit aus Phytinsäure ab- spaltet. Myo-Inosit wird aufgrund seiner lipotrophen Wirkung medizinisch in der Leber- therapie eingesetzt. Wenn Phytase dem Futter von monogastrischen Tieren (z. B. Geflü- gel und Schweinen) zugesetzt wird, ermöglicht es den Tieren, Phosphat effektiv aus der Nahrung aufzunehmen und reduziert gleichzeitig die Menge an ausgeschiedenem Phosphat. Dies bedeutet, daß bei Phosphat-armen Diäten dem Futter weniger oder gar kein Phosphat künstlich zugesetzt werden muß und daß der anfallende Tiermist auf- grund des reduzierten Phosphatgehalts weniger umweltschädlich ist.

In weiteren Ausführungsformen werden amylolytische Enzyme, z. B. a-Amylase oder Glukoamylase, oder Hormone erzeugt. In bevorzugten Ausführungsformen wird das re- kombinante Protein überproduziert. Wie bereits oben beschrieben, kann die Produktion durch mehrere Faktoren, wie verwendeter Vektor, Selektionssystem und Promotor, beeinflußt werden. Erfindungsgemäß ist bevorzugt, die Produktion unter die Kontrolle starker und/oder induzierbarer Promotoren zu stellen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens einer Nukleinsaure zum Steigern der Sekretion eines rekombinanten sekretorischen Proteins aus einer Wirtszelle, wobei diese Nukleinsäure ausgewählt ist aus der folgenden Grup- pe : i) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33) ; ii) einer Nukleinsaure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von elF4E kodiert ; iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von elF4Ekodiert; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität eines elF4E kodiert ; v) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäurese- quenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann ; vi) einer Nukleinsaure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2) ; vii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak- tivität einer CaM-Kinase kodiert ; viii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivitat einer CaM-Kinase kodiert ; ix) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; x) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsauren komplementaren Sequenz hybridisieren kann.

Die Coexpression einer der oben aufgeführten Nukleinsäuren mit der für ein ge- wünschtes Protein kodierenden Nukleinsäure ermöglicht die effiziente Sezernierung des gewünschten Proteins.

Rekombinante Proteine, die aus Wirtsorganismen sezerniert werden, welche eine oder mehrere der oben genannten Nukleinsäuren beinhalten, bieten den Vorteil, daß das ge- wünschte Protein effizienter sezerniert wird und damit einfacher aufgereinigt werden kann. Dadurch sinken die Produktionskosten. So gewonnene Proteine können z. B. als Medikamente, Nahrungsmittelzusatze oder in der Kosmetikindustrie verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die oben erwähnten Nukleinsäuren (i) bis (x) in einen Vektor integriert vor. Dabei sollte der Vektor neben einem Promotor P1, der funktionell mit der betreffenden Nukleinsaure verbunden ist, Polyadenylierungs-und Translationsterminationssignale enthalten.

Neben den obengenannten Verfahren stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren eines Nukleinsauremoleküls zur Verfügung, das für ein Protein kodiert, welches eine verbesserte Sezernierung eines rekombinanten sekretori- schen Proteins aus einer eukaryontischen Zelle ermoglicht und die folgenden Schritte umfaßt : a) Bereitstellen von rekombinanten Wirtszellen, die eine für ein sekretorisches Marker- protein kodierende Nukleinsäure in funktioneller Verbindung mit einem Promotor P3 enthalten, wobei das Wachstum der Wirtszellen bei gegebener Produktion des sekretorischen Markerproteins inhibiert ist, und die weiter einen Expressionsvektor enthalten, in dem DNA-Fragmente aus einem beliebigen Organismus unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors P1 stehen ; b) Wachsenlassen der rekombinanten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Selekti- on auf die Anwesenheit des Expressionsvektors erlauben ; c) Selektion von Wachstums-dereprimierten Kolonien ; d) Analyse der in dem Expressionsvektor enthaltenen DNA aus dem beliebigen Orga- nismus aus den Wachstums-dereprimierten Kolonien ; e) Identifizieren der Nukleinsäuresequenzen, die nach Expression in der rekombinan- ten Wirtszelle eine Derepression der Wachstums-Inhibition ermoglichen.

Der Promotor P3 ist dabei jeder beliebige Promotor, der die Expression des Genes für das sekretorische Markerprotein in der gegebenen Wirtszelle ermoglicht. Die Wahl eines starken Promotors kann dabei vorteilhaft sein.

Das erfindungsgemäße Screening-Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß durch ex- treme Überexpression einer geeigneten Nukleinsäure, die für ein sezerniertes Protein kodiert, der für die Sezernierung zuständige Zellapparat überlastet wird. Als Folge des- sen"verstopfen"das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat durch rekom- binantes Protein und die Zelle stellt Wachstum und Proteinsezernierung ein. Wird in ei- ner solchen Zelle nun ein weiteres rekombinantes Protein hergestellt, welches den bei der Sezernierung auftretenden Engpaß überwinden kann, beginnt die Zelle wieder zu wachsen und sich zu teilen. Durch Austesten einer möglichst großen Anzahl an ver- schiedenen rekombinanten Proteinen können mit dem hier erstmal beschriebenen Ver- fahren Proteine bzw. für diese Proteine kodierende Nukleinsäuresequenzen identifiziert werden, die einen Zellwachstumsstop verhindern bzw. wieder rückgängig machen kön- nen.

Die Wirtszellen des oben genannten Verfahrens können Pflanzenzellen, Tierzellen, Hefezellen, Pilzzellen oder Schleimpilzzellen sein. Dabei sind Säuger-und Insektenzel- len bevorzugte Tierzellen, und Zellen der Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharo- mvces, Kluvveromyces, Hansenula, Pichia, Schwanniomvces, Candida und Yarrowia, bevorzugte Hefezellen. Besonders bevorzugte Hefezellen sind Hefezelien der Gattung Hansenula polvmorpha. Erfindungsgemäß bevorzugte Pilzzelien sind Zellen der Gattun- gen Asperaillus, z. B. Aspergillus niaer, Neurospora, Rhizopus und Trichoderma. Des weiteren ist zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens eine Zelle der Gattung Dic- tvostelium als besonders bevorzugte Schleimpilzzelle mit umfaßt.

In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist der die Produktion des Markerproteins kontrollierende Promotor ein induzierbarer Promotor, bevorzugt ein starker Promotor. Ein Beispiel eines induzierbaren Promotors ist der PDC1-Promotor. Es empfiehit sich, die rekombinanten Wirtszellen in Schritt b) des Verfahrens unter induzierten Bedingungen wachsen zu lassen, d. h. bei der Verwendung eines Expressions-Vektors mit PDC1- Promotor werden die Wirtszellen in einem Glukose-haltigen Medium in Abwesenheit von Galaktose herangezogen.

In einer weiteren Ausführungsform liegt die für ein sekretorisches Markerprotein kodierende Nukleinsäure auf einem Plasmid mit hoher Kopienzahl pro Wirtszelle vor.

Dies kann z. B. durch die Anwesenheit des LEU2d-Gens erzielt werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß die in Schritt a) des oben erwähnten Verfahrens verwendeten DNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank stammen. Besonders bevor- zugt ist dabei eine cDNA-Genbank aus S. cerevisiae, z. B. die von Liu et al. (1992) be- schriebene Genbank, die in dem Basisvektor pRS316 (CEN/ARS-Plasmid) (Sikorski und Hieter, 1989) errichtet wurde.

In einer weiteren Ausführungsform können die im Schritt a) verwendeten DNA- Fragmente auch aus einer genomischen Genbank stammen, z. B. eine Genbank des S cerevisiae-Genoms.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Expressions-Vektor aus Schritt a), in dem DNA-Fragmente aus einem beliebigen Organismus enthalten sind, der CEN/ARS-Vektor pRS316 (Sikorski and Hieter, 1989).

Weiterhin besonders bevorzugt ist, da# das sekretorische Marker-Protein das Enzym Glukoamylase (EC 3.2.1.3 ; Glukoamylase mit Debranching-Aktivität) ist (Dohmen, 1990).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die für Glukoamylase kodierende Nukleinsäuresequenz in dem obengenannten Verfahren die GAM1-Sequenz aus S. oc- cidentalis.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung einer rekombinanten Wirtszelle, die eine für ein sekretorisches Marker-Protein kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors enthält, zum Identifizieren von Nukleinsauresequenzen, welche nach Expression eine Derepression der Wachstums-Inhibition ermoglichen, wo- bei das Wachstum der Wirtszelle bei gegebener Expression der Gene für das Marker- Protein inhibiert ist.

Weiterhin ist eine Wirtszelle von der vorliegenden Erfindung umfaßt, die eine durch ein rekombinantes Verfahren in die Zelle eingeschleuste Nukleinsäure in ihrem Chromosom enthält, welche aus der folgenden Gruppe ausgewahlt ist : i) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33) ; ii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert ; iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert ; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivitat eines eIF4E kodiert ; v) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) und iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann ; vi) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2) ; vii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak- tivität einer CaM-Kinase kodiert ; viii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsaure abgeleiteten Nukleinsaure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; ix) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; x) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung einen Kit, der eine zur Sezernierung von Proteinen geeignete Wirtszelle und einen Expressionsvektor enthält, wobei der Expressionsvektor in funktioneller Verbindung mit einem Promotor eine Nuklein- säure umfaßt, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von elF14E ko- diert, und aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist : i) einer Nukleinsäure, die für elF4E aus Saccharomvces cerevisiae kodiert (CDC33), ii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von elF4E mit der biologischen Aktivität von elF4E kodiert ; iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert ; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert ; v) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom- plementaren Sequenz hybridisieren kann.

Der Expressionsvektor kann episomal innerhalb der Wirtszelle vorliegen oder als ge- trenntes Präparat zur Verfügung gestellt werden.

Durch die Verwendung dieses Kits soll dem Anwender ermöglicht werden, auf einfache Weise ein Protein von Interesse effizient aus einer eukaryontischen Wirtszelle sezernie- ren zu lassen, um es schneller und in größeren Mengen als bisher möglich ernten zu können.

Des weiteren umfaßt die Erfindung einen Kit, der eine zur Sezernierung und/oder Glyko- sylierung von Proteinen geeignete Wirtszelle und einen Expressionsvektor enthält, wo- bei der Expressionsvektor in funktioneller Verbindung mit einem Promotor eine Nuklein- saure umfaßt, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase ko- diert und aus der folgenden Gruppe ausgewahlt ist : i) einer Nukleinsaure, die für CaM-Kinase aus Saccharomvces cerevisiae kodiert (CMK2) ; ii) einer Nukleinsaure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak- tivität einer CaM-Kinase kodiert ; iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsaure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsauren, das für ein Frag- ment mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; v) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom- plementären Sequenz hybridisieren kann.

Dieser Kit bietet dem Anwender den Vorteil, daß er im Falle eines sezernierbaren Prote- ins neben einer effizienten Sezernierung dieses Proteins auch gleichzeitig eine Glykosy- lierung des rekombinanten Proteins erzielen kann, die dem Glykosylierungsmuster in der natürlichen eukaryontischen Wirtszelle des Proteins stark ahnelt, d. h. eine häufig auf- tretende Hyperglykosylierung vermieden bzw. reduziert wird.

Die Erfindung enthält weiterhin einen Kit, der eine zur Sezernierung und/oder Glykosylie- rung von Proteinen geeignete Wirtszelle sowie einen Expressionsvektor enthält, der in funktioneller Verbindung mit dem entsprechenden Promotor Nukleinsäuren umfaßt, die für Polypeptide mit der biologischen Aktivitat einer CaM-Kinase und eines elF4E kodie- ren und aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind : i) einer Nukleinsaure, die für elF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33) ; ii) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von elF4E kodiert ; iii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab- geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert ; iv) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivität eines elF4E kodiert ; v) einer Nukleinsauresequenz, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäu- ren komplementären Sequenz hybridisieren kann ; vi) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomvces cerevisiae kodiert (CMK2) ; vii) einer Nukleinsaure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak- tivität einer CaM-Kinase kodiert ; viii) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi- tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert ; ix) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsauren, das für ein Poly- peptid mit der biologischen Aktivitat einer CaM-Kinase kodiert ; x) ein Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren kom- plementaren Sequenz hybridisieren kann.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält ein erfindungsge- mäßer Kit weiterhin einen leeren Expressionsvektor, der zum Hineinklonieren einer Nukleinsäure geeignet ist, welche ein rekombinantes und/oder rekombinantes sezernier- bares Protein kodiert. Diese Kit-Ausstattung soll die einfache Handhabung für einen An- wender ermöglichen, der eine bestimmte Nukleinsaure schnell und sicher in einem ge- eigneten Wirt exprimieren möchte, um eine effiziente Sezernierung und/oder reduzierte Hyperglykosylierung des entsprechenden rekombinanten Proteins zu erzielen.

Des weiteren wird von der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Kit zur Verfügung gestellt, der eine wie oben erwähnte Wirtszelle enthält, welche die zur Steigerung der Sezernierung notwendigen Sequenzen nicht auf einem Vektor, sondern in ihrem Genom trägt, in Verbindung mit einem leeren Expressionsvektor, der zum Hineinklonieren einer Nukleinsaure geeignet ist, welche ein rekombinantes und/oder rekombinantes sezernier- bares Protein kodiert. Dieser Kit erlaubt es, durch Transformation der ebenfalls vom Kit zur Verfügung gestellten Wirtszelle mit dem Expressionsvektor die effektive Produktion und gegebenenfalls Sezernierung eines Proteins von Interesse zu erzielen.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung zu beschreiben und zu erlautern. Die Auswahl der genutzten genetischen Komponenten und DNA-Sequenzen soll das Grundprinzip der Erfindung veranschaulichen. In diesem Sinne werden die aufgeführten Beispiele nicht als beschränkend aufgefaßt.

Abbildungen : Abbitduno 1 zeigt eine Plasmidkarte des Plasmids pMF23. Das Plasmid ist ein E. coli/S. cerevisiae Shuttle-Vektor. Es trägt die folgenden funktionellen Einheiten : einen Replikati- onsursprung (oriR) und das p-Lactamase-Gen (bla) zur Propagierung und Selektion in E. coli und die gesamte 2 µ-DNA für die Propagierung in S. cerevisiae. Markersequenzen für die Selektion in Hefe sind das TRP1-Gen und das LEU2d-Allel. Das Plasmid pMF23 enthält das von S. occidentalis stammende GAM1-Gen einschließlich des Terminators unter der Kontrolle des aus S. cerevisiae stammenden PDC1-Promotors. pMF25 ist wie pMF23 aufgebaut, enthält jedoch bei im wesentlichen gleicher kodierender Sequenz ein C-terminales Hämagglutinin-Epitop aus einem Influenzavirus.

Abbilduna 2 zeigt die subzelluläre Lokalisation von Gam1 p-Protein in verschiedenen S. cerevisiae-Stämmen in Abhängigkeit von der Expressionsstärke. Das GAM1-Gen wurde entweder von dem"single copy plasmid"pMF28 oder dem"multi copy plasmid" pMF25 exprimiert. Das Plasmid pMF28 ist ein CEN-Vektor, der das URA3+-Gen als Se- lektionsmarker und die mit einer für das Hämagglutinin kodierenden Sequenz fusionierte GAM1-Sequenz enthalt. Die Zellen wurden in 100 ml Minimalmedium, ohne Uracil (pMF28) oder ohne Tryptophan (pMF25), mit Galaktose oder Glukose (wie angegeben) als einziger Kohlenstoffquelle herangezogen oder sie wurden für 30 Stunden in einem Leucin-freien Minimalmedium in ihrem Wachstum arretiert. Zellfraktionen wurden durch Zentrifugation mit einem linearen Saccharosegradienten (7-47%) aufgetrennt und auf ih- rem Gehalt an Gam1 p-Protein durch SDS-PAGE und Western Blot unter Verwendung von spezifischen Anti-Hämagglutinin-Antikörpern untersucht. Die subzellulären Kompar- timente wurden durch die Anwesenheit von spezifischen Marker-Proteinen identifiziert.

Als Marker-Proteine wurden Dolichol-Phosphat-Mannose-Syntase (Dpm1p-Endoplas- matisches Retikulum), Oligosaccharyltransferase (Och1 p-früher Golgi), ATPase (Pmr1 p -medialer Golgi), Endoprotease (Kex2p-später Golgi) verwendet.

Abbildung 3 zeigt die im Kulturüberstand und der Zellwandfraktion von S. cerevisiae- Stämmen bestimmte Gam1 p-Aktivität. Die Zellen wurden in 20 ml SG-Medium ohne Tryptophan oder ohneTryptophan und ohne Leucin, inokuliert. Supertransformanden, die zusätzlich Plasmid mit der for CDC33 kodierenden DNA enthielten, wurden ohne Uracil kultiviert. Die Zellen wurden bis zur stationären Phase wachsen gelassen, und dann die Glukoamylase-Aktivität, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Die gemessenen Akti- vitäten sind Durchschnittswerte von mindestens drei unabhängigen Bestimmungen.

Abbildung 4 zeigt die Bestimmung der Gam1p-Aktivität im Kulturüberstand und der Zell- wandfraktion von S. cerevisiae-Stämmen. Alle Bedingungen waren mit den in Abbildung 3 beschrieben Bedingungen identisch. Als Vergleich wurde ein Stamm benutzt, der mit dem für CMK2 kodierenden Plasmid supertransformiert war.

Abbilduna 5 zeigt das Ausmaß der Glykosylierung von Gam1 p in CMK2-und CDC33- überexprimierenden S. cerevisiae-Stämmen. Die Stämme wurden wie in Abb. 2 be- schrieben kultiviert und subzelluläre Fraktionen auf ihren Gehalt an Gam1 p überprüft. In CMK2-überexprimierenden Stämmen ist ein großer Anteil des Gam1 p-Protein nicht hy- perglykosyliert.

Abbildunq 6 zeigt das Ausmaß der Glykosylierung von Phytase in CMK2-überexpri- mierenden Hansenulapolymorpha-Stämmen. H. polymorpha Phytaseher-die stellten, wurden mit einem Plasmid supertransformiert, welche das von S. cerevisiae stammende CMK2-Gen unter der Kontrolle des GAL1-Promotors aus S. cerevisiae ent- hielten. Der Phytase herstellende Stamm und repräsentative Beispiele der Supertrans- formanden wurden in Glycerin-Medium (5 % Glycerin, 0,1 M P04, pH 5,0) kultiviert. Das sezernierte Phytase-Protein wurde mittels SDS-PAGE analysiert und mit dem sezer- nierten und durch Behandlung mit Endo H deglykosylierten Produkt verglichen. Die Ab- bildung zeigt Phytase-Protein, welches von dem ursprünglichen Phytase- Produktionsstamm sezerniert wird, im Vergleich zu Phytase, die von einem supertrans- formierten Stamm hergestellt wurde, welcher zusätzlich ein GAL1-Promotor-CMK2- Konstrukt trägt. In den Supertransformanden ist das Ausmaß an Hyperglykosylierung re- duziert, so daß distinkte Polypeptidbanden beobachtet werden können.

Die Spuren 2,4,6,8,10 entsprechen Phytaseproben, die mit Endo H behandelt wurden ; die Proben der Spuren 1,3,5,7 und 9 wurden nicht vorbehandelt. Aufgetragen wurden in den Spuren 1 bis 4 : von supertransformierten Zellen sezernierte Phytase (zwei Kulturüberstande) ; in den Spuren 5 bis 10 : vom ursprünglichen Produktionsstamm sezernierte Phytase (drei Kulturüber- stade), und in der Spur 11 : Molekulargewichtsstandard : die obere Bande entspricht 66,3 kDa, die untere Bande entspricht 55,4 kDa.

Abbildung 7 zeigt die Plasmid-Ausstattung einer Wirtszelle, die zur effizienten Sezernie- rung bzw. Reduktion der Hyperglykosylierung eines rekombinanten Proteins von Interes- se geeignet ist (A) und einer Wirtszelle, die zum Identifizieren von Nukleinsäuremolekü- len geeignet ist, welche eine Wachstumsinhibition des Wirtes dereprimieren können (B).

Material und Methoden Saccharomyces Stämme ............................................................ ............................................................ ............................................................ ........................................ ............................................................ ............................................................ .......... ............................................................ ..... ............................................... .................................... ............................................. .............................................. ............................................. ............................ ....................... ............................ ................ ................................................... ............................................................ ............................................................ ........ ......................................... ............................................................ ....................................... ...................................... ....................... ............................................................ ..................... ............................... ................................... ............................................................ leu2-3,112,trp1-#63,ura3-52,his3-Dohmenetal.,1995JD52MATα, <BR> 200, Iys2-801, cir+ MF9 MATα, leu2-#1100, trp1-#63, ura3-52, s. unten his3-j200, Iys2-801, cir° Im S. cerevisiae Stamm JD52 wurde durch homologe Rekombination mit einem funktio- nellen LEU2-Fragment der LEU2-ORF wieder hergestellt. Das funktionelle LEU2- Fragment wurde als Sall-Xhol Fragment aus pUC/LEU#5 erhalten. Das wiederherge- stellte LEU2-Gen wurde anschließend im Bereich-407 bis +748 deletiert. Der resultie- rende Stamm wurde anschließend nach der Methode von Erhart und Hollenberg (1983) von der endogenen 2µ-DNA bereinigt, wodurch der Stamm MF9 entstand.

Plasmide :.... n....... : : :..... : :........ : : : : < : w. _... :.......... :. : :.. : : : :. :. : :.. :. : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : . : t :. c : v : : rII1 : : il :. : :... :. :. e » ze » : : : : : ; : : : : : :. efC : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : > : : : : : : : ............... pJDcPG-15 CEN/ARS-Plasmid, enthält die GAM1 Expres- Dohmen, 1989 sionskasette, URA3 pJDaG-15 TRP1/ARS-Plasmid, enthält die GAM1 Expres-Dohmen, 1989 sionskasette pJDB219 Gesamt 2p-LEU2d-E. coli Shuttle-Vektor Beggs, 1981 pRS316 CEN/ARS, URA3 Sikorski und Hieter, 1989 pUC19 E. coli-Klonierungsvektor Sambrook et al., 1989 pUC/LEU#5 pUC19 mit einem genomischen Sall-Xhol J. Dohmen, nicht publi- Fragment, welches das LEU2-Gen enthält ziert pMF23 Aus pJDaG-15 wurde das ARS Element durch diese Anmeldung, 2µ- Bg/ll-Pstl-Spaltung entfernt. Die kohäsiven En-TRP1/LEU2d Expressi- den wurden durch Behandlung mit T4-onsplasmid für GAM1 Polymerase aufgefullt und das Plasmid wurde unter der Kontrolle des religiert. In die EcoRI-Schnittstelle wurden die PPDC1-Promotors 2N-LEU2d-Anteile aus pJDB219 ligiert, die durch partielle Spaltung dieses Plasmides mit EcoRl erhalten wurden. pMF25 Die PCR-Produkte MF238/246 (GAM1) und diese Anmeldung, wie MF247/248 (GAM1-Terminator) wurden Sacl-pMF23 ; kodiert for eine C- Kpnl bzw. Xbal-Notl gespalten. Aus pJD307 terminal mit einem dop- wurde das HA2-Epitop als Kpnl-Xbal Fragment pelten HA-Epitop verse- (Dohmen et al., 1995) erhalten und mit einem hene Glukoamylase GAM1-Sacl-Kpnl-Fragment sowie einem GAM1-TerminatorXbal-Notl-Fragment in das mit Sacl/Notl geöffnete Plasmid pMF23 ligiert. pMF28pMF28Umklonierung des ausdieseAnmeldung,#Sin-Fragmentes pMF25 in pJDcPG-15 gle-Copy'- Expressionsplasmid für GAM1 Methoden Medien Saccharomyces cerevisiae-Medien : Vollmedium YPD 1 % Hefeextrakt ; 2% Pepton ; 2% Glukose Vollmedium YPGal 1 % Hefeextrakt ; 2% Pepton ; 2% Galaktose Minimalmedium SD 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base w/o Aminosäuren ; 2% Gluko- se ; 50 mM Citrat pH 4,5 Je nach Selektion wurden zusätzlich zugegeben Histidin und Methionin je 0,01 g/l; Arginin 0,02 g/l ; Lysin und Tryptophan 0,04 g/l ; Threonin ; 0,05 g/l; Leucin, Isoleu- cin und Phenylalanin 0,06 g/l ; Uracil 40 mg/l, Adenin 20 mg/l Minimalmedium SG wie SD, jedoch 2% Galaktose statt 2% Glukose Feste Nährböden enthielten zusätzlich 1,8% Agar, gegebenenfalls wurde 0,5% lösliche Stärke nach Zulkowsky (Merck) zugegeben. Die Anzucht der Hefen erfolgte bei 30°C, wenn nicht anders vermerkt.

Escherichia coli-Medien : LB-Medium 1 % Trypton ; 0,5% Hefeextrakt ; 1 % NaCl SOC-Medium 2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt ; 20 mM Glu- kose, 10 mM NaCl ; 2,5 mM KCI ; 10 nM mMMgSO4;pH7,510 M9 Minimalmedium Na2HP04 x 7 H20 12,8 g/l, KH2PO4 3 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4CI 1 gel Feste Nährböden enthielten zusatzlich 1,8% Agar. Zur Selektion plasmidhaltiger Zellen wurde dem Medium 120 mg/l Ampicillin zugesetzt. Die Bakterien wurden bei einer Tem- peratur von 37°C kultiviert.

Beispiel 1 Herstellunq eines Systems zum Identifizieren von Genen, die die Sekretion von hetero- loqen Proteinen in einer S. cerevisiae Wirtszelle beeinflussen Aus den Plasmiden pJDaG-15 und pJDB219 wurde ein 2 Plasmidderivat, welches mit pMF23 bezeichnet wurde, hergestellt (Dohmen, 1989 ; Beggs, 1981). Das resultierende Plasmid ist in Abb. 1 dargestellt und enthält neben der gesamten 2 4-DNA eine aus S. occidentalis abstammende GAM1-Sequenz, welche an ein PDC1-Promotorelement fusi- oniert ist. Ferner enthält das Plasmid die Selektionsmarker TRP1 und das LEU2d. Bei LEU2d handelt es sich um ein Allel des LEU2-Gens, bei dem der Großteil des Promotors deletiert ist und das daher schwach exprimiert wird. Die Verwendung dieser beiden Se- lektionsmarker gestattet es, den Selektionsdruck zu variieren und die Kopienzahl der in den S. cerevisiae-Stamm MF9 (trp1, leu2, cir°) eingeführten Plasmide zu beeinflussen.

Unter LEU2d-Selektionsbedingungen wird eine extrem hohe Kopienzahl des eingeführ- ten Plasmids erhalten, während unter Selektionsbedingungen für TRP1 eine zwar hohe, aber im Vergleich der LEU2d-Selektion geringere Kopienzahl erzielt wird. So enthalten rekombinante Stämme, die nach Transformation mit dem oben beschriebenen Plasmid erhalten wurden, unter LEU2d-Selektionsbedingungen relativ viele Kopien des GAM1- Gens, dessen Transkription durch den PDC1-Promotor reguliert wird. Wachstum auf Glukose-haltigem Medium erzielt eine hohe PDC1-Promotor-Aktivitat, wahrend Wachs- tum auf Galaktose zu einer geringeren Aktivität führt. Transformanden, die unter LEU2d- Selektionsbedingungen herangezogen wurden, sind weder in der Lage, auf Glukose- noch auf Galaktose-haltigem Medium zu wachsen. Ein Vergleich dieser Zellen mit Transformanden aus Kontrolltransformationen, bei denen Plasmide verwendet werden, die für enzymatisch inaktive Glukoamylase kodieren, zeigte, daß die unter LEU2d- Selektionsbedingungen beobachtete Wachstumsinhibition dadurch verursacht wurde, daß für das rekombinante Enzym ein zu hoher Sekretionsdruck bestand. Die Wachstumsinhibition wurde nicht durch die enzymatische Aktivität der Glukoamylase verursacht. Dies wurde durch die Beobachtung bestätigt, daß Gam1p-Produktion unter weniger stringenten Bedingungen zu einer Akkumulierung des Enzyms in dem En- doplasmatischen Retikulum und dem cis-Golgi führte (Abb. 2).

Derartige Transformanden wurden benutzt, um sie mit den klonierten DNA-Sequenzen der S. cerevisiae-cDNA Genbank zu retransformieren. Dazu wurde eine cDNA-Genbank aus S. cerevisiae verwendet, die unter der Kontrolle des GAL1-Promotors in einen CEN/ARS-Vektor kloniert wurde (Liu et al. 1992 ; Ausubel et al., 1987). Die S. cerevisiae- Stämme wurden entweder auf nicht selektivem Medium (YPD) oder auf einem Minimal- medium wachsen gelassen. Stamme, die die Fähigkeit, die Glukoamylase unter den o- ben beschriebenen stringenten Bedingungen zu sezernieren und dann zu wachsen, wiedererlangt hatten, hatten DNA-Fragmente aufgenommen, welche dazu führten, daß die beobachtete Wachstumsinhibition und damit die Limitierung der Sekretion überwun- den werden konnten. Plasmide aus solchen Transformanden, die eine Suppression der Wachstumsinhibition des Gam1 p-überproduzierenden Wirtsstammes zeigten, wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert.

Eine Analyse des unter erfindungsgemäßen Bedingungen erhaltenen Glukoamylase- Proteins und sein Vergleich mit Standard-isolaten, d. h. Isolaten, die unter Verwendung gleicher Randbedingungen mit der Ausnahme erhalten wurden, daß statt der CMK2 und/oder CDC33 enthaltenden Vektoren entsprechende Leervektoren verwendet wur- den, ermöglichten es weiterhin, sekundäre Modifikationen, wie z. B. das Glykosylie- rungsmuster des sezernierten Produktes, zu beurteilen.

Beispiel 2 Identifizieruna von S. cerevisiae-Genen. die die Wachstumsinhibition in Gam1 p überpro- duzierenden S. cerevisiae-Stämmen supprimieren Der Stamm MF9 : pMF23 wurde mit der oben beschriebenen cDNA-Genbank transfor- miert. 420.000 Transformanden wurden für zwei Tage auf SG-Platten ohne Tryptophan und Uracil wachsen gelassen. Die so erhaltenen Kolonien wurden auf SG-Platten ohne Leucin, Tryptophan und Uracil durch Replika-Plattierung repliziert. 320 Leucin-proto- trophe Klone wurden erhalten, von denen 66 ein Wachstum in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle (Wachstum auf Galaktose, kein Wachstum auf Glukose) zeigten. Alle erhaltenen Klone sezernierten Glukoamylase. Die cDNA-Inserts der 55 am besten wach- senden Klone wurden durch PCR-Amplifikation analysiert. Acht verschiedene cDNA- Größen konnten unterschieden werden, wobei 3 Größen mehrmals vertreten waren. Ins- gesamt 13 Plasmide wurden isoliert und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Die Fä- higkeit der isolierten DNA-Sequenzen, eine Wachstumsinhibition zu dereprimieren, wur- de durch Retransformation der einzelnen Sequenzen in den Stamm MF9 : pMF23 bestä- tigt. Die Identität der erhaltenen Sequenzen wurde durch Vergleich mit Daten aus Se- quenzbanken bestimmt. Unter diesen DNA-Sequenzen war die CDC33-Sequenz 4 mal vertreten, während die CMK2-Sequenz 3 mal auftrat. CDC33 kodiert einen wesentlichen Teil des"cap binding complex"durch Binden der 5'cap-Struktur von mRNAs (Sonen- berg, 1996). Die Sekretionseffizienz von Gam1 p wurde mit der des ursprünglich Gam1 p sezernierenden Wirtsstammes verglichen und das sezernierte Produkt wurde auf seine Glykosylierung hin überprüft.

Beispiel 3 Gam1 p-Herstellung in Stämmen, die das CDC33-Gen aus S. cerevisiae überexprimieren Der rekombinante Stamm MF9 : pMF23 wurde mit dem Plasmid pCDC33, welches die CDC33-kodierende Sequenz aus S. cerevisiae unter der Kontrolle des GAL1-Promotors enthält, retransformiert. Der ursprüngliche Stamm und der retransformierte Stamm wur- den in SG-Medium entweder ohne Tryptophan (TRP1-Selektion) oder ohne Tryptophan und ohne Leucin (TRP1 und LEU2d-Selektion) in 20 ml bei 30°C wachsen gelassen, bis die stationäre Phase erreicht war.

Die von den rekombinanten Stämmen sezernierte Glukoamylaseaktivität wurde anhand der neu erworbenen Fähigkeit der Hefezellen, Stärke degradieren zu können, gemes- sen. Diese Zellen wurden daher auf Platten aufgebracht, die 0,5% lösliche Stärke (ge- mäß Zulkowski, Merck, Darmstadt) enthielten. Nach dem Zellwachstum wurden die Plat- ten mit lodkristallen jodiert. Die Menge an sezernierter Glukoamylase wurde aus dem Durchmesser der farblosen Höfe auf dem rot gefärbten Hintergrund bestimmt. Für eine genauere Bestimmung der Glukoamylaseaktivitäten verschiedener Stämme wurden die- se in die wie oben beschriebenen Medium wachsen gelassen und die Glukosebildung aus einem Stärkesubstrat gemessen (Dohmen et al., 1990 ; Gellissen et al., 1991). Für die Glukosebestimmung wurden die Komponenten des"glucose test kits" (Merck, Darm- stadt) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. Glukoamylase-Aktivität wurde in Proben der Kulturüberstände und Zellwandfraktionen gemessen. Zusätzlich wurde die Enzym-Aktivität in Gesamtzellextrakten bestimmt, welche aus Zellen gewonnen wurden, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden. Die Aktivitäten wurden jeweils in mindestens drei unabhängigen Messungen bestimmt.

Überexpression des CDC33-Gens führte zu einem 2,5-fachen Anstieg in der Produktion an sezernierter Glukoamylase im Falle von TRP1-Selektion und zu einem 7-fachen An- stieg im Falle von LEU2d-Selektion (siehe Abb. 3).

Stamm Selektion OD600 Aktivitätim Ü-Aktivitätinder AktivitätimGe- berstand Zellwandfraktion samtzellextrakt (Einheiten/1) (Einheiten/1) (Einheiten x10-3/ g Protein MF9 : pMF23 TRP1 5,0 54,78,4 MF9 : pMF23 : TRP1 5,0 53,22,5 pCDC33 "LEU2d 4,5 n. b. n. b. = nicht bestimmt Beispiel 4 Gam1p-Produktion von Stämmen, die das S. cerevisiae CMK2-Gen überexprimieren : Der rekombinante Stamm MF9 : pMF23 wurde mit dem Plasmid pCMK2, welches die CMK2-kodierende Sequenz aus S. cerevisiae unter der Kontrolle des GAL1-Promotors enthält, wie oben beschrieben retransformiert. Der ursprüngliche Stamm und der retransformierte Stamm wurden in SG-Medium entweder ohne Tryptophan (TRP1- Selektion) oder ohne Tryptophan und ohne Leucin (TRP1 und LEU2d-Selektion) in 50 ml bei 30°C wachsen gelassen, bis die stationäre Phase erreicht war. Die Glukoamylase- Aktivität wurde wie vorher beschrieben in Proben der Kulturüberstände und der Zell- wandfraktionen gemessen. Zusätzlich wurde Enzymaktivität in Proben von Gesamtzell- extrakten bestimmt, die aus Zellen gewonnen wurden, welche sich in der stationären Phase befanden. Die Aktivitäten wurden jeweils in mindestens drei unabhängigen Mes- sungen bestimmt.

Überexpression des CMK2-Gens führte zu einem 3-fachen Anstieg in der Produktion von sezernierter Glukoamylase im Fall von TRP1-Selektion und zu einem 6,4-fachen Anstieg im Falle von LEU2d-Selektion (siehe Abb. 4).

Stamm Selektion OD600 Aktivität im Ü-Aktivität in der Aktivität im Ge- berstand Zellwandfraktion samtzellextrakt (Einheiten/1) (Einheiten/1) (Einheiten x10-3/ g Protein MF9 : pMF23 TRP1 5,0 54,78,4 MF9 : pMF23 : TRP1 5,0 56,115,3 pCMK2 "LEU2d 4,5 n. b. n. b. = nicht bestimmt Beispiel 5 Ausmaß der Glvkosylierunq von Gam1 P in rekombinanten S. cerevisiae-Stammen, die CDC33 und CMK2-Gene überexprimieren Das Gam1p-Protein ist ein Enzym mit einem Molekulargewicht > 140kDa. Das errech- nete Molekulargewicht der Aminosäuresequenz ist 104 kDa. Der Unterschied zwischen apparentem und errechnetem Molekulargewicht ist auf die Anwesenheit von N-und O- Glykosylierung zurückzuführen. Die Behandlung von Gam1 p mit dem Enzym PNGase F, das N-gekoppelte Zuckereinheiten spezifisch entfernt, führt zu einer Reduktion des Mo- lekulargewichtes auf 120 kDa. Der verbleibende Unterschied zwischen 120 kDa und dem errechneten Molekulargewicht von 104 kDa ist auf O-gekoppelte Zuckereinheiten zurückzuführen. In diesem Beispiel wird das in dem ursprünglichen S. cerevisiae-Stamm hergestellte Gam1 p-Protein mit dem in CDC33-und CMK2-Supertransformanden her- gestellten Gam1 p-Protein verglichen. Für diesen Zweck wurde eine Glukoamylase mit einem C-terminalen HA-Marker für die immunologische Identifizierung der heterologen Enzyme aus Zellfraktionen mit Hilfe der Western Blot-Analyse hergestellt. Durch scho- nende Homogenisierung wurden Zellextrakte hergestellt, und Zellfraktionen durch Zentrifugation in einem Saccharose-Dichte-Gradienten erhalten. Mit Hilfe von Marker- Enzymen, die spezifisch für bestimmte subzelluläre Fraktionen sind, wurden verschiede- ne zelluläre Kompartimente identifiziert (siehe Abb. 2). Die Anwesenheit und die Größe des heterologen Gam1 p-Proteins wurde durch SDS-PAGE gemäß Laemmli bestimmt (Laemmli, 1970). Die aufgetrennten Polypeptide wurden auf PVDF-Membranen (Schlei- cher und Schuell) transferiert und mit spezifischen Antikörpern gegen das HA-Epitop (BabCo) behandelt. In den Stämmen, die das CMK2-Gen überexprimierten, bestand die Population an Gam1p-Proteinen aus Molekülen mit einem Molekulargewicht von 140 kDa und 104 kDa. Daraus wird ersichtlich, daß die Expression des CMK2-Gens zur Er- zeugung von rekombinanten Proteinen beiträgt, deren Molekulargewicht dem Molekular- gewicht der nicht modifizierten Aminosäurekette entspricht. Dieser Effekt wurde in CDC33-überexprimierenden Stämmen nicht beobachtet.

Diese Ergebnisse zeigen, daß CMK2-Überexpression sowohl zu einer Verbesserung der Sekretion als auch zu einer Reduktion der Glykosylierung führt. Überexpression von CDC33 führt dagegen ausschließlich zu einem Anstieg der Sekretion. Das Ausmaß der Glykosylierung wird in diesem Fall nicht beeinflußt (siehe Abb. 5).

Beispiel 6 Ausmaß der Glvkosvlieruna einer rekombinanten Phytase in H. polymorpha-Stammen, die das aus S. cerevisiae stammende CMK2-Gen überexprimieren Der Einfluß des CMK2-Gens auf die Glykosylierung von heterologen Proteinen wurde in einem Phytase-herstellenden H. polymorpha-Stamm untersucht, wie von Mayer et al., 1999, beschrieben. Der Stamm enthält 40 in das Genom integrierte Kopien eines Phyta- se-Expressionsplasmids, in dem die kodierende Sequenz für Phytase an ein aus H. Polymorpha stammendes FMD-Promotorelement zur Expressionskontrolle fusioniert ist. Die betreffende Phytase-Variante besteht aus einer Aminosäurekette mit einem er- rechneten Molekulargewicht von 55 kDa. Hyperglykosylierung führt zu Proteinen in ei- nem Bereich zwischen 60 kDa und 110 kDa. Der Produktionsstamm wurde mit einem Plasmid, welches das aus S. cerevisiae stammende CMK2-Gen entweder unter der Kontrolle des ebenfalls aus S. cerevisiae stammenden GAL1-Promotors oder unter der Kontrolle des das H. polymorpha stammenden FMD-Promotors trägt, supertransformiert.

Beispiele für Anwendungen des FMD-Promotors sind in EP 299108 veröffentlicht. Die resultierenden Supertransformanden wurden auf das Ausmaß an Glykosylierung der se- zernierten Phytase durch vergleichende SDS-PAGE untersucht. In beiden Fällen wurde gefunden, daß die Hyperglykosylierung reduziert war. Anstatt einer Vielzahl von Protein- banden mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden Banden mit distinkten Größen sichtbar (Fig. 6).

Zitierte Literatur : -Altmann und Trachsel, Nuc., Acid Res. 17,5923 (1989) -Ausubel et al. (eds), Current protocols in molecular biology.

Wiley & Sons, New York (1987) -Beggs, Molecular genetics in yeast, von Wettstein et al. eds., Munksgaard, Copenhagen (1981) -Brenner et al., Mol. Cell. Biol. 8,3556 (1988) -Dohmen, Doktorarbeit, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (1989) -Dohmen et al., Gene 95,111 (1990) -Dohmen et al., J. Biol. Chem. 270,18099 (1995) -Erhart und Hollenberg, J. Bact. 156,625 (1983) -Gellissen et al., Biotechnology 9,291 (1991) -Gellissen und Hollenberg, Gene 190,87 (1997) -Giga-Hama und Kumagai,"Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharo- myces pombe", Springer, Berlin (1997) -Hinnen et al., Gene expression in recombinant microorganisms, Smith, ed., Marcel Dekker, N. Y., 121 (1994) -Hollenberg und Gellissen, Curr. Opin. Biotechnol. 8,554 (1997) -Johnston & Davis, Mol. Cell. Biol. 4 (8), 1440 (1984) -Laemmli U, Nature 227,680 (1970) -Liu et al., Genetics 132,665 (1992) -Mayer et al., Biotechnol. Bioeng. 63, S. 373-381 (1999) -Ohya et al., J. Biol. Chem. 266,12784 (1991) -Pausch et al., EMBO J. 10,1511 (1991) -Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444 (1988) -Sakei et al., Genetics 129,499 (1988) -Sambrook, Fritsch & Maniais, Molecular Cloning-A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) -Shulman, Curr. Opin. Cell Biol. 5,247 (1993) -Shusta et al., Nature/Biotechnology 1 16,773 (1998) -Sikorski & Hieter, Genetics 122,19 (1989) -Smith et al., Science 229,1219 (1985) -Sonenberg, Translational control, Mathews et al. eds, Cold Spring Harbour, N. Y.

(1996)<BR> <BR> -W098/13473