Plasmin ist zum einen in der Lage, Fibrin abzubauen, und zum anderen, Matrix- metalloproteinasen (MMP) und Wachstumsfaktoren zu aktivieren, die wiederum für den Abbau der extrazellulären Matrix und die Wundheilung mitverantwortlich sind.

Plasmin entsteht dabei aus seinem Vorläufermolekül, dem Plasminogen. Bislang sind zwei physiologische Aktivatoren des Plasminogens (auch als Plasminogenaktivatoren, PA bezeichnet) bekannt. Dies sind der Gewebe-Typ Plasminogenaktivator (tissue-type PA ; t-PA) und der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (urokinase-type PA ; u-PA). Das System ist zusätzlich durch eine Reihe von Proteaseinhibitoren, z. B. a2-Antiplasmin, reguliert. Direkt mit den beiden unterschiedlichen Aktivatoren sind die zwei wichtigsten biologischen Eigenschaften des Plasminogens bzw. des Plasmins verknüpft.

Der sogenannte t-PA-vermittelte Weg ist für die Fibrinhomöostase verantwortlich, während der u-PA-vermittelte Weg bei der Zellmigration und der Geweberemodellierung hervorzuheben ist.

Insbesondere konnte gezeigt werden, dass bei u-PA defizienten Mäusen chronische, nichtheilende Wunden entstehen. Gleiches gilt für Mäuse, deren Gene für Plasminogen und t- PA bzw. u-PA ausgeschaltet wurden. Darüber hinaus verkürzte sich die Lebenszeit der Tiere deutlich, was unter anderem auf Thrombosen und Organversagen zurückzuführen ist. Eine Übersicht über das Plasminogen/Plasminsystem wurde von Desire Collen (Thrombosis and Haemostasis, 82,1999 (1)) publiziert.

Der therapeutische Einsatz von Plasmin bietet sich für die Behandlung von Herzinfarkt-oder Schlaganfall-Patienten an, bei denen eine schnelle Auflösung des Fibrinclots entscheidend für das Überleben ist, und stellt somit eine alternative Behandlung zu der mit Plasminogen- aktivatoren dar, die die Hydrolyse des Fibrinclots nur indirekt erreichen.

Wie die oben erwähnten Mausmodelle zeigen, ist Plasmin zudem ein potentielles Therapeutikum, das bei der Behandlung von nicht oder nur langsam heilenden Wunden eingesetzt werden kann.

Die Aktivierung von Plasminogen durch t-PA erfolgt in der Regel nur in Gegenwart von Fibrin, also nach Abschluss der Blutgerinnungskaskade. In Abwesenheit eines Substrats wird Plasmin nahezu sofort durch a2-Antiplasmin inhibiert. Durch Bindung des Plasmin an Fibrin wird diese Wechselwirkung allerdings deutlich verlangsamt und dadurch der Abbau des Fibrinclots ermöglicht.

Da die Auflösung von Blutgerinnseln bei einem Herzinfarkt oder bei einem Schlaganfall für das Überleben der Patienten oft unumgänglich ist, werden verschiedene Strategien der Plasminogenaktivierung zur Therapie eingesetzt. Beispielsweise führt die Infusion von Streptokinase zu einer raschen Rekanalisierung der Gefäßlumina. Die Aktivierung von Plasminogen mit Streptokinase, einem bakteriellen Protein, beruht dabei nicht auf einer proteolytischen Aktivierung sondern auf einer Komplexierung. Dieser Komplex kann dann andere Plasminogenmoleküle zu Plasmin aktivieren.

Weiterhin wird Urokinase therapeutisch eingesetzt, die allerdings ähnlich wie Streptokinase auf molekularer Ebene fibringebundenes Plasminogen von freiem Plasminogen nicht unterscheiden kann. Deshalb wurde rekombinantes humanes t-PA entwickelt, das sich in den klinischen Studien als überlegen gegenüber Streptokinase erwies. Allerdings konnten diese Befunde in anderen Studien nicht bestätigt werden.

Gerade die rekombinant hergestellten Plasminogenaktivatoren wie rt-PA (zuzüglich verschiedener Derivate), rekombinanter single chain urokinase-PA und rekombinante Staphylokinase heben die Bedeutung der mit molekulargenetischen Methoden erzeugten Produktionssysteme zur Herstellung rekombinanter Proteine für die Anwendung in der modernen Therapie hervor.

Plasminogen ist das Vorläufermolekül des fibrinolytischen Enzyms Plasmin. Die cDNA (Malinowski et al., Biochemistry, 23,1984 (12) ; Forsgren et al., FEBS Lett. 213, 1987 (2)) sowie das Gen einschließlich der nicht codierenden Introns (Petersen et al., J. Biol. Chem., 265, 1990 (3)) für humanes Plasminogen wurden bereits in der wissenschaftlichen Literatur publiziert.

Humanes Plasminogen (hPg), das Proenzym der Serinprotease Plasmin, ist ein aus einer Polypeptidkette von 791 Aminosäuren bestehendes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 92. 000 und einem theoretischen isoelektrischen Punkt von 7,1. Der Kohlenhydratanteil liegt bei 2 % (Collen, 1999, (1)). Plasminogen wird in der Leber gebildet, die Plasmakonzentration liegt bei etwa 200 mg/1 (1, 5-2 uM).

Das Molekül ist unterteilt in 7 Strukturdomänen ; dazu gehören das N-terminale Präaktivierungspeptid (Glu-1-Lys-77), fünf partiell homologe Kringle-Domänen und die katalytisch aktive Proteinase-Domäne (Val-562-Asn-791 ; Collen, 1999 (1)). Das allen Serinproteasen gemeinsame Strukturmotiv der katalytischen Triade setzt sich aus den Aminosäuren His-603, Asp-646 und Ser-741 zusammen. Die Kringle-Domäne 1 dient als Erkennungssequenz zur Bindung des Plasminogens an Fibrin (Petersen et al., 1990 (3)) und verschiedene Zelloberflächenrezeptoren.

Unter den posttranslationalen Modifikationen sind besonders die zwei für die Funktion von Plasminogen (Aktivierbarkeit durch diverse Proteinasen bzw. Streptokinase, Rezeptor- Bindungseigenschaften) essentiellen Glykosylierungsstellen Asn-289 und Thr-346 hervorzuheben, die beide in der Kringle-Domäne 3 lokalisiert sind. Anhand dieser Modifizierungen werden zwei Hauptformen des Plasminogens unterschieden : - Plasminogen 1 besitzt das oben beschriebene Glykosylierungsmuster - Plasminogen II fehlt die Modifizierung an Asn-289 Eine weitere Glykosylierungstelle ist die Aminosäure Ser-248. Die Aminosäure Ser-578 kann phosphoryliert vorliegen.

Die Aktivierung erfolgt im Organismus durch proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren Arg-561 und Val-562. Anschließend erfolgt eine weitere proteolytische Aktivierung zwischen Lys-77 und Lys-78 zum Lys-78-hPg. Alternativ kann auch zunächst diese Bindung direkt im Glu-Pg hydrolysiert werden. Das aktive Plasmin Lys-78-hPm ist in jedem Fall über Disulfidbrücken verknüpft. Die schwere Kette des hPm (1/78-561) ist dabei für die Wechselwirkung mit den Substraten, z. B. Fibrinogen und Fibrin, verantwortlich. Die aus dem C-Terminus entstandene leichte Kette (562-791) stellt die katalytisch aktive Untereinheit dar.

Bereits aus der Literatur bekannt ist ein Verfahren, mit dem die Fibrinbindedomäne des Plasminogens in Pichia pastoris rekombinant mit einer Ausbeute von 17 mg/1 hergestellt wurde (Duman et al., Biotechnol Appl Biochem. 28 ; 39-45,1998 (4)). Die Glykosylierung dieser Domäne (Kringle 1-4) konnte von den Autoren nachgewiesen werden. Eine weitere Literaturstelle beschreibt die Produktion der zwei Domänen Kringle 4 und 5 des humanen Plasminogens (Guan et al., Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 17,2001 (5)). Zielsetzung war die Domäne zu identifizieren, die das Wachstum von Endothelzellen inhibieren kann.

Die von den beiden Arbeitsgruppen rekombinant in Pichia pastoris hergestellten Plasminogendomänen verfügen jedoch nicht über die für die physiologische Funktionalität entscheidende katalytische Domäne.

Gonzalez-Gronow et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1039,1990 (6)) verglichen die Expression von rekombinantem humanem Plasminogen in Escherichia coli und COS-Zellen, einer Affen-Nierenzelllinie, miteinander. Die mikrobielle Produktion in E. coli scheiterte, was die Autoren auf die mangelnde Glykosylierung zurückführen. Die Produktion der Peptidkette gelang zwar, jedoch in einer nicht aktivierbaren Form, d. h. die Behandlung mit Aktivatoren (Urokinase und t-PA) führte nicht zu aktivem Plasmin.

Die fehlende Glykosylierung resultiert also in einem Protein, dem die wichtigen physiologischen Funktionen sowohl im Hinblick auf Aktivierbarkeit (keine Enzymaktivität nachweisbar) als auch in Bezug auf Endothelzellerkennung fehlen (Gonzalez-Gronow et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1039,1990 (6)). Die posttranslationale Modifizierung mit den Kohlenhydraten beeinflusst darüber hinaus maßgeblich die Halbwertszeit im Blut von Säugetieren.

In COS-Zellen konnten die Autoren hingegen funktionelles Plasminogen herstellen. Andere Autoren beschreiben die funktionelle Expression in Insektenzellen (Whitefleet-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys., 271,1989 (7)). Nachteilig sind jedoch die aufwendigen und kostenintensiven Kultivierungsbedingungen bei der Verwendung von Säugetier-und Insektenzellen sowie die erzielbaren, geringen Proteinmengen. Weiterhin sind Säugerzellen aufgrund der intrazellulären Expression und den Proteasen im Cytoplasma ungeeignet, um größere Mengen eines Proenzyms herzustellen (Nilsen und Castellino, Protein Expression and Purification, 16,1999 (8) und Busby et al., J. Biol. Chem., 266,1991 (9)). Typischerweise liegen die Expressionsausbeuten beim System Baculovirus/Lepidopteran (Insektenzellen) lediglich bei 3-10 mg/ml.

In W00250290 wurde die rekombinante Herstellung von funktionellem Mini-und Microplasminogen in Hefe offenbart. Die Autoren exprimierten hierzu die Gene für die katalytische Domäne von humanem Plasminogen mit (Miniplasminogen) oder ohne einer Kringle-Domäne (Microplasminogen) in dem Wirtsorganismus Pichia pastoris. Das derart rekombinant hergestellte Mini-bzw. Microplasminogen wurde anschliessend gereinigt, zu Mini-bzw. Microplasmin prozessiert und dessen Aktivität im Tierversuch demonstriert. Die beanspruchte Ausbeute der rekombinanten Proteine liegt bei 100 mg/1 für Miniplasminogen und bei 3 mg/1 für Microplasminogen. Je grösser jedoch ein Protein ist, desto schwieriger ist dessen rekombinante Herstellung, was durch die deutliche Abnahme der Ausbeute um zwei Zehnerpotenzen von Micro-zu Miniplasminogen in der Offenbarung von W00250290 bestätigt wird. Ein Ausführungsbeispiel zur Expression von längeren Plasminogen-Varianten wie z. B. Lys-oder Glu-Plasminogen wurde nicht dargestellt.

Die rekombinante Herstellung von funktionellem Plasminogen in Mikroorganismen wurde bisher noch nicht offenbart, so dass ein Fachmann sie ausführen kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, funktionelles humanes Plasminogen in einem kostengünstigen Verfahren herzustellen und zu katalytisch aktivem Plasmin zu prozessieren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein rekombinantes Herstellungsverfahren zur Herstellung von Plasminogen mit einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 1. Weitere Lösungen werden in den unabhängigen Ansprüchen genannt. Die abhängigen Ansprüche reflektieren bevorzugte Ausführungsformen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass in Mikroorganismen die rekombinante mikrobielle Produktion von funktionellem Glu-und Lys-Plasminogen möglich ist. Weiterhin wurde gefunden, dass die rekombinante Herstellung von Micro-, Mini-, Lys-und Glu-Plaminogen in unerwartet hohen Mengen möglich ist.

Gegenstand der Erfindung ist die Klonierung des Plasminogen-Gens, bevorzugt des humanen Micro-und Miniplasminogen-Gens und weiter bevorzugt des Glu-oder Lys-Plasminogen-Gens oder jeweils einer funktionellen Variante hiervon, in Expressionsvektoren und die rekombinante Herstellung von funktionellem Plasminogen, vorzugsweise funktionellem humanem Plasminogen, unter Verwendung von molekulargenetischen Methoden. Die Erfindung beschreibt des weiteren die Identifizierung von Proteasen, welche die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin katalysieren. Das Plasminogen bzw. Plasmin, das durch diese Erfindung hergestellt wird, ist frei von Kontaminationen wie z. B. tierischen Proteinen oder Viren, die bei der Isolierung aus Menschen, Rindern und anderen Säugern natürlicherweise auftreten und die zu Nebenwirkungen bei den Patienten fuhren können.

Die Erfindung ist durch ein rekombinantes Herstellungsverfahren gekennzeichnet, umfassend mindestens den folgenden Schritt : a. ) Fusion der mindestens für den funktionellen Teil des Plasminogen-Peptids kodierenden Nukleinsäuresequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die für mindestens ein Signalpeptid kodiert, wobei die für das funktionelle Plasminogen-Peptid kodierende Nukleinsäuresequenz und die für mindestens das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit Kodons für Schnittstellen von Proteasen verknüpft sind, welche die Abspaltung des Signalpeptids gewährleisten. Die Herstellung von therapeutischen Proteinen wird zunehmend mit rekombinanten Produktionssystemen durchgeführt. Aufgrund von Kostenfaktoren wird angestrebt, die rekombinante Produktion in mikrobiellen, insbesondere in bakteriellen, Organismen durchzuführen. Diese Systeme bringen den Vorteil mit sich, dass neben einer vergleichsweise kostengünstigen Produktion Proteinausbeuten im g/1-Bereich erreichbar sind und die rekombinanten Proteine nicht mit Viren oder Proteinen wie z. B.

Prionen verunreinigt sind, die für die Patienten schädlich sein können. Da bakterielle Produktionssysteme oftmals nicht in der Lage sind, korrekt gefaltetes Protein herzustellen, wird, neben der in vitro-Rückfaltung der fehlgefalteten Proteine, häufig die Herstellung in eukaryontischen Systemen wie Hefen, Insektenzellen oder Säugerzellen durchgeführt. Die eukaryontischen Produktionsstämme und-zelllinien bieten den Vorteil, dass mit ihnen glykosylierte Proteine hergestellt werden können. Insbesondere für Insektenzellen oder Säugerzellen gilt, dass die rekombinante Proteinproduktion sehr kostenintensiv ist und die Ausbeuten häufig sehr gering sind. Des weiteren haben sie den Nachteil, dass sie ebenfalls mit für den Menschen schädlichen Viren und Proteinen verunreinigt sein können. Dies ist bei der Verwendung von eukaryontischen Mikroorganismen nicht der Fall. Die apparative Ausstattung für die Kultivierung von eukaryontischen Mikroorganismen ist mit der bakterieller Organismen vergleichbar, Kontaminationen mit Säugerviren und Proteinen sind nicht vorhanden und Proteinausbeuten im g/1-Bereich sind ebenfalls möglich. Besonders bevorzugt gehört der verwendete eukaryontische Wirtsorganismus zur Abteilung der Pilze, vorzugsweise zu den Ascomycota. Weiterhin wird bevorzugt, dass er zu den Saccharomycotina, insbesondere zur Klasse der Saccharomycetes, hier besonders zur Ordnung der Saccharomycetales, zählt. Gemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen gehört der Wirtsorganismus weiterhin zur Familie Saccharomycetaceae, hier insbesondere zur Gattung Pichia. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete eukaryontische Mikroorganismen sind beispielsweise die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, weitere Beispiele sind Candida, die methanothrophen Hefen Pichia pastoris, Pichia methanolica und Hansenula polymorpha oder filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, wie z. B. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae und Aspergillus nidulans.

Besonders bevorzugt wird Pichia pastoris.

Das rekombinante Herstellungsverfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass ein für mindestens den funktionellen Teil von Plasminogen kodierendes Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor für diesen Mikroorganismus eingefügt wird, wobei das vorzugsweise für humanes Plasminogen kodierende Nukleinsäuremolekül mit dem für mindestens für ein Signalpeptid, vorzugsweise ein Präpropeptid, vorzugsweise für den Transport in das endoplasmatische Reticulum, kodierende Nukleinsäuremolekül fusioniert ist, wobei zwischen den beiden Nukleinsäuremolekülen Kodons für Protease-Schnittstellen eingefügt sind, die das Abspalten der Signalsequenz oder des Präpropeptids im Wirtsorganismus ermöglichen.

Vorzugsweise wird ein für humanes Plasminogen kodierendes Nukleinsäuremolekül verwendet. Außer einem für humanes Plasminogen kodierenden Nukleinsäuremolekül können Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die für Plasminogen aus anderen Säugetieren kodieren. Dies führt zur Produktion von Plasminogen der jeweiligen Säuger. Des weiteren wird das rekombinante humane Plasminogen gemäß dem vorliegenden Verfahren durch Überexpression gebildet und kann, wenn gewünscht, in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem es durch Zentrifugation, Filtration oder Sedimentation von den Wirtszellen abgetrennt werden kann und somit ohne aufwendige Zellaufschlussverfahren der Proteinreinigung zugeführt werden kann, die mittels dem Fachmann bekannten Methoden durchführbar ist. Die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin wird durch Proteasen gelöst, die in der Lage sind, Plasminogen zu katalytisch aktivem Plasmin zu prozessieren.

Im folgenden werden im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdrücke definiert : "Rekombinantes Herstellungsverfahren"bedeutet, dass ein Peptid oder ein Protein von einer Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise einer DNA-Sequenz, durch einen geeigneten Wirtsorganismus exprimiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz aus einer Klonierung und Fusion einzelner Nukleinsäureabschnitte entstanden ist.

Unter"Klonierung"sollen hier alle zufolge dem Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfasst sein, die jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

"Expression in einem geeigneten Expressionssystem"soll hier alle zufolge dem Stand der Technik bekannten Expressionmethoden umfassen, insbesondere diejenigen, welche in den Ansprüchen angesprochen werden.

Unter dem"funktionellen Plasminogen-Peptidteil"ist der Teil des Plasminogens oder Plasminogen-Peptids zu verstehen, der die biologisch relevanten Funktionen des Plasminogens wahrnehmen kann. Diese biologisch relevanten Funktionen sind mindestens die Aktivierbarkeit zu Plasmin durch Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise tissue-Plasminogenaktivator, Urokinase, vampire-bat Plasminogenaktivator, Streptokinase, Stapyhlokinase, Pla-Protein aus Yersinia pestis etc., und die proteolytische Aktivität, die durch die Hydrolyse von Fibrin gekennzeichnet ist. Unter dem in der Beschreibung und den Beispielen verwendeten Begriff "Plasminogenaktivator (en)" sollen sowohl proteolytische als auch nicht-proteolytische Plasminogenaktivatoren verstanden werden.

Bei Glu-Plasminogen ist zusätzlich die Prozessierbarkeit zu Lys-Plasminogen durch die Plasmin-katalysierte Abspaltung des Präaktivierungspeptids zu verstehen.

Ebenfalls gehört zu den biologischen Funktionen die bis zum Faktor 1000 gesteigerte Aktivierbarkeit von Plasminogen nach Bindung an Fibrin, Laminin, Fibronectin, Vitronectin Heparansulfatproteoglucan, Collagen Typ 4 und andere Substrate.

Unter den biologisch relevanten Funktionen von Plasmin, welche nach Prozessierung des Plasminogens gewährleistet sein müssen, ist die Degradation von Laminin, die Degradation von Fibronectin, von Vitronectin, von Heparansulfatproteoglucan, die Aktivierung von ProCollagenasen, die Aktivierung von Promatrixmetalloproteasen, die Aktivierung von Latenter Makrophagen Elastase, Prohormonen und Wachstumsfaktoren wie den TGFß-1 (latent transforming growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) oder bFGF (basic fibroblast growth factor) zu verstehen.

Eine weitere Biologische Funktion ist die Inhibierbarkeit durch Plasmin-Inhibitoren wie a2- Antiplasmin und a2-Makroglobulin.

Außerdem gehört zu den biologisch relevanten Funktionen die Bindung an Fibrin, Laminin, Fibronectin, Vitronectin, Heparansulfatproteoglucan und Collagen Typ 4, die Bindung an Rezeptoren wie beispielsweise die a-Enolase, Annexin II oder Amphoterin.

Plasminogen wird zunächst als inaktives Glu-Plasminogen gebildet. Dieses Glu-Plasminogen kann von Plasmin durch Abspaltung des sog. Präaktivierungspeptids in Lys-Plasminogen umgewandelt werden. Beides wird von tissue-Plasminogenaktivatoren (also in diesem Fall nur durch die oben erwähnten proteolytischen Aktivatoren) durch proteolytische Spaltung in Plasmin umgewandelt, das aus über Sulfid-Brücken verbundenen Untereinheiten besteht. Die kleinere Untereinheit beinhaltet die proteolytische Domäne und die Phosphorylierungsstelle, die größere Untereinheit trägt die drei Glykosylierungen und ist für die Bindung an Fibrin verantwortlich. Des weiteren sind die Glykosylierungen wichtig für die Stabilität im Plasma.

Plasminogen kann zusätzlich durch die Ausbildung eines 1 : 1 Komplexes mit Streptokinase oder Staphylokinase zu einem proteolytisch aktiven Enzym umgewandelt werden, das in der Lage ist, Plasminogen zu Plasmin zu prozessieren.

Funktionelles Plasminogen ist demnach Plasminogen, das durch Plasminogenaktivatoren zu proteolytisch aktivem Plasmin prozessiert werden kann. Des weiteren beinhaltet funktionelles Plasminogen vorzugsweise die Fibrin-bindende Domäne und kann vorzugsweise mindestens eine der drei Glykosylierungen enthalten.

Kleinste Formen von funktionellem Plasminogen sind Micro-und Miniplasminogen, eine grössere Form Lys-Plasminogen. Glu-Plasminogen, das noch das Präaktivierungspeptid beinhaltet, ist ebenfalls funktionelles Plasminogen. Es ist jedoch denkbar, dass Bereiche insbesondere innerhalb der größeren Kette weggelassen werden können, ohne die oben genannte Funktionalität (u. a. Proteolyse, Fibrinbindung) entscheidend zu beeinträchtigen.

Es ist für den Fachmann naheliegend, unterschiedliche Formen des Plasminogens (im folgenden als Plasminogenderivate bezeichnet) herzustellen, die eine funktionelle katalytische Domäne beinhalten. Unter funktionell ist wie bereits beschrieben zu verstehen, dass die Plasminogen-Variante nach Aktivierung mit Plasminogenaktivatoren wie Streptokinase oder Urokinase proteolytische Aktivität aufweist. die katalytische Domäne kann Deletionen und Aminosäureaustausche beinhalten oder mit weiteren Aminosäuren oder Peptiden oder Proteinen fusioniert sein. die große Domäne kann alle Zwischenstufen von Glu20 bis Arg580 (bezogen auf die Sequenz des Prä-Plasminogens) beinhalten, die mit Plasminogenaktivatoren zu aktivem Plasmin aktivierbar sind.

Als konkretes Beispiel seien drei Formen von Lys-Plasminogen genannt : Variante 1 : N-Terminale Aminosäure : Met88 Variante 2 : N-Terminale Aminosäure : Lys97 Variante 3 : N-Terminale Aminosäure : Val98 Die Plasminogenderivate sind bevorzugt um eine Anzahl von 1 bis 50 Aminosäuren kürzer oder länger als das entsprechende Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen oder weisen bevorzugt einen Austausch von 1 bis 10 Aminosäuren auf, wobei diese Derivate weiterhin die Eigenschaft besitzten, durch Plasminogenaktivatoren aktiviert zu werden. Zwischen dem jeweiligen Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen und dem zugehörigen Plasminogenderivat besteht eine Sequenzhomologie (Sequenzübereinstimmung) von über 80%, bevorzugt von über 85%, weiter bevorzugt von über 90%, ferner weiter bevorzugt von über 95%, insbesondere bevorzugt von über 98% und ferner insbesondere bevorzugt von über 99%.

Bevorzugt weisen die Plasminogenderivate folgende Charakteristiken auf : 'die katalytische Domäne kann mindestens eine Deletion und/oder mindestens einen Aminosäureaustausch beinhalten und/oder mit mindestens einer weiteren Aminosäure oder mindestens einem weiteren Peptid oder mindestens einem weiteren Protein fusioniert sein. die große Domäne kann alle Zwischenstufen von Glu20 bis Arg580 (bezogen auf die Sequenz des Prä-Plasminogens) beinhalten, die mit Plasminogenaktivatoren zu aktivem Plasmin aktivierbar ist.

Ein Plasminogenderivat weist eine Aminosäuresequenzhomologie (-übereinstimmung) von bevorzugt von über 80%, ferner weiter bevorzugt von über 85%, des weiteren bevorzugt von über 90%, insbesondere bevorzugt von über 95% und ferner insbesondere bevorzugt von über 99% auf.

Mit"Mikroorganismus"werden alle solchen Lebensformen umfasst, die nur geringe Abmessungen aufweisen. Dabei sollen sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Mikroorganismen umfasst sein. Insbesondere zu nennen wären Bakterien, Hefen, Pilze und Viren.

"Nukleinsäure"soll sowohl DNA als auch RNA, beide in allen denkbaren Konfigurationen, umfassen, z. B. in Form von doppelsträngiger Nukleinsäure, in Form von einzelsträngiger Nukleinsäure, Kombinationen davon, sowie lineare oder zirkuläre Nukleinsäuren.

Unter"Signalsequenz"wird eine Peptidsequenz verstanden, die in der Lage ist, den Transport einer weiteren Peptidsequenz in oder über eine Membran zu gewährleisten, z. B. in das endoplasmatische Retikulum. Dabei kann es sich beispielsweise um ein Präpropeptid, ein Präpeptid oder ein Propeptid handeln.

Mit"Schnittstelle"werden solche Stellen in einer Peptidsequenz bezeichnet, welche die Abspaltung einer Signalsequenz, eines Präpropeptids oder Propeptids von der weiteren Peptidsequenz oder allgemein die Spaltung einer Peptidsequenz in zwei Teile in einem Wirtsorganismus ermöglichen.

Eine für mindestens ein Signalpeptid oder ein Präpropeptid kodierende Nukleinsäure"ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Peptid oder eine Proteinstruktur kodiert, die dem weiteren Polypeptid ein Einschleusen in Membranen, z. B. ins endoplasmatische Retikulum, ermöglicht.

Mit"Primer"wird ein Starter-Oligonukleotid bezeichnet. Hiermit meint man kurzkettige, einzelsträngige Oligoribo-oder Desoxyribo-Nukleotide, die zu einem Bereich auf einem einzelsträngigen Nukleinsäure-Molekül komplementär sind und mit diesem zu einem Doppelstrang hybridisieren können. Das freie 3'-Hydroxy-Ende in diesem Doppelstrang dient als Substrat für DNA-Polymerasen und als Startstelle für die Polymerisierungsreaktion des gesamten Einzelstranges zum Doppelstrang. Die Primer werden insbesondere für die PCR, d. h. die dem Fachmann bekannte Polymerase-Kettenreaktion, eingesetzt.

Mit"Plasmid"werden die in vielen prokaryontischen und einigen eukaryontischen Mikroorganismen vorkommenden, nicht ins Chromosom integrierten Nukleinsäure-Moleküle mit einer Länge von ca. 2 kb bis mehr als 200 kb bezeichnet.

"Ligation"ist die Bezeichnung für die Verknüpfung der Enden zweier Nukleinsäure-Moleküle mit Hilfe einer Ligase oder im Rahmen einer Selbst-Ligation, d. h. durch eine intramolekulare Ringschlussreaktion, bei der sich die beiden einzelsträngigen Enden eines linearen DNA Moleküls zusammenlagern, sofern ihre Enden miteinander Basenpaare bilden können.

"Restriktionsendonuklease"ist die Bezeichnung für eine Klasse von bakteriellen Enzymen, die in beiden Strängen eines DNA Moleküls innerhalb spezifischer Basensequenzen Phosphodiester-Bindungen spalten.

"Elektroporation"ist ein Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen. Dabei werden die Zellmembranen der in Suspension befindlichen, exponentiell wachsenden Empfängerzellen durch kurze elektrische Pulse hoher Feldstärke für hochmolekulare Moleküle durchlässig gemacht, während man sie der Nukleinsäure-Lösung aussetzt.

Unter"Überexpression"wird eine vermehrte Herstellung von funktionellem Plasminogen durch eine Zelle im Vergleich zu einer Produktion durch den Wildtyp dieser Zelle verstanden.

In der Regel spricht man von einer Überexpression dann, wenn das exprimierte Fremdgen bei intrazellulärer Produktion etwa 1-40 % des gesamten zellulären Proteins der Wirtszelle ausmacht.

Unter"Expressionsvektor"sind solche Vektoren zu verstehen, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transkription des in den Vektor einklonierten Fremdgens und die darauffolgende Translation der gebildeten mRNA (Boten-RNA) erlauben. Expressionsvektoren enthalten in der Regel die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.

Zur Kontrolle der Genexpression in Hefen wie z. B. Pichia pastoris werden in der vorliegenden Erfindung bevorzugt durch Methanol induzierbare Promotoren wie z. B. der AOXl-Promotor oder besonders bevorzugt konstitutive Promotoren wie z. B. der YPTl-Promotor oder der GAP-Promotor verwendet. Insbesondere bevorzugt ist der konstitutive GAP-Promotor.

"AOX1"ist ein Gen der Alkoholoxidase 1 aus P. pastoris ; "GAP"ist ein Gen der Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase aus P. pastoris und "YPT1"ist ein Gen eines GTP-Bindeproteins aus P. pastoris.

Für die sekretorische Produktion in Hefen werden häufig die Signalpeptide der von den Genen PHO-1, SUC-2, PHA-E oder alpha-MF codierten Proteine verwendet.

"PHO1"ist ein Gen der sauren Phosphatase aus P. pastoris ; "SUC-2"ist ein Gen der sekretorischen Invertase aus S. cerevisiae ; "PHA-E"ist ein Gen der sauren Phosphatase von Phaseolus vulgaris Agglutinis ; und "alpha-MF"ist ein Gen des alpha-Mating Factors aus S cerevisiaea.

Besonders bevorzugt sind die Kodons für die Schnittstellen von Proteasen und Kodons für die Schnittstellen zur Abspaltung des Propeptids für die Protease Kex 2 oder die Protease Ste 13.

Besonders bevorzugt erfolgt die Verknüpfung in Schritt a) oben mit Kodons, die für eine Kex 2 Schnittstelle und zusätzlich zwei Ste 13 Schnittstellen kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsfbrm der vorliegenden Erfindung stammt das für das Signalpeptid oder Präpropeptid kodierende Nukleinsäuremolekül aus Hefe, insbesondere der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Eine noch bevorzugtere Ausführungsform ist auf ein für das Signalpeptid oder das Präpropeptid kodierendes Nukleinsäuremolekül gerichtet, das für das Signalpeptid oder Präpropeptid des a-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae kodiert. Das in Schritt a) oben beschriebene entstandene Fusionsprodukt wird vorzugsweise durch PCR amplifiziert und danach weiterhin bevorzugt gereinigt.

In W002/50290 wird die rekombinante Herstellung von Mini-und Microplasminogen mit dem für Hefe geeigneten Expressionsvektor pPICZaADDder den induzierbaren AOXl-Promotor und das Präpropeptid des Hefe alpha-Faktors enthält, offenbart. Diese kleineren Varianten von Plasminogen besitzen entweder gar keine (wie Microplasminogen) oder nur eine Kringle- Domäne (wie Miniplasminogen). Der Expressionsvektor pPICZaADenthält die Schnittstellen für die Proteasen Kex2 und Stel3. Bei der Klonierung der entsprechenden Expressionsvektoren von Mini-und Microplasminogen wurden jedoch die Stel3-Schnittstellen deletiert.

Für induzierbare Expressionssysteme in Hefe sind eine Reihe von Promotoren bekannt.

Hierzu zählen unter anderem der AOXl-Promotor, AOX2, CUP1 (Koller A, Valesco J, Subramani S., Yeast 2000 : 16 (7), 651-6), PHO1 (EP0495208), HIS4 (US 4885242), FLD1 (Shen et al., Gene 1998 : 216 (1), 93-10) und der XYLl-Promotor (Den Haan and Van Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 : 57 (4), 521-7).

Mit Hilfe des Methanol-induzierbaren AOXl-Promotors kann die heterologe Proteinproduktion gezielt gesteuert und eine homogene Biomasse erreicht werden. Bevor die Expression des Fremdproteins induziert wird, können die Wirtsorganismen eine hohe Wachstumsdichte ohne Selektionsnachteile, welche durch die Expression eines Fremdproteins entstehen würde, erreichen.

Im Gegensatz zu ihren kleineren Varianten, welche in W002/50290 unter Kontrolle des AOXl-Promotors exprimiert werden, beinhaltet das in der vorliegenden Erfindung rekombinant hergestellte Glu-und Lys-Plasminogen alle fünf Kringle-Domänen, was ihre rekombinante Herstellung aus den folgenden Gründen schwierig macht : - Möglicher Verlust der Expresssionskassette aufgrund von Wachstumsnachteilen für die Wirtsorganismen bei der Expression der Fremdproteine ; - Proteolytische Degradierung der exprimierten Proteine und - Geringe Ausbeute.

Aufgrund der dargestellten Nachteile, ist die Herstellung von Glu-oder Lys-Plasminogen in W002/50290 nicht offenbart worden.

Diese Schwierigkeiten wurden in der vorliegenden Erfindung u. a. dadurch gelöst, dass das rekombinante Protein ein Signalpeptid eine Kex2 und mindestens eine Stel3-, bevorzugt zwei Stel3 Protease-Schnittstellen beinhaltet. Weiterhin wurde in einer bevorzugten Ausführungsform als weitere C-Quelle eine Glycerol-Zufütterung zwischen 0,1 und 10 ml/h, bevorzugt zwischen 0,5 und 5 ml/h, weiter bevorzugt zwischen 0,8 und 1,5 ml/h durchgeführtund das Kulturmedium auf neutralen pH von 7,0 gepuffert. Es wurde auf ausreichenden Sauerstoffeintrag geachtet.

In einer bevorzugten Ausführungsform wurde darauf geachtet, die rekombinante Nukleinsäure nicht in Anschluss an den 5'-Bereich des AOXl-Gens, sondern in Anschluss an den 5'-Bereich des Glyceraldeydphosphat-Dehydrogenase-Gens aus P. pastoriszu integrieren. Hierbei wurde kein induzierbarer, sondern ein konstitutiver Promoter verwendet. Konstitutive Promotoren, die in Hefe aktiv sind und verwendet werden können sind der GAP-Promotor, der YPT1- Promotor (Sears et al., Yeast 1998 : 14 (8), 783-90), der TKL-Promotor (Den Haan and Van Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 : 57 (4), 521-7), der ACT-Promotor (Kang et al., Appl.

Microbiol. Biotechnol. 2001 : 55 (6), 734-41) und der PMAl-Promotor (Yeast 2000 : 16 (13), 1191-203). Bevorzugte Promotoren sind der GAP-Promotor und der YPTl-Promotor. Ein besonders bevorzugter Promoter ist der GAP-Promoter.

Im Gegensatz zu einem induzierbaren Promoter hat ein konstitutiver Promoter den Nachteil, dass das zu exprimierende Fremdprotein konstitutiv, also während der gesamten Wachstumsphase hergestellt wird. Hierdurch entstehen Nachteile für die Wirtszelle, was sich u. a. in einem verlangsamten Wachstum ausdrückt. Aufgrund des herrschenden Selektionsdrucks, haben Wirtszellen, die die rekombinante Expressionskassette verloren haben einen Vorteil und können die rekombinanten Wirtszellen überwachsen. Hierdurch kann eine heterogene Mischpopulation entstehen, die vermieden werden soll. Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, dass der konstitutive GAP-Promoter gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine höhere Ausbeute ermöglicht.

Während bei Verwendung des AOXl-Promotors Ausbeuten an Lys-Plasminogen nach 120 Stunden Induktion von mindestens 17 U/1 ( 1, 5 mg/l) weiter bevorzugt 120 U/1 (=11 mg/l), weiter bevorzugt 180 U/1 (3 16 mg/l), ferner weiter bevorzugt 200 U/1 (a 18 mg/l), weiter bevorzugt 220 U/1 (= 20 mg/l), ferner weiter bevorzugt 240 U/1 (s 22 mg/l), insbesondere bevorzugt 260 U/1 (=24 mg/l) und weiter insbesondere bevorzugt 280 U/1 (= 25, 5 mg/l) erhalten wurden, lagen die Ausbeuten bei Verwendung eines konstitutiven Promotors, insbesondere des GAP-Promotors, wesentlich höher.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP- Promotor operativ mit einer Nukleinsäure verbunden, welche für mindestens den funktionellen Teil der Plasminogen-Sequenz kodiert, und welche mit einer Nukleinsäuresequenz fusioniert ist, die mindestens für ein Signalpeptid kodiert, wobei die für das funktionelle Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz und die für mindestens das Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit Kodons für Schnittstellen von Proteasen verknüpft sind, welche die Abspaltung des Signalpeptids gewährleisten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor mit der Nukleinsäuresequenz des Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogens operativ verknüpft, welche mit der Nukleinsäuresequenz eines Signalpeptids aus der Hefe fusioniert ist.

Überraschenderweise wurde diesbezüglich festgestellt, dass der konstitutive GAP-Promoter gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine um das ca. 10- fache höhere Ausbeute ermöglicht (s. Beispiel 7c, Herstellung von Lys-Plasminogen, 1375 U/l, was umgerechnet 125 mg/1 ergibt). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als weitere C-Quelle eine Glycerol-Zufütterung zwischen 0,1 und 10 ml/h, bevorzugt zwischen 0,5 und 5 ml/h, weiter bevorzugt zwischen 0,8 und 1,5 ml/h durchgeführtund das Kulturmedium auf neutralen pH von 7,0 gepuffert. Die Wachstumsrate u [l/h] erreicht dabei Werte zwischen 0,002 und 0,10, bevorzugt zwischen 0,004 und 0,020, weiter bevorzugt zwischen 0, 008 und 0,010.

Bei Verwendung des GAP-Promotors wurden Ausbeuten an Lys-Plasminogen von mindestens 660 U/1 (60 mg/l), bevorzugt 1000 U/1 (= 91 mg/l), bevorzugt 1500 U/1 (= 136 mg/l), weiter bevorzugt 2000 U/1 (= 182 mg/ml), bevorzugt 2500 U/1 (_ 227 mg/l), insbesondere bevorzugt und weiter insbesondere bevorzugt 2750 U/1 (_ 250 mg/l) nach einer Fermentationszeit von 250 Stunden erhalten.

Bei der rekombinaten Herstellung von Mini-und Microplasminogen wurden entsprechend höhere Ausbeuten erhalten. Die Ausbeuten bei Miniplasminogen liegen zwischen 100 mg bis 2 g pro Liter, bevorzugt von 300 mg/1-1, 5 g/l, weiter bevorzugt von 400 mg/1-1 g/1 ferner weiter bevorzugt von 500 mg/1-800 mg/1 und insbesondere bevorzugt von 600-700 mg/l.

Die Ausbeuten von Microplasminogen liegen ferner mindestens 10% über denen von Miniplasminogen. Geringfügig schlechtere Ausbeuten im Vergleich zu Lys-Plasminogen lieferte die rekombinante Herstellung von Glu-Plasminogen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Herstellung von Mini-, Micro-, Lys-und Glu- Plasminogen. Bevorzugte Ausführungsformen richten sich daher auf die rekombinante Herstellung von Mini-, Micro-, Lys-und Glu-Plasminogen, welche jeweils an eine Signal-oder Präprosequenz gekoppelt sind, in einem Expressionsvektor, der einen konstitutiven Promotor, z. B. den GAP-Promotor enthält. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsfbrm besteht die Signalsequenz aus dem Signalpeptid oder Präpropeptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharo1nzyces cerevisiae. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor, operativ mit einer Nukleinsäure der Sequenzen Seq. ID. Nr. 7 oder 9 oder einer der Sequenzen Seq. ID. Nr. 13 oder 15 oder einer der Sequenzen Seq. ID. Nr. 50 bis 59 verbunden und in einem geeigneten Expressionsvektor exprimiert.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor operativ mit einer Nukleinsäure verbunden, welche für mindestens den funktionellen Teil der Plasminogen Sequenz kodiert. In einer besonders bevorzugten Ausfiihrungsform wird ein konstitutiver Promotor, z. B. der GAP-Promotor, operativ mit einer Nukleinsäure der Sequenzen Seq. ID. Nr. 13,15, 7 und 9 oder einer der Sequenzen Seq. ID. Nr.

50 bis 59 oder der Sequenz Seq. ID. Nr. 11 verbunden und in einem geeigneten Expressionsvektor exprimiert Glu-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq (DNASTAR)) Molekulargeicht : 88431. 67 Dalton 791 Aminosäuren 7.121 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0 : 1.351 Glycosylierungsstellen : 0-268, N-308, 0-365 (Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 AS-lang Prä-Plasminogen) Lys-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq (DNASTAR)) Molekulargeicht : 79655.71 Daltons 714 Aminosäuren 7.492 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0 : 5. 287 Glycosylierungsstellen : 0-268, N-308, 0-365 (Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 AS-lange Prä-Plasminogen) Mini-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq (DNASTAR)) Molekulargewicht 38169.63 Daltons 348 Aminosäuren 7.203 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0 : 0. 893 Keine Glycosylierungsstellen mehr Micro-Plasminogen (Daten berechnet mit dem Programm EditSeq (DNASTAR)) Molekulargewicht 27230.41 Daltons 249 Aminosäuren 7.934 Isoelektrischer Punkt bei pH 7.0 : 3.733 Keine Glycosylierungsstellen mehr.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben.

Das in Schritt a) der vorliegenden Erfindung entstandene Fusionsprodukt kann außerdem in einen für Mikroorganismen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden. Dieser Expressionsvektor wird bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend pPICZaA, B und C und pPICZ A, B und C und pGAPZaA, B und C und pGAPZA, B und C und pPIC6aA, B und C und pPIC6A, B und C sowie pA0815, pPIC3, 5K und pPIC9K. Die Einführung in den Expressionsvektor erfolgt wiederum bevorzugt durch Ligation. Das PCR-Produkt sowie der Expressionsvektor werden vorzugsweise mit den Restriktionsendonukleasen KspI und XhoI geschnitten, bevor sie mit einer T4 DNA-Ligase ligiert werden. Die ligierte Nukleinsäure kann durch Elektroporation in einen Mikroorganismus, vorzugsweise E. coli, transformiert werden und aus den so erhaltenen transformierten Stämmen kann die DNA isoliert und durch endonukleolytische Spaltung vorzugsweise mit SoI oder SfuI und KspI, getrennt werden. Die so erhaltene Nukleinsäure kann ein Plasmid sein, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe pMHS476.1, pSM54.2, pSM49.8, pSM82.1, pSM58. 1, pAC37.1, pJW9. 1, pPLGl. l, pPLG2.1, pPLG3.2, pPLG4.2, pPLG5.3, pPLG6.1, pPLG7.1, pPLG8.3, pPLG9. 1, pPLG10. 1, pPLG11. 2, pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15. 1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18. 1, pPLG19.2 und pPLG20.1. Als Primer für die oben genannte Amplifikation werden bevorzugt zwei Oligonukleotidprimer, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend N034 (Sequence ID-Nummer 1), N036 (Sequence-ID-Nummer 2), N036a (Sequence-ID-Nummer 19), N036b (Sequence-ID- Nummer 20), N036c (Sequence-ID-Nummer 21), N036d (Sequence-ID-Nummer 22), N036e (Sequence-ID-Nummer 23), N036f (Sequence-ID-Nummer 24), N036g (Sequence-ID-Nummer 25), N036h (Sequence-ID-Nummer 26), N036i (Sequence-ID-Nummer 27), N036j (Sequence- ID-Nummer 28), N057 (Sequence ID-Nummer 3), N037 (Sequence ID-Nummer 4), N035 (Sequence ID-Nummer 5) und N056 (Sequence ID-Nummer 6) eingesetzt. Die folgenden Ausführungsformen sind gemäß der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt : - Kodons, die für die Schnittstelle der Protease Kex2 kodieren und das Plasminogenfusionsgen, das die in Sequence ID-Nummer 7 oder 13 dargestellte Nukleinsäureabfolge aufweist.

- Kodons, die für die Schnittstelle der Protease Kex2 kodieren und das Plasminogenfusionsprotein, das die in Sequence ID-Nummer 8 oder 14 dargestellte Amionsäureabfolge aufweist.

- Kodons, die für die Schnittstelle der Protease Kex2 und der Protease Stel3 kodieren und das Plasminogenfusionsgen, das die in Sequence ID-Nummer 9 oder 15 dargestellte Nukleinsäureabfolge aufweist.

- Kodons, die für die Protease Kex2 und die Protease Stel3 kodieren und das Plasminogenfusionprotein, das die in Sequence ID-Nummer 10 oder 16 dargestellte Aminosäureabfolge aufweist.

Vorzugsweise wird das oben erwähnte Plasmid, das aus der oben erwähnten Gruppe bevorzugt ausgewählt ist, in einen mikrobiellen Wirt transformiert. Die Transformation kann beispielsweise durch Elektroporation durchgeführt werden. Vorzugsweise ist der verwendete Mikroorganismus ein eukaryontischer Mikroorganismus, der zur Abteilung der Pilze zählt.

Bevorzugte Mikroorganismen gehören zu den Ascomycota, bevorzugt Saccharomycotina und davon bevorzugt die Klasse der Saccharomycetes, weiter bevorzugt die Ordnung der Saccharomycetales, mehr bevorzugt die Familie der Saccharomycetaceae und davon besonders bevorzugt die Gattungen Pichia, Saccharomyces, Hansenula und Aspergillus.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die für mindestens den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz aus einem mit dem im oben beschriebenen Schritt a) entstandenen Fusionsprodukt transformierten mikrobiellen Wirtsorganismus überexprimiert und mindestens der funktionelle Teil von Plasminogen wird sezerniert, wobei er vorzugsweise ins Kulturmedium sezerniert wird.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der funktionelle Teil der Nukleinsäuresequenz von Plasminogen eine der Sequenzen ID-Nummer 60,61, 62,63, 64,65 oder 66. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform entspricht der funktionelle Teil der Nukleinsäuresequenz von Plasminogen der vollständigen Plasminogensequenz.

Vorzugsweise wird mit dem rekombinanten Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein humanes funktionelles Plasminogen hergestellt.

Dieses Plasminogen, das durch das rekombinante Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, oder das daraus durch die Einwirkung von Proteasen entstehende Plasmin kann zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Wunden, insbesondere zur Behandlung von langsam oder schlecht heilenden Wunden, für die Behandlung thrombotischer Ereignisse, oder für die Vorbeugung thrombotischer Ereignisse verwendet werden.

Zudem wurde erkannt, daß das erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen sowie das daraus erhaltene Plasmin anti-koagulative Eigenschaften aufweisen. Diese vorteilhaften Eigenschaften ermöglichen zudem die Verwendung des Plasminogens und/oder Plasmins als anti- thrombotische sowie anti-koagulative Wirkstoffe zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation. Das Plasminogen kann auch zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts und zur Wiedereröffnung (Reperfusion) verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt eingesetzt werden. Weitere Verwendungen des erfindungsgemäß hergestellten Plasminogens umfassen die Prophylaxe und Behandlung von akuter Lungenembolie, von frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, Venenthrombosen, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ 1-Mangel, Verbrennungen und Erfrierungen, Verätzungen sowie disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock.

Bevorzugt werden Plasminogen und/oder Plasmin bei diesen Indikationen zusammen mit einem Antikoagulant eingesetzt. Als Antikoagulantien eignen sich Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure.

Die vorliegende Erfindung ist daher auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, umfassend ein Plasminogen, das gemäß dem rekombinanten Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, oder das daraus entstehende Plasmin, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Zusatzstoff und/oder Lösungsmittel. Zudem können die pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise einen antikoagulativen Wirkstoff, insbesondere Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure enthalten.

Das erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen und/oder das daraus erhältliche Plasmin werden bei der äußeren Wundbehandlung bevorzugt in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche für die topische Anwendung geeignet sind. Dabei werden Plasminogen und/oder Plasmin in einer Konzentration von 0,01-500 U pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung, bevorzugt 0,1-500 U, weiter bevorzugt 0,1-250 U, ferner weiter bevorzugt 0,5-250 U pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung und insbesondere bevorzugt in einer Konzentration von 1-150 U Plasminogen und/oder Plasmin pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung verwendet. Werden anstelle von halbfesten Zubereitungen in Form von beispielsweise Salben, Pasten, Gelen usw. Pflaster oder sonstige Verbandsmaterialien verwendet, so gelten die oben angegebenen Konzentrationsbereiche pro 2 cm2 Pflasteroberfläche bzw. Oberfläche des Verbandsmaterials.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise verwendeten pharmazeutischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart in einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt. Die bevorzugten pharmazeutischen Formulierungen oder Zubereitungen liegen in einer Darreichungsform vor, die zur lokalen äußeren Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Salben, Pasten, Gele, Filme, Dispersionen, Emulsionen, Suspensionen oder spezielle Formulierungen, wie beispielsweise nanodisperse Systeme in Form von Liposomen, Nanoemulsionen oder Lipid-Nanopartikeln, sowie tensidfreie Formulierungen, polymerstabilisierte oder feststoffstabilisierte Emulsionen.

Verfahren zur Herstellung diverser Formulierungen sowie die verschiedenen Applikationsmethoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in"Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA"eingehend beschrieben.

Bei einer Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akutem Herzinfarkt sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation eignen sich die für die parenterale Applikation hergestellten Zubereitungen.

Zudem eigenen sich die pharmazeutischen Zusammensetzungen bei diversen systemischen Anwendungen umfassend den Einsatz bei akuter Lungenembolie, thrombolytischer Therapie beim akuten Herzinfarkt, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, Rekanalisierung arteriovenöser Shunts, Venenthrombosen, Wiedereröffnung (Reperfusion) verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen, Verätzungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit bietet sich bei Plasminogen-Mangel, wie z. B. erworbenem oder congenitalem Plasminogen-Mangel (homozygoter Typ-I-Plasminogen- Mangel), der z. B. zu Conjungtivitis lignosa oder Thrombophilie führen kann. Hierbei besteht die Möglichkeit, durch beispielsweise intravenöse Gabe des rekombinanten Plasminogens, einschließlich der Formen Glu-, Lys-, Mini-und Microplasminogen sowie der davon abgeleiteten Varianten, die Krankheit zu behandeln. (Heinz et al., Klin. Monatsblatt Augenheilkunde 2002,219 (3) : 156-8).

In einer weiteren Anwendungsmöglichkeit, kann bei Verabreichung von Plasminogen ein Rückgang der Pseudomembranen und die Normalisierung der Atemwege, sowie die verbesserte Wundheilung erzielt werden. Diese Applikation wurde für ein neugeborenes Kind beschrieben (The New England Journal of Medicine 1998,339, 23,1679-1686).

Somit wird das rekombinant hergestellte Plasminogen eventuell zusammen mit dem daraus gewonnenen Plasmin oder auch nur Plasmin in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche zur Prophylaxe und/oder Behandlung von akuter Lungenembolie, thrombolytischer Therapie beim akuten Herzinfarkt, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, Rekanalisierung arteriovenöser Shunts, Venenthrombosen, Wiedereröffnung (Reperfusion) verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Konjunktivitis bei Plasminogen Typ I-Mangel, Verbrennungen, Verätzungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock geeignet sind.

Das erfindungsgemäß rekombinant hergestellte Plasminogen wird bevorzugt in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche zur topischen Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen, Verletzungen und/oder Wunden, insbesondere schlecht heilender Wunden geeignet sind. Dabei wird das rekombinante Plasminogen bevorzugt zusammen mit mindestens einem Aktivator (Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise Urokinase oder Streptokinase) eingesetzt. Eine andere bevorzugte Möglichkeit besteht darin, das erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen vor seiner Verwendung ganz oder teilweise mittels eines Aktivators in Plasmin umzuwandeln und als Plasmin oder Plasmin mit Plasminogen in den hierin beschriebenen Indikationen und Formulierungen einzusetzen.

Als parenterale Applikationen kommen vor allem die intravenöse, intravasale, intraperitoneale, subkutane sowie die intramuskuläre Verabreichung in Betracht. Bei den parenteralen Formulierungen insbesondere in Form von Lösungen zur Injektion oder Infusion wird das Protein in einer Konzentration von 0,1-100 Millionen Units, bevorzugt 10 bis 100 Millionen Units pro 10 ml Lösung, weiter bevorzugt 1 bis 10 Millionen Units pro 10 ml Lösung und insbesondere bevorzugt 3 bis 5 Millionen Units pro 10 ml Lösung. Bei zur oralen Applikation geeigneten Formulierungen wird das Protein in einer Konzentration von 0,1 bis 100.000 Units pro Gramm Formulierung, bevorzugt 100 bis 80.000 Units pro Gramm Formulierung und insbesondere bevorzugt 1.000 bis 50.000 Units pro Gramm Formulierung eingesetzt.

Weitere vorteilhafte Formulierungen stellen beispielsweise Protease-enthaltende Pflaster, Verbände oder sonstige Verbandsmaterialien dar. Diese Formulierungen eignen sich insbesondere für die topische Anwendung bei der Wundbehandlung, oder zur Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen und/oder Verletzungen. Das erfindungsgemäß rekombinant hergestellte Plasminogen wird bevorzugt in den pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere den Wundheilmitteln, Pflastern sowie Verbandsmaterialien, zusammen mit mindestens einem Aktivator (Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise Urokinase oder Streptokinase) eingesetzt oder vorher in Plasmin mittels der oben beschriebenen Aktivatoren umgewandelt und als Plasmin eventuell zusammen mit Plasminogen und eventuell mit mindestens einem Aktivator in und/oder auf den pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen verwendet. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von Plasminogen, bevorzugt Plasminogen mit einem Aktivator, oder Plasmin oder Plasmin zusammen mit Plasminogen und einem Aktivator in und/oder auf Pflastern und Verbandsmaterialien, welche zur Wundbehandlung, insbesondere zur Behandlung schlecht heilender Wunden, sowie zur Behandlung von Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen oder sonstiger Verletzungen geeignet sind.

Die Verbandsmaterialien, Wundheilverbände oder Pflaster enthalten der erfindungsgemäß hergestellte Plasminogen und/oder daraus gewonnenes Plasmin in einer Konzentration von 0,01 - 500 Units Plasminogen und/oder Plasmin pro cm2 der pharmazeutischen Formulierung, bevorzugt 0,1 bis 500 Units Plasminogen und/oder Plasmin pro cm2 Verbandsmaterial bzw.

Pflaster. Weiter bevorzugt ist das Pasminogen und/oder Plasmin in einer Konzentration von 0,1-250 Units, ferner weiter bevorzugt von 0,5-250 Units und insbesondere bevorzugt von 1 - 150 Units Plasminogen und/oder ein daraus entstehendes Plasmin pro cm2 pharmazeutischer Formulierung in dem Pflaster oder Verbandsmaterial enthalten.

Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 100 llg und 1 ng Urokinase eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 10 gag und 10 ng Urokinase eingesetzt. Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 1 mg und 1, ug Streptokinase eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 300 llg und 3 u. g Streptokinase eingesetzt. Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 100 gag und 10 ng Protease aus S. griseus eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 10 ig und 100 ng Protease aus S. griseus eingesetzt. Für die Aktivierung von 1 mg Plasminogen werden zwischen 100 ig und 10 ng Protease VIII eingesetzt, bevorzugt werden zwischen 10 ug und 100 ng Protease VIII.

Vorzugsweise ist die für den funktionellen Teil des Plasminogens kodierende Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die folgenden Plasmide : Plasmid pPLGl. l Plasmid pPLG2. 1 Plasmid pPLG3. 2 Plasmid pPLG4.2 Plasmid pPLG5. 3 Plasmid pPLG6. 1 Plasmid pPLG7. 1 Plasmid pPLG8.3 Plasmid pPLG9. 1 Plasmid pPLG10. 1 Plasmid pPLG11. 2 Plasmid pPLG12. 1<BR> Plasmid pPLG13. 1 Plasmid pPLG14. 2 Plasmid pPLG15. 1 Plasmid pPLG16. 3 Plasmid pPLG17. 2 Plasmid pPLG18. 1 Plasmid pPLG19. 2 Plasmid pPLG20. 1 Plasmid pMHS476. 1 (Hinterlegungsnummer : DSM 14678) Plasmid pSM54.2 (Hinterlegungsnummer : DSM 14682) Plasmid pSM49.8 (Hinterlegungsnummer : DSM 14681) Plasmid pSM82. 1 (Hinterlegungsnummer : DSM 14679) Plasmid pSM58.1 (Hinterlegungsnummer : DSM 14680) Plasmid pAC37. 1 (Hinterlegungsnummer : DSM 15369) Plasmid pJW9. 1 (Hinterlegungsnummer : DSM 15368).

(Die Hinterlegungsnummern beziehen sich auf die Hinterlegung bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig) Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine zur Expression geeignete DNA-Sequenz, die mindestens die für den funktionellen Teil von Plasminogen kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, erhältlich durch das rekombinante Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Sie betrifft außerdem den mikrobiellen Wirtsorganismus, der das im oben beschriebenen Schritt a) erhaltene Fusionsprodukt und eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz umfasst. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, ein DNA-Molekül, oder ein RNA-Molekül, welches das in dem oben beschriebenen Schritt a) erhaltene Fusionsprodukt oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz umfasst.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Screening-Verfahren zur Identifizierung von Plasminogenaktivatoren, insbesondere Plasminogen-aktivierenden Proteasen, wobei das funktionelle Plasminogen, hergestellt gemäß dem oben beschriebenen rekombinanten Herstellungsverfahren, verwendet wird. Vorzugsweise wird hierfür nach Vorinkubation der Proteasen mit dem funktionellen Plasminogen, wie hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, die resultierende Plasminaktivität gemessen. Die resultierende Plasminaktivität kann mit einem synthetischen Peptidsubstrat gemessen werden. Besonders bevorzugt wird die resultierende Plasminaktivität mit N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA gemessen.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert, die folgendes darstellen : Fig. l : Physikalische Karte des Plasmids pMHS476.1 (5682 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl-Promotors.

Fig. 2 : Physikalische Karte des Plasmids pSM54.2 (5694 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl-Promotors.

Fig. 3 : Physikalische Karte des Plasmids pSM49.8 (5715 bp). Das humane Präplasminogen-Gen steht unter der Kontrolle des AOXl-Promotors.

Fig. 4 : Physikalische Karte des Plasmids pSM82. 1 (5913 bp).

Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2- Schnittstelle mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOXl-Promotors.

Fig. 5 : Physikalische Karte des Plasmids pSM58. 1 (5925 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Glu-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOX1-Promotors.

Fig. 6 : Physikalische Karte des Plasmids pAC37.1 (11400 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOX1-Promotors.

Fig. 7 : Physikalische Karte des Plasmids pJW9.1 (5925 bp). Das Gen des Präpropeptids des alpha-Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Lys-Plasminogen-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des GAP-Promotors.

Fig. 8 : Physikalische Karte des Plasmids pPLGl. l. Das Gen des Präpropeptids des alpha- Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Mini-Plasminogens-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des AOX1-Promotors.

Fig. 9 : Physikalische Karte des Plasmids pPLG11. 2. Das Gen des Präpropeptids des alpha- Faktors ist durch die Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3- Schnittstellen mit dem humanen Mini-Plasminogens-Gen verbunden und steht unter der Kontrolle des GAP-Promotors.

Fig. 10 : Nachweis der Fibrinolyse-Aktivität im Klärhofassay.

Als Wirtsorganismen kommen erfindungsgemäß alle Mikroorganismen in Betracht, die in der Lage sind, die Glykosylierung und, wenn gewünscht, die Sekretion von Proteinen durchzuführen. Beispielhaft seien hier genannt : S. cerevisiae, P. pastoris, P. methanolica und H. polymorpha oder der filamentöse Pilz Aspergillus sp.

Insbesondere kommt eine Verwendung des gemäß dem vorliegenden Herstellungsverfahrens hergestellten funktionellen Plasminogens bzw. Plasmins in einer pharmazeutischen Formulierung in Betracht. In einer solchen Formulierung kann das funktionelle Plasminogen auf dem Fachmann bekannte Weise mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Hilfsstoff sowie weiteren geeigneten Hilfs-oder Zusatzstoffen vermischt sein.

Die Kex2-Schnittstelle gewährleistet das Abspalten des Propeptids durch die im Golgi-Apparat lokalisierte Protease Kex2. Diese auch als Protease YscF oder als Kexin bezeichnete Protease ist Proprotein-prozessierende Serin-Protease, die C-terminal von basischen Aminosäurenpaaren schneidet (z. B. : Lys-Arg).

Die Stel3-Schnittstelle gewährleistet das Abspalten des Propeptids durch die im Golgi-Apparat lokalisierte Protease Stel3. Stel3 (auch als Protease YscVI oder Dipeptidylaminopeptidase A bezeichnet) ist im späten Golgi lokalisiert und entfernt schrittweise N-terminale Xaa-Ala Dipeptide, z. B. vom unreifen a-Faktor der Hefe S. cerevisiae.

Außer den Schnittstellen für die Proteasen Kex2 und Stel3 können weitere Schnittstellen eingefügt werden, die von im endoplasmatischen Retikulum oder im Golgi-Aparat lokalisierten Proteasen als Substrat erkannt werden.

Es ist ebenfalls möglich, ausschließlich eine für den Transport in das Endoplasmatische Retikulum verantwortliche Signalsequenz (Präpeptid) mit dem Plasminogen-Gen zu fusionieren, d. h. das Propeptid z. B. des Mating-Faktors der Hefe S. cerevisiae ist nicht zwingend nötig.

Die in den Beispielen erwähnten mikrobiologischen, molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. Als Referenz seien folgende Nachschlagewerke erwähnt : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, 1989 (10) ; Gassen & Schrimpf, Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1999 (11) ; EasySelect Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen, Groningen, Niederlande, Katalog-Nr, K1740-01. Die Pichia pastoris- Stämme und Expressionssysteme stammen ebenfalls von Invitrogen und sind im o. g.

Instruction Manual beschrieben.

Kurz gefasst handelt es sich bei pPICZA, B und C um 3.3 kb Pichia pastoris Expressionsvektoren. Die Vektoren tragen ein Zeocin-Resistenzgen für die direkte Selektion von Pichia-Transformanten. Die Vektoren tragen außerdem eine C-terminale tag-Sequenz, die eine schnelle Reinigung und den Nachweis von Fusionsproteinen ermöglicht. Bei pPICZalpha A, B und C handelt es sich um 3,6 kb Pichia pastoris Expressionsvektoren, die ebenfalls das Zeocin-Resistenzgen sowie die oben erwähnte C-terminale tag-Sequenz tragen. Zudem enthalten sie das alpha-Faktor Sekretionsignal von Saccharomyces cerevisiae für einen effizienten Transport von Proteinen ins Medium.

Das Plasminogen kann außerdem aktiviert werden. Dafür kann das Plasminogen beispielsweise mit einer Protease inkubiert werden, die mit dem erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifiziert wurde.

Vorzugsweise wird dafür das Plasminogen mit Protease aus S. griseus, mit Protease VIII oder Protease XVIII, mit Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, mit Endoproteinase Glu-C, Protease XIII, Proteinase A, Trypsin, Endoproteinase Asp-N oder Elastase inkubiert.

Es ist weiterhin denkbar, Plasminogen zu aktivieren, indem Plasminogen mit einer der Proteasen t-PA, u-PA, oder vb-PA (Vampirfledermaus-PA) inkubiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Plasminogen aktiviert, indem es mit Staphylokinase oder mit Streptokinase inkubiert wird. Streptokinase oder Staphylokinase bilden mit Plasminogen einen 1 : 1 Komplex. Durch diese Komplexbildung erfährt das im Komplex gebundene Plasminogen eine Konformationsveränderung, so dass es proteolytisch aktiv wird und in der Lage ist, Plasminogen zu Plasmin zu aktivieren.

Das gemäß dem vorliegenden rekombinanten Herstellungsverfahren hergestellte funktionelle Plasminogen oder das aktivierte funktionelle Plasmin ist in der Lage, Fibrin zu hydrolysieren.

Ferner ist es in der Lage, ProMatrixmetalloproteasen und Wachstumsfaktoren zu aktivieren.

Die Erfindung wird nachfolgend durch Beispiele näher erläutert.

Beispiel la : Amplifizierung des Lys-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle am 5'-Ende Das Plasmid pPLGKG (Forsgren et al., FEBS Lett. 1987 Mar 23 ; 213 (2) : 254-60 (2)), das das Gen für Prä-Glu-Plasminogen enthält, wurde aus dem Stamm E. coli HB101 (pPLGKG) unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Midi-Kits (QIAGEN, Hilden) isoliert. 150 ng pPLGKG- DNA wurden mit 10 U der Restriktionsendonuklease EcoRI (Roche, Mannheim) linearisiert und anschließend mit dem QIAquick PCR-Purification Kit (QIAGEN, Hilden) gereinigt. Zur Amplifizierung des Plasminogen-Gens wurde das Oligonukleotid-Primer-Paar N034 (Seq. ID No. 1) und N036 (Seq. ID No. 2) verwendet. Der Oligonukleotid-Primer N036 trägt neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-Schnittstelle. Zur PCR wurden 0,5 U Pwo-DNA-Polymerase (Hybaid, Heidelberg), je 400 nM der Oligonukleotid- Primer, je 200 uM dNTP, 3 ng linearisierte pPLGKG-DNA und der zugehörige Reaktionspuffer in einem Endvolumen von 50 ul eingesetzt. Die Primer-Binde-Temperatur betrug 58°C.

Das entstandene PCR-Produkt wurde durch Agarose-Gelelektrophorese auf die erwartete Größe hin untersucht und mit dem QIAquick PCR-Purification Kit gereinigt.

Beispiel lb : Klonierung des Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZaA 400 ng des PCR-Produkts wurden mit je 10 U der Restriktionsendonukleasen KspI und XhoI (Roche, Mannheim) geschnitten. 300 ng DNA des Plasmids pPICZaAA (Invitrogen, Groningen, Niederlande), das die Präpropeptidsequenz des a-Faktors von S. cerevisiae enthält, wurden ebenfalls mit 10 U der Restriktionsendonukleasen Kspl und XhoI geschnitten. Die so behandelte DNA wurde in einem 0,9 %-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt und die erhaltenen Fragmente wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Die Vektor-DNA wurde mit der Insert-DNA vereinigt und mit 1 U T4- DNA-Ligase (Roche, Mannheim) bei 4°C über Nacht ligiert.

Die DNA des Ligierungs-Ansatzes wurde danach mit dem QIAquick PCR-Purification Kit gereinigt und zur Transformation von E. coli JM109 durch Elektroporation eingesetzt.

Die elektroporierten E. coli JM109-Zellen wurden 1 h bei 37°C in 1 ml SOC-Medium inkubiert, anschließend auf LB-Agar-Festmedium mit 20 ug/lll Zeocin (Invitrogen, Groningen, Niederlande) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Aus einem der so erhaltenen E. coli-Stämme wurde mit dem QIAGEN Plasmid Mini-Kit (QIAGEN, Hilden) die DNA isoliert und 300 ng nach endonukleolytischer Spaltung mit den Enzymen XhoI und KspI durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Das isolierte Plasmid beinhaltete ein Fragment der erwarteten Größe und wurde als pMHS476.1 bezeichnet (Abb. l).

Die korrekte Sequenz des Fusionsgens aus dem Präpropeptid-Gen des alpha-Faktors der Hefe Saccharonyces cerevisiae und dem Lys-Plasminogen-Gen sowie den Kodons für die Schnittstellen-Sequenz der Protease Kex2 wurde durch Sequenzanalyse bestätigt (Seq. ID No. 7).

Beispiel le : Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pMHS476.1 Mit dem QIAGEN Plasmid Midi-Kit wurde aus dem Stamm E. coli JM109 (pMHS476. 1) Plasmid-DNA des Plasminogen-Expressionsvektors pMHS476.1 isoliert. 10 llg pMHS476.1- DNA wurden mit 100 U PmeI (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert und nach dem im EasySelect Pichia Expression Kit Instruction Manual wiedergegebenen Protokoll zur Elektroporation von Pichia pastoris KM71H his 4 : : HIS 4 arg 4 aoxl : : ARG 4 Genotyp von Pichia pastoris Y-11430 (Northern Regional Research Laboratories, Peoria, USA) eingesetzt.

Die auf YPDS-Festmedium (EasySelect Pichia Expression Kit Instruction Manual) mit 1001lg/ml Zeocin nach drei bis vier Tagen gewachsenen Kolonien wurden auf YPD- Festmedium mit 100 ug/ml Zeocin ausgestrichen und zur Beimpfung von Flüssigkulturen eingesetzt. Die Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pMHS476. 1-1/a bezeichnet, wobei"a"für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel ld : Anzucht von Pichia pastoris KM7li/pMHS476. 1-1/1 bis-1/3 und Induktion der Plasminogen-Gen-Expression Zur Herstellung der Vorkulturen wurden 100 ml BMGY-Medium (EasySelect Pichia Expression Kit Instruction Manual) in 1 1 Schikane-Kolben bei 28°C und 250 rpm bis zu einer OD6oo = 20-30 inkubiert. Anschließend wurden die Vorkulturen bei 4645 g und 4°C 10 min zentrifugiert. Die so geernteten Zellen wurden in BMMY-Medium (0,5 % Methanol) resuspendiert, um eine Biofeuchtmasse-Konzentration von 80 g/1 zu erhalten. 60 ml dieser Hauptkulturen wurden in 300 ml Schikanekolben bei 28°C und 250 rpm für 118 h inkubiert.

Nach 24 und 72 Stunden wurden 2% Methanol zugegeben. Die Schikanekolben und die hohe Drehzahl von 250 rpm wurden verwendet, um einen ausreichenden Sauerstoffeintrag zu gewährleisten, der bei Verwendung des AOX-Promotors notwendig ist.

Beispiel le : Messung der Plasminogen-Aktivität im Überstand der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase Die Proben der Hauptkulturen wurden 10 min bei 16 000 g zentrifugiert. 300 ul des Überstands wurden 20 min bei 37°C mit 1 gl Streptokinase (S8026) (Sigma, Deisenhofen) inkubiert. Zu 750 ul 100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8,0, 36 mM CaCl2, 0,9% NaCl wurden 100 ul N- Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA-Lösung (9,5 mg gelöst in 75 mg Glycin/10 ml, 2% Tween@ 20) pipettiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Zum Start der Reaktion wurden 250 nl des mit Streptokinase vorbehandelten Überstands zugegeben und bei 37°C weiter inkubiert. Die Extinktionszunahme wurde photometrisch bei 405 nm gemessen. Zur Bestimmung von Kontrollwerten wurden Überstände einer parallel angezogenen P. pastoris KM71H-Kultur sowie Überstände ohne Streptokinase-Aktivierung verwendet. Für die nach 72 h Induktion gezogenen Proben wurden folgende Aktivitätswerte bestimmt (1 U/1 = 1 gmol N-Tosyl-Gly- Pro-Lys-pNA-Umsatz pro Minute pro Liter Kulturüberstand) : KM71H/pMHS476. 1-1/l : 2 U/1 ; KM71H/pMHS476. 1-1/2 : 2 U/1 ; KM71H/pMHS476. 1-1/3 : 1 U/1. Nach 118 h Induktion konnten folgende Aktivitätswerte bestimmt werden : KM71H/pMHS476. 1-1/l : 7 U/l ; KM71H/pMHS476. 1-1/2 : 9 U/1 ; KM71H/pMHS476. 1-1/3 : 8 U/l.

Beispiel 2a : Amplifizierung des Lys-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons einer Kex2-Schnittstelle und zweier Stel3-Schnittstellen am 5'-Ende Die Amplifizierung des Lys-Plasminogen-Gens zur Klonierung in den Vektor pPICZaA mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N057 (Seq. ID No. 3) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Der Oligonukleotid-Primer N057 trägt neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2- Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen.

Beispiel 2b : Klonierung des wie in Beispiel 2a beschrieben amplifizierten Lys- Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZaA Die Klonierung des Lys-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZoA zur Herstellung eines Fusionsgens aus dem Gen des Präpropeptids des alpha-Fakors der Hefe S. cerevisiae und dem humanen Plasminogen-Gen mit Einbau der Kodons für die Schnittstellen der Proteasen Kex2 und Stel3 wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt. Das erhaltene Plasmid wurde als pSM54.2 bezeichnet (Abb. 2). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No.

9) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.

Beispiel 2c : Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pSM54.2 Wie in Beispiel lc für pMHS476. 1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM54.2 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM54. 2-1/a bezeichnet, wobei"a"wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel 2d : Kultivierung von Pichia pastoris KM71H/pSM54. 2-1/1 bis-1/3 und Induktion des Plasminogen-Gens Die Herstellung der Vorkulturen und der Hauptkulturen sowie die Induktion mit Methanol erfolgte analog zu den in Beispiel 1d beschriebenen Bedingungen.

Beispiel 2e : Messung der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase Die Plasminogenaktivität nach Aktivierung mit Streptokinase wurde wie in Beispiel le für KM71H/pMHS476. 1-1/1 bis-1/3 beschrieben bestimmt. Für die nach 72 h Induktion gezogenen Proben wurden folgende Aktivitätswerte erhalten : KM71H/pSM54. 2-1/1 : 2 U/1 ; KM71H/pSM54. 2-1/2 : 8 U/l ; KM71H/pSM54. 2-1/3 : 6 U/1. Nach 118 h Induktion konnten folgende Aktivitätswerte bestimmt werden : KM71H/pSM54. 2-l/l : 8 U/1 ; KM71H/pSM54.2- 1/2 : 17 U/l KNI71H/pSM54. 2-1/3 : 13 U/1.

Beispiel 3a : Amplifizierung des Plasminogen-Gens mit eigener Signalsequenz und Klonierung in den Vektor pPICZA ; Transformation von Pichia pastoris Die Amplifizierung des Plasminogen-Gens einschließlich der für das eigene Signalpeptid kodierenden Sequenz (Prä-Plasminogen) zur Klonierung in den Vektor pPICZA wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N037 (Seq. ID No. 4) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt.

Die Klonierung des Prä-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZA wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt, wobei sowohl der Vektor als auch das PCR-Produkt mit den Restriktionsendonukleasen SfuI und KspI geschnitten wurden. Das erhaltene Plasmid wurde als pSM49.8 bezeichnet (Abb. 3). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 11) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.

Wie in Beispiel Ic für pMHS476. 1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM49.8 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM49. 8-1/a bezeichnet, wobei"a"wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel 4a : Amplifizierung des humanen Glu-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons einer Kex2-Schnittstelle und Klonierung in den Expressionsvektor pPICZa (alpha) A ; Transformation von Pichia pastoris Die Amplifizierung des Glu-Plasminogen-Gens zur Klonierung in den Vektor pPICZaA mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N035 (Seq. ID No. 5) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Der Oligonukleotid-Primer N035 trägt neben den zum Glu- Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-Schnittstelle.

Die Klonierung des Glu-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZaA zur Herstellung eines Fusionsgens aus dem Gen des Präpropeptids des alpha-Fakors der Hefe S cerevisiae und dem humanen Glu-Plasminogen-Gen mit Einbau der Kodons für die Schnittstellen der Protease Kex2 wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt.

Das erhaltene Plasmid wurde als pSM82.1 bezeichnet (Abb. 4). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 13) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.

Wie in Beispiel le für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM82.1 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM82.1/a bezeichnet, wobei"a"wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel 5a : Amplifizierung des humanen Glu-Plasminogen-Gens mit Einbau der Kodons einer Kex2-Schnittstelle und zweier Stel3-Schnittstellen am 5'-Ende und Klonierung in den Expressionsvektor pPICZaA ; Transformation von Pichia pastoris Die Amplifizierung des Glu-Plasminogen-Gens zur Klonierung in den Vektor pPICZaA mit Einbau der Kodons für eine Kex2-Schnittstelle und zweier Stel3-Schnittstellen wurde mit den beiden Oligonukleotid-Primern N034 und N056 (Seq. ID No. 6) unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Der Oligonukleotid-Primer N056 trägt neben den zum Glu-Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-und die Stel3-Schnittstellen.

Die Klonierung des Glu-Plasminogen-Gens in den Vektor pPICZaA zur Herstellung eines Fusionsgens aus dem Gen des Präpropeptids des alpha-Fakors der Hefe S. cerevisiae und dem humanen Glu-Plasminogen-Gen mit Einbau der Kodons für die Schnittstellen der Proteasen Kex2 und Stel3 wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt.

Das erhaltene Plasmid wurde als pSM58.1 bezeichnet (Abb. 5). Die korrekte Sequenz (Seq. ID No. 15) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.

Wie in Beispiel lc für pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pSM58.1 transformiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pSM58.1/a bezeichnet, wobei"a"wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel 6a : Einfügen des Lys-Plasminogen-Gens aus pSM54.2 in den Vektor pPIC9K 150 ng des Vektors pPIC9K (Invitrogen, Groningen, Niederlande) wurden mit je 10 U der Restriktionsendonukleasen SacI und NotI (beide Roche Diagnostics, Mannheim) geschnitten.

300 ng des Plasminogen-Expressionsplasmids pSM54.2 (siehe Beispiel 2b) wurden ebenfalls mit den Enzymen SacI und NotI geschnitten. Die so behandelte DNA wurde durch Gelelektrophorese mit einem 0,9%-igen Agarosegel getrennt. Das jeweils größere Fragment wurde mithilfe des QIAgen Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Die beiden Fragmente wurden vereinigt und mit 1 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 4°C ligiert.

Die Transformation von E. coli DH5a, die Isolierung und die Charakterisierung des resultierenden Plasmids erfolgte analog zur Beschreibung in Beispiel lb, wobei anstelle des Antibiotikums Zeocin das Antibiotikum Ampicillin zur Selektion von Transformanten verwendet wurde. Das derart konstruierte Plasmid wurde mit pAC37. 1 (Abb. 6) bezeichnet.

Beispiel 6b : Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pAC37.1 Wie in Beispiel lc für die Transformation von Pichia pastoris KM71H mit pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71 mit dem mit der Restriktionsendonuklease SalI linearisierten Plasmid pAC37.1 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf dem Histidin-freien Medium MD-Agar (Multi-Copy Pichia Expression Kit Instruction Manual) ausplattiert und inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/a bezeichnet, wobei"a"wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel 6c : Kultivierung von Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 und Induktion des Plasminogen-Gens Die Herstellung der Vorkulturen und der Hauptkulturen sowie die Induktion mit Methanol erfolgte analog zu den in Beispiel ld beschriebenen Bedingungen. Die Induktion erfolgte über 216 h. Begonnen wurde mit einer Methanolkonzentration von 0,5%, nach 24 h und danach im Abstand von 48 h wurden 2% Methanol nachgefiittert.

Beispiel 6d : Messung der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase Die Plasminogenaktivität nach Aktivierung mit Streptokinase wurde wie in Beispiel le für KM71H/pMHS476. 1-1/1 bis-1/3 beschrieben bestimmt. Für die nach 120 h Induktion gezogenen Probe 120 U/1 Aktivität erhalten. Nach 216 h Induktion konnten 190 U/1 Aktivität gemessen werden.

Beispiel 6e : Induktion von Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 in Minimal-Medium (BSM) und Messung der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase Nach der Anzucht von Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 in BMGY-Komplex-Medium (siehe Beispiel 1 d) wurden 80 g der abzentrifugierten Zellen in 100 ml BSM-Minimal-Medium für die Induktionsphase resuspendiert. Das BSM (Basal Salts Medium)-Minimal-Medium ist folgendermaßen zusammengesetzt : H3P04, 85 % : 26,0 mL/L ; CaC12-2H20 : 0,6 g/L ; K2S04 : 18,0 g/L ; MgS04-7H20 : 14,0 g/L ; KOH : 4,0 g/L ; Glycerin : 20 mL/L ; Antischaum : 1,0 mL/L ; Spurenlösung : 8,0 mL/L ; Biotinlösung (0,2 g/L) : 8, 0 mL/L.

Zusammensetzung der Spurenlösung : H2S04 : 5,0 mL/L ; CuS04-5H20 : 6,0 g/L ; KI : 0,08 g/L ; MnS04-H20 : 3,0 g/L ; Na2Mo04 : 0,2 g/L ; H3B03 : 0,02 g/L ; CoC12 : 0, 5 g/L ; ZnC12 : 20,0 g/L ; FeS04-7H20 : 65,0 g/L.

Zur Induktion wurden täglich 2% Methanol zugegeben. Die Plasminogenaktivität nach Aktivierung mit Streptokinase wurde wie in Beispiel le für KM71H/pMHS476. 1-1/1 bis-1/3 beschrieben bestimmt. Nach 120 Stunden Induktion wurden 193 U/1 Plasminogen-Aktivität bestimmt, nach 168 h konnten 289 U/L gemessen werden.

Beispiel 6f : Nachweis der Plasminogen-Aktivität in den Proben der Hauptkulturen nach Aktivierung mit Streptokinase im Fibrinolyse-Klärhof-Test Zur Vorbereitung des Fibrinolyse-Klärhof-Tests (Stack, M. S., Pizzo, S. V., und Gonzalez- Gronow, M. (1992) : Effect of desialylation on the biological properties of human plasminogen.

Biochem. J. 284,81-86) (13) wurden 1,5 g GTG-Low-Melting-Agarose in 75 ml 50 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4 durch Aufkochen geschmolzen. 35 ml einer Fibrinogen- Lösung (225 mg/37,5 ml 50 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4) wurden blasenfrei mit 3 5 0 lil Thrombinlösung (10 U/ml in 50 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4) vermischt, in die Agarose-Lösung eingerührt und in eine Petrischale gegossen. Nach Erstarren des Fibrinagars wurden 1 mm große Löcher in den Agar gestochen.

Um die Fibrinolyse-Aktivität des rekombinant hergestellten Plasminogens nach Streptokinase- Aktivierung nachzuweisen, wurden in die Löcher je 20 gel folgender Lösungen pipettiert und 20 h bei 37°C inkubiert : 1 : 0,5 mg/ml Plasminogen (Roche, Mannheim) 2 : Kulturüberstand KM71/pAC37. 1-3/1 aus Beispiel 6e 3 : 0,5 mg/ml Plasminogen, Streptokinase-aktiviert 4 : Kulturüberstand KM71/pAC37. 1-3/1 aus Beispiel 6e, Streptokinase-aktiviert 5 : 0,25 mg/ml Plasminogen, Streptokinase-aktiviert 6 : Kulturüberstand KM71/pAC37. 1-3/1 aus Beispiel 6e, 1 : 2 verdünnt, Streptokinase- aktiviert 7 : 0,125 mg/ml Plasminogen, Streptokinase-aktiviert 8 : Kulturüberstand KM71H, wie in Beispiel 6e für KM71/pAC37. 1-3/1 beschrieben hergestellt, Streptokinase-aktiviert Zur Aktivierung mit Streptokinase wurden zu 40 Ill der jeweiligen Lösungen 2 nl Streptokinase (100 U/lll, Sigma, Deisenhofen) pipettiert und bei 37°C 60 min inkubiert.

Die durch fibrinolytische Aktivität entstandenen Klärhöfe sind in Abb. 8 gezeigt.

Beispiel 6g : Reinigung des rekombinant in Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 hergestellten Plasminogens durch Affinitätschromatographie 50 ml des Kulturüberstands von Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 aus Beispiel 6c/6d wurde bei 4°C gegen 4 L 50 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,5 dialysiert. Nach 24 h wurde der Dialysepuffer gewechselt und weitere 24 h dialysiert. Das Dialysat wurde anschließend durch einen 0, 02, um Filter gepresst und danach auf eine mit 50 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,5 äquilibrierte Lysin-SepharoseTM 4B-Säule (Durchmesser : 16 mm, Höhe : 95 mm) (Amersham Biosciences) aufgetragen. Mit 50 mM Natrium Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,5 M NaCl wurden unspezifisch gebundene Proteine von der Säule gewaschen. Das gebundene Plasminogen wurde mit 50 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,5, 0,01 M s-Aminocapronsäure eluiert. Einzelne Proben wurden durch 7,5%-ige SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung analysiert (Fig.

11). Das in den Fraktionen enthaltene rekombinante Plasminogen befindet sich im Gel auf der Höhe des als Referenz aufgetragenen human-Plasminogens (s. Fig. 11).

Fig. 11 zeigt ein 7,5 % iges SDS-PAGE der Reinigungsfraktionen aus Beispiel 6g.

In Fig. 11 haben die verwendeten Abkürzungen folgende Bedeutungen : M : Größenstandard (von oben nach unten : 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa. ) D : Dialysat, N : nichtbindende Fraktion, W : Waschfraktion, F1-F5 Plasminogenhaltige Elutionsfraktionen, Plg : Plasminogen (American Diagnostica, Pfungstadt).

Beispiel 6h : Fermentation von Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 zur Evaluierung des pH-Wertes und des Substrat-Einflusses 50 ml YEP-G-Medium (10 g/1 Hefeextrakt, 20 g/1 Caseinpepton, 20 g/1 Glycerol) in einem 11- Weithalskolben ohne Schikanen wurden mit 2 ml Glycerolkryokultur Pichia pastoris KM71/pAC37. 1-3/1 beimpft und 9 h bei 30°C und 300 rpm inkubiert. 5 ml dieser Kultur wurden verwendet, um 50 ml MG-Medium (5 g/l Yeast-Nitrogen-Base w/o amino acids, 20 g/1 Glycerol, 2,5 ml/1 Biotinlösung (0, 2g/1)) in einem 1 1 Weithalsschüttelkolben ohne Schikanen zu inokulieren. Diese zweite Vorkultur wurde bei 30°C und 300 rpm für 16 h inkubiert. Die Hauptkultur wurde in der Multifermenteranlage"stirrer-pro" (DASGIP, Jülich) fermentiert, die die parallele Fermentation von vier Kulturen bei unterschiedlichen Bedingungen erlaubt. Dazu wurden je 150 ml BSM-Medium (siehe Beispiel 6e) mit 15 ml der zweiten Vorkultur inokuliert. Die Fermentationen wurden bei pH 6 gestartet, der Ziel-pH-Wert wurde nach Beginn der Substratdosierung angesteuert. Die unterschiedlichen Bedingungen und Ergebnisse der Parallelfermentationen sind in Tab. l dargestellt.

Tabellel Versuch pH Substrat Feedrate OD60o Plasminogenkonzentration 1 6 Methanol Profil 187 1, 4 mg/1 II 7 Methanol Profil 160 6, 1 mg/1 III 6 Methanol/Glycerol 1 ml/h 270 10,1 mg/1 IV 6 Methanol Profil 130 3,4 mg/1 In Versuch IV wurde dem Medium 30 g/1 Pepton zugegeben. Vor dem Beginn der Methanoldosierung wurde für 4 h mit einer konstanten Rate von 24 ml/h Glycerol-Feedmedium (500 g/1 wasserfreies Glycerol, 10 ml/1 Spurenlösung, 10 ml/1 Biotinlösung [siehe Beispiel 6e]) zudosiert. Für das Profil in den Versuchen I, II und IV wurde folgender Term in als Dosierfunktion eingegeben : f (x) =Pl+ (P2/l+exp (-P3 (t-P4)))) + (P5/ (l+exp (-P6 (t-P7)))) mit P1=0 ; P2=0,7 ; P3=0,2 ; P4=15 ; P5=P6=P7=0. Aus Tabelle 1 wird ersichtlich, dass die Plasminogenkonzentrationen bei neutralem pH-Wert bzw. gemischter Glyerol/Methanoldosierung am höchsten ist.

Beispiel 7a : Einfügen des Lys-Plasminogen-Gens aus pAC37.1 in den Vektor pGAPZaA 150 ng des Vektors pGAPZoA (Invitrogen, Groningen, Niederlande) wurden mit je 10 U der Restriktionsendonukleasen SoI und NotI (beide Roche Diagnostics, Mannheim) geschnitten.

300 ng des Plasminogen-Expressionsplasmids pAC37.1 (siehe Beispiel 6a) wurden ebenfalls mit den Enzymen SoI und NotI geschnitten. Die so behandelte DNA wurde durch Gelelektrophorese mit einem 0,9%-igen Agarosegel getrennt. Das 2715 bp große Plasminogen- Gen-Fragment aus pAC37.1 sowie das 3073 bp große Vektorfragment aus pGAPZaA wurden mithilfe des QIAgen Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Die beiden Fragmente wurden vereinigt und mit 1 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 4°C ligiert.

Die Transformation von E. coli DH5a, die Isolierung und Charakterisierung des resultierenden Plasmids erfolgte analog zur Beschreibung in Beispiel lb. Das derart konstruierte Plasmid wurde mit pJW9. 1 (Abb. 7) bezeichnet.

Beispiel 7b : Transformation von Pichia pastoris mit dem Plasmid pJW9.1 Wie in Beispiel lc für die Transformation von Pichia pastoris KM71H mit pMHS476.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem mit der Restriktionsendonuklease Binai linearisierten Plasmid pJW9.1 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf YPDS- Agar mit 100, ug/ml Zeocin (EasySelectTM Pichia Expression Kit Instruction Manual) ausplattiert und inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pJW9.1-a bezeichnet, wobei"a"wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Beispiel 7c : Fermentation von Pichia pastoris KM71H/pJW9. 1-3 zur Evaluierung des pH- Wertes bei und der Glycerol-Zufütterungs-Rate Die Vorkulturen und die Fermentation im"Stirrer-pro"wurden wie in Beispiel 6i beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tagelle 2 dargestellt.

Tabelle 2 Versuch pH Substrat Feedrate OD600 Plasminogenkonzentration 1 6,5 Glycerol 1 ml/h 220 18,6 mg/1 II 7,0 Glycerol 1 ml/h 203 22, 2 mg/1 111 6,5 Glycerol 0,5 ml/h 142 10,1 mg/1 IV 7,0 Glycerol 0,5 ml/h 99 3,8 mg/1 Auch bei Glycerol-Fütterung wurden durch Fermentation bei neutralem pH-Wert die besten Ausbeuten erhalten, wobei der Einfluss der Substratdosierung (Feedrate) auf die Produktbildung deutlich zu sehen ist.

Beispiel 7d : Fermentation von Pichia pastoris KM71H/pJW9. 1-3 50 ml YEP-G-Medium (10 g/1 Hefeextrakt, 20 g/1 Caseinpepton, 20 g/1 Glycerol) in einem 1 1- Weithalskolben ohne Schikanen wurden mit Pichia pastoris KM71H/pJW9.1-3 beimpft und 9 h bei 30°C und 300 rpm inkubiert. 10 ml dieser Kultur wurden verwendet, um. 40 ml MG- Medium (5 g/1 Yeast-Nitrogen-Base w/o amino acids, 20 g/1 Glycerol, 2,5 ml/1 Biotinlösung (0, 2g/1)) in einem 1 1 Weithalsschüttelkolben ohne Schikanen zu inokulieren. Diese Kultur wurde bei 30°C und 300 rpm für 16 h inkubiert.

3 1 BSM-Medium (siehe Beispiel 6e) wurden mit 30 ml dieser Kultur in einem 7,5 1 Laborfermenter (Typ Labors, Infors AG, CH) beimpft. Die Fermentation wurde bei 25°C und einer konstanten Begasungsrate von 3,2 1/min durchgeführt. Nach 24 h wurde Glycerollösung (500g/l Glycerol, 10 ml/l Spurenlösung, 10 ml/l Biotinlösung [siehe Beispiel 6e] ) zudosiert.

Die Dosierungsrate wurde von 10 ml/h im Verlauf der Fermentation schrittweise auf 45 ml/h erhöht. Nach 250 h konnten 1375 U/1 Plasminogen-Aktivität nach Streptokinase-Aktivierung gemessen werden.

Beispiel 8 : Identifizierung von Plasminogenaktivatoren 24 im Handel erhältliche Proteasen wurden auf Ihre Eignung zur Plasminogen-Aktivierung getestet. Die Versuche dazu wurden in 100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8,0, 36 mM CaCl2, 0,9% NaC1 durchgeführt.

Die in pulveriger Form gelieferten Proteasen wurden in Puffer gelöst, die in Lösung gelieferten Proteasen wurden direkt eingesetzt bzw. bei Bedarf mit Puffer verdünnt. 25 ul der Protease- Lösungen wurden mit 25 p1 Plasminogen gemäß der vorliegenden Erfindung (20 mg/ml) vermischt und bei 37°C 10 min inkubiert. Anschließend wurde die Plasmin-Aktivität bzgl. des Substrats N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA bestimmt. Dazu wurden zu 850 ul Puffer 200 ul Substratlösung (9,5 mg N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA, gelöst in 75 mg Glycin/10 ml, 2% Tween 20) pipettiert, mit den 50 ul des vorinkubierten Plasminogen-Protease-Gemisches versetzt und weiter bei 37°C inkubiert. Die Zunahme der Extinktion wurde photometrisch bei 405 nm gemessen. Zur Messung der durch die Proteasen bedingten Extinktionszunahmen wurden Kontrollen durchgeführt, bei denen anstelle des vorinkubierten Plasminogen- Proteasegemisches ein ebenfalls vorinkubiertes Puffer-Proteasegemisch verwendet wurde.

Die Proteasen Protease aus S. griseus, Protease VIII, Protease XXIII, Protease XIX, Protease XVIII, Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, Glu-C, Protease XIII, Chymopapain, Chymotrypsin, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase A wurden von Sigma, Deisenhofen bezogen ; Trypsin, Papain, Asp-N, Dispase I, Lys-C, Thrombin und Elastase stammen von Roche, Mannheim, die Proteinase K wurde von QIAGEN, Hilden geliefert. Die hergestellten Protease-Stammlösungen hatten die in der Tabelle angegebenen Proteinkonzentrationen. Der Verdünnungsfaktor F gibt an, in welchem Verhältnis die Stammlösungen für die Messungen verdünnt wurden.

Folgende Plasmin-Aktivitäten konnten nach Aktivierung bestimmt werden (1 U/mg = 1 gmol N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA-Umsatz pro Minute pro mg Protein) : Tabelle3 Protease Plasmin-Aktivität nach Aktivierung cProtein [mg/mll F Protease aus S. griseus 613,3 U/mg 0,77 1000 Protease VIII 9 U/mg 3, 58 1000 Protease XXIII * 17, 8 50000 Protease XIX * 2, 78 100 Protease XVIII 0,7 U/mg 1,79 100 Ficin 0,01 U/mg 0, 81 1 Metalloendopeptidase 8,9 U/mg 0, 01 1 Clostripain 1,7 U/mg 0, 25 1 Endopoteinase Glu-C 0,6 U/mg 0, 81 1 Protease XIII 0,01 U/mg 0, 43 1 Chymopapain * 2, 02 1 Chymotrypsin * 0, 14 1 Protease X * 2, 01 1 Bromelain * 0, 81 Kallikrein * 0, 56 1 Proteinase A 0,02 U/mg 0, 36 1 Trypsin 11 kU/mg 3,40 100000 Papain * 0, 64 10 Endoproteinase Asp-N 4,3 U/mg 0, 004 1 Dispase I * 0, 2 1 Endoproteinase Lys-C * 0, 01 Thrombin 83, 0 U/mg 0,59 500 Elastase 0,63 U/mg 0,36 5 Proteinase K * 3, 60 100 * Für die Proteasen Protease XXIII, Protease XIX, Chymopapain, Endoproteinase Lys-C, Chymotrypsin, Papain, Dispase I, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase K konnte keine Plasminogen-Aktivierung nachgewiesen werden.

Beispiel 9 : Pharmazeutische Formulierungen Das in den folgenden Beispielen verwendete rekombinante funktionelle Plasminogen wurde mit Hilfe des erfinderischen Herstellungsverfahren erhalten. Hierbei bezieht sich die Bezeichnung"Plasminogen"sowohl auf rekombinantes Micro-, Mini-, Lys-oder Glu- Plasminogen und die Bezeichnung"Plasmin"auf Plasmin, das durch proteolytische Spaltung von rekombinantem Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen gewonnen wurde. Die Aktivierung von Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen kann unter Verwendung derselben Plasminogenaktivatoren, insbesondere Plasminogen-aktivierenden Proteasen, wie oben beschrieben erhalten werden ist aber nicht beschränkt darauf, wobei das Verhältnis an Units Aktivator zu Units Plasminogen (Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen) ungefähr 1 : 1000 beträgt.

Das Plasminogen kann sowohl proteolytisch, d. h. durch die Proteasen tissue-Plasminogen- Aktviator, Urokinase oder die im Patent beschriebenen Proteasen Protease VIII oder Protease aus S. griseus aktiviert werden, als auch durch Komplexierung mit Streptokinase oder Staphylokinase.

Beispiel 9a : Pharmazeutische Formulierungen Hydrogele Basisformulierung für Hydrogele (100g) Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Hydroxyethylcellulose 10 000 3, 5 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 4%, PHB-Ester 0, 1 %). gereinigtes Wasser ad 100,0 Die Hydroxyethylcellulose bzw. stattdessen Hypromellose bzw. Methylcellulose können alternativ in einer Menge von 0,5-15, 0 g eingesetzt werden.

Gel Plasminogen 1000 U Plasminogenaktivator (en) 1 U Glycerol (85%) 150,0 g Hydroxyethylcellulose 10 000 32,5 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 4%, PHB-Ester 0, 1%) Ringerlösung ohne Laktat zu 1000, 0g alternativ : 100g enthalten : Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Hydroxyethylcellulose 30 000 2,5 g Glycerol 85% 10,0 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 2%, PHB-Ester 0,1%) gereinigtes Wasser ad 100,0 alternativ : 100g Gel enthalten : Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Polyacrylsäure 1 g Propylenglykol 8 g Mittelkettige Triglyceride 8 g Diethylamin (zur pH-Einstellung) q. s. optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 2%, PHB-Ester 0, 1 %) 2-Propanol 0-1 g Wasser zu 100g Hydrophile Salbe (Macrogolsalbe) 50g enthalten Plasminogen 50 U Plasminogenaktivator (en) 0,05 U Macrogol 400 30,0 g Macrogol 4000 10,0 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 2%, PHB-Ester 0, 1%) gereinigtes Wasser ad 50,0 g alternativ : wasserfreie Macrogolsalbe 100g enthalten : Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0, 1 U Macrogol 300 50 g Macrogol 1500 zu 100 g alternativ Wasseraufnehmende Salbe Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Cetylstearylalkohol 29 g Paraffin, dickflüssiges 34 g Vaselin, weißes zu 100 g Hydrophobe Salbe Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Vaseline 80,0 g Paraffin dünnflüssig zu 100,0 g Hydrophobe Paste Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Hypromellose 400 20 g Vaseline, weißes zu 100 g alternativ Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Carbomer (z. B. Carbopol 974p) 15 g Paraffin, dickflüssiges 40 g weißes Vaselin zu 100,0 g Creme : Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Mittelkettige Triglyceride 20 g Emulgierender Cetylstearylalkohol 10 g Lanolin 10 g Sorbitol 10 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 2%, PHB-Ester 0, 1%) Wasser gereinigtes zu 100 g Nichtionische hydrophile Creme Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Cetylalkohol 20 g 2-Ethyllauromyristat 10 g Glycerol 85% 6 g Kaliumsorbat 0,14 g Citronensäure 0,07 g Wasser ad 100 g Nichtionische Creme Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Polysorbat 60 5 g Cetylstearylalkohol 10 g Glycerol 85% 10 g Vaselin, weißes 25 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 2%, PHB-Ester 0, 1%) Wasser ad 100 g Liposomale Formulierung Plasminogen 100 U Plasminogenaktivator (en) 0,1 U Sojalecithin, Hühnerlecithin 15 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0, 2%, PHB-Ester 0, 1%, bzw. Diazodinylharnstoff 1-2g) Wasser zu 100,0 g Kapsel eine Kapsel mit 0,25g Pulver/Granulat enthält : Plasminogen 5 U Plasminogenaktivator (en) 0,005 U Stärke 0,1 g Siliciumdioxid 0,02 g Magnesiumstearat 0,002 g Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 0,015 g Triethylcitrat 0, 0005 g Talkum 0,001 g Cellulose, mikrokristalline zu 0,25 g alternativ eine Kapsel mit 0,25g Pulver/Granulat enthält : Plasminogen 5 U Plasminogenaktivator (en) 0,005 U Siliciumdioxid 0,01 g Magnesiumstearat 0,002 g Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 0,015 g Triethylcitrat 0,0001 g Talkum 0.001 mg Mannitol zu 0,25 g Tablette 100mg Tablettengranulat enthalten Plasminogen 5 U Plasminogenaktivator (en) 0,005 U Stärke 30 mg Siliciumdioxid 2 mg Magnesiumstearat 4 mg Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 5 mg Triethylcitrat 0-1 mg Talkum 0.0001 mg Cellulose mikrokristalline zu 100 mg Pellets 100g Pellets enthalten : Plasminogen 2000 U Plasminogenaktivator (en) 2 U Stärke 20 g Sucrosestearat 20 g Siliciumdioxid 2 g Magnesiumstearat 3 g Polyvinylpyrrolidon 0-1 g Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 5 g Talkum 0, 2 g Triethylcitrat 0,1 g Cellulose, mikrokristalline zu 100 g Injektionslösung Plasminogen 500 U Plasminogenaktivator (en) 0,5 U Ethanol 0-1 g Propylenglykol 10 g Polyethylenglykol 0-1 g Natriumchlorid q. s. optional Puffer (Natriumhydrogenphosphat/Natriumdihydrogenphosphat) gereinigtes Wasser zu 100 ml Anstelle von Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen kann bei den aufgezählten Formulierungen auch die gleiche Menge bezogen auf die Aktivität an Plasmin eingesetzt werden. Wird Plasmin direkt verwendet, so brauchen in der pharmazeutischen Formulierung keine Plasminogenaktivator (en) enthalten zu sein.

Beispiel 9b : Pharmazeutische Formulierungen a) Hydrogele Basisformulierung für Hydrogele (100 g) Plasmin 100 U Hydroxyethylcellulose 400 2,5-5, 0 g gereinigtes Wasser zu 100,0 g Die Quellungszeit beträgt 1 bis 3 h.

Möglich ist die Verwendung von 1-1000 U Plasmin pro Gramm Hydrogel. b) Hydrophile Salbe Basisformulierung einer hydrophilen Salbe (1000 g) : Plasmin 1000 U wasserfreies Glycerol 85,0 g Hydroxyethylcellulose10. 000 32,5 g optional Polyhexanid 0,2 Gew. % Ringerlösung ohne Lactat zu 1000,0 g Polyhexanid kann als antimikrobieller Wirkstoff optional in einer Konzentration bis 0,2 Gew. % zugegeben werden.

Anstelle von Hydroxyethylcellulose 10.000 (Natrosol 250t HX PHARM) kann auch Hydroxyethylcellulose 400 (z. B. Tylosec H 300 oder Natrosol 250t HX PHARM) Möglich ist die Verwendung von 1-10000 U Plasmin pro Gramm Salbe. c) Salbe Basisformulierung für Salbe (50 g) Plasmin 50 U Macrogol 400 30,0-32, 5 g Macrogol 4000 12,5-7, 5 g gereinigtes Wasser zu 50,0 g Zubereitung : 12,5 g Macrogol 4000 und 30,0 g Macrogol 400 (bei weichen Salben 7,5 g Macrogol 4000 und 32,5 g Macrogol 400) werden in einer Salbenschale im Wasserbad erwärmt, bis das Macrogol geschmolzen ist. Nach dem Abkühlen wird die entsprechende Menge an Plasmin, das mit Hilfe des erfinderischen Verfahrens hergestellt wurde, gelöst in 7,5 g gereinigtem Wasser zugesetzt und anschließend homogenisiert. d) Kapseln Basisformulierung für 0,5 g Plasmin 5 U Lactose 0,42 g Stärke 0,06 g Magnesiumstearat 0,02 g Möglich ist die Verwendung von 0,1-100 U Plasmin pro Kapsel. e) Injektionslösung/Inisionslösung Basisformulierung für 100 ml Plasmin 500 U Ethanol 0,01 g Propylenglykol 30 ml gereinigtes Wasser zu 100 ml.

Möglich ist die Verwendung von 1-500 U Plasmin pro ml Lösung.

Anstelle von Plasmin kann auch Micro-, Mini-, Lys-oder Glu-Plasminogen in den für das Plasmin genannten Mengen bezogen auf die Aktivität in Units eingesetzt werden, wenn zugleich mindestens ein Plasminogenaktivator zugesetzt wird, in einer Menge von 1 : 10000 bis 1 : 100, bevorzugt in einer Menge von 1 : 1000 bezogen auf die Plasminogen-Aktivität.

Beispiel 10a : Amplifizierung und Klonierung verschiedener Formen des Mini-und des Microplasminogen-Gens und Klonierung in den Vektor PPICZ (YA ; Transformation von Pichia pastoris Mini-und Microplasminogen sind verkürzte Plasminogen-Derivate, denen N-terminale Domänen fehlen, die aber dennoch zu aktivem Plasmin aktivierbar sind.. Die Amplifizierung der Mini-und Microplasminogen-Gene zur Klonierung in den Vektor pPICZaA wurde mit dem Oligonukleotid-Primer N034 für das 3'-Ende und je einem der Primer N036a-j (Seq. ID No. 19 bis 28) für das jeweilige 5'-Ende unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Die Oligonukleotid-Primer N036a, c, e, g, i tragen neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2-Schnittstelle, die Primer N036b, d, f, h, tragen zusätzlich im Anschluss an die Kodons für die Kex2-Schnittstelle die Kodons für zwei Stel3-Schnittstellen. Der Primer N034 trägt des Weiteren eine KspI- Schnittstelle, die Primer N036 a-j tragen eine SoI-Schnittstelle.

Die Klonierung der Mini-und Microplasminogen-Gene in den Vektor pPICZaA wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt, wobei sowohl der Vektor als auch das jeweilige PCR-Produkt mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und KspI geschnitten wurden. Zusammenfassend sind die verwendeten Primer, die Namen des Plasminogen- Derivats, die kodierten Protease-Schnittstellen, die Bezeichnung der erhaltenen Plasmide und die N-Terminale Aminosäure des sezernierten Plasminogen-Derivats folgender Tabelle zu entnehmen.

5'-Primer 3'-Primer Name Protease-Plasmidname N-Terminale Schnittstelle Aminosäure* N036a N034 Miniplasminogen Kex2 pPLGl. 1 A463 N036b N034 Miniplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG2. 1 A463 N036c N034 Microplasminogen Kex2 pPLG3.2 K550 N036d N034 Microplasminogen Kex2, 2xSte13 pPLG4.2 K550 N036e N034 Microplasminogen Kex2 pPLG5.3 L551 N036f N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG6.1 L551 N036g N034 Microplasminogen Kex2 pPLG7.1 A562 N036h N034 Microplasminogen Kex2, 2xSte13 pPLG8.3 A562 N036i N034 Microplasminogen Kex2 pPLG9.1 S564 N036j N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG10. 1 S564 * Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 Aminosäuren lange Präplasminogen (Seq. ID No. 12) Beispielhaft ist in Fig 8 das Plasmid pPLGl. l dargestellt.

Wie in Beispiel le für pMHS476. 1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem Plasmid pPLGl. 1 transformiert. Die resultierenden Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pPLGl. l-l/a bezeichnet, wobei"a'; wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Zur Generierung von Stämmen auf Basis der Plasmide pPLG2.1, pPLG3.2, pPLG4.2, pPLG5.3, pPLG6.1, pPLG7.1, pPLG8.3, pPLG9.1 und pPLG10. 1 wurde entsprechend der Herstellung des Stämms KM71H/pPLGl. l-l/a vorgegangen.

Oligonukleotid-Primer N036a-j Beispiel 10b : Amplifizierung und Klonierung verschiedener Formen des Mini-und des Microplasminogen-Gens und Klonierung in den Vektor pGAPZaA ; Transformation von Pichia pastoris Die Amplifizierung der Mini-und Microplasminogen-Gene zur Klonierung in den Vektor pGAPZaA wurde mit dem Oligonukleotid-Primer N034 für das 3'-Ende und je einem der Primer N036a-j (Seq. ID No. 19 bis 28) für das jeweilige 5'-Ende unter Verwendung der in Beispiel la geschilderten Bedingungen durchgeführt. Die Oligonukleotid-Primer N036a, c, e, g, i tragen neben den zum Plasminogen-Gen komplementären Basen die Kodons für die Kex2- Schnittstelle, die Primer N036b, d, f, h, j tragen zusätzlich im Anschluss an die Kodons für die Kex2-Schnittstelle die Kodons für zwei Stel3-Schnittstellen. Der Primer N034 trägt des Weiteren eine KspI-Schnittstelle, die Primer N036 a j tragen eine XhoI-Schnittstelle.

Die Klonierung der Mini-und Microplasminogen-Gene in den Vektor pGAPZaA wurde analog zu der in Beispiel lb beschriebenen Klonierung durchgeführt, wobei sowohl der Vektor als auch das jeweilige PCR-Produkt mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und KspI geschnitten wurden. Zusammenfassend sind die verwendeten Primer, die Namen der Plasminogen-Derivate, die kodierten Protease-Schnittstellen, die Bezeichnung der erhaltenen Plasmide und die N-Terminale Aminosäure des sezernierten Plasminogen-Derivats folgender Tabelle zu entnehmen.

5'-Primer 3'-Primer Name Protease-Plasmidname N-Terminale Schnittstelle Aminosäure* N036a N034 Miniplasminogen Kex2 pPLG11. 2 A463 N036b N034 Miniplasminogen Kex2, 2xSte13 pPLG12.1 A463 N036c N034 Microplasminogen Kex2 pPLG13. 1 K550 N036d N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG14.2 K550 N036e N034 Microplasminogen Kex2 pPLG15. 1 L551 N036f N034 Microplasminogen Kex2, 2xSte13 pPLG16.3 L551 N036g N034 Microplasminogen Kex2 pPLG17.2 A562 N036h N034 Microplasminogen Kex2, 2xSte13 pPLG18. 1 A562 N036i N034 Microplasminogen Kex2 pPLG19. 2 S564 N036j N034 Microplasminogen Kex2, 2xStel3 pPLG20.1 S564 * Die Nummerierung bezieht sich auf das 810 Aminosäuren lange Präplasminogen (Seq. ID No. 12) Beispielhaft ist in Fig. 9 das Plasmid pPLG11. 2 dargestellt.

Wie in Beispiel 7a für pJW9.1 beschrieben, wurde Pichia pastoris KM71H mit dem durch die Restriktionsendonuklease BlnI linearisierten Plasmid pPLG11. 2 transformiert. Die resultierenden Kolonien wurden als Pichia pastoris KM71H/pPLG11. 2-1/a bezeichnet, wobei wiederum für die fortlaufende Nummerierung der Kolonien beginnend bei 1 steht.

Zur Generierung von Stämmen auf Basis der Plasmide pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16. 3, pPLG17. 2, pPLG18. 1, pPLG19. 2 und pPLG20.1 wurde entsprechend der Herstellung des Stamms KM71H/pPLGl. l-l/a vorgegangen.

Sequenzprotokoll Sequenz 1 : Oligonukleotid-Primer N034 AAAAACCGCGGTCAATTATTTCTCATCACTCCC Sequenz 2 : Oligonukleotid-Primer N036 AAAAACTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTG Sequenz 3 : Oligonukleotid-Primer N057 AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTG Sequenz 4 : Oligonukleotid-Primer N037 AAAAATTCGAAAAATGGAACATAAGGAAGTGG Sequenz 5 : Oligonukleotid-Primer N035 AAAAACTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTAT Sequenz 6 : Oligonukleotid-Primer N056 AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTAT Sequenz 7 : humanes Lys-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2- Schnittstelle und dem Gen der Signal-Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 8 : humanes Lys-Plasminogen mit Kex2-Schnittstelle und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 9 : humanes Lys-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2- Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Gen für die Signal- Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 10 : humanes Lys-Plasminogen mit Stel3 und Kex2-Schnittstellen und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 11 : humanes Prä-Plasminogen-Gen Sequenz 12 : humanes Prä-Plasminogen Sequenz 13 : humanes Glu-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2- Schnittstelle und dem Gen für die Signal-Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 14 : humanes Glu-Plasminogen mit Kex2-Schnittstelle und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 15 : humanes Glu-Plasminogen-Fusionsgen mit den Kodons für die Kex2- Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Gen für die Signal- Sequenz des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 16 : humanes Glu-Plasminogen mit Stel3 und Kex2-Schnittstellen und dem Signal-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 17 : Sequenz des ins Medium sezernierten Glu-Plasminogen (pSM49.8, pSM58.1 und pSM82. 1) Sequenz 18 : Sequenz des ins Medium sezernierten Lys-Plasminogen (pMHS476. 1, pSM54.2, pAC37.1 und pJW9.1) Sequenz 19 : Oligonukleotid-Primer N036a AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG Sequenz 20 : Oligonukleotid-Primer N036b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG Sequenz 21 : Oligonukleotid-Primer N036c AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG Sequenz 22 : Oligonukleotid-Primer N036d AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG Sequenz 23 : Oligonukleotid-Primer N036e AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG Sequenz 24 : Oligonukleotid-Primer N036f AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG Sequenz 25 : Oligonukleotid-Primer N036g AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG Sequenz 26 : Oligonukleotid-Primer N036h AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG Sequenz 27 : Oligonukleotid-Primer N036i AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC Sequenz 28 : Oligonukleotid-Primer N036j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC Sequenz 29 : Mini-Plasminogen (pPLG1. 1 und pPLG2.1) Sequenz 30 : Micro-Plasminogen (pPLG3.2 und pPLG4. 2) Sequenz 31 : Micro-Plasminogen (pPLG5.3 und pPLG6. 1) Sequenz 32 : Micro-Plasminogen (pPLG7.1 und pPLG8.3) Sequenz 33 : Micro-Plasminogen (pPLG9.1 und pPLG10. 1) Sequenz 34 : DNA-Sequenz des alpha-Faktors aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae in pPICZaA bis zur Kex2-Schnittstelle.

Sequenz 35 : Aminosäure-Sequenz des alpha-Faktors aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae in pPICZaA bis zur Kex2-Schnittstelle.

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSN STNN GLLFINTTIASIAAKEEGVSLE Sequenz 36 : DNA-Sequenz der Kex2-Schnittstelle AAAAGA Sequenz 37 : DNA-Sequenz der Stel3-Schnittstellen GAGGCTGAAGCT Sequenz 38 : Aminosäure-Sequenz der Kex2-Schnittstelle KR Sequenz 39 : Aminosäure-Sequenz der Stel3-Schnittstellen EAEA Sequenz 40 : Aminosäure-Sequenzen des humanen Mini-Plasminogens wie in pPLG1. 1 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 41 : Aminosäure-Sequenz des humanen Mini-Plasminogens wie in pPLG2. 1mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 42 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG3.2 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 43 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG4.2 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 44 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG5.3 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 45 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG6.1 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 46 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG7.1 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 47 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG8.3 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 48 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG9.1 mit Kex2-Schnittstelle und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 49 : Aminosäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogens wie in pPLG10. 1 mit Kex2-Schnittstelle und zwei Stel3-Schnittstellen und dem Präpro-Peptid des alpha-Faktors der Hefe Saccharorsayces cerevisiae Sequenz 50 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Mini-Plasminogen-Gens wie in pPLGl. 1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 51 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Mini-Plasminogen-Gens wie in pPLG2.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saecharoiizyces cerevisiae Sequenz 52 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG3.2 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 53 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG4.2 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 54 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG5.3 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saecharonrayces cerevisiae Sequenz 55 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG6.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 56 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG7. 1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 57 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG8.3 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 58 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG9.1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha-Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 59 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gen wie in pPLG10. 1 mit den Kodons für die Kex2-Schnittstelle und die Stel3-Schnittstellen und dem Gen des Präpro-Peptids des alpha- Faktors der Hefe Saccharomyces cerevisiae Sequenz 60 : Nukleinsäure-Sequenz des humanes Mini-Plasminogen-Gens wie in pPLGl. l und pPLG2.1 Sequenz 61 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG3.2 und pPLG4.2 Sequenz 62 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG5.3 und pPLG6.1 Sequenz 63 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG7.1 und pPLG8.3 Sequenz 64 : Nukleinsäure-Sequenz des humanen Micro-Plasminogen-Gens wie in pPLG9.1 und pPLG10. 1 Sequenz 65 : Nukleinsäuresequenz des humanen Glu-Plasminogen-Gens Sequenz 66 : Nukleinsäuresequenz des humanen Lys-Plasminogen-Gens Literaturverzeichnis (1) Desire Collen, Thrombosis and Haemostasis, 82,1999 (2) = Forsgren et al., FEBS Lett. 213,1987 (3) = Petersen et al., J. 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