La présente invention se rapporte à des récepteurs T solubles et plus particulièrement à des formes sécrétées de récepteurs T solubles (RTs)

VαCα/VβCβ, VγCγ/VδCδ ou VαCδ/VβCγ et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques.

Les lymphocytes T sont capables de reconnaî¬ tre de façon hautement spécifique des myriades d'antigè¬ nes (Ag), ce au moyen de structures de surface extrême¬ ment diversifiées appartenant à la superfamille des immunoglobulines ( Ig) , les récepteurs T (RT).

Chez l'homme comme chez la souris, la plupart des lymphocytes T chez l'adulte expriment des RT consti¬ tués de 2 sous-unités glycoprotéiques variables dénommées α et β. Tout comme les chaînes lourdes et légères des Ig, ces sous-unités comportent un domaine variable (V) aminoterminal et un domaine constant (C) carboxyterminal et sont en outre très généralement associées entre elles de façon covalente, via un pont disulfure interchaine. La nature des antigènes reconnus par le récepteur T αβ est relativement bien établie : il s' agit de complexes formés par un antigène oligopeptidique ( issu de la dégradation intracellulaire de protéines endogènes ou exogènes) étroitement associé aux produits de gènes polymorphes situés dans le complexe majeur d'histocompa- tibilité (CMH) , dits de classe I ou II. L'interaction entre le récepteur T αβ et les complexes CMH/Ag est classiquement renforcée par des molécules dites corécep- trices ou accessoires (CD4 et CD8) , reconnaissant des portions conservées des molécules CMH de classe II et I respectivement.

Plus récemment a été décrit une autre sous- population de lymphocytes T qui se distingue par la nature des gènes ( 7 et δ > codant pour ces récepteurs T.

A la différence des lymphocytes T αβ, la spécificité* antigénique des cellules T yδ reste encore peu claire. Se basant sur une relative homologie des séquences primaires des chaînes αβ et γδ du récepteur T, certains ont prédit une similarité structurale des ligands pour ces récepteurs. En accord avec cette hypothèse, une fraction des lymphocytes T γδ s'est avérée être dirigée contre des molécules structuralement proches ou identi¬ ques aux produits du CMH classiquement reconnus par les lymphocytes T αβ. Cependant, il existe également plu¬ sieurs exemples de reconnaissance par cette sous-popula¬ tion T de molécules de structure plus éloignée, telles les protéines de stress ou certaines molécules d'activa- tion comme le CD48. Les présents inventeurs ont cherché à générer des formes "soluoles" (sécrétées) de récepteur T γδ, qui pourraient être utilisées (à l'instar des Ig) en tant que sondes permettant l'isolement, la localisation et éventuellement la purification de ligands spécifiques. Par ailleurs, de tels récepteurs T solubles présentent également un certain nombre d'applications cliniques. Traunecker et coll. (1989. Immunol. Today 10:29) ont rapporté des tentatives de production de récepteurs T solubles ayant consisté à éliminer la portion transmembranaire (TM) des chaînes α ou des chaînes β par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la région TM qui se sont révélées infructueuses, aucune sécrétion n'ayant pu être décelée. A la suite de ces échecs initiaux, d'autres stratégies ont alors été adoptées. Dans la plupart des cas, le principe consistait à construire des protéines chimériques comprenant les régions V, ou V et C des sous- unités α et β, accolées aux régions C 'immunoglobulines ou à des ancres de type glycosyl phosphatidylinositol

(GPI). Dans le cas des protéines de fusion RT/Ig, le problème principal s'est avéré être la sécrétion parfois majoritaire de formes monomériques ou homodimériques. En outre, les formes hétérodimériques RTs αβ présentait parfois des différences structurales significatives avec les formes membranaires ; en particulier les 2 chaînes α et β étaient très généralement associées de façon non covalente. Ceci pouvait par conséquent avoir des réper¬ cussions sur la structure globale et la spécificité antigénique fine de telles molécules chimériques. Dans le cas des récepteurs T "lipiés" (ancrés à la membrane par une séquence GPI ) , une proportion parfois assez élevée d'hétérodimères αβ associés de façon covalente pouvait être obtenue. Cependant, 1'inconvénient principal de cette technique était la nécessité d'un traitement enzymatique (par phospholipase C), afin de libérer les récepteurs T dans le milieu, et donc une production coûteuse et de faible rendement. Plus récemment a été proposé un protocole de production de récepteurs T dits monochaîne, consistant à accoler un domaine Va à un domaine Vβ via un pont peptidique. Cependant, cette technique s'est révélée délicate d'utilisation. En particulier, elle supposait l'introduction d'un nombre important de mutations dans certaines zones hydrophobes des régions V normalement masquées sur la protéine native, pour rendre ces récepteurs T monochaîne hydroso- lubles.

Tous les exemples de production de formes solubles de récepteurs T décrits dans la littérature, dans tous les cas sous forme hybride, ont montré une extrême variabilité d'efficacité d'une combinaison de chaîne à l'autre.

Les présents inventeurs ont découvert que 1 'on pouvait obtenir des récepteurs T solubles de façon aisée et avec un rendement élevé quelle que soit la

combinaison de chaînes mise en oeuvre, à l'aide d'un procédé consistant à produire des molécules d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutive du récepteur T délétées de la portion trans embranaire, et à co-trans- fecter ces ADN dans une cellule-hôte.

La présente invention à aussi pour objet un procédé de production de récepteurs T solubles, carac¬ térisé en ce que l'on réalise une co-transfection dans une cellule hôte des séquences d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutives du récepteur T délétées de la portion transmembranaire du récepteur T.

Selon l'invention, on produit des récepteurs T solubles VαCα / VβCβ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sous- unités α et β du récepteur Tαβ délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tαβ.

On produit également des récepteurs T solubles VγCγ / VδCδ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sous- unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tγδ.

On produit en outre des récepteurs T solubles hétérodimériques VαCγ / VβCδ et VαCδ / VβCγ, dans les¬ quels les sous-unités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cel¬ lule-hôte des séquences d'ADN codant pour les domaines Cγ et Cδ des sous-unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de leur portion transmembranaire, fusionnées respecti¬ vement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Va et Vβ des sous-unités a et β du récepteur Taβ pour obtenir des récepteurs VaCγ / VβCδ, ou fusionnés respectivement avec les séquences 'ADN codant pour les domaines Vβ et Va des sous-unités β et a du récepteur Taβ pour obtenir des récepteurs VaCδ / VβCγ. On produit également des récepteurs T

solubles hybrides VγCγ / VαCδ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour la sous- unité γ du récepteur Tγδ délétée de sa portion transmem¬ branaire, avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Cδ de la sous-unité δ fusionnées avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Va de la sous-unité α du récepteur Tα6. Cette construction est particulièrement avantageuse et est basée sur le fait que certains gènes Va peuvent être utilisés soit par des clones αβ, soit par des clones γδ.

Avantageusement, on utilise pour les constructions des récepteurs T solubles de 1 'invention pour les parties variables les séquences d'ADN des gènes Vδ2 et Vγ9. II peut toutefois être intéressant de produire des récepteurs VγCγ / VδCδ en utilisant une séquence d'ADN Vγ9 d'une part, et en remplaçant la séquence d'ADN Vδ2 par d'autres séquences d'ADN Vδ pour les mêmes raisons que celles évoquées ci-dessus pour la construction du récepteur hybride VγCγ / VαCδ. Cette construction permet d'obtenir des anticorps anti-α, ou dirigés contre des Vδ distincts de Vδ2.

Réciproquement, il est également possible de conserver l'ADN Vδ2 et de remplacer la séquence d'ADN Vγ9 par d'autres séquences d'ADN Vγ, afin d'obtenir des anticorps anti-Vγ .

L' invention englobe également ces modes de réalisation de récepteurs T solubles VγCγ / VδCδ.

Il est à noter que plusieurs segments Vδ (notamment Vδl ) peuvent être considérés comme des Va, dans le sens où ils peuvent êtr indifféremment utilisés par des chaînes α ou δ du récepteur T. Ainsi, on peut considérer que les exemples de récepteurs produits sous forme soluble ici fournis démontrent notamment l'intérêt du procédé dans le cadre de la génération d'anticorps

monoclonaux dirigés non seulement contre les régions, variables γ et δ, mais également α.

Avantageusement, la délétion de la portion transmembranaire des sous-unités constitutives du récepteur T est réalisée, par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la portion transmembranaire de ces sous-unités, notamment par mutagénèse dirigée par P.C.R. (Polymerase Chain Reaction) . Les séquences d'ADN sont des séquences d'ADN génomique ou d'ADNc.

De préférence, la co-transfection est réalisée dans des cellules eucaryotes, notamment des cellules d'ovaires de hamster (CHO) . L'invention a également pour objet une protéine de fusion formée entre un récepteur T soluble et une séquence peptidique, la séquence peptidique étant constitutive d'un peptide ou d'une protéine, la protéine de fusion étant obtenue par fusion de la séquence d'ADN codant pour le peptide ou la protéine à l'une des chaînes ou aux deux chaînes d'ADN codant pour les sous-unités d'un récepteur T délétées de leur portion transmembra¬ naire, suivie d'une co-transfection des séquences d'ADN ainsi fusionnées dans une cellule-hôte. Avantageusement dans ce cas, la séquence peptidique est celle de 1'interleukine-2 (IL-2).

L'invention a également pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux humains ou animaux dirigés contre un récepteur T soluble obtenu par le procédé de l'invention ou une protéine de fusion RTs-IL2 telle que définie précédemment.

Les anticorps monoclonaux selon 1' invention peuvent être préparés selon une technique classique. A cet effet, les récepteurs T solubles, éventuellement fusionnés avec 1 ' interleukine-2 ou une autre protéine,

peuvent être couplés si nécessaire à un agent immunogène, . tel que 1 'anatoxine tétanique, par un agent de couplage tel une benzidine bis diazotée.

La présente invention englobe également les fragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab' ) ₂ qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab' ) ₂ et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécu¬ les d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Ces fragments, ainsi que des fragments Fc, peuvent être également obtenus par génie génétique. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liés des marqueurs tels qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives.

L'invention a également pour objet des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifi¬ ques de la séquence peptidique décrite ci-dessus. Ces hybridomes peuvent être obtenus par les techniques classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par 1'antigène ou provenant d'un animal immunisé contre la séquence peptidique de l'invention, et des cellules d'une lignée myélomateuse.

L'invention a également pour objet une composition de diagnostic comprenant un récepteur T soluble obtenu par un procédé selon 1 'invention ou une protéine de fusion RTs-séquence peptidique, notamment RTs-IL2 telle que définie précédemment, ou encore un anticorps monoclonal selon l'invention. La composition de diagnostic selon 1 ' inven-

tion peut être utilisée pour le typage de spécificités cellulaires liées au récepteur T. A cet effet, on peut utiliser un récepteur T soluble en tant que tel. Cepen¬ dant, en raison de l'affinité probablement faible de celui-ci pour son ligand spécifique, il est avantageux de coupler les récepteurs T solubles à un support, afin d'augmenter leur avidité par augmentation de leur valence.

Le support peut consister en tout support traditionnellement utilisé, tel des billes organiques ou magnétiques.

De tels supports sont par exemple des plaques en matière plastique utilisées pour les tests ELISA sur lesquels on fixe le récepteur T soluble de la même manière que les immunoglobulines, des billes magnétiques tosyl-activées, par exemple celles commercialisées par Dynal, Oslo, Norvège, ou encore des gels activés de type AFFIGEL tels ceux commercialisés par BIORAD.

Les techniques de couplage sont celles classiquement utilisées et indiquées par le distributeur pour les supports disponibles dans le commerce.

Ces méthodes peuvent consister en un couplage chimique ou au moyen d'anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs T solubles en question, ces derniers étant eux-mêmes couplés au support par couplage chimique.

Avantageusement, les compositions de diagnos¬ tic comprennent une protéine fusionnée telle que décrite précédemment, constituée d'un récepteur T soluble et d'un déterminant antigénique contre lequel on dispose d'anti¬ corps spécifiques.

De telles compositions de diagnostic peuvent être utilisées pour le typage de spécificités cellulaires non détectées par les techniques sérologiques classiques. La composition de diagnostic selon 1' inven-

tion peut également comprendre des anticorps monoclonaux tels que définis précédemment, et de préférence un panel d'anticorps monoclonaux dirigés contre les portions V et C des chaînes des récepteurs T obtenus par immunisation d'animaux contre les récepteurs T solubles obtenus selon l'invention, préalablement purifiés.

Afin d'améliorer l'efficacité des immunisa¬ tions, il est également possible d'injecter des protéines de fusion RTs-IL2 telles que définies précédemment. Une telle composition de diagnostic peut être utilisée notamment pour la mise en évidence de proliféra¬ tions mono ou oligoclonales, comme celles rencontrées dans les leucémies T par exemple.

Selon l'invention, on met en présence la composition diagnostique avec un prélèvement biologique, par exemple un échantillon de sang contenant des lympho¬ cytes T pathologiques, et on met en évidence le complexe formé avec le ligand spécifique du récepteur T et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion comprenant le récepteur T soluble et un déterminant antigénique ou le complexe formé par les anticorps monoclonaux selon 1 'invention et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion récepteur T soluble-IL2 contre lesquels ils sont spécifiquement dirigés. Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radio-immunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou une méthode immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA.

Pour la mise en oeuvre de ces procédés de détection, on utilise des molécules froides non marquées ou marquées à 1 'aide d'un marqueur adéquat qui peut être la biotine ou ses dérivés, une enzyme comme la peroxyda- se, un marqueur fluorescent comme la fluoresceine, un marqueur radioactif, etc... Ces procédés de diagnostic in vitro compren-

nent par exemple les étapes suivantes : dépôt d'une quantité déterminée d'une composition contenant un récepteur T soluble, un récep¬ teur soluble fusionné avec un déterminant antigénique ou un anticorps monoclonal selon 1 'invention dirigé contre le récepteur T soluble ou la protéine de fusion récepteur T soluble-Interleukine 2 selon l'invention, dans les puits d'une plaque de microtitation ou sur un autre support tel que des billes ou une membrane de nitrocellu- lose, dépôt dans les puits du prélèvement biologique à tester, ou incubation de celui-ci avec les billes ou la membrane, en présence d'agents saturants ou après saturation préalable des supports activés, - après incubation et rinçage des micropla¬ ques ou des bilies, dépôt dans les puits ou incubation avec les billes d'un système de révélation du complexe récepteur T soluble-ligand éventuellement formé.

Les kits pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de 1 'invention comprennent :

- au moins une composition de diagnostic selon l'invention,

- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'un complexe entre le ou les ligands éventuellement présents dans un échantil¬ lon biologique,

- un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le complexe formé.

L'invention a également pour objet une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble obtenu selon le procédé de 1 ' invention ou une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, notamment une RTs-IL2 selon l'inven¬ tion. Une telle composition thérapeutique est utile

notamment dans le traitement des processus pathologiques- dans lesquels on observe une prolifération pauciclonale de lymphocytes T, tels les leucémies ou lymphômes T et certaines maladies autoimmunes. Elle est administrée de préférence par voie injectable dans un véhicule approprié.

L'administration de cette composition thérapeutique a un double but. Elle permet d'une part l'induction d'une réponse immunitaire anti-idiotypique, conduisant alors à l'élimination active et sélective des cellules porteuses de ces idiotypes, et d'autre part le blocage par compétition de la reconnaissance d'antigènes autologues dans le cas de proliférations autoimmunes.

Avantageusement, la composition thérapeutique selon l'invention comprend un récepteur T soluble hétérodimérique tel que défini précédemment, porté éventuellement par une protéine de fusion.

La composition thérapeutique selon 1 'inven¬ tion peut également comprendre un anticorps monoclonal selon l'invention, éventuellement couplé à une molécule thérapeutiquement active, par exemple une molécule cytotoxique, ou un fragment ou dérivé d'anticorps monoclonal tels que définis précédemment.

Une telle composition permet l'élimination directe de cellules mono- ou oligoclonales rencontrées dans certains types de leucémies T.

On décrira ci-après en détail l'obtention de récepteurs T solubles dans le cas de RTγδ en se référant aux Figures annexées sur lesquelles : - la Figure 1 représente des produits d'assemblage des gènes γ et δ. Les séquences des amorces 5 ' et 3 ' utilisées pour amplifier les ADNc permettant l'obtention des récepteurs Tγδ solubles (ADNc γs et δs) sont représentées au-dessus et en-dessous des ADNc γ et δ respectivement. Les positions des codons de terminaison

sont représentées en caractères gras. Les parties en gris • en 3' des ADNc γ et δ correspondent aux régions transmem- branaires (TM) hydrophobes.

La Figure 2 représente les séquences nucléotidiques et peptidiques correspondantes des chaînes δ et γ solubles du clone utilisé pour la construction du récepteur T soluble décrite ci-dessus.

- la Figure 3 représente les résultats des essais de détection de RTsγδ par la technique IRMA en milieu conditionné à partir des cellules CHO transfectées par γs/δs.

SN représente le surnageant de culture des cellules CHO, transfectées avec un ADNc non pertinent (C) ou avec les ADNc des sous-unités γ et δ solubles selon l'invention (sγδ).

Les anticorps monoclonaux donnant un signal radioimmunologique significatifs sont représentés en rectangles gras.

- la Figure 4 représente la titration en activité de RT soluble exprimée en μg/ml, comme attesté par le test IRMA (sand ich 7B6/TiVδ2), des fractions éluées d'une colonne d'affinité couplée avec l'anticorps anti-Vγ 7B6 (commercialisé par Immunotech), sur laquelle ont été appliquées environ 500 ml de surnageant de culture de cellules γδsF5-CH0.

- la Figure 5 représente 1 'analyse par SDS- PAGE de fractions positives pour 1 'activité de RT soluble, comme attesté par le test IRMA (sandwich 7B6/TiVδ2), des fractions éluées d'une colonne d'affinité couplée avec l'anticorps anti-Vγ9B6.

Deux préparations indépendantes (# 1 et # 2) ont été analysées en conditions non réductrices (à gauche) et réductrices (à droite) . MW : marqueurs de poids moléculaire.

EXEMPLE 1

1. Construction et expression des gènes γôs des RTs

Le clone de lymphocytes humains γδs G 115 (dont les séquences nucléotidiques et peptidiques correspondant aux chaînes δ et γ solubles sont repré¬ sentées à la Fig. 2, respectivement en A et B) exprimant des récepteurs T V9JPClγ/V2D3JlCδ a été utilisé pour la construction des gènes γδs et l'expression de récepteurs T solubles.

Ce clone a été utilisé pour plusieurs raisons dont les principales sont :

- la grande majorité des récepteurs T γδ des leucocytes humains du sang périphérique comprennent des régions V(D)J similaires de sorte que les résultats structuraux et fonctionnels obtenus avec la forme soluble du RT particulier utilisé peuvent être appliqués facile¬ ment au RT exprimés par une large proportion de cellules γδ, - des anticorps monoclonaux spécifiques des régions Cγ, Cδ, Vγ9 et Vδ2 sont facilement disponibles et peuvent être utilisés pour suivre la production et la purification des molécules RT solubles,

- à la différence de la plupart des lymphocy- tes T humains γδ Vδl- positifs, les chaînes γ et δ des récepteurs T du clone G 115 sont liées de manière covalente par un pont disulfure qui stabilise fortement la molécule après sa sécrétion dans le milieu,

- la spécificité antigénique du clone G 115 est assez bien connue. En particulier, ce clone tue les cellules d'un lymphome de Burkitt (dénommé Dadi) et reconnaît également un antigène présent dans des extraits hydrosolubles de Mycobacterium tuberculosis.

Le clone G 115, issu de lymphocytes Tγδ déri- vant de leucocytes de sang humain périphérique a été

maintenu dans un milieu RPMI 1640 contenant 8% de sérum- humain, 2 mM de L-glutamine et 150 unités BRMP (Biolo- gical Response Modifier Program) d'IL2 et stimulé une semaine sur deux avec 0,5 μg/ml de leucoagglutinine (Pharmacia, France), des leucocytes de sang périphérique irradiés et des lymphoblastes B irradiés et transformés par l'EBV.

Après deux lavages dans une solution saline de tampon phosphate, 5.10 ⁶ cellules ont été lysées sur de la glace dans un tampon Tris-HCl (80 mM, pH 7,5) conte¬ nant 100 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA et 0,5% en poids de Triton X100. Après centrifugation, le surnageant a été récolté et mélangé avec un volume égal de phénol à 65°C. L'ARN a été extrait par un traitement au phénol/CHC1 ₃ , précipité dans 2,5 volumes d'éthanol et solubilisé dans 40μl de Tris 10 mM/EDTA 1 mM). 5 μl d'ARN total ont été transcrits de manière inverse pendant 1 heure à 37°C à 1'aide d'une amorce 3' phosphatée contenant des codons de terminaison de traduction en amont de la région transmembranaire hydrophobe des gènes γ et δ, après les codons de la Lys ²⁴⁷ et de Gin ²⁷⁴ , comme représenté à la Fig. 1, à une concentration de 50 pM, des quatre dNTP à une concentration 1 mM chacun et 200 unités de transcrip- tase réverse du virus de la tumeur mammaire de souris (MMTV) (Boehringer Mannheim, Allemagne), dans un volume final de 25 μl. 75 μl d'un mélange pour PCR (comprenant Tris-HCl 13 mM (pH 8,2), KC1 66 mM, MgCl ₂ 2 M, 2 U de Taq polymérase (Boehringer) et 50 pM d'amorce 5 ' phospha¬ tée représentée à la Figure 1 ont été ajoutés au matériau obtenu par transcription réverse et 30 cycles d'amplifi¬ cation (94°C - 1 min, 45°C - 1 min, 72°C - 1 min) ont été effectués. L'ADN amplifié a été purifié après électropho- rèse sur gel d'agarose à bas point de fusion et clone dans un plasmide Bluescript SK+ (Stratagène, La Jolla, Californie) digéré par Sma I. Le sequençage a été réalisé

en utilisant un système de matrice à double brin selon le protocole fourni par le fournisseur du kit USB Seque- nase. Les fragments ont été clones dans un vecteur d'expression pKCR6 (Matrisian et al. , Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 83 : 9413) digéré par EcoRI.

L'ADN plasmidique a alors été introduit dans des cellules d'ovaire de hamster DUKX-B11 DHFR (dihydro- folate réductase)-négatives, cultivées sur un milieu RPMI 1640, additionné de sérum de veau foetal à 8%, de 2 mM de L-glutamine, de thymidine, d'adénosine et de déoxyadé- nosine à 10 μg/ml chacun, par la technique de précipita¬ tion au phosphate de calcium (Wigler et al., 1979 Cell. 16 : 777). Les cellules DHFR- positives ont été sélec¬ tionnées par culture des cellules transfectées pendant trois semaines en milieu RPMI, additionné de sérum foetal de veau et de L-glutamine (2 mM) sans nucléosides. Les transfectants stables ont alors été clones par la technique de dilution limitante.

2. Détection, purification et caractérisation des récepteurs Tyô solubles a) Détection des récepteurs T solubles Les anticorps monoclonaux utilisés pour la détection des RT solubles ont été marqués à 1' ¹²⁵ I par la méthode à 1 ' Iodogène (Fraker et al., 1978 Biochem.- Biophys.Res.Commun. 80 : 849). Les récepteurs T ont été détectés par un essai immunoradiométrique (IRMA) en sandwich à 1 'aide de paires d'anticorps monoclonaux spécifiques des chaînes γ et δ.

Des plaques de microtitration Immulon-1 (Dynatech, Marnes, France) ont été revêtues pendant 90 min. à 37°C avec 50 μl d'anticorps monoclonal Y102 (ou 7B6) à 40 μg/ml dans une solution saline de tampon phos¬ phate. Après élimination de l'anticorps, les sites non liés ont été saturés avec une solution saline de tampon phosphate contenant 0,5% de sérum albumine bovine pendant

1 heure à température ambiante. Les échantillons à analyser ont alors été ajoutés à raison de 40 μl en même temps que 10 μl d'anticorps monoclonal TiVδ2 marqué. Après 90 min. d'incubation à 37°C, les puits ont été rincés à quatre reprises avec 100 μl d'une solution saline de tampon phosphate additionné de sérum albumine bovine.

La radioactivité liée a été mesurée dans un compteur γ à scintillation. L'ensemble d'anticorps suivant a été utilisé pour mesurer la sécrétion de RTγδ soluble par la technique IRMA : anticorps anti-Vγ9 (Y102, B37, 7B6), anti-Cγ (B121) et anti-Vδ2 (TiVδ2) (Miossec et al., 1989, J.Exp.Med. 171 : 1171). Un anticorps monoclonal spécifique de l'IL2 a également été utilisé à titre de témoin négatif.

Avec les différentes combinaisons d'anti¬ corps, on n'a observé aucun signal avec les surnageants de cellules d'ovaires de hamster (CHO) non transfectées, de cellules transfectées avec un ADNc non pertinent ou des cellules transfectées avec soit un ADNc tronqué γs ou un ADNc tronqué δs (Fig. 3). Mais les hétérodimères γδ solubles ont été détectés de façon nette par IRMA (essai radioimmunologique) dans les surnageants de cellules CHO cotransfectées avec des produits d'assem- blage γ solubles et δ solubles (γδsF5-CH0) lorsqu'on utilisait des paires d'anticorps spécifiques de Vδ2/Cγ ou Vδ2/Vγ9 (Fig. 3), ce qui suggère que les molécules de RT solubles sécrétées par les cellules γδF5-CH0 étaient en majorité des hétérodimères.

b) Purification des récepteurs T solubles 10 mg d'anticorps monoclonal Y102 ou 7B6 (an- ti-Vγ9) ont été liés de manière covalente à une matrice de billes d'agarose activé (Affigel, Biorad, Richmond, CA. ) selon les indications de fournisseur.

Les surnageants de culture ont été appliqués sur une colonne d'affinité à raison de 30 ml/h à 4°C. Après lavage avec une solution saline de tampon phospha¬ te, le matériau lié a été élue avec un tampon glycine 0,2 M (pH 2,5). Les fractions éluées ont été neutralisées en une seule fois par Na ₂ HP0 ₄ 1M.

Les fractions positives pour 1 'activité de RT soluble comme attesté par le test IRMA ont été rassem¬ blées, dialysées pendant une nuit contre de l'eau distillée et concentrées par évaporation.

Des échantillons de RT solubles ont été préparés dans un tampon pour électrophorèse en gel avec ou sans agent réducteur, séparés par SDS-PAGE, et transferrés sur une membrane de nitrocellulose conformé- ment aux recommandations du fournisseur. Après saturation des sites non liés avec un tampon de blocage (lait écrémé déshydraté et Tween 20), les empreintes obtenues ont été incubées en présence d'anticorps primaire (surnageant d'hybridome dilué au tiers avec le tampon de blocage) pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage, un conjugué anti-Ig-peroxydase de raifort a été ajouté, et l'incubation poursuivie pendant 2 autres heures. Les anticorps liés ont été révélés par la diaminobenzidine (1 mg/ml), de H ₂ 0 ₂ et du CoCl ₂ . Dans une préparation type, 3,3 mg (calculés en utilisant un coefficient pour 1% d'extinction de 1,5, comme calculé pour les immunoglobulines) de RT γδ purifiés par affinité ont été traités avec la neuramini- dase de Vibrio cholerae (Boehringer Mannheim) dans 1 ml de tampon contenant 50 mM d'acétate de sodium, 150 mM NaCl et 4 mM CaCl ₂ à pH 5,5 pendant 1 heure à 37°C.

Dans ces conditions, la réaction a été estimée complète par détermination d'essais de contrôle d'échantillons digérés par focalisation isoélectrique en milieu PhastGel IEF 3-9 (Pharmacia).

Après une dilution par un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,3, l'échantillon a été concentré au moyen d'une colonne centripep à 30 000 tours (Amicon) avant protélyse. Les récepteurs γδ traités à la neuraminidase ont été digérés à 37°C pendant 30 minutes avec de la papaïne ( orthington) à un rapport enzyme/substrat de 1/500 en présence de 1,5 M 2-mercaptoéthanol et 1,25 mM EDTA. La réaction a été complétée par addition de N- éthylmaléimide.

Ces conditions étaient suffisantes pour éliminer complètement le pont dissulfure intercaténaire, comme attesté par analyse en SDS-PAGE en conditions non réductrices. Des rapports enzyme/substrat plus élevés et/ou des durées d'incubation plus longues n'ont apporté aucune preuve d'un clivage protéique supplémentaire. Le milieu réactionnel a alors été appliqué sur une colonne de chromatographie d'exclusion de taille Zorbax CF-250 (DuPont - New England Nuclear) qui a permis d'obtenir après élution le récepteur T traité à la papaïne et à la neuraminidase sous forme d'un pic simple à environ 65 kDa par comparaison avec 75 kDa pour la protéine native.

Aucun signe de dissociation de chaîne n'était apparent.

Après concentration sur centripep, le matériau décrit ci-dessus a été incubé pendant une nuit à 37°C en présence d'endoglycosidase F et N-glycosidase F (Boehringer Mannheim) en conditions non-dénaturantes (0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,3), comme préconisé par le fabricant. Une purification finale a été effectuée au moyen d'une colonne de chromatographie d'échange d'anions à haute performance, Mono Q (Pharma¬ cia) .

Le rendement total à partir de 3,3 mg de récepteur T purifié par affinité était de 1,1 mg ou environ 34%.

Le matériau élue de la colonne anti-Vγ9. consistait essentiellement en hétérodimères γδ, dans la mesure où il était précipité par des anticorps monoclo¬ naux spécifiques de Vδ2. En outre, une analyse par SDS- PAGE en conditions réductrices et non réductrices a montré que ces hétérodimères étaient liés par une liaison covalente.

En effet, en conditions non réductrices, une bande principale diffuse ayant un poids moléculaire apparent de 75-80 kD était observé, qui se résolvait en conditions réductrices en deux composants majoritaires de 42 et 44 kD et deux composants minoritaires de 50 et 39 kD. Des motifs identiques ont été obtenus avec du matériel précipité par étapes avec des anticorps mono- clonaux anti-Vγ9 et anti-Vδ2. Au moyen d'anticorps monoclonaux générés contre ce récepteur soluble (anti¬ corps monoclonaux 360 et 389, cf. ci-après), il a pu être montré par la technique de Western-Blot que les bandes de 50 kD et 44 kD correspondaient à la chaîne γ, et que la bande de 42 et 39 kD correspondait à la chaîne δ. Les différences de tailles des espèces γ et δ solubles étaient dues aux différents degrés de N-glycosylation, comme cela a été précisé par la suite.

3. Obtention et propriétés des anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs T solubles de 1'invention a) Génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre des formes solubles de RT γδ après immunisation de souris contre des RT solubles γδ :

Des souris BALB/c ont été immunisées avec des récepteurs T solubles γδ, conformément au protocole suivant : au jour 1, 50 μg de protéine dans 500 μl d'adjuvant de Freund complet émulsifie à 50% dans NaCl à 0,9% ont été injectés par voie sous-cutanée en quatre

points différents. Au jour 25, le même protocole a été. répété dans de l'adjuvant de Freund incomplet. Un rappel a été effectué par 3 injections intrapéritonéales aux jours 50, 51 et 52, à l'aide de 15 μg de protéine chacun dans 250 μl de NaCl à 0,9%. Des splénocytes récoltés au jour 53 ont été fusionnés avec le myélome X63 Ag 8653. Des colonnies hypoxanthine/aminoptérine/thymidine résis¬ tantes ont été criblées par un essai radio-immunologique (RIA) à l'aide d'un récepteur T soluble marqué à l'iode, conformément à la méthode à l'IODOGEN.

A cet effet, des plaques de microtitration à 96 puits revêtus d'avidine (Immunotech) ont été incubées avec des immunoglobulines de chèvre-anti-souris biotinylées (GAMIG, Immunotech) dans PBS, BSA, NaN ₃ pendant une nuit à 4°C, puis lavées à 3 reprises dans du Tween PBS.100 μl (10 ⁵ cpm) de récepteurs T solubles radiomarqués ont été incubés pendant 2 heures à tempéra¬ ture ambiante et lavés à 3 reprises dans du PBS-Tween. Les récepteurs T solubles radiomarqués liés ont été dosés par comptage γ.

Neuf anticorps monoclonaux reconnaissant tout ou partie des lymphocytes T γδ humains ont été obtenus à partir d'une rate de souris immunisée, 2 anticorps anti-Vγ9 (292 et 360), 2 anticorps anti-Vδ2 (1 et 389), 1 anticorps pan γδ (510) et 4 anticorps dirigés contre des sous-populations γδ (49, 60, 103 et 515).

b) Réactivité des anticorps monoclonaux anti- RT solubles vis-à-vis de lignées lymphoïdes humaines mono et polyclonales :

Les anticorps monoclonaux ayant produit un signal RIA ont été ensuite testés par immunofluorescence pour déterminer leur aptitude à reconnaître des récep¬ teurs T liés aux membranes du clone G9. La spécificité fine de ces anticorps monoclonaux a finalement été

étudiée par criblage de leur réactivité vis-à-vis de clones et de lignées de lymphocytes T dont le phénotype du récepteur T était connu.

A partir d'une seule expérience de fusion, les surnageants de 16 colonnies (3% des puits ensemencés) ont donné un signal RIA positif et parmi eux, onze contenaient des anticorps monoclonaux reconnaissant le clone G9 dans un essai d'immunofluorescence indirect. La spécificité de 7 anticorps monoclonaux a été mesurée par analyse de flux cytométrique.

Trois anticorps monoclonaux (52, 106 et 510) étaient dirigés contre un déterminant qui était commun à tous les récepteurs Tγδ mais non aux récepteurs Tαβ. Deux anticorps monoclonaux (292 et 360) étaient spéci- fiques de récepteurs T comprenant la région Vγ9 et deux anticorps monoclonaux ( 1 et 389 ) de récepteurs T com¬ prenant la région γδ2. Aucune spécificité précise n'a pu être attribuée aux anticorps monoclonaux restants (49, 60, 103 et 515) qui reconnaissaient des sous-populations de lymphocytes γδ mais dont la réactivité n'a pu être corrélée à la présence d'une région V particulière de récepteur T (Tableau I ci-dessous).

Il est à noter que tous les anticorps monoclonaux étaient capables de reconnaître des ré- cepteurs T solubles non réduits dans des analyses de Western-Blott, et plusieurs réagissaient également avec des espèces γ ou δ isolées après réduction (Tableau II), à la différence de la plupart des anticorps monoclonaux V spécifiques générés contre des récepteurs T natifs (liés aux membranes) . En accord avec des attributions de spécificité déduites d'expériences de flux cytométriques, les anticorps monoclonaux 389 et 360 reconnaissaient différentes espèces (de masse moléculaire 39-42 kDa et 44-50 kDa, respectivement), qui pouvaient correspondre aux chaînes δet γ respectivement. En outre, dans la

mesure où les anticorps monoclonaux pan γδ52 et 510, et l'anticorps 389 spécifique de Vδ2 réagissant avec les mêmes espèces de 39-42 kDa, cela indiquant que les anticorps monoclonaux 52 et 510 étaient dirigés contre la région Cδ (Tableau I ) .

TABLEAU I

Analyse cytométrique en circulation de clones de Tγδ au moyen d'un anticorps monoclonal anti-RTs. Le phénotype des clones de lymphocytes T a été déterminé par marquage avec des anticorps Tiγa(anti-Vγ9) , TiVδ2) et A13 (anti-Vδl) ; NR (non réalisé).

TABLEAU II

Résultats des analyses en Western-Blot de récepteurs T solubles à l ' aide d 'anticorps anti-RTs.

La masse moléculaire apparente (en kDa) des espèces reconnues par chaque anticorps est rapportée.

( * NR = pas de réactivité ; R = réactivité)

EXEMPLE 2

1. Construction d'autres récepteurs T solubles γδ

D'autres récepteurs solubles γδ ont été préparés comme décrits ci-après, après modification du site multiple de clonage du vecteur d'expression pKCR6.

a) Modification du site multiple de clonage du vecteur d'expression pKCR6 Afin de faciliter et de permettre l'intégra¬ tion orientée des ADN complémentaires codant pour les chaînes gamma et delta solubles dans le vecteur d'expres¬ sion en système eucaryote pKCR6, un fragment d'ADN préalablement clone entre les sites Xba I et Sal I du vecteur pKCSRα a été introduit entre les sites Kpn I de ce vecteur.

La digestion du vecteur pKCR6 ainsi modifié par les enzymes Xho I et Xba I a libéré ces deux sites et permis un clonage orienté, le site Xho I se situant entre 5 ' de la séquence codante et le site Xba I en 3' . b) Génération d'un ADN complémentaire codant pour une chaîne Vγ8 soluble bl ) Clonage par PCR d'une chaîne Vγ8 soluble L'ARN utilisé pour ce clonage est issu d'un clone Tγδ.

L'amorce oligonucléotidique utilisée pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire est la suivante :

5' GGG TTA CTG CAG CAG TAG TGT ATC 3'

L'amplification de cet ADNc a été effectuée à l'aide de 1 'oligonucleotide décrit précédemment utilisé

comme amorce anti sens et d'une amorce sens contenant un site pour l'enzyme de restriction Xho I en amont du codon d'initiation de la traduction. La séquence de cet oligonucleotide est la suivante :

5' CCC TCG AGA TGC TGT TGG CTC TAG CTC 3'

Le fragment d'ADN obtenu à l'issue de cette amplification a été clone dans le vecteur pBS-SK ouvert par l'enzyme de restriction Sma I puis séquence. La séquence obtenue est conforme à celle décrite dans la littérature (Cell. (1986) 45:237-246) à l'exception de la séquence jonctionnelle impliquant le segment Jγl :

Vγ8 N Jγl

TGT GCC ACC TC-G GAC AGT CAT TAT TAT AAG AAA CTC TTT

b2) Intégration dans le vecteur d'expression et transfection dans les cellules eucaryotes Le fragment d'ADNc codant pour une chaîne Vγ8 soluble a été extrait du vecteur pBS-SK après digestion par les enzymes de restriction Xho I et Xba I et intégré dans le vecteur d'expression pKCRô modifié décrit en a) digéré par les mêmes enzymes. Le vecteur ainsi obtenu a été co-transfecté en association avec le vecteur d'expression contenant l'ADNc codant pour la chaîne Vδ2 soluble.

La procédure de transfection, de criblage des clones producteur et de purification des TCR solubles produits est analogue à celle décrite ci-dessus pour la production de TCR Vγ9 Vδ2 soluble.

c) Génération d'un ADN complémentaire codant pour un chaîne Vδ3 soluble cl) Clonage par PCR d'une chaîne Vδ3 soluble

L'ARN utilisé pour ce clonage est issu d'un clone Tγδ.

L'amorce nucléotidique utilisée pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire est la suivante :

5' GGG TTA CTT CTC GGT ATG AAC TAT GGC 3'

L'amplification de cet ADNc a été effectuée à l'aide de l'oligonucleotide décrit précédemment utilisé comme amorce anti sens et d'une amorce sens contenant un site pour 1 'enzyme de restriction Xho I en amont du codon d'initiation de la traduction. La séquence de cet oligonucleotide est la suivante :

5' GAC TCG AGA AAA GAT GAT TCT TAC TGT GGG 3

Le fragment d'ADN obtenu à 1'issue de cette amplification a été clone dans le vecteur pBS-SK ouvert par l'enzyme de restriction Sma I puis séquence. La séquence obtenue est conforme à celle décrite dans la littérature (J. Exp. Med. (1989) 169:393-405) à l'excep¬ tion de la séquence jonctionnelle impliquant les segments Dδ2, Dδ3 et Jδl :

N Dδ3 CGG CTC T TG GGG G AC ACC

c2) Intégration dans le vecteur d'expression et transfection dans les cellules eucaryotes

Le fragment d'ADNc codant pour une chaîne Vδ3 soluble a été extrait du vecteur pBS-SK après digestion

par les enzymes de restriction Xho I et Xba I et intégré dans le vecteur d'expression pKCRδ modifié décrit en a) digéré par les mêmes enzymes.

Le vecteur ainsi obtenu a été co-transfecté en association avec le vecteur d'expression contenant l'ADNc codant pour la chaîne Vγ9 soluble.

La procédure de transfection, de criblage des clones producteurs et de purification des TCR solubles produits est analogue à celle décrite ci-dessus pour la production de TCR Vγ9 Vγ2 soluble.

d) Génération d'un ADN complémentaire codant pour un chaîne Vδl soluble

On a utilisé l'ADN complémentaire d'une chaîne Vδl Cδ total clone dans le vecteur pBS-SK entre les sites de restriction Sal I et Bam HI.

Ce fragment a été séquence dans sa totalité et ne présente pas de variation par rapport à la séquence décrite dans la littérature (Eur. J. Immunol. (1989) 19:1545-1549) à l'exception de la séquence jonctionnelle impliquant les segments Dδ2 et Jδl :

Vδl Dδ2 N TGT GCT CTT GGG GAC TTC CTA AAG GGT TCA GGT ACC ACC TAT

Jδl CCA TGG GAA CTC ATC TTT

e) Intégration dans le vecteur d'expression et transfection dans les cellules eucaryotes

La digestion par les enzymes de restriction

Xho I et Eco RI du vecteur pBS-SK contenant l'ADNc Vδl

Cδ libère un fragment d'ADN codant pour la totalité de la partie variable Vδl Dδ2 Jδl et la portion du premier

exon de la partie constante Cδ comprise entre la région jonctionelle et le site unique Eco RI.

Ce fragment d'ADN a été purifié et intégré dans le vecteur d'expression pKCR6 contenant la chaîne Vδ3 soluble après qu'il ait été digéré par les enzymes de restriction Xho I et Eco RI. Cette stratégie a donc permis de remplacer la partie variable Vδ3 par la partie variable Vδl et ainsi de construire un ADNc codant pour une chaîne Vδl soluble. Le vecteur ainsi obtenu a été co-transfecté en association avec le vecteur d'expression contenant l'ADNc codant pour la chaîne Vγ9 soluble.

La procédure de transfection, de criblage des clones producteurs et de purification des TCR solubles produits est analogue à celle décrite pour la production de TCR Vγ9 Vδ2 soluble.

2. Détection et purification d'autres récepteurs Tyδ solubles a) Détection des différents récepteurs solubles, contrôle de spécificité

De la même manière que décrit précédemment, 2 IRMA ont été mis au point avec l'anticorps 510 comme anticorps de phase et avec les anticorps 360 et 389 comme traceurs. Ces 2 IRMA ont été testés sur les surnageants de CHO transfectés avec les gènes Vγ9/Vδ2, Vγ9/Vδ3, Vγ8/Vδ2. Seuls les traceurs correspondants au V trans- fecté donnent un signal, fournissant ainsi un bon contrôle de spécificité.

b) Mise au point d'une méthode générale de purification

La purification précédemment décrite pour isoler le récepteur Vγ9Vδ2 consistait en une immunopuri- fication avec un anticorps anti Vγ9 (Y102 ou 7B6 ) . Une

colonne d'affinité de même type mais utilisant l'anti¬ corps 510 décrit ci-dessus et qui reconnaît un détermi¬ nant de la chaîne constante delta a été utilisée. L'avantage de cette nouvelle purification est la possibi- lité de purifier n'importe quel récepteur soluble de l'invention quelles que soient les chaînes variables γ, δ, et même α, β qu'elles contiennent. Cette méthode a d'abord été testée pour purifier le récepteur soluble contenant Vγ9/Vδ3. 5 mg d'anticorps 510 ont été liés de manière covalente à lg d'une matrice de billes de sépharose 4B activées au bromure de cyanogène (PHARMACIA, Upsalla, Suède) selon les indications du fournisseur.

Le surnageant de culture du transfectant γ9δ3 a été appliqué sur la colonne d'affinité ainsi formée à raison de 10 ml/heure à température ambiante. Après lavage par une solution saline de tampon phosphate PBS (phosphate 0.01 M, NaCl 0.14 M pH 7,2 même débit), le matériau lié a été élue avec une solution de citrate 0.05 M à pH 3.0. Les fractions éluées ont été neutrali¬ sées immédiatement par un tampon Tris 0.2 M pH 9 (100 μl pour 1ml d'éluat) .

Les fractions positives pour 1 'activité RT soluble comme attesté par le test IRMA ont été rassem- blées, et concentrées à lμg/ml de protéines sur cellule CENTRICON (barrière 30KD) (AMICON, Beverly, MA, USA) suivant les instructions du fabricant. Cette cellule a permis également de changer le tampon pour du PBS.

L'analyse des protéines éluées a été effec- tuée en SDS-PAGE et par Western-Blot. L'analyse a donné des résultats légèrement différents par rapport au γ9δ2. En effet, en conditions non réductrices, trois bandes fortement majoritaires de poids moléculaires 65, 68, 70kD qui se résolvaient en quatre bandes majoritaires 32.5, 34, 36 et 40kD. L'analyse en Western-Blot avec les

anticorps 510 (anti Cδ) et 360 (anti Vγ9) ont montré que toutes les bandes majoritaires observées précédemment en conditions non réductrices réagissaient avec les deux anticorps. En conditions réductrices, les bandes réagis- saient soit avec l'anticorps 360 soit avec l'anticorps 510.

De cette analyse, on peut conclure que le métériel élue de la colonne d'affinité consiste essen¬ tiellement en hétérodimères γδ, liés de manière covalen- te, vraisemblablement présents sous forme de plusieurs isomères de glycosylation.