技术领域

本发明属于合成生物学领域； 更具体地， 本发明涉及利用微生物生产甜菊糖苷类化合 物的方法。 背景技术

莱鲍迪苷 A(RebA)是 rebfl ^'imfl)中提取的新型天然甜味剂，它具有 甜度高， 热值含量低， 稳定性好等特点。 莱鲍迪苷 A与其它甜菊糖苷相比， 它的甜度最 高， 约为蔗糖的 450倍以上， 热值仅为蔗糖的 1/300。 莱鲍迪苷 A甜度高、 色泽洁白、 甜味纯正、 无异味， 因此它是一种蔗糖以及化学合成甜味剂的天然 最佳替代品， 被国际 上誉为 "世界第三糖源" 。

目前从甜叶菊中分离得到的甜菊糖苷类化合物 的结构式如图 1所示， 随着 Rl、 R2 为不同， 产生不同侧链修饰的的甜菊糖苷类化合物， 具体见表 1。 甜菊糖中莱鲍迪苷 A 含量越高， 甜味就越纯正， 也就受越多的消费者青睐， 因此在甜菊糖生产过程中必须提 高产品中莱鲍迪苷 A的含量。

表 1、 从甜叶菊分离的甜菊糖苷类化合物

序号 化合物 R1 R2

1 甜菊醇 H H

2 a

甜菊醇单糖苷 H β o-Glc

3 甜菊醇双糖苷 H P-Glc-P-Glc(2→l)

4 甜茶素 β-Glc β-Glc

5 甜菊糖苷 β-Glc P-Glc-P-Glc(2→l)

6 甜菊糖莱鲍迪苷 A β-Glc P-Glc-P-Glc(2→l) β-Glc (3→1)

7 甜菊糖莱鲍迪苷 B H P-Glc-P-Glc(2→l) β-Glc (3→1)

8 甜菊糖莱鲍迪苷 C β-Glc P-Glc-a-Rha(2→l)

9 甜菊糖莱鲍迪苷 D P-Glc-P-Glc(2 →1) P-Glc-P-Glc(2→l) β-Glc (3→1)

10 甜菊糖莱鲍迪苷 E P-Glc-P-Glc(2 →1) P-Glc-P-Glc(2→l)

1 1 甜菊糖莱鲍迪苷 F β-Glc P-Glc-a-Xly(2→l)

12 杜可尔苷 A β-Glc P-Glc-a-Rha(2→l) 目前， 甜菊糖苷类化合物已被广泛的用于食品、 饮料、 医药、 化妆品等行 研究表明， 甜菊糖苷类化合物还具有预防高血压， 糖尿病， 心脏病等保健作用。 因此， 甜菊糖苷类化合物的需求在近年来快速增长。

目前市场上的莱鲍迪苷 A主要是从甜菊叶中提取， 制备流程主要为： 干燥粉碎甜菊 叶、 液相浸提、 除杂、 树脂处理、 喷雾干燥和精制等步骤。 通常情况下， 甜叶菊叶片可 以积累多达占干重 4%-20%的甜菊糖。 但是甜菊的种植需要占用大量的土地， 而且甜菊 糖生产存在甜菊品质参差不齐、 原料转化效率不高和提取产品的纯度低等诸多 问题。 因 此研究一种原料易得、生产安全和提取方法简 单的新型的莱鲍迪苷 A大规模生产方法显 得非常必要。

随着近十年合成生物学技术的进步， 利用微生物异源合成的方法生产某些化合物成 为可能。 它将具有成本低， 占地面积少， 产品质量易控等优， 但目前还未见有异源生物 合成莱鲍迪苷 A的报道， 其关键的技术难题是， 在莱鲍迪苷 A生物合成途径中， 从甜 菊醇单糖苷经一步糖基化反应得到甜菊醇双糖 苷的转移酶是未知的。 因此， 本领域迫切 需要克服现有技术难题， 实现莱鲍迪苷 A的微生物合成。 发明内容

本发明的目的在于提供一种利用微生物生产甜 菊糖苷类化合物的方法。

本发明在第一方面， 提供了一种分离的多肽， 其特征在于， 所述的多肽是非甜叶菊 来源的糖基转移酶， 用于催化在甜菊糖苷类化合物的 0-葡萄糖残基的 C-2' 再转移上 一个糖。

优选地， 其氨基酸序列与甜叶菊来源的具有同一功能的 酶的氨基酸序列一致性不大 于 95%， 较佳的， 不大于 80%; 较佳的， 不大于 70%; 较佳的， 不大于 60%; 较佳的， 不大于 50%; 更佳的， 不大于 40%; 更佳的， 不大于 30%。

在一个优选例中， 所述的非甜叶菊来源糖基转移酶来源于斯塔摩 酵母 (Starmerella bombicola)或甘薯 (Ipomoea batatas)。

在另一优选例中，所述的来源于斯塔摩酵母的 糖基转移酶，其特征在于，具有如 SEQ ID NO: 41的氨基酸序列 (称为 UGTB1)或在 SEQ ID NO: 41基础上经过一个或多个氨基 酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白。

在另一优选例中，所述的来源于甘薯的糖基转 移酶，其特征在于，具有如 SEQ ID NO: 51所示的氨基酸序列 (称为 IBGT), 或在 SEQ ID NO: 51基础上经过一个或多个氨基酸 残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白。

本发明在另一方面， 提供了一种分离的核苷酸序列， 其特征在于， 所述的核苷酸序 列编码非甜叶菊来源的糖基转移酶， 用于催化在甜菊糖苷类化合物的 0-葡萄糖残基的 C-2' 再转移上一个糖。

在一个优选例中， 所述的核苷酸序列具有： （1)如 SEQ ID NO:42所示的序列， 或与

SEQ ID NO: 42同源度在 70%及以上的序列 (较佳的， 在 80%以上； 更佳的在 90%以上， 更佳的在 95%以上 X2)如 SEQ ID NO:52所示的序列， 或与 SEQ ID NO: 52同源度在在 70%及以上的序列 (较佳的， 在 80%以上； 更佳的在 90%以上， 更佳的在 95%以上）。

在另一优选例中，所述的核苷酸序列是 (1)如 SEQ ID NO:42所示的序列或 (2)如 SEQ ID NO:52所示的序列。 本发明在另一方面， 提供了一种非甜叶菊来源的糖基转移酶的用途 ， 用于在宿主细 胞中重组表达以制备甜菊糖苷类化合物， 其特征在于， 催化在甜菊糖苷类化合物的 0- 葡萄糖残基的 C-2， 再转移上一个糖。

在一个优选例中， 所述的糖基转移酶的催化底物包括但不限于甜 菊醇 -13-0-葡萄糖 苷 (又称甜菊醇单糖苷)、 甜茶素 (又称甜叶悬钩子苷)、 甜菊糖苷、 莱鲍迪苷 A; 优选的， 催化甜菊醇单糖苷生成甜菊醇双糖苷。

本发明在另一方面， 提供了一种合成甜菊糖苷类化合物的方法， 其特征在于， 在宿 主细胞中重组表达能催化在甜菊糖苷类化合物 的 0-葡萄糖残基的 C-2' 再转移上一个 糖的非甜叶菊来源的糖基转移酶。 。

在一个优选例中， 所述的宿主细胞还含有下述中的一个或多个：

(a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶，

(b)选自以下 (I)或 (Π)的酶： （I)古巴焦磷酸合成酶和贝壳烯合成酶， （Π)双功能贝壳烯 合酶，

(c)贝壳烯氧化酶，

(d)细胞色素 P450氧化还原蛋白，

(e)贝壳烯酸 -13 α -羟化酶，

(f) UGT85C2糖基转移酶，

(h) UGT74G1糖基转移酶，

(i) UGT76G1糖基转移酶。

在另一优选例中， 所述的的宿主细胞还含有包括以下酶的基因表 达盒： 1-脱氧木糖

-5-磷酸合成酶， 2-甲基赤藓糖 -4-磷酸胞苷转移酶， 2-甲基赤藓糖 -2,4-环二磷酸合成酶和 异戊烯焦磷酸异构酶。

在另一优选例中， 所述的宿主细胞选自： 原核微生物细胞或真核微生物细胞。

在另一优选例中， 所述的原核微生物是： 大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌， 醋酸杆菌、 棒 状杆菌、 短杆菌； 更佳地， 所述大肠杆菌选自： BL21、 BLR、 DH10B、 HMS、 CD43、 JM109、 DH5 α或 Noveblue; 或所述的真核微生物细胞是： 酵母菌、 霉菌、 担子菌； 所 述的酵母菌是： 毕赤酵母， 酿酒酵母， 乳酸克鲁维酵母。 较佳地， 所述的毕赤酵母选自 GS115、 MC100-3、 SMD1163、 SMD1165、 SMDl 168或 KM71； 较佳地， 所述的酿酒酵 母选自 W303、 CEN.PK2、 S288c、 FY834或 S1949; 较佳地， 所述的乳酸克鲁维酵母选 自 GG799。

在本发明的另一方面， 提供一种合成甜菊糖苷类化合物的方法， 包括： 在细胞中 重组表达 (较佳地， 为异源表达

(a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS),

(b)选自以下 (I)或 (Π)的酶： （I)古巴焦磷酸合成酶 (CDPS)和贝壳烯合成酶 (KS)， (II) 双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS), (c)贝壳烯氧化酶 (KO)，

(d)细胞色素 P450氧化还原蛋白 (CPR)，

(e)贝壳烯酸 - 13 α -羟化酶，

f) UGT85C2糖基转移酶， 和

(g)UGTB l/IBGT糖基转移酶；

培养所述的细胞， 从而生成甜菊糖苷类化合物。

在一个优选例中， 还包括重组表达：

(h) UGT74G l糖基转移酶， 禾口 /或

(i) UGT76G l糖基转移酶。

在另一优选例中， 重组表达所述的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成 酶、 古巴焦磷酸合 成酶、 贝壳烯合成酶、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 - 13 α -羟化酶、 UGT85C2糖基转移酶和 UGTB 1/IBGT糖基转移酶， 从而合成甜菊醇双糖苷。

在另一优选例中， 重组表达所述的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成 酶、 古巴焦磷酸合 成酶、 贝壳烯合成酶、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 - 13 α -羟化酶、 UGT85C2糖基转移酶， UGTB 1/IBGT糖基转移酶和 UGT74G1糖基转移酶， 从而合成甜菊糖苷。

在另一优选例中， 重组表达所述的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成 酶、 古巴焦磷酸合 成酶、 贝壳烯合成酶、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 - 13 α -羟化酶、 UGT85C2糖基转移酶， UGTB 1/IBGT糖基转移酶， UGT74G 1糖基转移酶和 UGT76G1糖基转移酶， 从而合成莱 鲍迪苷 Α。

在另一优选例中， （b)项中， 采用 (Π)双功能贝壳烯合酶。

在另一优选例中， 所述的方法中， 所述的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶来源于 加 拿大红豆杉（Γ<¾;α« cimi½?ew;^)或甜叶菊 rebaudiana)(i ^i& , 来源于加拿大红豆 杉)；

所述的古巴焦磷酸合成酶来源于甜叶菊或慢生 大豆根瘤菌 (Bradyrhizobium fl/w 'c m) (；优选地， 来源于甜叶菊）；

所述的贝壳烯合成酶来源于甜叶菊或慢生大豆 根瘤菌 (优选地， 来源于甜叶菊)； 所述的双功能贝壳烯合酶来源于小立碗藓 (Physcomitrella patens)或藤仓赤霉 {Gibberella fujikuroi) (优选地， 来源于小立碗藓）；

所述的贝壳烯氧化酶来源于甜叶菊、 藤仓赤霉、 阿拉伯芥 (ArabWo/^ thaliana)或 慢生大豆根瘤菌 (优选地， 来源于甜叶菊)；

所述的贝壳烯酸 - 13ct-羟化酶来源于甜叶菊、 阿拉伯芥 (优选地， 来源于甜叶菊)； 所述的 UGT85C2糖基转移酶、 UGT74G1糖基转移酶、 UGT76G1糖基转移酶来源 于甜叶菊；

所述的 UGTB 1 糖基转移 bombicola); 所述的 IBGT 糖基转移酶来源于甘薯 (Ipomoea batatas) ;所述的细胞色素 P450氧化还原蛋白来源于黄 花蒿 (Ar em a imm i ， 暗球腔菌 (Phaeosphaeria sp. L487)， 藤仓赤霉， 甜叶菊或阿拉伯 芥 (优选地， 来源于暗球腔菌)。

在另一优选例中， （b)项中， 采用 (Π)双功能贝壳烯合酶； 且， 所述的栊牛儿基栊牛 儿基焦磷酸合成酶来源于加拿大红豆杉， 所述的双功能贝壳烯合酶来源于小立碗藓， 所 述的贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 -13ct-羟化酶、 UGT85C2糖基转移酶、 UGT74G1糖基转移 酶、 UGT76G1糖基转移酶来源于甜叶菊； 所述的 UGTB1糖基转移酶来源于斯塔摩酵母; 所述的细胞色素 P450氧化还原蛋白来源于暗球腔菌； 所述的 IGBT糖基转移酶来源于 甘薯 (Ipomoea batatas)。

在另一优选例中， 所述的来源于加拿大红豆杉的栊牛儿基栊牛儿 基焦磷酸合成酶， 在野生型的基础上去除了 N端的质体转运肽序列； 较佳地， 去除了 N端 98个氨基酸； 所述的来源于黄花蒿的细胞色素 P450氧化还原蛋白， 在野生型基础上去除了 N端 跨膜区序列； 较佳地， 去除了 N端 66个氨基酸。

在另一优选例中， 所述的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶具有 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列， 或在 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 45基础上经过一 个或多个 (如 1-30个，较佳地 1-20个，更佳地 1-10个，更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白；

所述的古巴焦磷酸合成酶具有 SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列， 或在 SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO: 25基础上经过一个或多个 (如 1-30个，较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个，更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成� �同功能衍生蛋白； 所述的贝壳烯合成酶具有 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 27所示的氨基酸序列， 或 在 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 27基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个，更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成� �同功能衍生蛋白； 所述的双功能贝壳烯合酶具有 SEQ ID NO: 21或 SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序 歹 lj， 或在 SEQ ID NO: 21或 SEQ ID NO: 23基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成� �同功能 衍生蛋白；

所述的贝壳烯氧化酶具有 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 3 K SEQ ID NO: 37或 SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列， 或在 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 37或 SEQ ID NO: 29基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白；

所述的贝壳烯酸 -13α-羟化酶具有 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 43、 SEQID NO: 47 或 SEQ ID NO: 49所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 43、 SEQID NO: 47或 SEQ ID NO: 49基础上经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的 同功能衍生蛋白；

UGT85C2糖基转移酶具有 SEQ ID NO: 1 1所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 1 1 基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个)氨基 酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白；

UGT74G1糖基转移酶具有 SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 13 基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个)氨基 酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白；

UGT76G1糖基转移酶具有 SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 15 基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个)氨基 酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白；

所述的 UGTB1糖基转移酶具有 SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 41基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个） 氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白；

所述的 IBGT糖基转移酶具有 SEQ ID NO: 51所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 51基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个） 氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白； 或

所述的细胞色素 P450氧化还原蛋白具有 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID

NO: 33、 SEQ ID NO: 35或 SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列，或在 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 35或 SEQ ID NO: 39基础上经过一个或多个 (如 1-30个， 较佳地 1-20个， 更佳地 1-10个， 更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成同功能衍生蛋白。

在另一优选例中， 所述的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶的编码 基因具有 SEQ ID

NO: 2或 SEQ ID NO: 46所示的核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 46序列 有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序� �；

所述的古巴焦磷酸合成酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 26所示的 核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 26序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码 同功能蛋白的核苷酸序列；

所述的贝壳烯合成酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 6或 SEQ ID NO: 28所示的核苷 酸序列， 或与 SEQ ID NO: 6或 SEQ ID NO: 28序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳 地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功 能蛋白的核苷酸序列；

所述的双功能贝壳烯合酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 22或 SEQ ID NO: 24所示的 核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO: 22或 SEQ IDNO: 24序列有 50%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码 同功能蛋白的核苷酸序列； 所述的贝壳烯氧化酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 38或 SEQ ID NO: 30所示的核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 38或 SEQ ID NO: 30序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序� �； 所述的贝壳烯酸 -13α-羟化酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 44、 SEQ

ID NO: 48或 SEQ ID NO: 50所示的核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 44、 SEQ ID NO: 48或 SEQ ID NO: 50序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷 酸序列；

UGT85C2糖基转移酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列，或与 SEQ

ID NO: 12序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳 地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序� �；

UGT74G1糖基转移酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列，或与 SEQ ID NO: 14序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳 地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序� �；

UGT76G1糖基转移酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列，或与 SEQ ID NO: 16序列有 70%以上 (较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳 地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序� �；

所述的 UGTB1糖基转移酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 42所示的核苷酸序列， 或 与 SEQ ID NO: 42序列有 50%以上 (较佳地 60%以上； 较佳地 70%以上； 较佳地 80%以 上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的 编码同功能蛋白的核苷酸序列；

所述的 IBGT糖基转移酶的编码基因具有 SEQ ID NO: 52所示的核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO: 42序列有 50%以上 (较佳地 60%以上； 较佳地 70%以上； 较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码 同功能蛋白的核苷酸序列或

所述的细胞色素 P450氧化还原蛋白的编码基因具有 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 36或 SEQ ID NO: 40所示的核苷酸序列； 或与 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 36或 SEQ ID NO: 40序列有 70% 以上 (；较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳的 93%以上； 更佳地 95%以上； 更佳的 97%以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序� �。

在另一优选例中， 所述的细胞选自 (但不限于)； 原核微生物细胞， 真核微生物细胞。 在另一优选例中， 所述的原核微生物是 (但不限于)： 大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌， 醋 酸杆菌、 棒状杆菌、 短杆菌； 更佳地， 所述大肠杆菌选自： BL21、 BLR、 DH10B、 HMS、 CD43、 JM109、 DH5a或 Noveblue。 在另一优选例中， 所述的真核微生物细胞是 (但不限于)： 酵母菌、 霉菌、 担子菌； 所述的酵母菌是 (但不限于)： 毕赤酵母， 酿酒酵母， 乳酸克鲁维酵母。 较佳地， 所述的 毕赤酵母选自 GS 115、 MC100-3、 SMD1163、 SMD1165、 SMD1 168或 KM71； 较佳地， 所述的酿酒酵母选自 W303、 CEN.PK2、 S288c、 FY834或 S1949; 较佳地， 所述的乳酸 克鲁维酵母选自 GG799。

在另一优选例中， 当所述的细胞为革兰氏阴性菌株， 采用 pET、 pBAD和 pQE系列 表达载体 (如 pET28a 和 pET21c)来重组表达各酶； 或当所述的细胞为酵母细胞， 采用 pPIC (如 pPIC3.5)或 pSY系列表达载体 (如 pSYOl)来重组表达各酶。

在另一优选例中， 所述的方法包括： 将各 (a)-(g)及可选地 (h)-(i)各酶的编码基因插 入到所述的重组表达载体中， 构建基因表达盒， 用于重组表达所述的酶。

在本发明的另一方面， 提供一种用于合成甜菊糖苷类化合物的表达构 建物 (如表达 载体)， 其中包括以下酶的基因表达盒：

(a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS),

(b)选自以下 (I)或 (Π)的酶： （I)古巴焦磷酸合成酶 (CDPS)和贝壳烯合成酶 (KS)， (II) 双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS),

(c)贝壳烯氧化酶 (KO)，

(d)细胞色素 P450氧化还原蛋白 (CPR)，

(e)贝壳烯酸 -13 α -羟化酶，

f) UGT85C2糖基转移酶， 和

(g)UGTBl/IBGT糖基转移酶。

在另一优选例中，所述的用于合成甜菊糖苷类 化合物的表达构建物还包括以下酶的 基因表达盒：

(h) UGT74Gl糖基转移酶， 禾口 /或

(i) UGT76Gl糖基转移酶。

在本发明的另一方面， 提供一种用于甜菊糖苷类化合物前体途径强化 的表达构建 物， 其包括以下酶的基因表达盒：

1-脱氧木糖 -5-磷酸合成酶 (DXS)， 2-甲基赤藓糖 -4-磷酸胞苷转移酶 (CMS), 2-甲基 赤藓糖 -2,4-环二磷酸合成酶 (MCS)和异戊烯焦磷酸异构酶 (IDI)。

在本发明的另一方面， 提供一种用于合成甜菊糖苷类化合物的宿主细 胞， 其中包含 所述的用于合成甜菊糖苷类化合物的表达构建 物。

在另一优选例中，所述的用于合成甜菊糖苷类 化合物的宿主细胞为非生殖材料及非 繁殖材料。

在另一优选例中， 所述的用于合成甜菊糖苷类化合物的细胞选自 (但不限于)； 原核 微生物细胞， 真核微生物细胞。

在另一优选例中，所述的用于合成甜菊糖苷类 化合物的宿主细胞中还包括所述的用 于甜菊糖苷类化合物前体途径强化的表达构建 物。

在本发明的另一方面， 提供一种制备贝壳烯的方法， 包括： 在原核微生物细胞， 真 核微生物细胞中重组表达 (较佳地， 为异源表达)：

(a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS), 和

双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS)。

在另一优选例中，所述的栊牛儿基栊牛儿基焦 磷酸合成酶来源于加拿大红豆杉或甜 叶菊； 或所述的双功能贝壳烯合酶来源于小立碗藓或 藤仓赤霉。

在本发明的另一方面， 提供一种用于制备贝壳烯的表达构建物， 其中包括以下酶的 基因表达盒：

(a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶和

(b)双功能贝壳烯合酶。

在本发明的另一方面， 提供一种用于制备贝壳烯的宿主细胞， 其中包含所述的用于 制备贝壳烯的表达构建物；和 /或所述的用于甜菊糖苷类化合物前体途径强� �的表达构建 物。

在另一优选例中， 所述的制备贝壳烯的宿主细胞是革兰氏阴性 DE3 溶源化菌株， 酵母细胞。

在本发明的另一方面， 提供 UGTB1/IBGT糖基转移酶的用途， 用于将甜菊醇单糖 苷转化为甜菊醇双糖苷 (较佳地， 在甜菊醇单糖苷的 C-13葡萄糖的 C-2 ' 位点上加上糖 基)。

在本发明的另一方面， 提供双功能贝壳烯合酶的用途， 用于将香叶基香叶基焦磷酸 转化为贝壳烯。

在本发明的另一方面， 提供一种用于制备甜菊糖苷类化合物的酶的组 合， 所述组合 包括：

(a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS),

(b)选自以下 (I)或 (Π)的酶： （I)古巴焦磷酸合成酶 (CDPS)和贝壳烯合成酶 (KS)， (II) 双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS),

(c)贝壳烯氧化酶 (KO)，

(d)细胞色素 P450氧化还原蛋白 (CPR)，

(e)贝壳烯酸 -13 α -羟化酶，

(f) UGT85C2糖基转移酶， 禾口

(g) UGTBl/IBGT糖基转移酶。

在另一优选例中， 所述的酶的组合还包括：

(h) UGT74Gl糖基转移酶，

(i) UGT76Gl糖基转移酶。

在本发明的另一方面， 提供一种用于制备甜菊糖苷类化合物的试剂盒 ， 所述试剂盒 中包括： 所述的用于合成甜菊糖苷类化合物的表达构建 物； 更佳地还包括所述的用于甜 菊糖苷类化合物前体途径强化的表达构建物； 或

所述试剂盒中包括： 所述的用于合成甜菊糖苷类化合物的宿主细胞 。

在本发明的另一方面， 提供一种用于制备贝壳烯的组合 (如含有酶的试剂盒)， 所述 组合包括： （a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS), 和 (b)双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS)。

在另一优选例中， 所述的用于制备贝壳烯的组合还包括： 1-脱氧木酮糖 -5-磷酸合成 酶 (DXS, l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase) , 2-甲基赤藓糖 -4-磷酸胞苷转移酶 (CMS, 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase), 2-甲基赤藓糖 -2,4-环二磷 酸合成酶 (MCS， 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase)和异戊烯焦磷酸异 构酉每 (IDI， isopentenyl-di hos hate delta-isomerase)。

在本发明的另一方面， 提供一种用于制备贝壳烯的试剂盒， 所述试剂盒中包括： 所 述的用于制备贝壳烯的表达构建物； 更佳地还包括所述的用于甜菊糖苷类化合物前 体途 径强化的表达构建物； 或所述试剂盒中包括： 所述的用于制备贝壳烯的宿主细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明

图 1、 甜菊糖苷类化合物的结构式。

图 2、 莱鲍迪苷 A的生物合成过程示意图。 图 3A、 质粒 pET28a-ggw^图谱， 插入 位点 Ncol/Hindlll;

图 3B、质粒 pET2\c-Inserted gene, Inserted gene为 cdps, cps/ks,ks,ko,kah,ugt85c2, ugtbl , ugt74gl , wg 76gJ九个基因单独克隆的质粒插入位点 (Ndel/Hindlll);

图 3C、 质粒 pET21d-cpr图谱 (插入位点 Ncol/Hindlll);

图 3D、 质粒 pJF47(pET21d-^^-^pD-^pF-W)图谱；

图 3E、质粒 pZQ110(pET28a-ggp/^-c/^/fc?-fco-^^- g S5c2- g W- g 74W -ugt76gl-cpr) 图谱；

图 3F、 质粒 pZQllO载体的酶切验证图谱；

图 3G、 fi pPIC3.5K-Inserted gene, Inserted gene为 cdps, cps/ks, ks, ko， kah, ugt85c2, ugtbl , ugt74gl, wg 76^九个基因单独克隆的质粒插入位点（Bglll/Not ll); 图 3H、质粒 pZQ2l0(pSYl-ggpps-cps/ks-ko-kah-ugt85c2-iigtbl-iigt74gl -ugt76gl-cpr) 图谱；

图 31、 质粒 p ZQ210载体的 PCR验证图谱。

图 4A、 cdps基因和 ugt85c2基因表达的 SDS-PAGE图谱；

图 4B、 ko基因和 ks基因表达的 SDS-PAGE图谱；

图 4C、 kah基因表达的 SDS-PAGE图谱； 图 4D、 ugt74gl基因表达的 SDS-PAGE图谱；

图 4E、 ugt76gl基因表达的 SDS-PAGE图谱。

图 5A、 实施例 6所得的发酵液中的贝壳烯的 GC-MS图；

图 5B、 实施例 6所得的发酵液中的贝壳烯产量。

图 6A、 实施例 7所得的发酵液中的 HPLC图；

图 6B、 实施例 7所得的发酵液中的贝壳烯酸的 HPLC-MS图；

图 6C、 实施例 7所得的发酵液中的甜菊醇的 HPLC-MS图；

图 6D、 实施例 7所得的发酵液中的甜菊醇单糖苷的 HPLC-MS图；

图 6E、 实施例 Ί所得的发酵液中的莱鲍迪苷 A的 HPLC-MS图；

图 6F、 实施例 7所得的发酵液中的莱鲍迪苷 A产量。

图 7、 实施例 9所得的发酵液中的贝壳烯产量。

图 8、 实施例 10所得的发酵液中的莱鲍迪苷 A产量。

图 9、 实施例 1 1所得发酵液中甜菊醇单糖苷和甜菊醇双糖苷 HPLC-MS图。

9a、含 pZQ 107表达载体的工程菌发酵液中甜菊醇单糖苷和 甜菊醇双糖苷 HPLC-MS 图。

9b、含 pZQ 108表达载体的工程菌发酵液中甜菊醇单糖苷和 甜菊醇双糖苷 HPLC-MS 图。

9c、含 pZQ 105表达载体的工程菌发酵液中甜菊醇单糖苷和 甜菊醇双糖苷 HPLC-MS 图。

9d、含 pZQ 109表达载体的工程菌发酵液中甜菊醇单糖苷和 甜菊醇双糖苷 HPLC-MS 图。

图 10、 实施例 1 1中不同来源表达质粒转化细胞后的甜菊醇单� �苷和甜菊醇双糖苷

具体实施方式

本发明人经过深入的研究， 首次揭示了甜菊糖苷类化合物异源生物合成的 关键酶， 从而可实现甜菊糖苷类化合物的异源生物合成 。 术语

如本文所用， 所述的 "甜菊糖苷类化合物"是指选自甜菊醇、 甜菊醇单糖苷、 甜菊 醇双糖苷、 甜菊糖苷、 甜菊糖莱鲍迪苷 A或甜菊糖莱鲍迪苷 B的化合物。

如本文所用， 所述的 "基因表达盒"是指包含有表达目的多肽 (本发明中为酶)所需 的所有必要元件的基因表达系统， 通常其包括以下元件： 启动子、编码多肽的基因序列， 终止子； 此外还可选择性包括信号肽编码序列等； 这些元件是操作性相连的。

如本文所用， 所述的 "可操作地连接 (相连) " 或 "操作性连接 (相连) " 是指两个或 多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列 。 例如： 启动子区被置于相对于目的基因 核酸序列的特定位置， 使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导 ， 从而， 启动子区 域被 "可操作地连接" 到该核酸序列上。

如本文所用， 所述的 "表达构建物" 是指重组 DNA分子， 它包含预期的核酸编码 序列， 其可以包含一个或多个基因表达盒。 所述的 "构建物"通常被包含在表达载体中。

如本文所用， 所述的 "异源"是指来自不同来源的两条或多条核酸或� ��白质序列之 间的关系， 获知来自不同来源的蛋白 (或核酸)与宿主细胞之间的关系。 例如， 如果核酸 与宿主细胞的组合通常不是天然存在的， 则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。 特定序 列对于其所插入的细胞或生物体来说是 "异源的" 。 合成途径的蛋白及其表达系统

本发明涉及甜菊糖苷类化合物合成过程中的栊 牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶、 古巴 焦磷酸合成酶、 贝壳烯合成酶、 双功能贝壳烯合酶 (或可选地， 古巴焦磷酸合成酶及贝壳 烯合成酶）、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 -13ct-羟化酶、 UGT85C2 糖基转移酶、 UGT74G1 糖基转移酶、 UGT76G1糖基转移酶， UGTB1糖基转移酶， 和细胞色素 P450氧化还原 蛋白。 上述蛋白在细胞中的共同表达可实现甜菊糖苷 类化合物的合成。 较佳地， 合成途 径的上游， 还涉及前体途径强化的酶， 所述的前体途径强化的酶可以是任何可将中心 代 谢途径的丙酮酸 (PYR)和 3-磷酸甘油醛 (G3P)前体转化为萜类合成通用前体异戊烯焦磷 酸 (IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸 (DMAPP)的酶； 优选地， 所述的前体途径强化的酶包括： 1-脱氧木糖 -5-磷酸合成酶 (DXS)， 2-甲基赤藓糖 -4-磷酸胞苷转移酶 (CMS), 2-甲基赤藓糖 -2,4-环二磷酸合成酶 (MCS)和异戊烯焦磷酸异构酶 (IDI)。

本发明人还研究了不同来源的酶应用于合成中 间产物贝壳烯及终产物甜菊糖类化 合物的效率， 获得了一系列具有较好的效果的酶。 因此， 作为本发明的优选方式， 所述 的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶来源于加拿 大红豆杉或甜叶菊 (更优选地，来源于加拿 大红豆杉)； 所述的古巴焦磷酸合成酶来源于甜叶菊或慢生 大豆根瘤菌 (更优选地， 来源 于甜叶菊)； 所述的贝壳烯合成酶来源于甜叶菊或慢生大豆 根瘤菌 (优选地， 来源于甜叶 菊) (更优选地， 来源于甜叶菊)； 所述的双功能贝壳烯合酶来源于小立碗藓或藤 仓赤霉 (更 优选地， 来源于小立碗藓)； 所述的贝壳烯氧化酶来源于甜叶菊、 藤仓赤霉、 阿拉伯芥或 慢生大豆根瘤菌 (更优选地， 来源于甜叶菊）； 所述的贝壳烯酸 -13ct-羟化酶、 UGT85C2 糖基转移酶、 UGT74G1糖基转移酶、 UGT76G1糖基转移酶来源于甜叶菊；所述的 UGTB1 糖基转移酶来源于斯塔摩酵母；所述的 IBGT糖基转移酶来源于甘薯；或所述的细胞色� � P450氧化还原蛋白来源于黄花蒿， 暗球腔菌， 藤仓赤霉， 甜叶菊或阿拉伯芥 (更优选地， 来源于暗球腔菌)。 作为本发明的更优选方式， 采用双功能贝壳烯合酶； 且， 所述的栊牛 儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶来源于加拿大红豆 杉， 所述的双功能贝壳烯合酶来源于小立 碗藓， 所述的贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 -13ct-羟化酶、 UGT85C2糖基转移酶、 UGT74G1 糖基转移酶、 UGT76G1糖基转移酶来源于甜叶菊； 所述的 UGTB1糖基转移酶来源于斯 塔摩酵母； 所述的细胞色素 P450氧化还原蛋白来源于暗球腔菌。

作为本发明的更优选方式，所述的来源于加拿 大红豆杉的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸 合成酶， 在野生型的基础上去除了 N端的质体转运肽序列； 较佳地， 去除了 N端 98个 氨基酸。 所述的来源于黄花蒿的细胞色素 P450氧化还原蛋白， 在野生型基础上去除了 N端跨膜区序列； 较佳地， 去除了 N端 66个氨基酸。

在本发明中， 上述的酶或蛋白可以是天然存在的， 比如其可被分离或纯化自动植物 或微生物。 此外， 所述的酶或蛋白也可以是人工制备的， 比如可以根据常规的基因工程 重组技术来生产重组酶或蛋白。 优选的， 本发明可采用重组的酶或蛋白。

任何适合的酶或蛋白均可用于本发明。所述的 酶或蛋白包括全长的酶或蛋白或其生 物活性片段 (或称为活性片段)，在本发明中具有 CDPS和 KS双功能酶的 CPS/KS的活性 片段为 YDTAWXA DXDD禾卩 DDXXD, 或 YDTAWXA DXDD禾卩 DEXXE, UGTB1 糖基转移酶的活性片段为 GHVGP和 NGGYGG。 经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的酶或蛋白的氨基酸序列也 包括在本发明中。酶或蛋白的生物活性片 段的含义是指作为一种多肽， 其仍然能保持全长的酶或蛋白的全部或部分功 能。通常情 况下， 所述的生物活性片段至少保持 50%的全长酶或蛋白的活性。 在更优选的条件下， 所述活性片段能够保持全长酶或蛋白的 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 99%、 或 100%的活性。 酶或蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨 基酸 的替代序列， 所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保 留了其部分的活性。 适当替 换氨基酸是本领域公知的技术， 所述技术可以很容易地被实施， 并且确保不改变所得分 子的生物活性。 这些技术使本领域人员认识到， 一般来说， 在一种多肽的非必要区域改 变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。 见 Watson等 Molecular Biology of The Gene, 第四版， 1987， The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。

本发明也可采用经修饰或改良的酶或蛋白， 比如， 可采用为了促进其半衰期、 有效 性、代谢和 /或蛋白的效力而加以修饰或改良的酶或蛋白� �所述经过修饰或改良的酶或蛋 白可以是一种共轭物， 或其可包含被取代的或人工的氨基酸。 所述经过修饰或改良的酶 或蛋白可以是与天然存在的酶或蛋白具有较小 的共同点， 但也能发挥与野生型相同或基 本相同的功能， 且不会带来其它不良影响。 也就是说， 任何不影响酶或蛋白的生物活性 的变化形式都可应用于本发明中。

本发明还包括了编码所述的酶或蛋白的生物活 性片段的分离的核酸，也可以是其互 补链。 作为本发明的优选方式， 可对各酶或蛋白的编码序列进行密码子优化， 以提高表 达效率。编码酶或蛋白的生物活性片段的 DNA序列，可以全序列人工合成，也可用 PCR 扩增的方法获得。 在获得了编码所述的酶或蛋白的生物活性片段 的 DNA序列之后， 将 其连入合适的表达构建物 (如表达载体)中， 再转入合适的宿主细胞。 最后通过培养转化 后的宿主细胞， 得到所要的蛋白。 本发明还包括了包含编码所述酶或蛋白的生物 活性片段的核酸分子的表达构建物。 所述的表达构建物可包括一个或多个编码所述 酶或蛋白的基因表达盒， 还可包含与所述 核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列， 以便于蛋白的表达。 所述的表达调控序列 的设计是本领域公知的。 表达调控序列中， 根据不同的需要， 可以应用诱导型或组成型 的启动子， 诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及 化合物生产， 有利于工业化应 用。

作为本发明的优选方式， 提供了一种表达构建物， 其包括以下酶的基因表达盒： 栊 牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS), 选自 (I)古巴焦磷酸合成酶 (CDPS)和贝壳烯合成 酶 (KS)或 (Π)双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS)的酶， 贝壳烯氧化酶 (KO)， 细胞色素 Ρ450氧化 还原蛋白（CPR)， 贝壳烯酸 -13 α -羟化酶， UGT85C2糖基转移酶和 UGTB1/IBGT糖基转 移酶。 更优选的， 所述的表达构建物还包括以下酶的基因表达盒 ： UGT74G1 糖基转移 酶和 /或 UGT76G1糖基转移酶。

表达构建物的建立目前已经是本领域技术人员 熟悉的技术。 因此， 在得知了所需选 择的酶或蛋白之后， 本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。 编码酶或蛋白的基因 序列可以被插入到不同的表达构建物 (如表达载体)中， 也可以被插入到同一表达构建物 中， 只要在转入到细胞后酶或蛋白能够被有效地表 达即可。

此外，含有编码所述酶或蛋白的生物活性片段 核酸序列的重组细胞也包括在本发明 中。 "宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。 常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、 枯草 杆菌等； 常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 昆虫细胞和哺乳动物细胞。 作为本发明的 优选方式， 所述的细胞选自 (但不限于)； 革兰氏阴性 DE3溶源化菌株， 酵母细胞。 更优 选地， 所述的革兰氏阴性菌 DE3溶源化菌株是 (但不限于)： 大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌； 更佳地， 所述大肠杆菌选自： BL21(DE3)、 BLR(DE3)、 DH10B(DE3)、 HMS(DE3)、 CD43(DE3)、 JM109(DE3)、 DH5a(DE3)或 Noveblue(DE3)。 更优选地， 所述的酵母细胞 是 (但不限于)： 毕赤酵母， 酿酒酵母， 乳酸克鲁维酵母。 较佳地， 所述的毕赤酵母选自 GS115、 MC100-3、 SMD1163、 SMD1165、 SMD1 168或 KM71； 较佳地， 所述的酿酒酵 母选自 W303、 CEN.PK2、 S288c、 FY834或 S1949; 较佳地， 所述的乳酸克鲁维酵母选 自 GG799。

针对细菌细胞或真菌细胞， 本领域已知适合的表达载体是哪些， 因此人们易于选择 到合适的表达载体作为克隆编码基因的骨架载 体， 例如， 当所述的细胞为细菌细胞时， 采用 pET 系列表达载体 (如 pET28a)来重组表达各酶； 当所述的细胞为酵母细胞， 采用 pPICC (如 pPICC3.5)或 pSY系列表达载体 (如 pSY01)。

用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常 规技术进行。 当宿主为原 核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用例如 CaCl ₂ 或 MgCl ₂ 等方法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 如果需要， 转化也可用电穿孔的 方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA转染方法： 磷酸钙共沉淀法， 常规 机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的酶或蛋白。根据所 用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞生长的条 件下进行培养。 合成甜菊糖苷类化合物的方法

本发明公开一种利用微生物异源合成生产甜菊 糖苷类化合物的方法。利用合成生物 学技术将不同来源的与甜菊糖苷类化合物生物 合成相关的酶进行人工组合， 在底盘细胞 中获得甜菊糖苷类化合物 (含莱鲍迪苷 A)。

本发明的合成甜菊糖苷类化合物的生物合成过 程参见图 2。 以中心代谢途径的丙酮 酸 (PYR)和 3-磷酸甘油醛 (G3P)为前体，获得萜类合成的通用前体异戊烯� ��磷酸 (IPP)和二 甲基丙烯基焦磷酸 (DMAPP)开始， 依次经过栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸 (GGPPS , ggw^基 因编码）， 古巴焦磷酸合酶 (CDPS， 基因编码)， 贝壳烯合酶 (KS， 基因编码)形成 贝壳烯 (更佳地， 以双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS , ^基因编码)取代 CDPS和 KS)， 随 后细胞色素 P450氧化蛋白贝壳烯氧化酶 (KO， 基因编码)催化贝壳烯形成贝壳烯酸， 并进一步被贝壳烯酸羟化酶 (KAH， kah 基因编码)氧化形成二萜母核甜菊醇。 甜菊醇经 UGT85C2 糖基转移酶作用， 得到甜菊醇单糖苷， 又经一步糖基化反应， 得到甜菊醇双 糖苷。 甜菊醇双糖苷在 UGT74G1 糖基转移酶作用， 得到甜菊糖苷， 最终经 UGT76G1 糖基转移酶作用， 形成甜菊糖莱鲍迪苷 A。

本发明人第一次应用上述的一系列酶成功实现 了甜菊糖苷类化合物的异源生物合 成，特别是将 UGTB 1/IBGT—类糖基转移酶用于将甜菊醇单糖苷转化 为甜菊醇双糖苷 (其 能在甜菊醇单糖苷的 C- 13葡萄糖的 C-2 ' 位点上加上糖基)， 克服了现有技术中无法将 甜菊醇单糖苷转化为甜菊糖双糖苷的技术问题 。 对于甜菊糖苷类化合物的生物合成中从 甜菊醇单糖苷经一步糖基化反应得到甜菊醇双 糖苷这一步骤所需要的糖基转移酶在现 有技术中是未知的； 而本发明人经过深入的研究， 筛选了大量的糖基转移酶基因， 最终 发现 UGTB 1或 IBGT糖基转移酶可以实现在底物的 C- 13葡萄糖的 C-2 ' 位点上进一步 糖基化。

合适的 UGTB 1/IBGT 类糖基转移酶可以发挥尿苷 -5 ' - 二磷酸葡糖基： 甜菊醇 - 13-0- 葡萄糖苷转移酶（ 又被称为甜菊醇 - 13- 单葡萄糖苷 1， 2- 葡糖基化酶） 的作用， 给受体分子甜菊醇 - 13-0- 葡萄糖苷中 13-0- 葡萄糖的 C-2 ' 转移上葡萄糖部分。

一般来说，合适的 UGTB 1/IBGT类糖基转移酶还可以发挥尿苷 -5 ' - 二磷酸葡糖基： 甜茶素转移酶的作用，给受体分子甜茶素 (Rubusoside)中 13-0- 葡萄糖的 C-2 ' 转移上葡 萄糖部分。

合适的 UGTB 1/IBGT类糖基转移酶还可以催化利用除了甜菊醇 - 13-0- 葡萄糖苷和 甜茶素以外的甜菊糖苷底物的反应， 例如可以利用甜菊糖苷 (Stevioside)作为底物， 将葡 萄糖部分转移到 19-0-葡萄糖残基的 C-2 ' 上从而产生莱鲍迪苷 E。还可以利用莱鲍迪苷 A 作为底物， 将葡萄糖部分转移到 19-0- 葡萄糖残基的 C-2 ' 上从而产生莱鲍迪苷 D。 但是， UGTB 1/IBGT类糖基转移酶一般不会给在 C- 13 位置具有 1， 3- 结合的葡萄糖的 甜菊醇化合物转移葡萄糖部分，即不会发生葡 萄糖部分到甜菊醇 1， 3- 二糖苷和 1，3- 甜 菊苷的转移。

合适的 UGTB 1/IBGT 类糖基转移酶可以转移来自除了尿苷二磷酸葡 糖以外的糖部 分。 例如， 合适的 UGTB 1/IBGT类糖基转移酶可以发挥尿苷 5 ' - 二磷酸 D- 木糖基： 甜菊醇 - 13-0- 葡萄糖苷转移酶的作用， 将木糖部分转移到受体分子甜菊醇 - 13-0- 葡萄 糖苷中 13-0- 葡萄糖的 C-2 ' 。 另一个例子， 合适的 UGTB 1/IBGT类糖基转移酶可以发 挥尿苷 5 ' - 二磷酸 L- 鼠李糖基： 甜菊醇 - 13-0- 葡萄糖苷转移酶的作用， 将鼠李糖部 分转移到受体分子甜菊醇 - 13-0- 葡萄糖苷中 13-0- 葡萄糖的 C-2 ' 。

获得萜类合成的通用前体 IPP和 DMAPP , 可以采用本领域技术人员已知的技术。 作为本发明的优选方式， 为了获得 IPP和 DMAPP , 相对于现有技术中还应用 r、 ispE、 ispG、 ispH等基因的技术方案， 本发明人进行了简化， 以中心代谢途径的丙酮酸 (PYR) 和 3-磷酸甘油醛 (G3P)为前体， 萜类合成的通用前体异戊烯焦磷酸 (IPP)和二甲基丙烯基 焦磷酸 (DMAPP)在 1 -去氧木糖 -5-磷酸途径的作用下， 依次经过 1 -脱氧木糖 -5-磷酸合成 酶 (DXS， 基因编码）， 2-甲基赤藓糖 -4-磷酸胞苷转移酶 (CMS , ^pD基因编码）， 2-甲 基赤藓糖 -2,4-环二磷酸合成酶 (MCS， ispF基因编码）的催化合成。 IPP和 DMAPP在异戊 烯焦磷酸异构酶 (编码基因 ^^作用下可以相互转化。 合成贝壳烯的方法

甜菊糖苷类化合物是以二萜类化合物贝壳烯为 骨架的反应产物。贝壳烯作为一种主 要的中间产物， 其生成效率的提高将有利于下游甜菊糖苷类化 合物的高效合成。

为了提高贝壳烯合成效率的方法， 本发明人通过反复实验， 最终发现采用双功能贝 壳烯合酶 (CPS/KS)取代古巴焦磷酸合成酶 (CDPS)及贝壳烯合成酶 (KS)， CPS/KS 是具有 CDPS和 KS的双功能酶， 能够显著地提高贝壳烯合成效率。 本发明的有益效果

利用本发明的方法， 关键中间产物贝壳烯产量能达到 l g/L以上， 莱鲍迪苷 A达到 10mg/L 以上。 该方法可替代植物提取法获得甜菊糖苷类化合 物、 特别是具有巨大市场 价值的莱鲍迪苷 A， 具有广阔的应用前景和发展潜力。

本发明的方法克服了传统从植物中提取时繁琐 ， 受环境影响大， 破坏自然资源等缺 点， 具有成本低， 占地面积少， 产品质量可控等优点。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件如 J.萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 第 3版， 科学出版社， 2002中所述的 条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 实施例 1、 甜菊糖苷类化合物化合物异源合成途径中所用 的蛋白的获得

甜菊糖苷类化合物莱鲍迪苷 A 异源合成途径中所用的栊牛儿基栊牛儿基焦磷 酸合 成酶、 古巴焦磷酸合成酶、 贝壳烯合成酶、 双功能贝壳烯合酶、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯 酸 - 13α-羟化酶、 UGT85C2糖基转移酶、 UGTB 1糖基转移酶、 UGT74G1糖基转移酶、 UGT76G 1糖基转移酶及细胞色素 Ρ450氧化还原蛋白的基因来源与合成。

首先从美国国立生物信息学数据库 (NCBI)中选取了来源于加拿大红豆杉 (7¾; « cimi^e/^'W和甜叶菊 rebfl ^'ima)的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS) , 来 源于甜叶菊 0¾eW<¾ reb<¾w<i im<¾)和慢生大豆根瘤菌 (£ra<iyrWzob m ^po 'c m)的古巴焦磷 酸合成酶 (CDPS)， 来源于甜叶菊 ( eWii rebaudiana)和慢生大豆根瘤菌 (Bmdyrhizobium japonicum)的贝壳烯合成酶（KS)， 来源于小立碗藓 (Physcomitrella patens)和藤仓赤霉 (<^'bbere//fl/w wroO的双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS) , 来源于甜叶菊 rebaudiana)、 阿拉伯芥 (Ambidopsis thaliana)、 藤仓赤霉 (fiibberella fujikuroi)和慢生大豆根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum) ^} JI壳烯氧化酶 (； KO)， 来源于甜叶菊 0¾eW<¾ rebaudiana) ^} JI 壳烯酸 - 13-羟化酶 (KAH)、 UGT85C2糖基转移酶、 UGT74G 1糖基转移酶、 UGT76G 1糖 基转移酶， 来源于斯塔摩酵母 0¾irmere//fl bombicola)\JGTB l 糖基转移酶， 来源于甘薯 (Ipomoea batatas)IBGT 糖基转移酶， 以及来源于黄花蒿 (Artem annua) , 暗球腔菌 (Phaeosphaeria sp. L487) 甜叶菊 (5YeW<¾ rebaudiana)、 /i / im )禾口 /^ r )的细胞色素 P450氧化还原蛋白， 所选取酶的信息如表 2。

表 2、 异源途径构建中所涉及的基因

基因名称 Genbank号 来源

GGPP合成酶 AAD16018 加拿大红豆杉

GGPP合成酶 ABD92926.2 甜叶菊

古巴焦磷酸合成酶 AAB87091 甜叶菊

古巴焦磷酸合酶 BAC47414 慢生大豆根瘤菌 贝壳烯合成酶 AAD34294 甜叶菊

贝壳烯合成酶 BAC47415 慢生大豆根瘤菌 双功能贝壳烯合酶 BAF61 135 小立碗藓

双功能贝壳烯合酶 Q9UVY5.1 藤仓赤霉

双功能贝壳烯合酶 CAH18005. 1 中间赤霉

双功能贝壳烯合酶 BAA22426 暗球腔菌

双功能贝壳烯合酶 CAP07655 痂囊腔菌

贝壳烯氧化酶 AAQ63464 甜叶菊 贝壳烯氧化酶 094142.1

贝壳烯氧化酶 AF047719 阿 ¾f白芥

贝壳烯氧化酶 NP—768785 侵生大豆根瘤菌

贝壳烯酸 -13ct-羟化酶 ABD60225 甜叶菊

贝壳烯酸 -13ct-羟化酶 AEH65419 甜叶菊

贝壳烯酸 -13ct-羟化酶 AED93376.1 阿拉伯芥

贝壳烯酸 -13ct-羟化酶 AED93377.1 阿拉伯芥

UGT85C2糖基转移酶 AAR06916

UGT74G1糖基转移酶 AAR06920

UGT76G1糖基转移酶 AAR06912

UGTB1糖基转移酶 ADT71703 斯

细胞色素 P450氧化还原蛋白 ABM88789

细胞色素 P450氧化还原蛋白 BAG85333 暗球腔菌

细胞色素 P450氧化还原蛋白 CAE09055.1 藤仓赤霉

细胞色素 P450氧化还原蛋白 ABB88839 甜叶菊

细胞色素 P450氧化还原蛋白 X66016 阿拉伯芥

IBGT糖基转移酶 ABL74480.1 通过本领域公知的密码子优化方法， 如 Optimizer(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/), 优化了所选取的酶的编码序列， 并进行了合成， 具体情况如下：

所用的来源于加拿大红豆杉的栊牛儿基栊牛儿 基焦磷酸合甜甜甜黄塔成酶的氨基酸序列见 SEQ ID 摩花叶叶叶

NO: 1， 去除了野生型 GGPP合成酶 N端 98个氨基酸 (质体转运肽菊菊菊酵蒿)， 然后加上甲硫氨酸， 获得改造后的重组 GGPP合成酶，然后进行密码子优化，优化后的 DN母A序列见 SEQ ID NO: 2。

来源于甜叶菊的古巴焦磷酸合成酶 (CDPS)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 3， 经密码 子优化后的 DNA序列见 SEQ ID NO: 4。

来源于甜叶菊的贝壳烯合成酶 (KS)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 5， 经密码子优化 后的 DNA序列见 SEQ ID NO: 6。

来源于甜叶菊的贝壳烯氧化酶 (KO)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 7， 经密码子优化 后的 DNA序列见 SEQ ID NO: 8。

来源于甜叶菊的贝壳烯酸 -13α-羟化酶 (KAH)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 9， 经密 码子优化后的 DNA序列， 见 SEQ ID NO: 10。

来源于甜叶菊的 UGT85C2糖基转移酶的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 11， 经密码子 优化后的 DNA序列见 SEQ ID NO: 12。

来源于甜叶菊的 UGT74G1糖基转移酶的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 13， 经密码子优化 后的 DNA序列见 SEQ ID NO: 14。

来源于甜叶菊的 UGT76G1糖基转移酶的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 15， 经优化后 的 DNA序列见 SEQ ID NO: 16。

来源于黄花蒿的细胞色素 P450氧化还原蛋白 (CPR)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 17， 切除了野生型 CPR 蛋白 N 端跨膜序列区的 66 个氨基酸， 然后加上热带假丝酵母 (C. ra/^'cfl/^)的 CPR蛋白 (AAU10466)N端序列， 最终获得本发明中改造的 CPR蛋白， 经密 码子优化后的 DNA序列见 SEQIDNO: 18。

来源暗球腔菌的细胞色素 P450氧化还原蛋白的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 19， 经 密码子优化后的 DNA序列见 SEQ ID NO: 20。

来源小立碗藓的双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS)的氨基酸序列见 SEQ NO: 21， 经密码 子优化后的 DNA序列， 见 SEQNO: 22。

来源藤仓赤霉的双功能贝壳烯合酶 (CPS/KS)的氨基酸序列见 SEQNO: 23， 经密码 子优化后的 DNA序列， 见 SEQNO: 24。

来源慢生大豆根瘤菌的古巴焦磷酸合成酶的氨 基酸序列见 SEQIDNO: 25， 经密码 子优化后的 DNA序列， 见 SEQIDNO: 26。

来源慢生大豆根瘤菌的贝壳烯合成酶的氨基酸 序列见 SEQIDNO: 27， 经密码子优 化后的 DNA序列， 见 SEQIDNO: 28。

来源慢生大豆根瘤菌的贝壳烯氧化酶的氨基酸 序列见 SEQIDNO: 29， 经密码子优 化后的 DNA序列见 SEQ IDNO: 30。

来源藤仓赤霉的贝壳烯氧化酶的氨基酸序列见 SEQIDNO: 31, 经密码子优化后的 DNA序列见 SEQ IDNO: 32。

来源藤仓赤霉的细胞色素 P450氧化还原蛋白的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 33， 经 密码子优化后的 DNA序列见 SEQ IDNO: 34。

来源甜叶菊的细胞色素 P450氧化还原蛋白的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 35， 经密 码子优化后的 DNA序列见 SEQIDNO: 36。

来源阿拉伯芥的贝壳烯氧化酶的氨基酸序列见 SEQIDNO: 37， 经密码子优化后的

DNA序列见 SEQ IDNO: 38。

来源阿拉伯芥的细胞色素 P450氧化还原蛋白的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 39， 经 密码子优化后的 DNA序列， 见 SEQIDNO: 40。

来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶 UGTB1基因的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 41， 经 密码子优化后的 DNA序列见 SEQ IDNO: 42。

来源于甜叶菊的贝壳烯酸 -13 α -羟化酶 (ΚΑΗ)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 43， 经 优化的 DNA序列见 SEQ IDNO: 44。

来源于甜叶菊的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成 酶 (GGPP)的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 45， 经优化后的 DNA序列见 SEQ IDNO: 46。

来源于阿拉伯芥的贝壳烯酸 -13 α -羟化酶 (Genbank 号： AED93376.1)的氨基酸序列 见 SEQNO: 47， 经密码子优化后的 DNA序列见 SEQNO: 48。

来源于阿拉伯芥的贝壳烯酸 -13α-羟化酶 (Genbank 号： AED93377.1)的氨基酸序列 见 SEQNO: 49， 经密码子优化后的 DNA序列见 SEQNO: 50。

来源于甘薯的糖基转移酶 (Genbank号： ABL74480.1)的氨基酸序列见 SEQ NO: 51， 经密码子优化后的 DNA序列见 SEQNO: 52。

其他蛋白可由相同方法得到优化的 DNA序列。

进一步地， 本发明人分析了不同来源的经鉴定发现为同功 能蛋白的序列同源性， 结 果如表 3 <

表 3、 不同来源氨基酸序列同源性分析

蛋白 来源 同源性

(NCBI blastP)

GGPPS Stevia rebaudianai^ v^. Taxus 力口拿大红 68%

CDPS 50%

CDPS 58%

CDPS Stev 57%

KS Stev 43%

KO Stevi a 55%

菌）

KO Stevia rebaudianai^ ― Gibberellafujikuroi( ^^9) 25%

KO Stevia 61 %

CPR 34%

CPR 75%

CPR 66%

KS 36%

KS 64%

CPS/KS Gib be re lla fuj ikuroi( ^ vs. Physcomitrella patensi^ AL^i^) 34%

KS vs. KS.'Stevia (甜叶菊) vs. CPSKS: Physcomitrella paim (小立碗藓) 36% Gibberella jhjikuroi( 仓赤雾 64%

UGTB l vs. UGTB 1 Starmerella bombicola斯塔摩酵母 vs. UGT85C2: Stevia 33%

UGT85C2 rebaudianai^口十菊)

UGTB l vs. UGTB 1 Starmerella bombicola斯塔摩酵母 vs. UGT74G 1 Stevia 83%

UGT74G1 rebaudianai^口十菊)

UGTB l vs. UGT76G1 Starmerella bombicola斯塔摩酵母 vs. UGT76G1 Stevia 45%

UGT76G1 rebaudianai^口十菊)

3 1 %

IBGT vs. IBGT: Ipomoea batatas甘暮 vs. UGT74G1 : Stevia rebaudianai^ 36%

UGT74G1

IBGT vs. IBGT: Ipomoea batatas甘暮 vs. UGT76G1 : Stevia rebaudianai^ 28%

UGT76G1

UGTB l vs. UGT76G1 : Starmerella bombicola斯塔摩酵母 vs. IBGT : Ipomoea batatas 22%

IBGT 从表 3中可知， 不同来源的相同功能蛋白氨基酸序列同源性较 低。 例如从甜菊来源 的 CDPS分别与小立碗藓和藤仓赤霉来源的具有 CDPS和 KS双功能酶的 CPS/KS最高 同源性仅有 50%和 58%。从甜菊来源的 KS分别与小立碗藓和藤仓赤霉来源的具有 CDPS 和 KS 双功能酶的 CPS/KS 最高同源性仅有 36%和 64%。 另外， 从斯塔摩酵母来源的 UGTB1 糖基转移酶与从甜菊来源的 UGT85C2 糖基转移酶、 UGT74G1 糖基转移酶和 UGT76G1糖基转移酶的同源性也仅有 33% 83%和 45%

几种真菌来源的 CPS/KS同源度较高， 小立碗藓来源的 CPS/KS同源度相对较低， 但它们都含有富含天冬氨酸的区域， 是具有 CPS和 KS 两个酶活性的片段， 其中 CPS 活性片段为从 YDTAWXA开始，具有 DXDD的 N端序列， KS活性片段为具有 DDXXD 或 DEXXE的 C端序列， X为任意氨基酸。 UGTB1的活性片段是位于氨基酸序列 16位 到 20位的 GHVGP和 338位到 343位 NGGYGG。

实施例 2、 原核表达载体的构建

将实施例 1优化所得的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶� � 古巴焦磷酸合成酶、 贝壳 烯合成酶、 双功能贝壳烯合酶、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 -13ct-羟化酶、 UGT85C2 糖基 转移酶、 UGT74G1糖基转移酶、 UGT76G1糖基转移酶及细胞色素 P450氧化还原蛋白 的相关基因克隆到相应的质粒上， 进行细菌莱鲍迪苷 A合成途径基因表达载体的构建。

在优化后的 ggpps基因的终止密码子 TAA后加入 Spel酶切位点， 然后将其克隆到 质粒 pET28a (购自 Novagen)的 Ncol/Hindlll酶切位点上， 得到 pET28a-ggp /^图 3A)。

在优化后的 c<i/«， cps/ks , ks, ko， kah, ugt85c2 , ugtbl , ugt74gl , ugt76gl 9 基因的终止密码子 TAA 后面分别加入 Spel 位点， 然后将这些基因分别克隆到质粒 pET21a(购 自 Novagen)的 Ndel/BamHI 位点上， 分别得到质粒 ρΕΤ21& φ ， pET2la-cps/ks , pET21a- ， pET21a-fco， pET2la-kah, pET2la-ugt85c2 , pET2la-ugtbl , pET2la-ugt74gl, pET2la-ugt76gl (图 3B)， 图 3b中的/ /wert gewe为 cdps, cps/ks, ks, ko, kah, ugt85c2 , ugtbl , ugt74gl , ugt76gl 九个基因单独克隆的质粒插入位点 (NdeI/HindIII)。

在优化后的 cpr基因的终止密码子 TAA后加入 Spel位点， 然后将其克隆到质粒 pET21d (购自 Novagen)的 Ncol/Hindlll位点上， 得到质粒 pET21d-cpr (图 3C)。

作为举例，质粒 pZQllO构建如下：采用了类似 New England Bio lab公司的 BioBrick Assembly Kit试剂盒提供的方法， 进行异源途径基因的串联组装； 即首先用 Spel/Hindlll 双酶切质粒 ρΕΤ28&-^ρ/ ^(加拿大红豆杉来源)，用 Xbal/Hindlll酶切质粒 pET21a-c/^/ (小 立碗藓)，分别用 PCR清洁试剂盒直接回收 pET28a-g^/«载体和胶回收 c/^/^DNA片段； 然后用 T4 DNA连接酶将 pET28a-ggp/^载体和 c/^/^DNA片段进行连接， 构建质粒 采用相同的方法用再将 (；甜叶菊来源)、 ½/ι (；甜叶菊来源)、 ugt85c2( 叶菊来源)、 g W (斯塔摩酵母来源)、 g 74^ (甜叶菊来源)、 g 76^ (甜叶菊来源) _Φ Γ (暗球 腔菌来源)逐步串联， 最终获得细菌莱鲍迪苷 Α合成基因表达质粒 pZQllO载体 (图 3E)。 该表达质粒的酶切 (Xbal/Hindlll双酶酶切)验证图谱如图 3F所示， 其中 Ml为 Marker 1， 分子量为 DS15000; 1为阴性对照产物； 2-4为 pZQllO产物； M2为 Marker 2， 分子量 为 DS5000。 从图 3F可以看出， 质粒 pZQllO用 Xbal/Hindlll双酶切后得到两条大小分 别为 5300/16500左右的条带， 可以得出 pZQllO构建正确。

基于与质粒 pZQllO类似的方法， 本发明人还构建了一些用于表达中间体或产物 的 重组表达质粒， 如表 4。

表 4、 细菌鲍迪苷 A合成途径基因表达质粒信息 质粒 全称 合成甜菊 _P ZQ3 _P ET28a-GGPPS-CDPS-KS

糖中间产 GGPPS: Taxus (加拿大红豆杉）（插入 pET28a的 Ncol/Hindlll位点) 物贝壳烯 CDPS: Stevia (甜叶菊）（插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点）

KS: Stevia «Αακί&κα (甜叶菊）（插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点）

_P SY32 _P ET28a-GGPPS-CPS/KS

GGPPS: Taxus (加拿大红豆杉) (插入 pET28a的 Ncol/Hindlll位点）

CPS/KS: Physcomitrella atera (小立碗玲 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点）

_P SY33 _P ET28a-GGPPS-CPS/KS

GGPPS: Taxus (加拿大红豆杉）（插入 pET28a的 Ncol/Hindlll位点）

CPS/KS: Gibberellafiijikuroi(B储 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl _P ET28a-GGPPS-CPS/KS

01 GGPPS: Stevia rebaudiana (甜叶 ： K pET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Physcomitrella patem( J、立碗難 : K pET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl pET28a-GGPPS-CPS/KS

02 GGPPS: Stevia rebaudiana (甜叶 ： K pET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: (¾ «^ ¾< '6#¾^¾) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） 合成甜菊 pZQl _P ET28a-GGPPS-CDPS-KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2

醇单糖苷 04 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CDPS: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KS: Stevia rebaudianai甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl _P ET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2

05 GGPPS: Taxus canadensisi口拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Physcomitrella patens( j、立碗 ) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO.Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (SEQ ID NO: 44)( \ pET28a的 Xbal/Hindlll

位点)

CPR: Phaeosphaeria sp. 1487、暗球腔鶴 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点) UGT85C2: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl _P ET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2

06 GGPPS: Taxus canadensis加拿大红豆杉)~ (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Gibberella fiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点） CPR: Phaeosphaeria sp. 1487暗球腔截 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） 合成甜菊 pZQl _P ET28a-GGPPS-CDPS-KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl

醇双糖苷 07 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点）

CDPS: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KS.Stevia rebaudianai甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl _P ET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl

08 GGPPS: Taxus canadensisi口拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Physcomitrella patens( j、立碗 ) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点）

KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl _P ET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl

09 GGPPS: Taxus canadensisi口拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点）

CPS/KS: Gibberella fiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO.Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移釅斯塔摩酵 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） pSY200 pET28a-GGPPS-CDPS-KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl

GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CDPS: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KS.Stevia rebaudianai甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） \KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll ¾|

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） IBGT糖基转移默甘暴 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） pSYZOl _P ET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl

GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS Physcomitrella paten 小立碗 ) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana(甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位 点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） IBGT糖基转移默甘暴 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点）

_P SY202 _P ET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl

GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Gibberella fiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO:Stevia rebaudianai甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位 点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） IBGT糖基转移職甘 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） 甜菊糖途 _P ZQ9 _P ET28a-GGPPS-CDPS-KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl-UGT74Gl-U GT76 径的串 Gl

联， GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） 合成莱鲍 CDPS: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） 迪苷 A KS: Stevia rebaudianai甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点）

KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl pET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTB 1 -UGT74G1 -UGT76G1 10 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Physcomitrella patens( j、立碗 ) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. 1487、暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） GT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl pET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTB 1 -UGT74G1 -UGT76G1

20 GGPPS: Taxus canadensisi口拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点）

CPS/KS: Gibberella fiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO.Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔簡 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQll pET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTB 1 -UGT74G1 -UGT76G1 1 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Physcomitrella patens( j、立碗 ) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll

位点）

CPR: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl pET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTB 1 -UGT74G1 -UGT76G1

21 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点）

CPS/KS: Gibberella fiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KO.Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 44) (插入 pET28aXbaI/HindIII位

CPR: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pZQl pET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTB 1 -UGT74G1 -UGT76G1 12 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Physcomitrella patens小立碗 ) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点）

KO: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Arabidopsis pET28aXbaI/HindIII位

CPR: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） pET28a-GGPPS-CPS/KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTB 1 -UGT74G1 -UGT76G1 GGPPS: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 ET28a的 Ncol/Hindlll位点） CPS/KS: Gibberella fiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点）

KO.Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） KAH: Arabidopsis pET28aXbaI/HindIII位

CPR: Stevia rebaudiana (甜叶菊 (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT85C2: Stevia rebaudiana{甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT74G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGT76G1 : Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pET28a的 Xbal/Hindlll位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 ET28a的 Xbal/Hindlll位点） 实施例 3、 真菌表达载体的构建

将实施例 1优化所得的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶� � 古巴焦磷酸合成酶、 贝壳 烯合成酶、 双功能贝壳烯合酶、 贝壳烯氧化酶、 贝壳烯酸 -13ct-羟化酶、 UGT85C2 糖基 转移酶、 UGTB1 糖基转移酶、 UGT74G1 糖基转移酶、 UGT76G1 糖基转移酶及细胞色 素 P450氧化还原蛋白的相关基因克隆到相应的质� �上， 进行真菌莱鲍迪苷 A合成基因 表达质粒的构建。

首先将原始的 pA0815 载体 (；购自 Invitrogen)进行改造， 采用定点突变 PCR 在 pA0815的终止子后引入 BamHI和 Xhol酶切位点， 改造后的 pA0815命名为 pSY01。 通过定点突变 PCR将 pET28a-ggw^基因内的 BamHI位点去掉。 通过定点突变 PCR将 pET21 Ά-ks基因内的 Bglll位点去掉。

以 pET28a-ggw^为模板， 通过 PCR扩增 ggpps基因， 在两端分别引入 EcoRI酶切 位点 (ATG前面加入 4个 A碱基)， 用 EcoRI酶切该 PCR片段， 同时用 EcoRI酶切载体 pS Y01，用清洁试剂盒直接回收 pS Y01载体和 ggpps片段；然后用 T4DNA连接酶将 pS Y01 载体和 片段进行连接， 构建质粒 pSY01-^w^。

以 ρΕΤ21&-ί·φ 为模板， 通过 PCR扩增 cdps基因 (红豆杉来源）， 在两端分别引入 Bglll和 Notl酶切位点 (ATG前面加入 4个 A碱基）， 用 Bglll和 Notl酶切该 PCR片段， 同时用 BamHI和 Notl双酶切载体 pPIC3.5KC购自 Invitrogen) , 用清洁试剂盒直接回收 PPIC3.5K载体和 cdps片段，然后用 T4DNA连接酶将 pPIC3.5K载体和 cdps片段进行连 接， 构建质粒 pPIC3.5K-c^^。 采用相同的方法用分别将 c / 、 ks、 ko、 kah、 ugt85c2 , ugt74gl、 ugt76gl及 cpr构建到 pPIC3.5K上（图中 Inserted gene位置）。

以 pPIC3.5K-c/«/; 为模板进行 PCR，扩增出 5 'AOX-c/«/; -TT，两端分别引入 Bglll 和 Xhol酶切位点， 用 Bglll和 Xhol酶切该 PCR片段， 同时用 BamHI和 Xhol双酶切载 体 pSY01-ggw«， 用清洁试剂盒直接回收 pSYO l-^w^载体和 5 'AOX-c/^/ -TT片段， 然后用 T4DNA连接酶将 pSYO l-ggw^载体和 片段进行连接， 构建质 粒。 采用相同的方法用再将 c/^/ (小立碗藓来源)、 (甜叶菊来源）、 fci ^(甜叶菊来源）、 g S5c2(甜叶菊来源）、 g W (斯塔摩酵母来源)、 g 74W (甜叶菊来源）、 g 76^ (甜叶菊来源） 及 cpr (暗球腔菌来源)逐步串联，最终获得表达质粒 pSY210(图 3G)。质粒 pSY210的 PCR 验证图谱如图 31所示， 其中 Ml 为 Marker, 分子量为 DS2000 ; 1 为阳性对照产物； 2 和 3为 pSY210产物。 从图 31可以看出， 质粒 pSY210用特异性针对全长 UGT74G1糖 基转移酶编码基因的引物做 PCR验证， 得到一条大小约 1383bp的条带， 可见 pSY210 构建正确。

基于与构建质粒 pZQ210类似的方法， 本发明人还构建了一些用于表达中间体或产 物的重组表达质粒， 如表 5。

表 5、 真菌鲍迪苷 A合成途径基因表达质粒信息 质粒名称 别名

合成到贝 pSY16 pSY01-GGPP-CDPS-KS

壳烯 GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 pSYOI的 EcoRI位点）

CDPS: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYOI的 BamHI/XhoI位点） KS.Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYOI的 BamHI/XhoI位点） pZQ132 pSY01-GGPP-CPS/KS

GGPP: Taxus cawa m«X加拿大红豆杉) (插入 pSYO I的 EcoRI位点） CPS/KS: Physcomitrella patens (小立碗 pSYO I的 BamHI/XhoI位 pZQ133 pSY01-GGPP-CPS/KS

GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) ^： K pSYO I的 EcoRI位点） CPS/KS: Gibberella fujikuroi (藤仓赤 ) (^？ K pSYO I的 BamHI/XhoI位点） pZQ201 pSY01-GGPP-CPS/KS

GGPP: Stevia rebaudiana (甜叶菊(^ pSY 的 EcoRI位点） CPS/KS: Physcomitrella patens小立碗 ) ^： K pSYO I的 BamHI/XhoI位点） pZQ202 pSYOl-GGPP-CPS/KS

GGPP: Stevia rebaudiana (甜叶菊(^ pSY 的 EcoRI位点） CPS/KS: Gibberella fujikuroi (藤仓赤 ) (^？ K pSYO I的 BamHI/XhoI位点） 甜菊糖途 pSY22 pSY01-GGPP-CDPS-KS-KO-KAH-CPR-UGT85C2-UGTBl-UGT74Gl-UGT76Gl 径的串 GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 pSYO l的 EcoRI位点) 联， CDPS: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO 1的 BamHI/XhoI位点） 合成莱鲍 KS:Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO 1的 BamHI/XhoI位点） 迪苷 A KO:Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO 1的 BamHI/XhoI位点）

KAH: Stevia rebaudiana(gffn†^)(SEQ ID NO: 10还是 SEQ ID NO: 插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔商 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT74G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT76G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGTB1糖基转移酶、斯塔摩酵母) (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） pZQ210 pSY01-GGPP-CPS/KS-KO-KAH-CPR- UGT85C2- UGTB 1 - UGT74G 1 - UGT76

Gl

GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 pSYO l的 EcoRI位点） CPS/KS: Physcomitrella patens、小立碗 ) (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） KO:Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 10)( \ pSYO 1的

BamHI/XhoI位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔商 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT74G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT76G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGTB1糖基转移酶、斯塔摩酵母) (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） pZQ220 pSY01-GGPP-CPS/KS-KO-KAH-CPR- UGT85C2- UGTB 1 - UGT74G 1 - UGT76

Gl

GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 pSYO l的 EcoRI位点） CPS/KS: Gibberella jiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） KO:Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） KAH: Stevia rebaudiana (甜叶 ^ SEQ ID NO: 插入 pSYO 1的

BamHI/XhoI位点）

CPR: Phaeosphaeria sp. I 87暗球腔商 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT74G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGT76G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） UGTB1糖基转移酶、斯塔摩酵母) (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） pZQ211 pSY01-GGPP-CPS/KS-KO-KAH-CPR- UGT85C2- UGTB 1 - UGT74G 1 - UGT76

Gl

GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 pSYO l的 EcoRI位点） CPS/KS: Physcomitrella patens、小立碗 ) (插入 pSYO l的 BamHI/XhoI位点） KO:Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） KAH: Stevia rebaudia 甜叶菊 (SEQ ID NO: 10) (插入 pSYO 1的

BamHiyXhoI位点）

CPR: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGT74G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGT76G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGTB1糖基转移酶、斯塔摩酵母) (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） pSY01-GGPP-CPS/KS-KO-KAH-CPR- UGT85C2- UGTB 1 - UGT74G 1 - UGT76

G1

GGPP: Taxus canadensis (加拿大红豆杉) (插入 pSYOl的 EcoRI位点） CPS/KS: Gibberella jiijikuroi (藤仓赤 ) (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） KO:Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） KAH: Stevia rebaudia 甜叶菊 (SEQ ID NO: 44) (插入 pSYO 1的

BamHI/XhoI位点）

CPR: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGT85C2: Stevia rebaudia 甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGT74G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGT76G1: Stevia rebaudiana、甜叶菊 (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） UGTB1糖基转移酶 (斯塔摩酵母) (插入 pSYOl的 BamHI/XhoI位点） 实施例 4、 各基因在大肠杆菌中的表达状况

将实施例 2 所得的质粒 pET21a-ci¾«， pET21a-^, pET21a-fco， pET2la-kah , pET2la-ugt85c2, pET2la-ugt74gl , ρΕΎ21 a-ugt76gl分别转化宿主细胞 BL21(DE3)。

分别挑取各单克隆到 2ml的 LB培养基中（100mg/L氨苄青霉素)， 37°C培养过夜，然 后以 1%(ν/ν)的接种量转接到 2ml 加有相同抗生素的新鲜 LB 培养基中， 37°C培养至 OD600为 0.3-0.4， 加入 IPTG至终浓度为 O.lmM后， 18°C诱导表达 6h， 然后将各发酵 液进行 SDS-PAGE分析。

结果如图 4A、 图 4B、 图 4C、 图 4D及图 4E所示， 从图 4A中可以看出基因 /«， g S5C2明显表达， 从图 4B中可以看出基因 和; 明显表达， 从图 4C中可以看出基 因½ 明显表达， 从图 4D中可以看出基因 wg 74^有较少表达， 从图 4E中可以看出基 因 ugt76gl明显表达。 实施例 5、 载体的转化及原核表达

将实施例 2所得的各用于莱鲍迪苷 A或其中间体合成的基因表达质粒和前体途径� � 化表达质粒 pJF47C图 3D)共同转化宿主细胞 E.coli BL21(DE3), 得到转化有莱鲍迪苷 A 或其中间体合成的基因表达质粒和 pJF47的重组大肠杆菌 E.ci^BL21(DE3)。 首先提取 . //MG1655 的基因组， 然后下表引物 PCR扩增各基因， 分别克隆到质粒 pET21d 的 NcoI/EcoRI 位点上。 然后用 Spel/EcoRI 酶切 pET21c- /¾^Ρ， Xbal/EcoRI 酶切 ρΕΤ21ά- ώ',回收 pET21c-/¾^载体和 idi基因片段，将两者连接，构建质粒 pET21d-ispF-idi; 接着将 Spel/EcoRI酶切 pET21c- / Ζ)，用 Xbal/EcoRI酶切 pET21d-ispF-idi，回收 pET21c- / Ζ) 载体和 ispF-idi基因片段，连接构建 pET21d-ispD-ispF-idi;再将 Spel/EcoRI酶切 pET21d- ^^， 用 Xbal/EcoRI酶切 pET21d-ispD-ispF-idi， 回收 pET21d- 载体和 ispD-ispF-idi基因片段， 连接构建质粒 pET21d-dxs-ispD-ispF-idi， 命名为 pJF47。 基因 Genbank No. 引物序列 克隆位点

dxs NP 414954.1 dxs-F: CATGCCATGGGCATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG NcollEcoRl

dxs-R: CGGAATTCACTAGTTTATGCCAGCCACCTT

ispD NP 417227.1 ^Z)-F:CATGCCATGGGCATGGCAACCACTCATTTGGATGTT Ncol/ EcoRI

,^D-R:CGGAATTCACTAGTTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTT

ispF NP— 417226.1 ispF-F: CATGCCATGGGCATGCGAATTGGACACGGTTTTG NcoI/EcoRI

ispF-R: CGGAATTCACTAGTTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAG

idi NP 417365.1 idi-F: CATGCCATGGGCATGCAAACGGAACACGTCATTTTA Ncol/ EcoRI

idi-R: CGGAATTCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAG

然后挑取单克隆至含有氨苄青霉素（100mg/L)和� ��那霉素 (50mg/L)的 LB液体 中， 37 °C培养 8h后， 离心收集菌体， 加入 10%(v/v)的甘油制备种子液， -80 °C保存。

以 5%(v/v)的接种量接入装有 10ml M9培养基 (购自上海生工) (含 100mg/L氨苄青霉 素， 50mg/L卡那霉素）的 100ml摇瓶中， 37°C培养至 OD约为 0.4后，加入 0.05mM IPTG 诱导培养， 然后 22 °C培养 5天后， 收集发酵液， -80 °C冷冻保存。 实施例 6、实施例 5制备的部分合成甜菊糖中间产物贝壳烯的重� �细胞的贝壳烯产 物检测

进行实施例 5所得的含有莱鲍迪苷 A或其中间体合成基因的表达质粒和前体途径� � 化表达质粒 pJF47的重组大肠杆菌 E. coli BL21(DE3)发酵生产， 进行贝壳烯的检测。

取 lml实施例 5所得的发酵液，加入 50ul 2M的 HC1,然后加入等体积的乙酸乙酯， 冰浴超声 lmin， 然后室温下漩涡震荡 20min， 12000rpm离心 lmin， 使有机相分层， 吸 取有机相， 残留的水相再用等体积乙酸乙酯萃取 1次， 合并有机相后， 获得经萃取的产 物 (含贝壳烯)， 用 GC-MS直接检测贝壳烯。

贝壳烯的 GC-MS检测条件：采用 Agilent 7890-5975 GC MS系统。柱子为 HP-5MS , 载气为氦气， 流速 lml/min。 进样量 5ul， 不分流， 进样温度 250 °C。 柱子升温程序为： 100°C保持 2min， 以 5 °C/min升温至 250°C， 然后 250°C保持 15min。 溶剂延迟 4.50min。 扫描方式： 选择离子扫描 (m/z 272)。 解离电压为 70eV。

检测贝壳烯的质谱图结果见图 5A， 贝壳烯的出峰时间为 1 1.212min。 各载体转化

E.ci^' BL21(DE3)获得的重组菌株的贝壳烯产量见图 5B和表 6。

表 6、 实施例 6和实施例 8所得的部分发酵液中的贝壳烯产量 宿主 转化宿主的质粒 OD _{6( )} 贝壳烯产量 值 (mg/L)

BL21(DE3) _P ET28a+pJF47 24.7 0

(对照， 空白质粒）

BL21(DE3) pZQ3+pJF47 31.8 189

BL21(DE3) pSY32+pJF47 24.0 1 105

BL21(DE3) pSY33+pJF47 24.2 876

BL21(DE3) pZQ 101+pJF47 20.1 403

BL21(DE3) _P ZQ 102+pJF47 22.3 296 由表 6结果可见， 除空载体 pET28a外， 贝壳烯产量最低的是采用 pZQ3(GGPP是加 拿大红豆杉来源， CDPS和 KS是甜叶菊来源)转化的细胞， 其产量只有 189mg/L。 贝壳 烯产量最高的是采用 pSY32(GGPP是加拿大红豆杉来源， CDPKS是小立碗藓来源)转化 的细胞， 其产量达到 1 105mg/L。

结果表明， 在 E. 表达系统中， 双功能的 CPS/KS模块比 CDPS和 KS双模块同 时表达合成贝壳烯更优， 且小立碗藓来源的 CPS/KS、 加拿大红豆杉来源的 GGPPS效果 尤佳。 实施例 7、 实施例 5制备的部分合成莱鲍迪苷 A的重组细胞的产物检测

取 1ml实施例 5所得的发酵液， 加入等体积的乙酸乙酯， 冰浴超声 lmin， 然后室温 下漩涡震荡 20min， 12000rpm离心 l min， 使有机相分层， 吸取有机相， 残留的水相再 用等体积乙酸乙酯萃取 1次，合并有机相后，萃取获得含甜菊糖苷类� �合物的萃取产物， 包括贝壳烯酸， 甜菊醇， 甜菊醇单糖苷和莱鲍迪苷 A。 将获得的有机相真空干燥， 然后 加入 500ul乙腈重溶残留物， 用 HPLC-MS检测产物。

贝壳烯酸， 甜菊糖醇， 甜菊糖苷化合物的 HPLC-MS检测条件： 采用 HPLC-MS进 行检测 (Aglient , LC 1200/MS-QTOF6520) , C 18反相色谱柱 (Waters, Xterra, 2.1 x50 mm)。 流动相 A相为甲醇 +0.1 %甲酸， B相为水 +0.1 %甲酸。采用梯度洗脱： 0-35min， A由 30% 增加到 100%， B由 70%将至 0。 流速 0.2ml/min， 进样量 8ul。 质谱条件： 采用负离子扫 描， 扫描范围 (m/z) 100- 1500。

结果见图 6， 其中图 6B 为贝壳烯酸的检测结果， 高分辨率质谱的结果显示正离子 扫描存在着 303.2291离子； 其中图 6C为甜菊醇的检测结果， 高分辨率质谱的结果显示 正离子扫描存在着 3 19.2244离子， 其中图 6D为甜菊醇单糖苷的检测结果， 高分辨率质 谱的结果显示正离子扫描存在着 481.2754离子， 其中图 6E为莱鲍迪苷 A的检测结果， 高分辨率质谱的结果显示正离子扫描存在着 967.43离子，最终结果表明该重组大肠杆菌 成功地合成了贝壳烯酸， 甜菊醇、 甜菊醇单糖苷和莱鲍迪苷 A， 其中各载体转化细胞的 莱鲍迪苷 A产量见图 6F和表 7。

表 7

样品 OD _6QQ 值 莱鲍迪苷 A产量 (mg/L)

BL21 (DE3)(pET28a+p JF47) 23.9 0

(对照， 空白质粒）

BL21 (DE3)(pZQ9+p JF47) 25.6 1.8 BL21 (DE3)(pZQ 1 10+p JF47) 20.2 1 1

BL21 (DE3)(pZQ 120+p JF47) 22.3 8.4

BL21 (DE3)(pZQ 1 1 1 +p JF47) 21 4.0

BL21 (DE3)(pZQ 121 +p JF47) 21.2 3.0

BL21 (DE3)(pZQ 1 12+p JF47) 22.5 2 从莱鲍迪苷 A合成途径可知， 斯塔摩酵母来源的 UGTB 1糖基转移酶成功地将甜菊 醇单糖苷的 C-13葡萄糖的 C-2'位点上进一步糖基化生成甜菊醇双糖苷。 对莱鲍迪苷 A 产量比较可见， 不同来源的蛋白对其产莱鲍迪苷 A 有影响。 产量最高的表达载体是 pZQ HO , 莱鲍迪苷 A产量达到 l lmg/L， 其 GGPP来源于加拿大红豆杉， CPS/KS来源 于小立碗藓， KO和 KAH来源于甜叶菊， CPR来源于暗球腔菌， UGT76G1、 UGT74G1 和 UGT85C2来源于甜叶菊， UGTB1糖基转移酶来源于斯塔摩酵母。 实施例 8、 真菌载体的转化及酵母表达

将实施例 3所得的用于合成莱鲍迪苷 A的表达质粒载体用 Sail将质粒酶切，使其线 性化， 电转到宿主细胞毕赤酵母 KM71(购自 Invitrogen)后得到具有质粒整合到基因组上 His位点的重组毕赤酵母 KM71 ; 然后挑取单克隆至 BMGY液体培养基中， 30 °C培养 24 小时后， 离心收集菌体， 加入 10%的甘油制备种子液， -80°C保存。

挑取单克隆到含 50ml BMGY的 500ml摇瓶中， 过夜 28 °C， 250rpm培养至 OD600 为 2-4C约 16-20h)。离心收集菌体，去掉上清培养基，将� �体转移到含 l OmlBMMY的 100ml 摇瓶中， 28 °C， 250rpm培养， 每 24小时加入 50μ1的甲醇， 培养 5天后， 收集发酵液， -80°C冷冻保存。 实施例 9、实施例 8制备的部分合成甜菊糖中间产物贝壳烯的重� �酵母细胞的贝壳 烯产物检测

进行实施例 8所得的重组毕赤酵母 KM71发酵生产的产物贝壳烯进行检测。

取 lml实施例 8所得的发酵液，加入 50ul 2M的 HC1,然后加入等体积的乙酸乙酯， 冰浴超声 lmin， 然后室温下漩涡震荡 20min， 12000rpm离心 lmin， 使有机相分层， 吸 取有机相， 残留的水相再用等体积乙酸乙酯萃取 1次， 合并有机相后， 用 GC-MS直接 检测贝壳烯， 成功检测到产物贝壳烯， 其产量见图 7和表 8。

表 8

样品 OD ₆₀₀ 值 贝壳烯产量 (mg/L)

KM71(pPIC3.5K)(对照， 空白质粒） 24.7 0

KM71 (pSY16) 124 189

KM71 (pZQ132) 143 1 172

KM71 (pZQ133) 135 827

KM71 (pZQ201) 120 438

KM71 (pZQ202) 123 342 从产量上比较可知， 在毕赤酵母表达系统中，双功能的 CPS/KS比 CDPS/KS的组合 具有更优异的合成贝壳烯的效果。 选用最优的表达载体 pZQ132， 贝壳烯产量达到 1172mg/L， 比选用 pSY16表达载体产量高了 5.4倍。 实施例 10、 实施例 8制备的部分合成莱鲍迪苷 A的重组酵母细胞的产物检测 取 lml实施例 8所得的发酵液， 加入等体积的乙酸乙酯， 冰浴超声 lmin， 然后室温 下漩涡震荡 20min， 12000rpm离心 lmin， 使有机相分层， 吸取有机相， 残留的水相再 用等体积乙酸乙酯萃取 1次， 合并有机相后， 萃取获得甜菊糖苷类化合物， 包括贝壳烯 酸， 甜菊醇， 甜菊醇单糖苷和莱鲍迪苷 A。 将获得的有机相中真空干燥， 然后加入 500ul 乙腈重溶残留物， 用 HPLC-MS检测产物， 高分辨率质谱的结果显示正离子扫描存在着 303.2291离子、 319.2244离子、 481.2754离子和 967.43离子， 结果表明该重组毕赤酵母 成功地合成了贝壳烯酸， 甜菊醇、 甜菊醇单糖苷和莱鲍迪苷 A。 各重组酵母细胞的莱鲍 迪苷 A产量见图 8和表 9。

表 9

样品 OD _6Q() 值 莱鲍迪苷 A产量 (mg/L)

KM71(pPIC3.5K)(对照， 空白质粒） 24.7 0

KM71 (pSY22) 120 1.7

KM71 (pZQ210) 132 12

KM71 (pZQ220) 141 8.9

KM71 (pZQ211) 118 4.5

KM71 (pZQ221) 119 3.6

从图 8和表 9可知， 莱鲍迪苷 A产量最高的表达载体是 pZQ210， 莱鲍迪苷 A产量 达到 12mg/L， 其 GGPP来源于加拿大红豆杉， CPS/KS来源于小立碗藓， KO和 KAH来 源于甜叶菊， CPR来源于暗球腔菌， UGT76G1、 UGT74G1和 UGT85C2来源于甜叶菊， UGTB1糖基转移酶来源于斯塔摩酵母。 实施例 11、 UGTB1或 IBGT糖基转移酶的功能研究

取 lml实施例 5所得的发酵液， 加入等体积的乙酸乙酯， 冰浴超声 lmin， 然后室温 下漩涡震荡 20min， 12000rpm离心 lmin， 使有机相分层， 吸取有机相， 残留的水相再 用等体积乙酸乙酯萃取 1次， 合并有机相后， 萃取获得甜菊醇单糖苷和甜菊醇双糖苷。 将获得的有机相中真空干燥， 然后加入 500ul乙腈重溶残留物， 用 HPLC-MS检测产物， 结果见图 9。从图 9C可知，只含 UGT85c2糖基转移酶，不含 UGTB1糖基转移酶或 IBGT 糖基转移酶的 pZQ104、 pZQ105和 pZQ106发酵液中只能检测到甜菊醇单糖苷， 不能检 测到甜菊醇双糖苷。 而 pZQ107、 pZQ108、 pZQ109 pSY200、 pSY201和 pSY202中都 含有 UGT85c2糖基转移酶和 UGTB1糖基转移酶或 IBGT糖基转移酶， 它们的发酵液中 都能成功检测到甜菊醇双糖苷（图 9A、 9B和 9D)。

本发明人还检测了不同表达载体转化的原核细 胞的甜菊醇单糖苷和甜菊醇双糖苷 产量， 结果如图 10和表 10。

表 10

样品 OD ₆₀₀ 甜菊醇单糖苷产量 甜菊醇双糖苷产

值 (mg/L) (mg/L)

BL21 (DE3)(pET28a+pJF47) 23.0 0 0

(对照， 空白质粒）

BL21 (DE3)(pZQ 104+p JF47) 24.9 24 0

BL21 (DE3)(pZQ 105+pJF47) 20.6 150 0

BL21 (DE3)(pZQ 106+pJF47) 22.1 98 0

BL21 (DE3)(pZQ 107+pJF47) 21.3 0.08 33

BL21 (DE3)(pZQ 108+pJF47) 21.9 1.3 206

BL21 (DE3)(pZQ 109+pJF47) 22.7 0.7 134

BL21 (DE3)(pSY200+pJF47) 21.1 0.09 31

BL21 (DE3)(pSY200+pJF47) 21.3 1.2 215

BL21 (DE3)(pSY200+pJF47) 22.8 0.6 140 从图 10和表 10可知， 不含 UGTB1 糖基转移酶或 IBGT糖基转移酶的表达载体 pZQ104、 pZQ105和 pZQ106和阴性对照 pET28a都只能生产甜菊醇单糖苷， 不能生产甜 菊醇双糖苷。从生物催化效率上看， UGTB1糖基转移酶或 IBGT糖基转移酶对甜菊醇单 糖苷的转化效率非常高， 转化效率可达 99%以上。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定 的范围。