Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer drei- dimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial umfassend den Schritt des Druckens oder Extrudierens des Strukturmaterials in einer Flüssigkeit zum Erhalt einer dreidimensionalen Struktur, wobei diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte ist. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung solche hergestellten dreidimensionalen Strukturen sowie entsprechende Druckeinrichtungen zum Ausbilden dieser dreidimensionalen Struktur, insbesondere zur erfindungsgemäßen Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Herstellung dreidimensionaler Strukturen, die zumindest teilweise lebende Zellen enthalten.

Stand der Technik

In den letzten Jahren hat die biotechnologische Herstellung von Biomaterialien zugenommen und insbesondere auf dem Gebiet des Tissue Engineerings wurden verschiedene Anwendungsbereiche diskutiert. Eines der Ziele des Tissue Engineering ist es, den Mangel an Spenderorganen durch die I mplantation autologer Organe oder Gewebe zu beheben. Zur Generierung von entsprechenden Gewebesubstituten gibt es verschiedene Möglichkeiten. So werden in einem Ansatz dem Patienten Zellen entnommen und in vitro vermehrt. Nach Erhalt einer ausreichenden Zellzahl werden die Zellen dann mit Hilfe verschiedener Verfahren z.B. in einem Bioreaktor kultiviert. Je nach Anwendung werden die Zellen dort in oder auf ein formgebendes Stützgerüst, dem sogenannten Scaffold, verbracht. Dieses Ge- rüst oder Scaffold kann dabei biologischen Ursprungs oder synthetisch sein. Solche Sca fo/c/materialien können dabei sowohl als degradierbare Materialien als auch Permanentmaterialien vorliegen. In einigen Anwendungsbereichen sind biodegradierbare Materialien gewünscht, die im Lau- fe der Zeit durch die von den Zellen gebildete Struktur ersetzt oder remodelliert werden. Solche durch Tissue Engineering gewonnenen Gewebe- substitute schließen sowohl Haut als auch andere Weich- oder Hartgewebe ein. Diese beinhalten unter anderem Knochen- oder Knorpelgewebe aber auch verschiedene Formen von Gefäßen einschließlich Blutgefäßen sowie Luftröhre oder Speiseröhre. Weitere durch Tissue Engineering gewonnene Strukturen beinhalten Herzklappen oder Venenklappen. Ziel des Tissue Engineerings ist die Bereitstellung von gesamten funktionsfähigen Geweben oder Organen. Das herzustellende Gewebesubstitut wird üblicherweise in Bioreaktoren bis zum Einsatz kultiviert. Je nach Anwendung kann das Gewebesubstitut mit entsprechend geeigneten Mitteln gelagert werden.

Wenn biodegradierbare Scaffolds eingesetzt werden, so werden hierzu bevorzugt biodegradierbare Strukturmaterialien genutzt, die als polymere Gele vorliegen, wie beispielsweise Kollagen-, Fibrin-, Alginat- oder Agarose-Gele. Bei Vermischung dieser polymeren Gele mit Zellen ist eine gleichmäßige Zellverteilung gewährleistet und die eingebrachten Zellen können sich entsprechend entwickeln und vermehren. Die Formgebung dieser dreidimensionalen Strukturen, den Scaffolds, die gegebenenfalls lebende Zellen enthalten, kann über verschiedene Verfahren erfolgen. Möglich sind hier Guss, Extrusion oder Drucken der dreidimensionalen Strukturen. Allerdings stellt die geringe Stabilität dieser Gele als Strukturmaterial Probleme bei der Herstellung entsprechender dreidimensionaler Strukturen dar. Bisherige Ergebnisse erlaubten allerdings lediglich die Herstellung von sehr kleinen dreidimensionalen Polymerkonstrukten. Es besteht daher ein Bedarf Verfahren bereitzustellen, die die Herstellung von Gewebesubstituten bereitzustellen, die die oben genannten Probleme insbesondere bzgl. der Dimension der dreidimensionalen Strukturen überwindet. Insbesondere bei Einbringen von lebenden Zellen in die dreidimensionale Struktur (Scaffold) muss dieses Verfahren gewährleisten, dass die Zellen sich anschließend in die gewünschten Gewebesubstitute entwi- ekeln können.

Fluorkohlenwasserstoffe sind nicht-wässrige (hydrophobe), biokompatible, stark oxygenierte Fluide mit hoher Schwimmdichte. Perfluorkohlenwas- serstoffe bzw. Perhalogenkohlenwasserstoffe sind häufig inerte Fluide. Bereits seit den 50er Jahren werden Fluorkohlenwasserstoffe in Experimenten mit Flüssigkeitsatmung untersucht. Es zeigte sich, dass Suspensionskulturen in Perfluorkohlenwasserstoffen sehr gut überleben können (z. B. Maillard E. et.al, Biomaterials, 201 1 , 32, 9282-9). Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial ggf. enthaltend lebende Zellen umfassend den Schritt des Druckens oder Extrudierens des Strukturmaterials ggf. in Mischung mit lebenden Zellen eingetaucht in eine Flüssigkeit, um eine dreidimensionale Struktur ggf. enthaltend lebende Zelle zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte ist, bereit.

Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer dreidimensionalen Struktur, die zumindest teilweise lebende Zellen enthält und als Gewebesubstitut geeignet ist, wobei die Herstellung durch Drucken oder Extrudieren der Struktur eingetaucht in eine Flüssigkeit erfolgt {submerged), wobei die Flüssigkeit bevorzugt ein Fluorkohlenwasserstoff, insbesondere ein Perfluorkohlenwasserstoff ist. Diese Flüssigkeit, insbesondere das erfindungsgemäß verwendbare Fluorkohlenwasserstoff, ist dabei eine Flüssigkeit hoher Dichte. Durch Verwendung der Flüssigkeit hoher Dichte ist ein ortsselektives Einbringen des Strukturmaterials durch Drucken oder Extrudieren möglich. Es zeigte sich, dass insbesondere die Fluorkohlenstoffe, wie die Perfluorkoh- lenstoffe, sich aufgrund ihrer inerten Eigenschaften nicht mit dem gedruck- ten, in flüssiger Form vorliegenden Strukturmaterial gegebenenfalls weiterhin enthaltend Lösungsmittel, mischbar und reaktiv sind. Aufgrund der hohen Dichte der Flüssigkeit, die höher ist als die Dichte des Strukturmaterials, wenn es in flüssiger Form gedruckt wird, wird eine Stabilisierung und Stützung des gedruckten oder extrudierten Strukturmaterials erreicht.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf dreidimensionale Strukturen, insbesondere solche, die lebende Zellen enthalten, erhältlich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese dreidimensionalen Strukturen sind insbesondere artifizielle Weich- oder Hartgewebe.

Ein weiterer Aspekt stellt eine Druckeinrichtung zur insbesondere ortsspezifischen Ausbildung dieser dreidimensionalen Strukturen dar. Diese Einrichtung kann mit Hilfe von strukturgeometrischen Daten zur dreidimensionalen Struktur ortsselektiv das Strukturmaterial Drucken oder Extrudieren. Schließlich richtet sich die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt auf die Verwendung dieser dreidimensionalen Strukturen ggf. enthaltend lebende Zellen als artifizielles Gewebe, insbesondere als Weichgewebe oder Hartgewebe. Letztlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Flüssigkeit hoher Dichte, insbesondere von Fluorkohlenwas- serstoffen, wie Perfluorkohlenwasserstoffen, als Medium zum Drucken oder Extrudieren einer dreidimensionalen Struktur, die ggf. lebende Zellen enthält, bereit.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial ggf. enthaltend lebende Zellen umfassend den Schritt des Druckens oder Extrudierens des Struk- turmaterials ggf. in Mischung mit lebenden Zellen eingetaucht in eine Flüssigkeit, um eine dreidimensionale Struktur ggf. enthaltend lebende Zelle zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte ist.

Vorliegend wurde festgestellt, dass diese Flüssigkeit hoher Dichte derart unterstützend auf das gedruckte oder extrudierte Strukturmaterial einwirkt, dass die dreidimensionalen Strukturen unter Erhalt dieser Struktur einfach durch Extrudieren und Drucken hergestellt werden können. Insbesondere erlaubt diese Flüssigkeit ein ortsselektives Aufbauen der Struktur. Es ist dabei gewünscht, dass die Flüssigkeit eine ist, die mit dem Strukturmaterial nicht-mischbar und/oder nicht-reaktiv ist. Die Flüssigkeit ist also bevorzugt eine inerte Flüssigkeit mit hoher Dichte, die das gedruckte oder extrudierte Strukturmaterial stützt und stabilisiert. Insbesondere bei Struk- turmaterialien, die Wasser als Lösungsmittel oder Bestandteil enthalten, wie Hydrogele, ist die Flüssigkeit hoher Dichte eine, die mit dem Strukturmaterial nicht-mischbar und nicht-reaktiv ist.

Unter dem Ausdruck„Strukturmaterial" wird vorliegend ein druck- oder extrudierbares Material verstanden, das eine dreidimensionale Struktur ausbilden kann. Insbesondere ist dieses Strukturmaterial eines, das eine beständige dreidimensionale Struktur ausbildet, insbesondere kann diese beständige dreidimensionale Struktur erhalten werden durch Abkühlen des zum Extrudieren oder Drucken erwärmten Strukturmaterials oder ander- weitiges Aushärten dieser Strukturmaterials, z. B. durch Vernetzen etc, wie durch Induktion der Aushärtung durch Energiezufuhr.

Als Strukturmaterialien können sowohl thermosensitive synthetische Polymere als auch Hydrogele verwendet werden. Insbesondere sind die

Hydrogele solche aus einem Material ausgewählt aus Agarose, Kollagen, Fibrin, Alginat, Chitosan, Hyaluronan oder synthetischen Hydrogelen einschließlich Polyethylenglycol, Poly-(N-Isopropylacrylamid) und Kopolyme- re, Polylaktide, Polyurethane oder Polyvinylalkohole oder Mischungen von sowohl natürlichen als auch synthetischen Polymeren, insbesondere Hydrogele, die stark hydratisiert sind und somit insbesondere im Zusammenspiel mit lebenden Zellen geeignet sind.

Als Polymere können auch Gele auf Silica-Basis, insbesondere solche, die zumindest teilweise mit einem Si-N Precursor hergestellt sind. Dem Fachmann sind geeignete Systeme bekannt. Es können dabei verschiedene Strukturmaterialien zur Herstellung der dreidimensionalen Struktur eingesetzt werden. Entweder derart, dass verschiedene Strukturmaterialien in verschiedenen Schichten eingesetzt werden oder dass verschiedene Strukturmaterialien in einer gedruckten oder extrudierten Schicht zur Ausbildung von Bereichen unterschiedlicher Ei- genschaften eingesetzt werden. Dadurch können Strukturen hergestellt werden, die in unterschiedlichen Teilbereichen verschiedene Zellarten aufweisen oder die nur abschnittsweise Zellen aufweisen, während andere Abschnitte zellfrei sind. Unter dem Ausdruck„Flüssigkeit hoher Dichte" wird vorliegend ein Fluid, insbesondere eine Flüssigkeit, verstanden, das im Vergleich zu der Dichte des Strukturmaterials, das in die Flüssigkeit hoher Dichte gedruckt oder extrudiert wird, zum Zeitpunkt des Druckens oder Extrudierens eine Dichte von größer als 0,2 g/cm ³ , bevorzugt von grö ßer als 0,3 g/cm ³ im Vergleich zu der Dichte des Strukturmaterials aufweist. Die Flüssigkeit hoher Dichte ist eine, deren Dichte höher ist als die Dichte des in flüssiger Form gedruckten Strukturmaterials. Die Dichte ist dabei ein Maß für die Masse des Stoffes pro Volumeneinheit. Sie ist vollkommen unabhängig von der Viskosität eines Fluids. Die Viskosität ist ein Maß für die Zähflüssigkeit eines Fluids. Diese Zähflüssigkeit ist dabei unabhängig von der Dichte des Stoffes. D.h. eine Flüssigkeit hoher Dichte kann eine niedrige Viskosität aufweisen und ist dennoch erfindungsgemäß geeignet. So weisen z.B. Fluor- Kohlenwasserstoffe wie Perfluorkohlenwasserstoffe eine hohe Dichte bei niedriger Viskosität auf.

Der Ausdruck„umfassen" oder„umfassend" und die Ausdrücke„enthal- tend" oder„enthalten", wie sie vorliegend verwendet werden, beinhalten die Ausführungsform von„bestehen" oder„bestehend aus" soweit nicht explizit anders ausgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet dreidimensi- onale Strukturen herzustellen, wobei diese Strukturen zumindest teilweise lebende Zellen enthalten können. Diese lebenden Zellen können dann im Rahmen des Tissue Engineering (im Deutschen auch als Gewebekonstruktion bzw. Gewebezüchtung bezeichnet) eingesetzt werden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können dabei die Nachteile bekannter Verfahren überwunden werden, nämlich die Herstellung von dreidimensionalen Strukturen guter mechanischer Stabilität und in Dimensionen, die aufgrund der geringen Stabilität der Gele, wie Hydrogele, die im Tissue Engineering-Bereich eingesetzt werden, bisher nicht erzielt werden konnten.

Bevorzugt handelt es sich bei der Flüssigkeit hoher Dichte um eine Flüssigkeit mit einer Dichte von mindestens 1 ,5 g/cm ³ , insbesondere bevorzugt einer Flüssigkeit mit einer Dichte von mindestens 1 ,7 g/cm ³ . Diese Flüssigkeiten sind bevorzugt hydrophobe Flüssigkeiten.

Besonders geeignete Flüssigkeiten hoher Dichte sind erfindungsgemäß Fluorkohlenwasserstoffe, insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe. Die erfindungsgemäß verwendbaren Flüssigkeiten, in die eingetaucht die dreidimensionalen Strukturen insbesondere ortsselektiv extrudiert bzw. ge- druckt werden, sind dabei solche, die bevorzugt nicht wässrig, biokompatibel sowie gut oxygenierbar sind. Weiterhin sind die Flüssigkeiten hoher Dichte bevorzugt derart, dass sie sich gegenüber dem Strukturmaterial inert verhalten, nicht-mischbar und/oder nicht-reaktiv sind.

Insbesondere die Perfluorkohlenwasserstoffe erlauben ein Herstellen dreidimensionaler Strukturen, die zumindest teilweise lebende Zellen enthal- ten können. Kohlenwasserstoffe und insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe sind bekannt als Flüssigkeiten, in denen Zellen überleben können. Sie sind z. B. als Flüssigkeiten beschrieben, die die Fähigkeit aufzeigen Atemgase, wie Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid zu lösen. Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei den Perfluorkohlenwasserstof- fen als Flüssigkeit hoher Dichte um Perfluorkohlenwasserstoffe ausgewählt aus der Gruppe von Perfluortributylamin (C ₁₂ F ₂₇ N), Perfluordecalin (C-I OF-I S), Perfluorhexamethylprisman (Ci ₂ Fi ₈ ). Perfluorkohlenwasserstoffe, wie Perfluordecalin oder Perfluorhexamethylprisman sind chemisch inert, so dass eine Umsetzung mit dem Strukturmaterial oder mit Zellkomponenten nicht auftritt. Perfluorkohlenwasserstoffe oder Perfluorkohlenwasserstoffemulsionen, die vorliegend unter dem Ausdruck Perfluorkohlenwasserstoffe fallen, sind als Sauer- stoffträger bekannt. Sie werden z. B. als Blutersatz (EP 0307087 B1 ) oder im Rahmen der Flüssigbeatmung beschrieben. Durch Tan, Q., et al., Tis- sue Engineering Part A, 2009 ;1 5(9) :2471 -2480 ist die Verwendung von Perfluorkohlenwasserstoffemulsionen zur Sauerstoffversorgung kultivierter Zellen und Gewebe bekannt. Überraschend wurde nun gefunden, dass solche Flüssigkeiten hoher Dichte, wie Fluorkohlenwasserstoffe und insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe, ideale Flüssigkeiten zur Herstellung dreidimensionaler Strukturen, die zumindest teilweise lebende Zellen enthalten, darstellen. D.h., bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Einrichtungen zum Extrudieren oder Drucken in die Flüssigkeit hoher Dichte eingetaucht und dann das Strukturmaterial ggf. enthaltend lebende Zellen dreidimensional extrudiert bzw. schichtweise gedruckt. Entsprechende Verfahren des Extrudierens und Druckens von Strukturen sind all- gemein bekannt. Z.B. können Verfahren eingesetzt werden, wie sie aus dem„Rapid-Prototyping" bekannt sind. Diese Verfahren können ortsselektiv das Strukturmaterial extrudieren oder drucken. Üblicherweise erfolgt dieses aufgrund bereitgestellter strukturgeometrischer Daten. Diese Daten geben die detaillierte Geometrie dieser herzustellenden Struktur, wie des Gewebes, wieder.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zel- len. Diese Struktur enthaltend lebende Zellen wird dann in weiteren Schritten mittels bekannter Zellkulturverfahren kultiviert, um schließlich artifiziel- le dreidimensionale Strukturen als Gewebesubstitut bereit zu stellen.

Strukturmaterial, das erfindungsgemäß eingesetzt wird ist dabei zumindest teilweise eine Mischung aus dem Strukturmaterial und lebenden Zellen, um dreidimensionale Strukturen, die zumindest abschnittsweise lebende Zellen enthalten, herzustellen. Bevorzugt handelt es sich bei den lebenden Zellen um eukaryotische Zellen, insbesondere Zellen humanen Ursprungs. Es ist insbesondere bevorzugt, dass es sich bei den Zellen um Primärzellen handelt, z.B. Zellen xenogenen, allogenen oder autologen Ursprungs. Diese Zellen werden entsprechend als Isolate bereitgestellt.

Die Zellen können dabei je nach herzustellender Struktur, z.B. je nach herzustellendem Hart- oder Weichgewebe, entsprechend gewebespezifische Zellen sein. Vorzugsweise liegen mehrere Arten dieser gewebespezi- fischen Zellen vor. Unter gewebespezifischen Zellen oder organspezifischen Zellen werden zunächst alle Zellen verstanden, die sich in dem Organ oder dem Gewebe befinden (einschließlich nicht auf das spezielle Gewebe oder Organ beschränkte Zellen). Diese Zellen schließen verschiedene Typen von Zellen einschließlich Muskelzellen, Epithelzellen, Nervenzellen, Bindegewebszellen aber auch Stammzellen ein. So können Zellen vom Typ Muskelzellen glatte Muskelzellen, quergestreifte Muskelzellen oder Herzmuskelzellen sein, Epithelzellen schließen ein Darme- pithelzellen, Hautepithelzellen, Endothelzellen, Pneumozyten, Nervenzellen schließen ein Neuronen einschließlich motorische und sensorische Neuronen sowie Interneuronen, Gliazellen usw. ; sowie Bindegewebszellen mit Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Myo- fibroblasten, Perizyten.

Die oben genannte Aufzählung ist nur beispielhaft und nicht abschließend zu verstehen. Je nach Gewebe oder Organ können auch entsprechend gewebe- und organspezifische Zellen eingebracht werden.

Weiterhin kann das Strukturmaterial bzw. die Mischung mit den lebenden Zellen und ggf. weiteren Zusatzstoffen weiterhin Hilfsstoffe zur Unterstützung des Kultivierungsprozesses enthalten. Solche Hilfsstoffe sind insbesondere Zelladhäsionsmoleküle, Differenzierungsfaktoren, immunologisch aktive Zytokine/Chemokine und/oder Antibiotika. Diese können ggf. mit dem Strukturmaterial konjugiert vorliegen. Als weitere Zusatzstoffe sind Ionen, Nährstoffe einschließlich Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und anderen notwendigen Nährstoffen, die die Proliferation und Differenzierung der Zellen fördern, möglich.

Das Strukturmaterial kann je nach Anwendungsgebiet weiterhin Zusatzstoffe in flüssiger oder fester Form aufweisen. Z. B. für den Aufbau von Knochen- oder Knorpelsubstituten können entsprechende Calciumphos- phate vorliegen. Möglich sind auch Komponenten, z. B. in Form von ver- kapselten Verbindungen, die eine zeitverzögerte Freisetzung von in der Kapsel vorliegenden Verbindungen erlaubt.

Bevorzugt handelt es sich bei den Strukturmaterialien um Polymere, die eine gute Kohäsion zwischen den einzelnen gedruckten oder extrudierten Schichten erlaubt.

Je nach Anwendung kann es sich bei dem Strukturmaterial um ein perma- nentes Material oder um ein biodegradierbares Material handeln. Im Bereich des Tissue Engineerings kann insbesondere ein biodegradierbares Material vorteilhaft sein. Dieses biodegradierbare Material übernimmt vorübergehend die Funktion der extrazellulären Matrix, die im weiteren Ver- lauf von den Zellen selbst sezerniert wird. Anwendungsbereiche sind hier insbesondere Gefäße usw.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Ausbildung von Gewebesubstituten, insbesondere von artifiziellen Weichgewebe oder Hartgewebe. Weichgewebe oder Hartgewebe schließen ein

Knochengewebe oder Knorpelgewebe aber auch Gefäße, wie Blutgefäße oder Luftröhre, Speiseröhre aber auch Herzklappen oder andere Klappen, Gewebeconduits zum Harnblasenersatz, Ligamente und Sehnenersatz sowie Organe.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der dreidimensionalen Struktur kann weitere Schritte umfassen. So kann nach Drucken oder Extrudieren der dreidimensionalen Struktur in der Flüssigkeit hoher Dichte, die Flüssigkeit hoher Dichte entfernt werden, um die dreidimensionale Struktur ggf. enthaltend lebende Zellen weiter zu kultivieren. Eine Kultivierung kann gemäß üblicher Verfahren, wie sie aus der Gewebezüchtung bekannt sind, erfolgen, um das Zielgewebe zu erhalten.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Druckverfahren. Dabei wird das Strukturmaterial ggf. enthaltend lebenden Zellen sequenziell ortsselektiv gedruckt. Das Drucken erfolgt in mehreren Schichten übereinander, um durch dieses mehrfache Drucken die Ausbildung der dreidimensionalen Struktur ggf. mit lebenden Zellen zu erlauben. Wie ausgeführt, können die Schichten aus gleichen oder unterschiedlichen Strukturmaterialien ausgebildet sein.

Durch dieses Drucken sind insbesondere komplexe dreidimensionale Strukturen herstellbar. Solche dreidimensionalen Strukturen umfassen Herzklappen aber auch andere Arten von Hart- und Weichgewebe sowie von Gefäßen, z. B. Gefäße mit abgehenden Gefäßteilen (Gefäßäste) usw. Gerade in komplexen dreidimensionalen Strukturen liegen Freiräume, wie Lumina und Kavitäten vor, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden können. Durch das ortsselektive Extrudieren oder Drucken des Strukturmaterials in der Flüssigkeit hoher Dichte lassen sich einfach entsprechende Lumina und Kavitäten ausbilden, so dass eine Schaffung komplexer dreidimensionaler Strukturen einfach möglich ist, ohne dass diese Strukturen aufgrund geringer Stabilität des Strukturmaterials sich während der Herstellung oder der späteren Kultivierung verformen.

Ein bekanntes Verfahren umfasst ein tintenstrahlbasiertes System, wie es in der Literatur beschrieben ist. Andere Verfahren sind solche auf pneumatischer Basis oder auf Extruder-Basis.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf dreidimensionale Strukturen enthaltend ggf. lebende Zellen, die mit dem erfin- dungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Bei diesen dreidimensionalen Strukturen handelt es sich insbesondere um Gewebesubstitute, wie artifi- zielles Weichgewebe oder Hartgewebe, einschließlich Knochengewebe, Knorpelgewebe, Blutgefäße, Luftröhre, Speiseröhre, Herzklappe oder Organe. Diese so erhaltenen dreidimensionalen Strukturen ggf. enthaltend lebende Zellen können als artifizielles Gewebe eingesetzt und Patienten implantiert werden. Sie können als transientes oder permanentes Gewebe implantiert werden.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbaren dreidimen- sionalen Strukturen können insbesondere komplexe Strukturen darstellen, die mit den bisher bekannten Verfahren aufgrund der Instabilität der hergestellten Strukturen nicht erreichbar waren oder nur durch Einsatz zu- sätzlicher Hilfsstrukturen.

Die strukturgeometrischen Daten, also die detaillierte Geometrie der nachzubildenden dreidimensionalen Struktur, insbesondere des Gewebes oder des Organs, erlauben die Steuerung der Extrudier- oder Druckeinrichtung, insbesondere des Druckkopfes oder der Extrudierdüse, um die Raumform der gewünschten dreidimensionalen Struktur ortsselektiv zu drucken. Diese strukturgeometrischen Daten werden mit Hilfe bekannter Verfahren auf Basis von Originalstrukturen, z. B. Gefäßen, Organen etc. generiert und dann entsprechend mit Hilfe der erfindungsgemäßen Einrichtung umgesetzt.

Es ist erfindungsgemäß möglich, bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren die dreidimensionalen Strukturen ohne Einsatz von Hilfs- strukturen herzustellen. D. h., es müssen keinerlei Stütz- oder Hilfsstrukturen genutzt werden, um insbesondere Strukturmaterialien, wie Hydrogele zu stützen. Diese Stützung erfolgt durch die Flüssigkeit hoher Dichte, in die das Stützmaterial extrudiert bzw. gedruckt wird. Überraschenderweise zeigte es sich, dass auch aufgrund der vorhandenen Dichteunterschiede das Stützmaterial bzw. die dreidimensionale Struktur nicht in ungewollter Art und Weise verformt wird.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf eine Einrichtung, wie eine Druckeinrichtung oder Extrusionseinrichtung, zum Ausbilden einer dreidimensionalen Struktur ggf. enthaltend lebende Zellen. Die Einrichtung ist derart ausgebildet, dass sie zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Diese Einrichtung umfasst Mittel zum Drucken oder Extrudieren, wobei diese Mittel derart ausgebildet sind, dass sie ein Drucken oder Extrudieren des Strukturmaterials ggf. enthaltend lebende Zellen ortsselektiv ermöglicht und ein Drucken oder Extrudieren in einer Flüssigkeit hoher Dichte erlaubt. Weiterhin weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Einrichtung zur Aufnahme der Flüs- sigkeit hoher Dichte auf. Die Einrichtung zum Drucken oder Extrudieren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Extrudieren oder Drucken derart ausgebildet sind, dass sie ein in eine Flüssigkeit eingetauchtes Extrudieren oder Drucken ermöglichen. Die Einrichtung zum Drucken oder Extrudieren ist dabei derart ausgebildet, dass sie mit Hilfe von einer ggf. motorisierten X-, Y-, Z-Steuerung eine Positionierung dieser Mittel zum Drucken oder Extrudieren in eine in allen drei Dimensionen vorbestimmte Position erlaubt. Weiterhin ist dieses Mittel zum Drucken oder Extrudieren bevorzugt mit einer Einheit ausgestattet, die ein Erwärmen des zu dru- ckenden oder extrudierenden Strukturmaterials ermöglicht. Entsprechende Steuerungselemente einschließlich Ventile erlauben eine präzise Mengenabgabe des zu extrudierenden oder druckenden Strukturmaterials.

Alternativ oder ergänzend kann die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssig- keit hoher Dichte ebenfalls beweglich ausgebildet sein, d. h. ebenfalls in X- , Y- und Z-Richtung bewegbar ausgebildet sein. Sollte die Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme der Einrichtung für die Flüssigkeit hoher Dichte bewegbar ausgebildet sein, kann das Mittel zum Drucken und Extrudieren auch stationär ausgebildet sein.

Die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte ist geeignet zur Inkubation der dreidimensionalen Struktur ggf. enthaltend lebende Zellen bei Temperaturen von mindestens 30 °C. Insbesondere handelt es sich bei dieser Einrichtung um eine, die einen Bioreaktor selbst darstellt oder in einen Bioreaktor überführt werden kann oder, dass die in der Einrichtung gedruckte oder extrudierte Struktur in ein Nährmedium überführt werden kann. Hierdurch ist es einfach möglich, die durch Extrusion oder Druck hergestellte dreidimensionale Struktur mit enthaltenen lebenden Zellen zu kultivieren, um eine entsprechende dreidimensionale Struktur, die als Ge- webesubstitut geeignet ist, bereitzustellen.

In einer Ausführungsform kann die Druckeinrichtung unter entsprechenden Kulturbedingungen gehalten werden.

Unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur 1 werden eine erfindungsgemäße Druckeinrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren näher erläu- tert.

Die Figur 1 stellt das Druckverfahren als ersten Schritt, die Inkubation bei 37 °C, d. h. die Kultivierung der gedruckten dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen als zweiten Schritt sowie die erhaltene dreidi- mensionale Struktur im dritten Schritt dar.

Dargestellt ist eine übliche Zellkulturplatte als Beispiel einer Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte 1 enthaltend die Flüssigkeit hoher Dichte 2, z.B. einen Fluorkohlenstoff. Dabei kann die Platte in einer Aufnahmevorrichtung vorliegen, die eine Bewegung in die X-, Y- und Z- Richtung erlaubt (nicht dargestellt). Weiterhin dargestellt ist das Mittel zum Drucken oder Extrudieren des Strukturmaterials 3. Dieses Mittel ist ebenfalls in X-, Y- und Z-Richtung bewegbar. Der Extrusionskopf oder Druckkopf ist dabei so ausgebildet, dass kleinste Mengen an Strukturmaterial gedruckt bzw. extrudiert werden können. Dadurch können eine Vielzahl von Schichten übereinander gedruckt bzw. extrudiert werden. Wie dargestellt, ist das Mittel zum Drucken oder Extrudieren beheizbar 4, um das Strukturmaterial zu erwärmen und so in einem entsprechenden flüssigen Zustand zum Drucken bzw. Extrudieren zu halten. Nicht dargestellt sind die Steuereinrichtungen zum Steuern des Mittels zum Drucken oder Extrudieren bzw. zum Bewegen der Aufnahmeeinrichtung für die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte.

Mit Hilfe des Mittels zum Drucken bzw. Extrudieren wird schichtweise orts- selektiv gemäß den strukturgeometrischen Daten die dreidimensionale

Struktur 5 extrudiert bzw. gedruckt. Ggf. können auch mehrere Extrusions- oder Druckmittel, d.h. mehrere -Köpfe oder -Düsen, verwendet werden, um z.B. Bereiche mit oder ohne Zellen zu drucken bzw. extrudieren oder um verschiedene Mischungen von Strukturmaterial und Zellen zu drucken bzw. extrudieren. Über die entsprechende Steuerung des Mittels zum Drucken bzw. über die Steuerung der Positionierung und der Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte ist es möglich, die dreidimensionale Struktur zu drucken bzw. zu extrudieren. Das Drucken bzw. Extrudieren des jeweiligen fließbaren Strukturmaterials findet derart statt, dass der Druckkopf bzw. die Extrusionsdüse in die Flüssigkeit hoher Dichte eingetaucht ist und eine vorbestimmte Menge des Strukturmaterials an der vorgegebenen Position gedruckt bzw. extrudiert wird.

Mit dem Drucken in der Flüssigkeit, im Englischen auch als„submerged printing" oder„submerged extrusion" bezeichnet, ist es möglich dreidimensionale Strukturen einer gewünschten Grö ße bereitzustellen. Insbesondere ist es möglich, diese Strukturen derart bereitzustellen, dass keine Verformung der dreidimensionalen Struktur während des Druckens oder Extrudierens oder der späteren Kultivierung stattfindet. Dadurch ist die Größe der hergestellten dreidimensionalen Struktur nicht mehr derart begrenzt, wie es im Stand der Technik gegeben ist. Des Weiteren sind auch komplexe Strukturen möglich, die Kavitäten und Lumina einschließen oder komplexe Strukturen, wie Gefäßäste usw. Nach dem Drucken bzw. Extrudieren wird die Aufnahmeeinrichtung mit der Flüssigkeit hoher Dichte und der hergestellten dreidimensionalen Struktur aus der Druckeinrichtung herausgenommen und in eine Einrichtung zum Kultivieren platziert. Vorher wird zumindest teilweise die Flüssigkeit hoher Dichte entfernt und durch entsprechendes Kulturmedium 6 ersetzt.

Die dreidimensionale Struktur wird dann gemäß bekannter Verfahren kultiviert, um z. B. ein Gewebesubstitut 7, wie artifizielles Weichgewebe oder artif izielles Hartgewebe bereitzustellen.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens war es möglich, Körperstrukturen mit eingelagerten Zellen herzustellen, die anschließend kultiviert wurden. Eine Untersuchung dieser kultivierten Strukturen über einen Zeitraum von mindestens 24 Stunden zeigte, dass die Zellen überleben und sich auch in der Struktur entsprechend entwickelten und proliferierten. Hierzu wurde ein Agarose-Gel nach Autoklavieren auf ca. 37 °C gebracht und mit Zellen einer Zelllinie, vorliegend MG-63 humane Osteo- sarkomzelllinie vermischt oder isolierte und kultivierte humane mesenchymale Stammzellen, um eine Konzentration von 200.000 Zellen/ml zu erhalten. Die verwendete Agarose-Hydrogel-Suspension hatte eine Endkonzentration von 3 %. Mit Hilfe einer rechnergesteuerten Druckeinrichtung wurde das Zellen enthaltende Agarose-Hydrogel gedruckt. Dazu wurde der Druckkopf in Perfluortributylamin (C ₁₂ F ₂₇ N) getaucht und der Hohlkörper sequenziell Schicht für Schicht gedruckt, um einen über 3 cm langen Hohlkörper zu drucken. Nach Herstellung dieses über 3 cm langen Hohlkörpers wurde der Perfluorkohlenwasserstoff entfernt und durch Zellmedium (37 °C) ersetzt. Nach 24stündiger Kultivierung konnte mittels Lebend- /Tot-Färbung der Zellen nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der gedruckten Zellen in der dreidimensionalen Struktur lebend waren und entsprechend verteilt in dem Hohlkörper vorlagen. Bei Überprüfung der dreidimensionalen Strukturen nach 2 oder 3 Wochen, konnten die guten Ergebnisse bestätigt werden. Mit einer Färbung für einen Proliferationsmar- ker (Ki-67) konnte eine Proliferation der in der Struktur vorliegenden Zellen 2 bzw. 3 Wochen nach Kultivierung bestätigt werden.

Bei der Herstellung einer Vielzahl von Strukturen zeigte sich eine hervorragende Reproduzierbarkeit der Herstellung dieser mit Hilfe des erfin- dungsgemäßen Verfahrens.