Anwendungsgebiete sind die Medizin, u. a. Gentherapie, Vakzineentwicklung und Diagnostik, sowie die Veterinärmedizin.

Die somatische Gentherapie hat in den vergangegenen Jahren eine rasante Entwicklung genommen. Inzwischen werden erste klinische Studien durchgeführt. Dennoch ist die Applikationsform des 'heilenden Gens'nach wie vor mit Problemen behaftet. Obwohl virale Vektoren (z. B. auf der Basis von Retroviren oder Adenoviren) eine Reihe von Vorteilen bieten, existieren auch eine Reihe von Sicherheitsproblemen, z. B. ein onkogenes Potential solcher Vektoren und deren Infektiosität, verursacht z. B. durch Reversion deletierter viraler Vektoren zum virulenten Wildtyp in packaging-Zellinien (Übersichten in J.- M. H. Vos, Herausgeber, Viruses in human gene therapy, Carolina Academic press, 1995 ; Schofield und Caskey, 1995, British Med.

Bull. 51,56-71). Gegenüber solchen Virusvektoren besitzen virus-ähnliche Partiel (virus-like particles : VLPs) den Vorteil, daß sie nicht infektiös sind und kein tumorigenes Potential besitzen. Solche VLPs können durch Expression von viralen Kapsid-und Hüllproteinen in verschiedenen heterologen Expressionssystemen erzeugt werden (Übersicht in Ulrich et al., Adv. Virus Res. 50,1997). Besondere Aufmerksamkeit für den Gentransfer erlangten virus-ähnliche Partiel auf der Basis des Hauptkapsidproteins VP1 ('Virusprotein 1') von Polyomaviren.

Bisher sind VP1 verschiedener Polyomaviren in Insektenzellen exprimiert worden. Das rekombinante VP1 von nicht-humanen und humanen Polyomaviren lagerte sich in den Insektenzellen spontan zu VLPs zusammen (Montross et al., 1991, J. Virol. 65,4991- 4998 ; Chang et al., 1997, J. Gen. Virol. 78,1435-1439). Bei E. coli-Expression von Polyomavirus-VP1 ist es gelungen, Kapsomere zu exprimieren, die in vitro zu VLPs re-assoziiert werden können (Salunke et al., 1986, Cell 46,895-904).

Die Verwendung solcher VP1-Partikel im medizinischen Bereich erfordert jedoch eine weitergehende Reinigung, um eventuell vorhandene Fremdstoffe (z. B. toxisch wirkende Verunreinigungen) zu beseitigen.

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung von virusähnlichen Partikeln fuir Gentherapie, Diagnostik und Vakzineentwicklung. Dieses Verfahren soll die hocheffiziente Produktion von nicht-infektiosen, Endotoxin- freien virusähnlichen Partikeln ermöglichen, die fur humane Anwendungen geeignet sind.

Die Erfindung wird gemäß dem Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Der wesentliche Bestandteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Hefe-Expressionssystem, das die Hochexpression von Kapsid-ähnlichen Partikeln von Polyomaviren erlaubt. Diese Partiel können in gober Menge aus Hefezellen isoliert und durch einfache Zentrifugationsschritte gereinigt werden.

Das Verfahren beinhaltet die PCR-Amplifikation und Klonierung einer Polyomavirus-VP1-kodierenden Sequenz. Diese DNA-Sequenz wird in einen Hefeexpressionsvektor mit einer Hefe-spezifischen Expressionseinheit (Promoter und Transkriptionsstopsignal) eingebaut. Die Expression des VP1 erfolgt in Hefezellen, bevorzugt im Saccharomyces cerevisiae Stamm AH 22 (leu2 his4).

Nach AufschluB der Hefezellen mit Hilfe von Glasperlen werden die virusähnlichen Partiel durch Ultrazentrifugation (Saccharose-Kissen) sedimentiert. Durch anschließende Ultrazentrifugation im Cäsiumchloridgradienten werden die Partiel gereinigt. Die anschliebende Analyse der Partiel erfolgt durch Elektronenmikroskopie.

Durch die Erfindung wird ein neuartiges Expressionssystem fur virusähnliche Partiel von Polyomaviren verfügbar, das gegenüber den bisher verfugbaren Systemen in E. coli bzw.

Insektenzellen wesentliche Vorteile beinhaltet. So erlauben Hefe-Expressionssysteme die biotechnologische Produktion von Antigenen. Desweiteren besitzen Hefen keine Toxine, die unerwünschte Nebenwirkungen bei human-oder veterinärmedizinischen Anwendungen hervorrufen würden. Ein weiterer Orteil ist, daB Hefesysteme bereits fur die humane Vakzineproduktion zugelassen sind : Die rekombinante HBV-Vakzine basiert auf Hefe-exprimiertem HBsAg.

Es ist besonders überraschend, daß die Hefezellen das Polyomavirus-VP1 in gober Menge synthetisieren. Außerdem können die VP1-Partikel nach der Lyse der Hefezellen in gober Menge mit einfachen Methoden isoliert und gereinigt werden. Sie sind u. a. verwendbar zum Nachweis von Infektionen mit humanen Polyomaviren, als Vehikel fUr den Gentransfer, fur eine Vakzineentwicklung gegen humane Polyomaviren oder gegen andere Viren (z. B. durch Präsentation von Fremdepitopen auf HaPV-VP1- Kapsiden).

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden : Ausfuhrungsbeispiel 1. Gewinnung der HaPV-VP1 kodierenden Sequenz HaPV-Virionen werden aus Epitheliomen HaPV-infizierter Z3 Hamster isoliert und durch Saccharose/Casiumchlorid- Gradientenzentrifugation gereinigt. Die Virionen werden durch Zugabe von Probenpuffer denaturiert, im SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran transferiert. Die VP1-Proteinbande wird ausgeschnitten und mit Hilfe der Edman-Degradation am N-Terminus sequenziert.

Entsprechend der N-terminalen Proteinsequenz, des Molekulargewichts und des vorhergesagten offenen Leserahmens wird die VP1-kodierende Sequenz mittels PCR amplifiziert. Als Template wird virale DNA verwendet, die durch Phenol- Chloroform-Extraktion und anschließende Äthanol-Präzipitation aus HaPV-Virionen gewonnen wird. FUr die PCR werden 2 Oligonukleotidprimer verwendet, die das Initiationskodon (ATG) bzw. Terminationskodon (TAA ; komplementäre Sequenz) und Spaltorte fur die Restriktionsendonuklease XbaI am 5'-und 3'- Ende enthalten : VP1-Xba-N2 : 5'-A CGT CTA GAT ATG GCC CCA AAA AGA AAA AGC GGC-3' VP1-Xba-C : 5'-TCT AGA TTA GTT TGC TGG TTT TGC AGG GGG-3' Das erhaltene PCR-Amplifikat wird mit XbaI gespalten und in <BR> <BR> <BR> einen E. coli-Vektor (pFR36) inseriert. Rekombinante Plasmide werden durch Restriktionsendonuklease-Verdau und DNA-Sequenz- Analyse charakterisiert.

2. Herstellung von Hefe-Expressionsvektoren Das Hefeexpressionsplasmid, vorzugsweise pFX7 (Abb. 1), enthalt -einen Hefe-spezifischen Promoter (GAL10-PYK1-Hybrid-Promoter, der aus einem-138 bis-511 Nukleotid-Fragment von GAL10 mit GAL1-10 UAS-Sequenzen und der-4 bis-271-Sequenz von PYK1 besteht), -eine Transkriptionsterminationssequenz (von PGK1), -ein 2 pm DNA-Fragment und -einen dominante Selektionsmarker (FDH1-Gen von Candida mal tosa) -und einen unikalen Restriktionsort, zwischen Promoter und Terminator, fUr die Insertion von Fremdsequenzen (XbaI).

Das VP1-kodierende Segment (mit eigenem Translationsinitiations-und-terminationssignal) wird mit XbaI aus pFR36-VP1 herausgeschnitten und in den mit XbaI linearisierten Hefeexpressionsvektor pFX7 ligiert. Rekombinante Plasmide werden nach Transformation in E. coli K12 (XL-1 Blue) selektioniert und durch Restriktionskartierung charakterisiert.

3. Expression des Hauptkapsidproteins vom Polyomavirus in Hefe Das HaPV-VP1-Expressionsplasmid wird in Hefezellen, vorzugsweise in Saccharomyces cerevisiae, Stamm AH22 (leu2 his4) transformiert. Die Anzucht der transformierten Hefezellen erfolgt in YEPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose) mit 5 mM Formaldehyd. Nach 18stUndiger Anzucht bei 30 OC werden die Zellen geerntet, in YEPG-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 3% Galaktose) mit Formaldehyd re-inokuliert und weitere 24 Stunden kultiviert. FUr die Expressionskontrolle wird ein Aliquot entnommen und mit Proben-Puffer denaturiert. Nach Auftrennung im SDS-Polyacrylamidgel wird das rekombinante HaPV- VP1 im Western blot unter Verwendung eines VP1-spezifischen Kaninchenserums nachgewiesen (Abb. 2).

4. Reinigung von virus-ähnlichen Partikeln Die, wie unter 3. beschrieben, angezuchteten Hefezellen werden nach Sedimentation in 1 ml Lysepuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2 ; 100 mM NaCl ; 2 mM PMSF) resuspendiert und nach Zugabe von 1 g Glasperlen (0,5 mm) durch Vortexing fUr 4 Minuten bei 4 °C aufgeschlossen. Die entstandenen Lysate werden mit dem doppelten Volumen Lysepuffer verdunnt und 10 Minuten bei 5000 g zentrifugiert. 8,5 ml einer 45% igen Saccharoselösung (w/v ; in Lysepuffer) werden mit 1,5 ml des Überstandes überschichtet.

Die Partiel werden durch 4stundige Zentrifugation bei 100 000 g im Beckman Ti70.1-Rotor sedimentiert. Das Sediment wird in Lysepuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2 ; 100 mM NaCl und 2 mM PMSF) resuspendiert. Mit dieser Suspension wird ein vorher geschichteter Cäsiunchloridgradient (1,38,1,35,1,32, 1,29,1,26 und 1,23 g/ml in 50 mM Tris-HC1, pH 7,5) beladen und 15 Stunden bei 100 000 g im Beckman Tri70.1-Rotor zentrifugiert.

Fraktionen werden gesammelt und mittels SDS-Polyacylamid- Gelelektrophorese und Western blot analysiert. Die Bildung von HaPV-VP1-Partikeln wird durch negative staining mit 1% Uranylacetat und elektronenmikroskopische Analyse bewiesen (Abb. 3). Partikel-enthaltende Fraktionen werden gegen Lysepufferdialysiert.

Abb. 1 Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsplasmids pFX7-VP1, das die Hamsterpolyomavirus (HaPV)-VP1-kodierende Sequenz enthält.

Abb. 2 Nachweis der Expression von HaPV-VPl in Hefezellen.

Totallysate von Hefezellen wurden im 15% igen SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt, mit Coomassieblau-gefarbt (a) bzw. auf Nitrocellulose transferiert und mit Kaninchen anti- HaPV-VP1 Serum (b) bzw. einem Serum eines HaPV-infizierten Hamsters (c).

Bahnen B und C : HaPV-VP1-exprimierende Hefezellen Bahn A : Hefezellen ohne VP1-Expressionsplasmid Bahn M : Molekulargewichtsmarkerproteine Die VP1-Proteinbande ist durch Pfeile markiert.

Abb. 3 Nachweis von HaPV-VP1-abgeleiteten virusahnlichen Partikeln aus Hefezellen.

Elektronenmikroskopische Analyse nach Negativkontrastierung.

Vergrößerung : 100 000fac.