Más especificamente, la invención propone un nuevo método de tratamiento del quitosán que permite obtener filmes de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, lo que le confiere importantes aplicaciones en medicina, farmacia y biotecnología no conseguidas hasta la fecha.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El quitosán es un polímero de origen natural obtenido por desacetilación parcial de la quitina, homopolímero de la ß-1, 4-2-acetamida-D-glucosamina, siendo este último el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza después de la celulosa.

Ambos, quitina y quitosán, poseen aplicaciones importantes y reales en la industria alimentaria, farmacéutica y biotecnológica, baste para ello hacer una revisión de las patentes presentadas acerca de sus posibles usos en los últimos años y observar la orientación fundamentalmente aplicada que presentan los Simposios Internacionales sobre el tema (Domard y col., Advances in Chitin Sciences, Vol II, 7th ICCC (Euchis97), Jacques Sandre Publisher (1998); Peter y col., Advances in Chitin Sciences, Vol IV (Euchis 99), Universitát Potsdam (2000)).

El quitosán presenta varias propiedades que hacen que su uso este especialmente indicado en la industria

médica/farmacéutica. Por una parte, es un polímero biocompatible y biodegradable (Lim y col., J. Biomed.

Mater. Res. (Appl. Biomater.) 43,282-290 (1998); Muzzarelli y col., Biomaterials, 14 (1), 39-43 (1993)), con propiedades antifúngicas y antimicrobianas (Sano y col., J. Dental. Res., 66,141-149 (1987); Ramos, V.

Tesis Doctoral, Univ. Nacional del Sur, Bahía Blanca, Argentina, (1999)), que puede presentarse en una gran variedad de estados físicos, por ejemplo, matrices porosas, geles, hidrogeles, hilos, películas, etc., dependiendo del procesamiento al que se le someta.

Por otra parte, es un producto capaz de inmovilizar por adsorción una gran cantidad de sustancias y con la posibilidad, dada la presencia de un gran número de grupos reactivos, de inmovilizar covalentemente, por medio de reacciones relativamente sencillas, sustancias que aporten una actividad biológica deseada (sustancias bioactivas), así como la de su derivatización con diversos grupos funcionales (WO 92/09635; Muzzarelli y Zattini, J. Biol. Macromol. 8,137-143 (1986); y Muzzarelli y col. Carbohydr. Polymers 11, 307-320 (1989)).

Las referencias aportadas indican la enorme gama de posibilidades que su uso ofrece en el campo de la bioingeniería, habiéndose desarrollado ya algunas aplicaciones importantes del mismo como, por ejemplo, su uso en la fabricación de suturas médicas o como componente de vendaje para heridas (US 6.022.556), donde se aprovechan algunas de las propiedades ya mencionadas.

La degradación in vivo del quitosán produce oligómeros de D-glucosamina, cuya posterior degradación permite obtener productos que pueden entrar en la ruta biosintética del ácido hialurónico, lo que hace a este

producto una elección adecuada para la reparación guiada de lesiones óseas y óseo-cartilaginosas, estando descrito en la bibliografía su efecto positivo en el tratamiento de este tipo de lesiones.

Sin embargo, hasta el momento, no existe ningún producto comercializado basado en quitosán o derivados del mismo en el campo de las reparaciones tisulares guiadas, especialmente de lesiones óseas y óseo- cartilaginosas.

La razón debe buscarse en una falta de adecuación del quitosán para la adhesión y proliferación celular de una forma homogénea sobre una matriz tridimensional de ese compuesto, una de las características que deben poseer las matrices usadas en ingeniería de tejidos (Atala y Mooney, Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds, Birkáuser, Boston (1997)). De hecho, si se hace un estudio de las aplicaciones biomódicas del quitosán, su uso fundamental, fuera de los ya mencionados de material de sutura y componente de vendaje de heridas, radica en su empleo como material de relleno, tal vez actuando de aglutinante en forma de hidrogel, o como agente liberador de sustancias bioactivas encapsuladas.

Tan sólo se ha recuperado una patente en la base de datos de patentes norteamericanas de los últimos 20 años en el que se utiliza el quitosán como soporte para la regeneración guiada y, en ella, se obvia el inconveniente antes citado recubriendo la malla tridimensional de quitosán con una película de poliláctico-coglicólico (US 5.830.493), perdiéndose en este proceso la capacidad de fijación y adsorción de sustancias bioactivas de interés, ya mencionada.

Por otra parte, si a esta capacidad de activación mediante la adsorción o unión de compuestos de interés

biológico se le unen sus características filmogénicas, se tendra, en principio, un material idóneo para el recubrimiento de prótesis, implantes o incluso de mallas tridimensionales de otros polímeros susceptibles de usarse en ingeniería de tejidos, de forma que la acción biológica deseada inducida por este quitosán activado se produciria precisamente en la región elegida del organismo.

De nuevo una búsqueda bibliográfica conduce a un vacío en cuanto a la explotación de esta capacidad filmogénica en este campo; tan sólo destacar su uso como material de recubrimiento de sistemas de diálisis (US 5.885.609), tratando a este material de forma que se reduzca en lo posible la adhesión celular.

Dos son los principales inconvenientes para el uso del quitosán en el sentido señalado. Por una parte, el procedimiento de estabilización usado normalmente para los filmes de quitosán puede afectar negativamente a la estructura del soporte a recubrir. En este sentido hay que tener en cuenta que el quitosán se solubiliza normalmente en medio ácido, y los filmes de quitosán obtenidos a partir de dichas soluciones conservan este carácter ácido, encontrándose el quitosán como ion quitosonio. Una película así formada, en contacto con el agua o disoluciones fisiológicas tamponadas (por ejemplo, tampón fosfato salino (PBS)) confiere un carácter ácido a dicha solución y el filme pierde su integridad rápidamente, deshaciéndose al poco tiempo. Debido a este fenómeno es necesario estabilizarlo, consistiendo el procedimiento normalmente usado en la inmersión del quitosán en una solución fuertemente básica, normalmente NaOH, durante al menos 1 hora. Este carácter básico es el que puede afectar a algunos de los soportes usados

comúnmente en ingeniería de tejidos, por ejemplo, ácido poliláctico o poliglicólico.

El segundo inconveniente, tal vez el mas importante desde el punto de vista de su aplicación práctica radica en la baja adherencia celular, si se compara la obtenida en un filme de quitosán formado según los protocolos existentes con respecto a la que se produce en los plásticos comerciales tratados con este fin. Esto está agravado, además, por no ser homogene la adherencia celular. Las células proliferan sólo en determinadas zonas del filme y cambian de forma drástica su morfología, lo que a su vez implica una alteración importante en el metabolismo y características específicas de las mismas con respecto a lo que se considera normal para estas líneas celulares.

Es pues, sobre todo, la baja tasa y esta falta de uniformidad en la adherencia celular la que dificulta su uso como material de recubrimiento, bien para prótesis usadas corrientemente en la práctica médico-quirúrgica y odontológica, o bien para mallas de biomateriales ya usados en ingeniería de tejidos, como pueden ser a título de ejemplo, el ácido poli-L-láctico o polianhídridos.

COMPENDIO DE LA INVENTION La invención se enfrenta con el problema de proporcionar filmes de quitosán capaces de permitir una buena adhesión y proliferación celular, y que, además, sean susceptibles de ser activados mediante la incorporación de sustancias con actividad biológica, lo que les proporcionaría una importante aplicación en el sector médico-farmacéutico.

La solución proporcionada por la presente invención se basa en que los inventores han observado que la

realizåción de una etapa de secado sobre un filme a base de quitosán previamente estabilizado y lavado incrementa considerablemente la capacidad de adherencia celular de un filme a base de quitosán sometido a dicho tratamiento de secado. Mediante dicho tratamiento es posible obtener filmes a base de quitosán que presentan unas características de adherencia y proliferación celular similares o superiores a las obtenidas en plásticos comerciales (por ejemplo, placas de pocillos) tratados con este fin, así como unas propiedades que les hacen susceptibles de inmovilizar, bien por adsorción o bien covalentemente, sustancias con actividad biológica, entre ellas las proteins morfogenéticas óseas (BMP), manteniéndose su actividad biológica.

Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un método para la producción de un filme a base de quitosán, con capacidad de adherencia celular aumentada.

Dicho filme constituye un objeto adicional de esta invención.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para la producción de un filme a base de quitosán, con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado con una sustancia con actividad biológica. El filme resultante constituye otro objeto adicional de esta invención.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un producto recubierto total o parcialmente con dichos filmes a base de quitosán, tal como, por ejemplo, un implante de uso odontológico o traumatológico.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituyen las aplicaciones de dichos filmes a base de quitosán, tales como el empleo de dicho filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada

como vehículo para el transporte y liberación de sustancias con actividad biológica, o su empleo en la elaboración de un filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado.

Dicho filme a base de quitosán biológicamente activado puede ser utilizado, a su vez, en múltiples aplicaciones, tales como en la inducción de una actividad biológica en un organismo receptor, en la potenciación de la osteointegración de implantes de uso odontológico o traumatológico y/o en la regeneración de tejidos, por ejemplo, tejido óseo, entre otras aplicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una fotografía, obtenida por microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12 sembradas sobre pocillos que contienen filmes de quitosán estabilizados con NaOH no sometidos al tratamiento de activación de la capacidad de adherencia celular de la invención (Ejemplo 1), donde puede observarse la apariencia redondeada de las células, indicativo de que se encuentran en suspensión.

La Figura 2 es una fotografía, obtenida por microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12 sembradas sobre pocillos que contienen filmes de quitosán estabilizados con NaOH no sometidos al tratamiento de activación de la capacidad de adherencia celular de la invención (Ejemplo 1), en una etapa posterior a la mostrada en la Figura 1, esto es, después de cambiar el medio de cultivo con el consiguiente arrastre de las células no adheridas al filme, donde puede observarse el agrupamiento de las células en forma de racimos, lo que indica un patrón de crecimiento atípico.

La Figura 3 es una fotorafía, obtenida por microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12 sembradas sobre pocillos que contienen filmes de quitosán estabilizados con glutaraldehído y NaOH no sometidos al tratamiento de activación de la capacidad de adherencia celular (Ejemplo 1), donde puede observarse una morfología alterada de dichas células debido a su adhesión al filme, indicativa de un patrón de crecimiento anómalo, así como una modificación de su citoarquitectura.

La Figura 4 es una fotografía, obtenida por microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12 sembradas sobre pocillos que contienen filmes de quitosán estabilizados con NaOH sometidos al tratamiento de activación de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención (Ejemplo 2), donde puede observarse que toda la superficie del filme esta recubierta totalmente de células en forma de monocapa hasta llegar a confluencia.

La Figura 5 es una fotografía, obtenida por microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12 sembradas sobre pocillos que contienen filmes de quitosán estabilizados con NaOH sometidos al tratamiento de activación de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención (Ejemplo 2), en una etapa anterior a la mostrada en la Figura 4, donde pueden observarse trozos de filme sin recubrir todavía con las células.

La Figura 6 es una fotografía, obtenida por microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células ROS 17/2. 8 sembradas sobre pocillos que contienen filmes de quitosán estabilizados con NaOH sometidos al tratamiento de activación de la capacidad de adherencia

celular proporcionado por esta invención (Ejemplo 2), donde puede observarse que toda la superficie del filme está recubierta totalmente de células en forma de monocapa hasta llegar a confluencia.

La Figura 7 es una fotografía (100x) obtenida por microscopía electrónica de barrido (SEM) de un fragmento de un tornillo de titanio utilizado en ensayos de implantes en animales de experimentación, antes de ser recubierto con un filme de quitosán, donde pueden observarse las líneas de mecanización del tornillo.

La Figura 8 es una fotografía (100x) obtenida por microscopía electrónica de barrido (SEM) de un fragmento de un tornillo de titanio utilizado en ensayos de implantes en animales de experimentación, recubierto con un filme de quitosán estabilizado con NaOH y sometido a un tratamiento de activación de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención.

La Figura 9 es un diagrama de barras que ilustra el contenido en proteins totales del cultivo celular, determinado por el método de Bradford, respecto al tiempo de cultivo (días), en donde el valor de la absorbancia es indicativo del contenido en proteins del cultivo celular en cada caso, e, indirectamente, de la cantidad de células adheridas al filme ; se comparan los valores obtenidos utilizando una placa de pocillos convencional (plástico) usada como referencia frente a los valores obtenidos utilizando filmes de quitosán estabilizados con distintos tratamientos de estabilización no sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención. Tratamiento 1 : estabilización con tampón'fosfato ;'Tratamiento 2 : estabilización con NaOH ; Tratamiento 3 : estabilización

con glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : estabilización con glutaraldehído.

La Figura 10 es un diagrama de barras que ilustra el contenido en proteins totales del cultivo celular, determinado por el método de Bradford, respecto al tiempo de cultivo (días), en donde el valor de la absorbancia es indicativo del contenido en proteins del cultivo celular en cada caso, e, indirectamente, de la cantidad de células adheridas al filme; se comparan los valores obtenidos utilizando una placa de pocillos convencional (plástico) usada como referencia frente a los valores obtenidos utilizando filmes de quitosán estabilizados con distintos tratamientos de estabilización sometidos posteriormente al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención.

Tratamiento 1 : estabilización con tampón fosfato ; Tratamiento 2 : estabilización con NaOH ; Tratamiento 3 : estabilización con glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : estabilización con glutaraldehído.

La Figura 11 es un diagrama de barras que ilustra el porcentaje de rhBMP-2 adsorbido por filmes de quitosán estabilizados con NaOH y sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención frente a la cantidad de proteína añadida.

La Figura 12 es un diagrama de barras que ilustra el porcentaje de rhBMP-2 adsorbido por filmes de quitosán estabilizados con glutaraldehído y sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención frente a la cantidad de proteína añadida.

La Figura 13 es un diagrama de barras que ilustra la actividad fosfatasa alcalina/proteína total en pocillo a

diversos días ; los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la rhBMP-2, unida a filmes de quitosán estabilizados mediante diversos tratamientos y sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención, permanece activa; se comparan los valores obtenidos frente a los obtenidos utilizando una placa de pocillos convencional (plástico) usada como referencia. Tratamiento 1 : estabilización con tampón fosfato ; Tratamiento 2 : estabilización con NaOH ; Tratamiento 3 : estabilización con glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : estabilización con glutaraldehído.

La Figura 14 es un diagrama de barras que muestra los valores del torque o par de fuerzas necesario para desenroscar el implante previamente implantado en la meseta tibial de los conejos utilizados a distintos tiempos; se comparan los resultados obtenidos utilizando tornillos de titanio recubiertos con filmes de quitosán proporcionados por esta invención, estabilizados mediante diversos tratamientos (NaOH : Tratamiento 2; Glutaraldehído y NaOH : Tratamiento 3; y Glutaraldehído : Tratamiento 4), sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención y activados biológicamente con rhBMP-2 frente a los resultados obtenidos con controles (tornillos de titanio sin recubrir); se incluyen además, a modo comparativo, los valores obtenidos con los tornillos comerciales Osseotite@ y TiUnite@ (Nobel Pharma) [datos extrados de Gottlob et al., Applied Osteointegration Research, 2000,1 : 25-27].

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en general, a la producción, de filmes a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, y susceptibles de ser activados biológicamente, así como a los filmes resultantes y a sus aplicaciones.

En general, el método de producción de filmes a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada proporcionado por esta invención comprende, en general, las etapas generales de formación del filme a base de quitosán, su estabilización y el tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular del filme estabilizado. Por otra parte, la activación biológica del filme a base de quitosán puede realizarse una vez que se ha formado el filme o, alternativamente, incorporando la sustancia con actividad biológica en alguna de las etapas del proceso productivo del filme, por ejemplo, durante la disolución del quitosán o durante la estabilización del filme, dependiendo de la estabilidad y naturaleza de las sustancias con actividad biológica a utilizar, así como del procesamiento que sufra el filme en las otras etapas.

De forma más concreta, la invención proporciona un método para la producción de un filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, en adelante método de la invención, que comprende : a) disolver quitosán, opcionalmente junto con un polímero biodegradable, en un medio de solubilización que comprende una solución acuosa de un ácido; b) depositar la solución resultante de la etapa a) sobre una superficie;

c) secar dicha solución depositada sobre dicha superficie, para obtener un filme a base de quitosán ; d) poner en contacto dicho filme a base de quitosán con un agente de estabilización seleccionado entre (i) una solución acuosa de una base, (ii) un tampón de pH igual o superior a 5, (iii) un agente de entrecruzamiento, y (iv) sus mezclas ; e) lavar el filme a base de quitosán, estabilizado, obtenido en la etapa d) ; y f) secar el filme a base de quitosán, estabilizado y lavado.

El filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, obtenible mediante el método de la invención, está constituido total o principalmente por quitosán. El quitosán es un polímero natural obtenido por desacetilación parcial de la quitina. La quitina puede obtenerse a partir de muy diversas fuentes, por ejemplo, crustáceos, hongos, etc.

El origen de la quitina empleada para la obtención del quitosán a utilizar en la presente invención es indiferente. Asimismo, es posible realizar modificaciones en el quitosán con el fin de introducirle diferentes grupos funcionales, los cuales, por ejemplo, pueden favorecer la degradación biológica in vivo del quitosán, estimular la regeneración ósea, etc. A modo ilustrativo, dichos grupos funcionales incluyen grupos fosfónicos, grupos carboximetilo, grupos metilpirrolidona, etc. En general, puede efectuarse cualquier modificación sobre el

quitosán siempre y cuando el producto final mantenga su capacidad filmogénica. En una realización particular, el quitosán utilizado en la presente invención comprende quitosán derivatizado con uno o más grupos funcionales seleccionados entre grupos fosfónicos, grupos carboximetilo, grupos metilpirrolidona y sus mezclas.

El quitosán, al ser un polímero obtenido por desacetilación parcial de la quitina, ofrece un intervalo de pesos moleculares y grados de desacetilación muy amplio, dependiendo estos parámetros de las condiciones concretas utilizadas en la hidrólisis básica realizada en el material de partida (quitina), así como del origen de este. Así, se pueden obtener, por ejemplo, quitosanos cuyo peso molecular promedio está comprendido entre 150.000 y 2.000.000 e incluso mayores, con grados de desacetilación comprendidos entre el 65% y el 95% o incluso mayores. Cualquiera de dichos quitosanos puede ser utilizado en la puesta en práctica de la presente invención aunque se prefieren aquellos quitosanos de pesos moleculares promedio medios y bajos, por ejemplo, entre 200.000 y 500.000, y de grado de desacetilación medios y elevados, por ejemplo, entre 65% y 95%.

El polímero biodegradable, en caso de utilizarse, puede ser cualquier polímero, natural o sintético, siempre y cuando sea soluble en agua o en un medio acuoso ácido, y biodegradable. Ejemplos ilustrativos de polímeros biodegradables que pueden utilizarse en la presente invención incluyen ácido poliglicólico, alginato, carragenato, colágeno, etc., y sus mezclas.

El medio de solubilización del quitosán, opcionalmente junto con el polímero biodegradable, es un medio que comprende una solución acuosa de un ácido, orgánico o inorgánico, de un pH igual o inferior a 3,5.

En general, puede utilizarse cualquier ácido en el que el quitosán, y, en su caso el polímero biodegradable, sean solubles. A modo ilustrativo, dicho ácido puede ser ácido clorhídrico, ácido acético, ácido citric, ácido láctico, ácido málico, etc. En una realización particular, el medio de solubilización es una solución acuosa de ácido acético.

La concentración del quitosán en la solución resultante puede variar dentro de un amplio intervalo, habiéndose alcanzado concentraciones de hasta el 5% en quitosán (es decir, superiores a las utilizadas habitualmente en la formación de películas de quitosán).

La solución de quitosán junto con, opcionalmente, el polímero biodegradable, en adelante, solución a base de quitosán, debe presentar una viscosidad adecuada a la aplicación a la que va destinada. Esta viscosidad puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de si dicha solución a base de quitosán va a ser aplicada sobre una superficie plana o sobre una superficie compleja, o si va a ser utilizada como medio para el recubrimiento por inmersión de un artículo, por ejemplo, un tornillo del tipo utilizado en los implantes dentales.

La viscosidad de la solución a base de quitosán viene determinada por varios factores intrínsecos a la misma.

Por una parte, por la concentración del quitosán, por otra, por el peso molecular promedio del quitosán empleado en la preparación de dicha solución, y, finalmente, por el medio de solubilización utilizado.

En general, la viscosidad no es determinante en la realización práctica de la presente invención, salvo en el caso de formación de películas sobre superficies complejas, donde este parámetro ha de ser suficientemente elevado como para permitir la formación de una película

homogénea sobre la misma durante el proceso de evaporación de la disolución.

En varias realizaciones prácticas de la presente invención se han utilizado, rutinariamente, disoluciones de quitosán al 1% en ácido acético 50 mM que poseían viscosidades intrínsecas que variaban desde 17 g. dL-1 hasta 4 g. dL-1, dependiendo del peso molecular del quitosán empleado.

Una vez preparada la solución a base de quitosán, con la viscosidad adecuada, dicha solución se deposita o extiende uniformemente, mediante métodos convencionales, por ejemplo, por pulverización, inmersión, aplicación con pincel, etc., sobre una superficie, tal como una superficie plana o compleja, o sobre la superficie del objeto a recubrir con el filme a base de quitosán proporcionado por esta invención.

Una vez depositada la solución a base de quitosán sobre dicha superficie, se procede a su secado con el fin de retirar el disolvente, por ejemplo, por simple evaporación, y obtener el filme a base de quitosán sobre dicha superficie.

El secado se puede realizar por cualquier método convencional. En general, se puede realizar a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y una temperatura en la que no se produzca la descomposición térmica del quitosán, por ejemplo, a una temperatura comprendida entre 15°C y 80°C, opcionalmente en presencia de una corriente de aire, durante un periodo de tiempo adecuado hasta pesada constante. En general, aumentando la temperatura se reduce la duración de esta etapa. Cuando los filmes base de quitosán van destinados a aplicaciones relacionadas con el crecimiento y proliferación celular, es conveniente trabajar en un

cuarto estéril o en una campana de flujo laminar con corriente de aire con el fin de obtener un filme no contaminado. En una realización particular, el secado del filme a base de quitosán se realiza a una temperatura comprendida entre 20°C y 40°C, bajo una corriente de aire. En las condiciones indicadas la etapa de secado puede durar entre 12 y 24 horas.

El filme a base de quitosán previamente obtenido no es susceptible de uso inmediato debido a su carácter fuertemente ácido. Como se ha indicado previamente, dicho filme en contacto con agua o con soluciones fisiológicas tamponadas, tal como PBS, se deshace rápidamente. Debido a ello es necesario proceder a estabilizar el filme antes de su uso.

Para estabilizar el filme a base de quitosán previamente formado, se pone en contacto dicho filme con un agente de estabilización, que puede ser (a) un agente de neutralización, tal como una solución acuosa de una base o un tampón de pH igual o superior a 5; (b) un agente de entrecruzamiento; o (c) mezclas de ambos.

El procedimiento normalmente usado para estabilizar filmes de quitosán consiste en la inmersión del filme (o del objeto o superficie recubierta por el mismo), en una disolución fuertemente básica, generalmente, NaOH 1 M, durante un periodo de tiempo mínimo de 1 hora, llegándose algunas veces hasta las 24 horas. Sin embargo, dicho procedimiento puede afectar negativamente, como ya se ha mencionado, a la estabilidad del soporte recubierto por el filme. El efecto de este tratamiento produce, además, y ese es su fin precisamente, una neutralización total de las cargas presentes en los iones quitosonio, con lo que se origina también una fuerte disminución de la

interacción entre la película y el soporte recubierto por ella.

Aunque es posible utilizar el protocolo de estabilización previamente mencionado, en la presente invención se prefiere el uso de condiciones menos drásticas en el tratamiento básico, disminuyendo tanto la concentración de base (NaOH) utilizada como el tiempo de exposición al mismo. En una realización particular, se emplea un tiempo de inmersión comprendido entre 30 y 40 minutos en una solución acuosa de NaOH 0,5 M.

Alternativamente, es posible utilizar otros medios más suaves, tales como los proporcionados por soluciones tampón con un pH igual o superior a 5, por ejemplo, soluciones tampón carbonato o tampón fosfato, para neutralizar la carga del filme de quitosán.

Otra forma de estabilizar el filme a base de quitosán formado comprende el entrecruzamiento, mediante el empleo de agentes de entrecruzamiento, tales como reactivos bifuncionales, entre las cadenas de quitosán presentes en el filme. En una realización particular, el agente de entrecruzamiento utilizado es el glutaraldehído ya que este es el reactivo bifuncional comúnmente empleado. El glutaraldehído puede utilizarse con un medio fuertemente alcalino, tal como el proporcionado por NaOH, o bien con un medio más suave, tal como el proporcionado por el tampón carbonato o el tampón fosfato. En estos casos, la estabilización del filme se consigue simultaneando la neutralización de sus cargas con el entrecruzamiento de las cadenas de quitosán.

De acuerdo con lo anterior, para la estabilización de los filmes a base de quitosán previamente obtenidos se puede utilizar, en una realización particular, un tampón fosfato de molaridad comprendida entre 0,1 y 1 M,

preferentemente 0,25 M, a un valor de pH próximo a la neutralidad. Como agente de entrecruzamiento se puede utilizar glutaraldehído, en concentraciones de hasta el 0, 1%, preferiblemente menores del 0,05% y más preferiblemente del 0,025% o menores. También se han utilizado combinaciones de ambos efectos estabilizadores, por ejemplo, el tratamiento simultáneo con NaOH y glutaraldehído en concentraciones de 0,5 M y 0,025%, respectivamente. En otra realización particular, se ha utilizado un agente de estabilización que comprende un tampón, tal como tampón fosfato o tampón carbonato, y glutaraldehído.

El tiempo de exposición a los diversos agentes es variable, prefiriéndose exposiciones comprendidas entre 30 y 45 minutos, aunque son posibles tiempos mayores.

Una vez estabilizado el filme a base de quitosán, se retira el agente de estabilización utilizado con tal fin y se lava una o varias veces para eliminar los restos del agente de estabilización utilizado, con un volumen suficiente de PBS o de cualquier otro medio compatible con el uso biológico propuesto para dichos filmes.

La película así estabilizada no es capaz aún de mostrar una adherencia celular uniforme y homogénea sobre toda su superficie. Como se pone de manifiesto en el Ejemplo 1, si tras los lavados se procede a la siembra de líneas celulares adherentes establecidas, los ensayos de cantidad de DNA presente indican que sólo aproximadamente un tercio de las células sembradas se adhieren al filme formado según el método previamente descrito (Figura 1).

Esta adherencia no es homogénea sino que se produce en determinadas zonas del filme, existiendo gran parte de su superficie sin células adheridas (Figura 2). Es más, la proliferación celular que se produce en dichas células

adherentes no tiende a producir su expansión sobre toda la superficie del filme, sino que se localiza en torno al punto inicial de adherencia (Figura 2), alterándose la citoarquitectura celular y cambiando la morfología típica de fibroblastos de estas líneas celulares (Figura 3).

Este hecho imposibilita el uso práctico de dichos filmes a base de quitosán para una regeneración tisular guiada.

La adherencia celular previamente mencionada es muy variable, dependiendo del origen del quitosán, del método utilizado en su obtención, del peso molecular promedio del quitosán usado, del tiempo y condiciones de almacenamiento del filme de quitosán, previo a su estabilización, etc. No existe una correlación clara entre las diversas variables mencionadas y la adherencia celular homogénea sobre el filme, obteniéndose, como se dijo al principio, resultados muy variables.

El hecho de que un tiempo prolongado de almacenamiento (a veces de meses) del filme a base de quitosán parezca afectar favorablemente a la adhesión celular, con respecto al mismo filme formado y empleado inmediatamente (con lo que se elimina la influencia del peso molecular del quitosán usado y siendo además los pesos de las láminas iguales), parece indicar que se produce un ligero cambio estructural que afecta de forma sutil a la adherencia.

No obstante, la aleatoriedad de este fenómeno indica la necesidad de desarrollar un procedimiento que homogeneice el comportamiento del filme de quitosán con respecto a la capacidad de unión y proliferación celular, de forma que se produzca la"activación"del quitosan en este sentido. Con esta finalidad se lleva a cabo la siguiente etapa del método de la invención, consistente

en un tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular del filme estabilizado.

Durante el desarrollo de la presente invención se ha descubierto, sorprendentemente, que la realización de, al menos, un segundo secado del filme a base de quitosán, ya estabilizado, y lavado en las mismas condiciones que las empleadas en la formación inicial del mismo, homogeneiza el comportamiento del filme de quitosán con respecto a la adherencia celular, obteniéndose densidades celulares tras la siembra similares a las que presentan las mismas células en frascos de cultivo comerciales, con niveles de actividad enzimática (indicadores de la viabilidad del cultivo) y cantidad de DNA equivalentes a los obtenidos en estos últimos. La proliferación celular es homogénea, manteniéndose microscópicamente la morfología celular típica de las líneas sembradas.

En general, el secado se puede realizar por cualquier método convencional, a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y una temperatura en la que no se produzca la descomposición térmica del quitosán, por ejemplo, a una temperatura comprendida entre 15°C y 80°C, opcionalmente en presencia de aire, durante un periodo de tiempo adecuado. El secado se realiza hasta pesada constante. En una realización particular, el secado del filme a base de quitosán se realiza a una temperatura comprendida entre 20°C y 40°C, bajo una corriente de aire. En las condiciones indicadas se suele conseguir la pesada constante en unas 12-24 horas.

El filme a base de quitosán, obtenible mediante el método de la invención, posee una capacidad de adherencia celular aumentada. La capacidad de un filme de adherencia celular puede ser determinada por diversos ensayos. A modo ilustrativo, dicha capacidad de adherencia celular

puede ser determinada utilizando cualquier línea celular adherente, por ejemplo, células C2C12, mediante el ensayo denominado"Ensayo del Etidio Homodimero" [véase el Ejemplo 1 donde se describe el protocolo de dicho ensayo] que, brevemente, comprende, cultivar células C2C12 en pocillos recubiertos con filme a base de quitosán o no recubiertos (plástico), lisar las células, añadir etidio homodímero, incubar y leer la Intensidad de Fluorescencia emitida a 645 nm tras excitación a 530 nm. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión"filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada"se refiere a que dicho filme a base de quitosán tiene una capacidad de adherencia celular superior a la que tiene el mismo filme en condiciones normales, esto es, sin haber sido sometido a ningún tratamiento específico para activar su capacidad de adherencia celular. A modo ilustrativo, el tratamiento activador de la capacidad de la adherencia celular de esta invención, proporciona a un filme a base de quitosán activado con dicho tratamiento una capacidad de adherencia celular, determinada por el Ensayo del Etidio Homodimero, igual o superior a un incremento de, al menos, un 25%, preferentemente de, al menos, un 50% sobre el valor de la capacidad de adherencia celular determinado por dicho Ensayo del Etidio Homodimero sobre un filme de quitosán no sometido a dicho tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular.

El filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, obtenible mediante el método de la invención constituye un objeto adicional de esta invención.

El filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular puede ser utilizado para adherir y

crecer células. Para ello, puede resultar interesante, inmovilizar sobre dicho filme sustancias con capacidad para estimular la proliferación celular.

Adicionalmente, el filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada puede ser utilizado como vehículo de sustancias con actividad biológica de forma que pueda fijar o inmovilizar sustancias con actividad biológica y, opcionalmente, liberarlas en los lugares de interés.

Por tanto, la invención proporciona un filme de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, activado biológicamente, que comprende dicho filme de quitosán obtenible según el método de la invención y, al menos, una sustancia con actividad biológica Como sustancia con actividad biológica puede utilizarse cualquier sustancia de origen natural, sintético o recombinante, capaz de ejercer alguna actividad biológica en un organismo receptor, tal como el cuerpo humano o animal. A modo ilustrativo, dicha sustancia con actividad biológica puede ser un antibiótico, una hormona, una protein, etc. En una realización particular, dicha sustancia con actividad biológica es una proteína perteneciente a la familia de las proteins morfogenéticas óseas (BMP), tal como una BMP humana, natural o recombinante, o un dímero o heterodímero de la misma, por ejemplo, una BMP humana recombinante (rhBMP). En una realización particular, dicha rhBMP se selecciona entre rhBMP-2, rhBMP-4, rhBMP- 7, sus dímeros o heterodímeros, y sus mezclas.

El filme de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, activado biológicamente, puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende poner en contacto un filme de quitosán con capacidad de

adherencia celular aumentada, obtenible según el método de la invención, con dicha sustancia con actividad biológica.

Alternativamente, el filme de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, activado biológicamente, puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende poner en contacto dicha sustancia con actividad biológica bien con una solución de quitosán, opcionalmente junto con un polímero biodegradable, en un medio de solubilización que comprende una solución acuosa de un ácido, en la etapa a) del método de la invención, o bien, alternativamente, con el filme a base de quitosán en contacto con el agente de estabilización, en la etapa d) del método de la invención.

El tratamiento de activación biológica del filme a base de quitosán, estabilizado, lavado y secado, tiene por finalidad activar biológicamente dicho filme para inducir la actividad biológica deseada en el organismo receptor. Dicha inducción se consigue mediante la fijación al filme a base de quitosán de dicha sustancia con actividad biológica. La fijación o inmovilización de dicha sustancia con actividad biológica al filme a base de quitosán puede conseguirse bien mediante adsorción directa de dicha sustancia sobre el filme, o bien mediante inmovilización covalente de la misma sobre el filme, por ejemplo, mediante interacciones entre grupos reactivos presentes en proteins con el glutaraldehído.

En el Ejemplo 3, se describe la inducción de actividad fosfatasa alcalina sobre la línea celular C2C12, producida por rhBMP-2 adsorbida o inmovilizada covalentemente sobre filmes de quitosán, comparándose favorablemente con la obtenida en dicha línea celular sembrada sobre plástico comercial y tratada con las

mismas dosis de rhBMP-2 en disolución, dosis presentes en el medio de cultivo durante todo el tiempo del ensayo.

Como puede observarse en dicho Ejemplo 3 (véase la Tabla V), parece existir un efecto sinérgico entre el quitosán y la rh-BMP2 en cuanto a su actividad biológica.

La invención también proporciona un artículo o un producto recubierto con un filme a base de quitosán, que comprende un soporte y un recubrimiento total o parcial de dicho soporte con un filme de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, opcionalmente activado biológicamente. En una realización particular, dicho artículo o producto recubierto es una prótesis o un implante médico-quirúrgicos, por ejemplo, un implante de uso odontológico o traumatológico y dicho filme a base de quitosán es un filme de quitosán biológicamente activado que comprende, al menos, una BMP. En otra realización particular, dicho soporte se selecciona entre mallas y matrices de polímeros biocompatibles y/o biodegradables utilizados en ingeniería de tejidos.

En otro aspecto, la invención se refiere al empleo de un filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado, proporcionado por esta invención, en la inducción de una actividad biológica en un organismo receptor, en la potenciación de la osteointegración de implantes de uso odontológico o traumatológico en la totalidad o parte de la zona del organismo receptor que se desea potenciar y/o en la regeneración de tejido óseo.

Más concretamente, la invención también se refiere al empleo de un filme a base de quitosán, con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado, proporcionado por esta invención, en la elaboración de un implante de uso odontológico o traumatológico.

La invención también proporciona un método para inducir una actividad biológica en un organismo receptor, que comprende implantar en dicho organismo receptor en necesidad de dicha actividad biológica un soporte recubierto con un filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado, proporcionado por esta invención.

La invención también proporciona un método para potenciar la osteointegración de implantes de uso odontológico o traumatológico en un organismo receptor que comprende implantar en dicho organismo receptor en necesidad de potenciar la osteointegración de dicho implante, un implante recubierto con un filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado, proporcionado por esta invención, en el que dicha sustancia con actividad biológica es una BMP.

La invención también proporciona un método para la regeneración de tejido óseo en un organismo receptor que comprende implantar en un organismo receptor con necesidad de regeneración de tejido óseo, una matriz de generación ósea recubierta con un filme a base de quitosán con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activado, proporcionado por esta invención, en el que dicha sustancia con actividad biológica es una BMP.

Como resultado de esta invención, tal como se ha expuesto detalladamente en lo que antecede, es posible obtener por primera vez en el sector técnico que nos ocupa, filmes a base de quitosán capaces de permitir una buena adhesión y proliferación celular y, además, susceptibles de ser activados por incorporación de sustancias con actividad biológica. Dichos filmes a base

de quitosán constituyen un material biocompatible y biodegradable, que se adapta perfectamente a la forma del objeto o implante a recubrir y sobre el cual es posible la adherencia de las células provenientes del organismo huésped.

En el caso de matrices tridimensionales porosas, frecuentemente utilizadas en la ingeniería de tejidos, permite formar un material compuesto que aprovecha las propiedades mecánicas del soporte y que permite mantener una adecuada porosidad para la penetración y crecimiento del tejido circundante, pues al estar el quitosán en forma de película no obtura los poros formados en el seno de la matriz. Al mismo tiempo su capacidad de adherencia celular junto con la activación biológica producida en todo el material, tanto en la superficie externa como interna, permite que el efecto biológico deseado se produzca simultáneamente en todo el seno de la matriz y no mediante una penetración hacia el interior. El agente activante usado se encuentra disponible, pues, desde un primer momento para producir su efecto en todo el seno del soporte.

Estas peculiares características de los nuevos filmes a base de quitosán proporcionados por esta invención los hacen particularmente adecuados para mejorar la osteointegración de implantes y prótesis usadas comúnmente en la práctica médico-quirúrgica, mediante el recubrimiento de dichos materiales por un filme a base de quitosán y su activación mediante la incorporación de factores inductores de crecimiento óseo, tales como las BMPs, de origen natural o recombinante, en forma dimérica o heterodimérica.

Asimismo, los filmes a base de quitosán de la presente invención tienen también especial utilidad en la

reparación de lesiones óseas y óseo/cartilaginosas basada en el recubrimiento de mallas o piezas de polímeros biocompatibles y/o biodegradables usados comúnmente en ingeniería de tejidos, mediante el recubrimiento total o parcial de los mismos con un filme a base de quitosán proporcionado por esta invención, activado mediante la incorporación de BMPs y/u otras sustancias con actividad biológica.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Crecimiento de líneas celulares sobre filmes de quitosán no activados para la adherencia celular Este ejemplo se ha diseñado para poner de manifiesto los niveles de adherencia celular conseguidos con los filmes de quitosán preparados de acuerdo con el método de la invención.

Se prepara una disolución de quitosán al 1% en ácido acético 50 mM. La disolución se esteriliza mediante filtración por 0,22 jjm después de sufrir una prefiltración a través de 0,45 µm.

Se depositan 200 l de esta disolución en los pocillos de una placa de 48 pocillos, dejando libres algunos de ellos que servirán como control de plástco comercial.

Se seca la placa bajo corriente de aire en una cámara de flujo laminar durante la noche a una temperatura de 30°C. Una vez seca, se tratan los pocillos por triplicado con 400 µl de alguno de los siguientes agentes de estabilización durante un periodo de tiempo de 30 a 45

minutos : (i) NaOH 0,5 M; fosfato 0,25 M; (ii) glutaraldehído al 0,025%; y (iii) una disolución de NaOH 0,5 M y glutaraldehído al 0,025%.

Pasado el tiempo de tratamiento se retira el medio y se lava 4 veces con 400 l de PBS, dejando en contacto este 10 minutos con la película entre lavado y lavado.

Se retira por último el PBS y se añaden 200 Zl del medio de cultivo celular (DMEM alto en glucosa, con penicilina/estreptomicina), y se siembran sobre los pocillos células C2C12 o células ROS, a una densidad de 10.000 cel/cm2. Se completa finalmente el medio con otros 200 Al de medio de cultivo y se incuban a 37°C en estufa de CO2. Al dia siguiente se retira el medio y se realizan los ensayos pertinentes sobre los. diferentes pocillos.

Los resultados obtenidos, una vez restados los valores del blanco correspondiente a cada condición, se ofrecen en las Tablas I y II para las líneas celulares C2C12 y ROS respectivamente. En todos los casos, salvo que se indique lo contrario, los valores entre paréntesis indican la relación porcentual entre el valor obtenido en cada caso y el valor correspondiente obtenido en una placa de pocillos convencional (plástico) usada como referencia. Tabla I ENSAYOS C2C12 Calceína AM Etidio MTT Homodimero Plástico 12553, 9 1873, 0 0,1806 Fosfato 3786, 73 542, 403 0, 087 o (30,16%) (28,96%) (48,24%) U 2 Sos 5546, 20 650, 067 0,116 a) Sosa g- (44, 18%) (34,71%) (64,12%) W W Glutaraldehído 4681, 53 424, 067 0,114 y sosa (54,13%) (22,64%) (63, 34%) H Glutaraldehido 588 420, 467 0, 105 (46, 86) (22, 45) (58, 145)

Tabla II ENSAYOS ROS Calcina AM Etidio MTT Homodimero Plastic 15209,9 1855,1 0,186 Fosfato 4426, 53 434,133 0,113 o (29, 10%) (23,40%) (61, 0%) 9195, 33 1077,13 0, 110 au Sosa g-u (60,46%) (58,06%) (59, 4%) W v Glutaraldehído 6795,53 663,267 0,123 y sosa (44,68%) (35,75%) (65,9%) a E-1-Gllitaraldehido 8352,33 545,012 0,152 H Glutaraldehído (54, 91%) (29,38%) (81, 9%) Los protocolos seguidos para la realización de los diferentes ensayos son los siguientes.

Calcina AM : Se retira el medio y se lavan los pocillos con 200 Al de PBS. Se retira el PBS y se añade 100 1 de solución de calcina AM por pocillo (obtenida mediante la mezcla de 10 pl de stock de calcina AM (4 mM) con 10 ml de PBS). Se incuba 1 hora a temperatura ambiente en la obscuridad y se lee la Intensidad de Fluorescencia emitida a 530 nm tras excitar a 490 nm.

Etidio homodímero : Se retira la calcina AM y se matan las células mediante adición de metanol al 70%.

Tras la muerte celular se retira el metanol y se añaden 100 pl por pocillo de solución de Etidio Homodimero (obtenida mediante la adición de 20 yl de disolución stock de etidio homodímero (2 mM) sobre 10 ml de PBS).

Tras una incubación de 30 minutos se lee la Intensidad de Fluorescencia emitida a 645 nm tras excitar a 530 nm.

MTT : se añade al medio de cultivo 40 ßl (1/10 del volumen existente en el pocillo) de una solución formada mediante la reconstitución de-15 mg de MTT en 3 ml de PBS. Se incuba 2 horas a 37°C en estufa de CO2. Se añade a cada pocillo tras esas 2 horas un volumen igual de

solución de solubilización (esencialmente Tritón X-100 en isopropanol), y tras la disolución mediante pipeteo repetido de los cristales de formazán formados, se lee la densidad óptica (D. O.) a 570 nm y a 690 nm, según el protocolo proporcionado por la casa suministradora del kit de este ensayo (Sigma Chemical Company).

Por otra parte, la observación por microscopía óptica inversa (lente : lOx y binocular : lOx, total 100x) de los cultivos celulares de C2C12 y ROS puso de manifiesto que tan sólo aproximadamente un tercio de las células sembradas se adhieren al filme formado según el método descrito (Figura 1) y que la adherencia no es homogénea sino que se produce en determinadas zonas del filme, existiendo gran parte de su superficie sin células adheridas, observándose, además, que la proliferación celular en dichas células adherentes no tiende a producir su expansión sobre toda la superficie del filme, sino que se localiza en torno al punto inicial de adherencia (Figura 2), alterándose la citoarquitectura celular y cambiando la morfología típica de fibroblastos de estas líneas celulares (Figura 3). Este hecho imposibilita el uso práctico de dichos filmes a base de quitosán para una regeneración tisular guiada. Por tanto, el filme de quitosán obtenido y estabilizado según el protocolo descrito en este Ejemplo no es capaz de mostrar una adherencia celular uniforme y homogénea sobre toda su superficie.

Ejemplo 2 Crecimiento de líneas celulares sobre filmes de quitosán activado para la adherencia celular Se sigue estrictamente el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

Tras el lavado con PBS se retira el medio y se procede a un segundo secado del filme a 30-35°C bajo corriente de aire.

Una vez seco se añaden 200 pl de medio de cultivo (DMEM alto en glucosa), se siembran las células a la misma densidad que en el Ejemplo 1 y se completa con 200 Al adicionales de medio. Finalmente se incuban en estufa de C02 a 37°C. Al dia siguiente se realizan sobre las placas, siguiendo los protocolos ya descritos, los mismos análisis efectuados en el Ejemplo 1. Los resultados obtenidos para las líneas celulares C2C12 y ROS se ofrecen respectivamente en las Tablas III y IV. Tabla III ENSAYOS C2C12 Calcina AM Etidio MTT Homodimero Plastic 11650,77 2001,70 0,132 FosEato 11193, 40 2172,66 0,108 0 (96, 1%) (108,5%) (81, 9%) 10828 47 1674, 80 0, 124 a) Sosa 0 H (92, 9%) (83,7%) (93,9%) W U Glutaraldehído 10629,02 1368,73 0,107 D U y sosa (91,2%) (68,4%) (81,4%) l l Glutaraldehido 11319f 80 2612,20 0, 099 (97, 2%) (130, 55%) (75,0%) Tabla IV ENSAYOS ROS Calcina AM Etidio Homodimero Plástico 14791, 91 1809, 37 0,136 Fosfato 13822, 1 1642,13 0,101 (93, 4%) (90,8%) (74,3%) C 9193, 80 1062,07 0,098 a) Sosa ul H (62, 2%) (58, 7%) (71, 9%) W W Glutaraldehído 8906, 74 804, 53 0, 097 2 U y sosa (60,2%) (44,5%) (71,3%) Glutaraldehido 10552,0 1744, 53 0, 101 (71, 3%). (96, 4%) (74, 3%)

Al comparar los valores mostrados en las Tablas III y IV con los valores mostrados en las Tablas I y II se observa que el crecimiento de las líneas celulares ensayadas sobre los filmes de quitosán sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular (Ejemplo 2) es muy superior al obtenido sobre los filmes de quitosán no sometidos a dicho tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular (Ejemplo 1).

Asimismo, la observación por microscopía óptica inversa (100x) de los cultivos celulares de C2C12 y ROS sobre filmes de quitosán sometidos a distintos tratamientos de estabilización y al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular puso de manifiesto que las células sembradas se adherían adecuadamente al filme formado según el método descrito y que la adherencia es homogénea, observándose, además, que la proliferación celular en dichas células adherentes tiende a producir su expansión sobre toda la superficie del filme, no alterándose la citoarquitectura celular (Figuras 4-6). Este hecho posibilita el uso práctico de dichos filmes a base de quitosán para una regeneración tisular guiada. Por tanto, el filme de quitosán obtenido, estabilizado y activado en cuanto a su capacidad de adherencia celular, según el protocolo descrito en este Ejemplo, es capaz de mostrar una adherencia celular uniforme y homogénea sobre toda'su superficie.

Ejemplo 3 Activación de filmes de quitosán mediante rhBMP-2 A filmes preparados según. el protocolo descrito en el Ejemplo 2 se les deposita, tras el segundo secado, una disolución formada por 40 Rl de rhBMP-2 (de una

concentración de 1 mg/ml en ácido acético 50 mM), y se diluye con 160 Al de PBS. Se mantienen a 4°C durante la noche, procediéndose al dia siguiente a la retirada del medio con la protein. Se efectúa, a continuación, la siembra celular con C2C12 según los protocolos descritos en los Ejemplos 1 ó 2, con una densidad celular inicial de 20.000 células/cm2.

En los pocillos controles de plastic se añade, tras la siembra, 40 µl de rhBMP-2 de una concentración de 1 mg/ml, mientras que en las células sembradas sobre los filmes de quitosán no se realiza adición alguna de rhBMP- 2.

Al tercer dia se retira el medio de cultivo y se cambia por igual volumen de medio fresco, realizándose una nueva adición de rhBMP-2 sobre las células control.

En las células sembradas sobre los filmes de quitosán activado no se realiza adición alguna de rhBMP-2 en todo el tiempo del ensayo, de manera que la activación producida ha de realizarse por la rhBMP-2 adsorbida sobre el filme previo a la siembra celular.

En la Tabla V se recogen los resultados obtenidos para la actividad fosfatasa alcalina inducida por la rhBMP-2.

El protocolo seguido para la realización de este ensayo es el siguiente. Se retira el medio de cultivo y se lava una vez con 200 ßl de PBS. Se retira el PBS y se añaden 100 µl por pocillo de la solución de lisis (Tritón X-100 al 0,1%, Tris-ClH 50 mM pH 6,8 y Cl2Mg 10 mM). Se congela/descongela a-80°C tres veces. Finalmente se retiran 15 Al de esta solución de lisis de cada pocillo a los que se le añaden 150 Lil de una solución 1 : 1 de tampón de fosfatasa alcalina y sustrato (Sigma Chemical

Company), previamente precalentados a 37°C y preparada la mezcla en el momento. Se incuba 10 minutos a 37°C y se para la reacción a los 10 minutos tras la adición de 150 Al de NaOH 0,5 M por pocillo. Finalmente se lee la D. O. a 405 nm. Tabla V ENSAYO de FOSFATASA ALCALIN C2C12 Sin BMP BMP en BMP BMP disolución adsorbida inmovilizada Plastico 0, 141 2, 432 Fosfato-0, 014 2,101 2,163 \e. _ o o Sosa-0, 001 2,299 2,292 H Glutaraldehido p007 2, 189 2, 238 y soma Ejemplo 4 Recubrimiento de un tornillo de implante Se sumerge un tornillo de titanio (Figura 7) en una disolución de quitosán al 1% en acético 50 mM, se retira y se seca bajo corriente de aire, manteniendo el tornillo en rotación constante, de forma que la película se extienda uniformemente sobre toda la superficie (Figura 8).

Una vez formado el filme, se trata, según alguno de los procedimientos señalados en el Ejemplo 2, y se activa según se describe en el Ejemplo 3. A continuación, se implanta en el tercio proximal de la cara interna de la meseta tibial de conejos de raza New-Zealand, de 2,5 kg de peso, suministrados por el animalario de la Universidad Complutense de Madrid (U. C. M). Al cabo de 3 semanas se procede a sacrificar los animales observándose una fijación más estable que en los controles (tornillos

de titanio sin recubrir), precisándose para la desinserción de fuerzas entre 20-60 Newtons.

Ejemplo 5 Determinación del contenido en proteins totales del cultivo celular Se realizó este ensayo para determinar el contenido en proteins totales del cultivo celular, mediante el método de Bradford, respecto al tiempo de cultivo (días).

En este ensayo, el valor de la absorbancia es indicativo del contenido en proteins del cultivo celular y, por tanto, de la cantidad de células adheridas al filme. Se comparan los valores obtenidos utilizando una placa de pocillos convencional (plástico) usada como referencia frente a los valores obtenidos utilizando filmes de quitosán estabilizados con distintos tratamientos de estabilización no sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención (Ejemplo 5.1) y frente a los valores obtenidos utilizando filmes de quitosán estabilizados con distintos tratamientos de estabilización sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención (Ejemplo 5.2).

5.1 Filmes de quitosán sin activar la capacidad de adherencia celular Para la realización de este ensayo se prepararon 7 placas de 48 pocillos (Costar) de la manera que se describe a continuación. Cada placa poseía unos pocillos, conteniendo distintos filmes de quitosán (1 cm2), por triplicado, obtenidos mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, estabilizados mediante distintos tratamientos [Tratamiento 1 : tampón fosfato; Tratamiento

2 : NaOH ; Tratamiento 3 : glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : glutaraldehído] no sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular de la invención. Como controles y blancos se utilizan pocillos con filme pero sin células, pocillos sin filme, pocillos sin células y pocillos con células.

A continuación, a cada pocillo, se añaden 200 µl de medio de cultivo celular (DMEM alto en glucosa con penicilina/estreptomicina), y se siembran sobre los pocillos células C2C12 o células ROS, a una densidad de 10.000 cel/cm2. Se completa cada pocillo con otros 200 Zl de medio de cultivo y se incuban a 37°C en estufa de C02 durante el periodo de tiempo establecido (1-7 días).

Para la realización del ensayo de determinación de proteins totales del cultivo celular mediante el método de Bradford, se procede de la siguiente manera. El dia del ensayo, en primer lugar, se retira el medio de cultivo y, a continuación, se lavan los pocillos con 400 1 de PBS (2 veces) para eliminar los restos de proteins que pudieran estar presentes en el medio y que podrían interferir en el ensayo, se añaden 200 ßl de reactivo Bradford (BioRad) por pocillo y 800 Rl de agua destilada o milliQ, se incuba durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 595 nm.

Los resultados obtenidos, una vez restados los valores del blanco correspondiente a cada condición, se muestran en la Figura 9, donde puede apreciarse la aleatoriedad de los valores obtenidos, observándose, como cabía esperar, que las células se han adherido al plastic de forma más eficiente que a los distintos filmes de quitosán, en donde la adherencia celular es nula o prácticamente nula a partir del cuarto dia

(coincidiendo con el cambio del medio de cultivo y la consiguiente retirada de las células no adheridas) como se pone de manifiesto por la drastic reducción de los valores de absorbancia medidos a partir del cuarto día.

5.2 Filmes de quitosán con activación de la capacidad de adherencia celular Se repitió exactamente el procedimiento descrito en el Ejemplo 5.1 pero reemplazando los filmes de quitosán usados en dicho ejemplo con filmes de quitosán estabilizados por distintos tratamientos [Tratamiento 1 : tampón fosfato; Tratamiento 2 : NaOH ; Tratamiento 3 : glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : glutaraldehído] y sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular de la invención descrito en el Ejemplo 2.

Los resultados obtenidos, una vez restados los valores del blanco correspondiente a cada condición, se muestran en la Figura 10, donde puede apreciarse que las células se han adherido a los filmes de quitosán utilizados en este caso a unos niveles similares o incluso superiores a los del plástico incluso después del cuarto día.

A1 comparar los valores mostrados en las Figuras 9 y 10 se observa que la capacidad de adherencia y crecimiento de las líneas celulares ensayadas sobre los filmes de quitosán sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular es muy superior a la obtenida sobre los filmes de quitosán no sometidos a dicho tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular.

Ejemplo 6 Adsorción de rhBMP-2 A filmes preparados según el protocolo descrito en el Ejemplo 2, depositados en secciones de 1 cm2 sobre los pocillos de una placa de 48 pocillos, se les añade el volumen adecuado de una disolución de rhBMP-2 (de una concentración de 1 mg/ml en ácido acético 50 mM) para obtener la cantidad de proteína deseada en el pocillo (5- 400 Rg de rhBMP-2), completando hasta 200 pLi con PBS cuando el volumen de disolución de proteína anadido al pocillo era inferior a 200 p. l. Seguidamente, se tapa la placa y se guarda en cámara fría a 4°C, durante toda la noche. Al dia siguiente, se retira la disolución de proteína de los pocillos (sobrenadante) y se determina en los sobrenadantes el contenido en proteins totales mediante el método de Bradford (Ejemplo 5). Por diferencia con los valores obtenidos con la disolución madre de protein, se obtiene la cantidad de proteína adsorbida sobre el filme de quitosán.

Los resultados de la adsorción de rhBMP-2 por filmes de quitosán estabilizados con NaOH, o con glutaraldehído, y sometidos al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención se muestran en las Figuras 11 y 12, respectivamente, en donde la barra de error corresponde al promedio de varios experimentos.

Ejemplo 7 Activación de filmes de quitosán mediante rhBMP-2 a lo largo del tiempo Se realizó este ensayo para evaluar la capacidad de activación de filmes de quitosán mediante rhBMP-2 a lo largo del tiempo. Para ello, a filmes preparados según el

protocolo descrito en el Ejemplo 2, depositados en los pocillos de una placa de 48 pocillos, se les añaden 10 Rg de rhBMP-2 (a partir de una disolución de rhBMP-2 en ácido acético 50 mM de una concentración de 1 mg/ml). Los pocillos no recubiertos con filme se utilizaron como controles.

Las placas se mantienen a 4°C durante toda la noche, procediéndose al dia siguiente a la retirada del medio con la protein. A continuación, se añade medio de cultivo y se procede a efectuar la siembra celular con C2C12 según los protocolos descritos en los Ejemplos 1 ó 2, con una densidad celular inicial de 10.000 células/cm2.

En los pocillos controles de plástico se añade, tras la siembra, 10 pg de rhBMP-2, mientras que en las células sembradas sobre los filmes de quitosán no se realiza adición alguna posterior de rhBMP-2.

Al cuarto dia se retira el medio de cultivo y se cambia por igual volumen de medio fresco, realizándose una nueva adición de rhBMP-2 sobre las células control.

En las células sembradas sobre los filmes de quitosán activado no se realiza adición alguna de rhBMP-2 en todo el tiempo del ensayo, de manera que la activación producida ha de realizarse por la rhBMP-2 adsorbida sobre el filme previo a la siembra celular.

En la Figura 13 se muestran los resultados obtenidos para la actividad fosfatasa alcalina (véase el protocolo del ensayo descrito en el Ejemplo 3) inducida por la rhBMP-2 total en pocillo a diversos días. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la rhBMP-2, unida a filmes de quitosán estabilizados mediante diversos tratamientos [Tratamiento 1 : tamp6n fosfato ; Tratamiento 2 : NaOH ; Tratamiento 3 : glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : glutaraldehído] y sometidos al tratamiento

activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención, permanece activa a lo largo del tiempo considerado.

Ejemplo 8 Determinación del torque necesario para desenroscar un implante Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 se prepararon unos tornillos de titanio recubiertos con filmes de quitosán estabilizados por diversos tratamientos [Tratamiento 2 : NaOH ; Tratamiento 3 : glutaraldehído y NaOH ; y Tratamiento 4 : glutaraldehído].

Una vez formados los filmes sobre los tornillos, la capacidad de adherencia celular de los filmes fue activada mediante el tratamiento descrito en el Ejemplo 2 y activados biológicamente por adsorción de rhBMP-2 según el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. Como controles se utilizaron tornillos de titanio sin recubrir.

A continuación, en el tercio proximal de la cara interna de una de las mesetas tibiales de conejos de raza New-Zealand, de 2,5 kg de peso, suministrados por el animalario de la Universidad Complutense de Madrid (U. C. M) se implanta un tornillo recubierto con filme de quitosán y en la otra meseta tibial del mismo animal se implanta un tornillo control. La implantación se realiza por métodos convencionales. Los animales se mantienen sin restricción de movimientos y, al cabo del tiempo señalado (5-7 semanas), se procede a sacrificar los animales y a evaluar la osteointegración del implante mediante la determinación del torque necesario para su desinserción.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 14 y ponen de manifiesto una fijación más estable en el caso de los tornillos recubiertos con los filmes de quitosán que en los controles (tornillos de titanio sin recubrir).

Se incluyen, además, a modo comparativo, los valores del torque obtenidos con los tornillos comerciales Osseotite@ y TiUniteX (Nobel Pharma) [datos extrados de Gottlob et al., Applied Osteointegration Research, 2000,1 : 25-27].