Hintergrund der Erfindung Die Produktion von Nukleinsäuren hat durch die Verwendung dieser Biomoleküle als Transportsysteme (Vektoren) für therapeutische Gene in modernen Therapieformen wie Zelltherapie, Gentherapie oder genetische Impfung (DNA-Vakzinierung) große Bedeutung erlangt. Zahlreiche Nukleinsäure-Vakzine und Gentherapeutika werden derzeit in klinischen Studien getestet. Bei diesen Therapieformen werden Nukleinsäuren als nicht-virale Vektoren eingesetzt. Der Gentransfer kann durch direkte Injektion der Nukleinsäuren in Gewebe bzw.

Zellen oder mit Hilfe einer Gene Gun erfolgen. Die DNA kann dabei als"nackte" Nukleinsäure vorliegen oder in Formulierung mit anderen Substanzen (z. B. Liposomen), die den Gentransfer bzw. die Effizienz erhöhen.

Mikroorganismen besitzen die Eigenschaft, extra-chromosomale, zirkuläre Nukleinsäuren, wie beispielsweise Plasmide oder Cosmide replizieren zu können. Diese Eigenschaft kann zur Herstellung der Nukleinsäuren in großen Mengen genutzt werden.

Plasmide sind extrachromosomale, meist zirkuläre, doppelsträngige DNA Moleküle. Sie haben eine Größe zwischen ca. 200 und 100.000 Basenpaaren (Bp), existieren in den Zellen neben dem bakteriellen Chromosom und werden autonom von diesem repliziert. Plasmide liegen oft in mehreren Kopien pro Zelle vor. Ihre Anzahl variiert zwischen 2 bis 20 Kopien pro Zelle (low-copy Plasmide) oder mehreren hundert Kopien pro Zelle (high-copy Plasmide).

Die zusätzliche genetische Information durch die Plasmide verleiht dem Wirtsorganismus einen Selektionsvorteil gegenüber plasmidfreien Zellen, wie z. B. die Resistenz gegen ein Antibiotikum. In der Biotechnologie finden Plasmide zahlreiche Anwendungen als Klonierungs-und Expressionsvektoren. Sie besitzen ein Replikationssystem, ein oder mehrere Selektionsmarkergene und einen Klonierungsabschnitt zur Aufnahme fremder Genabschnitte.

Die Produktion großer Mengen dieser Nukleinsäuren in hoher Qualität erlangt durch die zunehmende Verwendung der Nukleinsäuren in präklinischen, klinischen oder veterinärmedizinischen Anwendungen der Zell-und Gentherapie bzw. DNA-Vakzinierung ein besonderes Interesse.

Zur Produktion von bakterieller Biomasse zur Herstellung von Nukleinsäuren von pharmazeutischer Qualität werden die Bakterienzellen auf Nährmedien zu hohen Zelldichten bei gleichzeitiger hoher Produktkonzentration in den Zellen und hoher Qualität des Produktes herangezogen. Die hierbei verwendeten Medien bestehen aus Kohlenstoff-und Stickstoffquellen, sowie einer Mineralsalzmischung. In Verfahren aus dem Stand der Technik werden Nährmedien verwendet, deren Kohlenstoff-und/oder Stickstoffquellen ein oder mehrere nicht-definierte komplexe Bestandteile sind, wie Extrakte oder Hydrolysate von Naturprodukten (siehe beispielsweise Wan et al., US005487986 (1996) oder Rainikainen et al., Biotechnol. Bioeng. 33 (1989), 386-393, O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000), 175- 183). Im Stand der Technik werden auch Nährmedien verwendet die Komponenten aus tierischen Quellen enthalten. Auch andere mögliche toxische Substanzen können durch die nicht-definierten, komplexen Komponenten in das Nährmedium und damit in Kontakt mit dem Nukleinsäureprodukt gelangen. Außerdem variiert die Bildung von Biomasse und Produkt stark mit der Zusammensetzung und Qualität der verwendeten komplexen Komponente, die von Charge zu Charge verschieden sein können.

Während der Kultivierung werden durch die Verstoffwechselung der Medienkomponenten Biomasse, das Produkt als Teil der Zellmasse und zusätzlich Stoffwechselenergie erzeugt. Bei Verfahren aus dem Stand der Technik werden auch hohe Substratkonzentrationen zu Beginn der Kultivierung vorgelegt, um hohe Biomasse-und Produktkonzentrationen zu erzeugen. Es werden aber stattdessen wachstums-und produktbildungsinhibierende Stoffwechsel- komponenten, wie Acetat gebildet (siehe Kleman et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), 3952-3958). Die Bildung dieser unerwünschten Stoffwechselnebenprodukte wird beim Stand

der Technik durch die Anwendung sogenannter Zulaufkultivierungsverfahren umgangen.

Hierbei werden die Substrate zu Beginn der Kultivierung in geringeren Konzentrationen vorgelegt. Nach dem Verbrauch dieser Substrate erfolgt ein Zulauf von frischem, konzentrierten Nährmedium, der kontinuierlich oder geregelt erfolgen kann (siehe beispielsweise Chen et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18 (1997), 43-48 ; Lahijani et al., Hum. Gen. Ther. 7 (1996), 1971-1980 ; Schmidt et al. WO 99/61633 (1999)). Der entscheidende Nachteil dieser Zulaufverfahren besteht in der aufwendigen, technischen Umsetzung der Steuerungs-und Regelungsverfahren für den Zulauf von Medium. Außerdem wird durch den Wechsel zwischen Substratüberschuß und Substratmangel ein physiologischer Stress auf die Bakterienzellen ausgeübt, der sich negativ auf den Produktbildungsprozess auswirken kann.

Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren, insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren, von pharmazeutischer Qualität bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung Gelöst wird die Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren, das bei der Herstellung von Nukleinsäuren auf komplexe Nährmedienbestandteile vollständig verzichtet. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren umfasst die Kultivierung von die Nukleinsäure enthaltenen Bakterienzellen in einem Medium ohne komplexe Bestandteile und die Isolierung der Nukleinsäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medium ohne komplexe Bestandteile die folgenden synthetischen Bestandteile : (aa) organische Kohlenstoffquelle, (ab) anorganische Stickstoffquelle (ac) Mineralsalzmischung und (ad) eine zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel der Bakterienzellen verstärkt.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders vorteilhaft im Satzverfahren durchführen und führt bei hohen Nährstoffkonzentrationen zu großen Produktmengen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Nukleinsäuren, insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren in großen Mengen und gewährleistet Nukleinsäuren in hoher Qualität, die in prä-klinischen, klinischen oder veterinärmedizinischen Anwendungen der Zell-und Gentherapie bzw. DNA-Vakzinierung eingesetzt werden können.

Vorzugsweise liegen superspiralisierte Nukleinsäuren zu mindestens 70-90 %, insbesondere zu mehr als 90 % in der superspiralisierten ccc-Form vor. Bei der ccc-Form (covalently closed circular) handelt es sich um eine kompakte, kovalent-geschlossene zirkuläre Nukleinsäure- struktur, die in Mikroorganismen durch Topoisomerasen erzeugt wird.

Insbesondere werden durch das erfindungsgemäße Verfahren Kontaminationen durch unerwünschte Substanzen, die schwer nachzuweisen sind und damit in das Nährmedium gelangen, vermieden, was z. B. im Zuge der BSE-Problematik von elementarer Bedeutung ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren verzichtet ganz auf den Einsatz komplexer Bestandteile.

Die Konzentrationen der Bestandteile im Medium betragen für die organische Kohlenstoffquelle 1 bis 500 g/L, vorzugsweise 10 bis 300 g/L und insbesondere 50 bis 100 g/L, für die anorganische Stickstoffquelle 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20 bis 80 mM und insbesondere 40 mM und für die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente 25 bis 1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM Die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel verstärkt, ist eine Vorstufe in der Biosynthese der Nukleotidbasen der Nukleinsäuren.

Auch bei der zusätzlichen stickstoff-haltige Komponente handelt es sich um eine nicht komplexen Bestandteil.

Die vorliegende Erfindung beschreibt daher ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren. Dabei wird die Kultivierung der transformierten Bakterienzellen in einem

Medium, vorzugsweise im Satzverfahren (=Satzkultivierungsverfahren) durchgeführt, welches keine komplexen Bestandteile enthält.

Ein Satzkultivierungsverfahren ist ein diskontinuierliches Kultivierungsverfahren bei dem alle Komponenten des Nährmediums vor dem Zufügen der Mikroorganismen im Kulturgefäß vorliegen.

Komplexe Bestandteile von Nährmedien sind nicht definierte Naturprodukte bzw. aus diesen gewonnenen Extrakte zur Kultivierung von Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefeautolysat, Hefeextrakt, Peptone, Malz-oder Fleischextrakte.

Die Kultivierung der transformierten Bakterienzellen erfolgt in einem Medium, welches die definierten, synthetischen Bestandteile organische Kohlenstoffquelle, anorganische Stickstoffquelle, Mineralsalzmischung und eine zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente enthält, die den Produktstoffwechsel verstärkt. Während der Kultivierung produzieren die transformierten Bakterienzellen Nukleinsäuren.

Die besondere Zusammensetzung des voll-synthetischen Mediums ermöglicht die Kultivierung im Satzprozess zu hohen Zelldichten bzw. Biomassekonzentrationen (optische Dichte (600 nm) 2 75) in Verbindung mit hohen Produktausbeuten (Plasmidkonzentration 2 65 mg/L), die bisher nur im Rahmen von technisch aufwendigeren Zulaufprozessen in meist komplexen Medien erreicht wurden. Durch die Verwendung rein synthetischer Bestandteile und den Verzicht auf komplexe und tierische Komponenten ist das Medium optimal für die Herstellung von Nukleinsäuren in pharmazeutischer Qualität für zum Beispiel Zell-und Gentherapie oder genetische Impfung geeignet.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren, wobei die Kultivierung der Bakterienzellen vorzugsweise im Satzverfahren erfolgt. Im Satzverfahren werden von Beginn der Kultivierung an alle Nährstoffquellen den Bakterienzellen im Medium bereitgestellt. Der Einsatz hoher Substratkonzentrationen führt jedoch bei Verfahren, die dem Stand der Technik entsprechen, nicht gleichzeitig im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung zu hohen Zelldichten und Produktmengen, weil Stoffwechselprodukte, wie beispielsweise Acetat gebildet werden, die weiteres Zellwachstum inhibieren (siehe zum Beispiel Kleman et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), 3952-3958). Deshalb können zur Vermeidung von

Substratinhibierung bei Kultivierungen zu hohen Zelldichten sogenannte Zulaufverfahren eingesetzt werden, bei denen den Bakterienzellen am Anfang der Kultivierung nur geringe Mengen an Nährstoffen zur Verfügung stehen und bei Verbrauch dieser Nährstoffe frisches Medium zuläuft. Diese Zulaufverfahren sind bekannt und entsprechen dem Stand der Technik (siehe zum Beispiel Chen et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18 (1997), 43-48, Lahijani et al., Hum. Gen. Ther. 7 (1996), 1971-1980, Schmidt et al. WO 99/61633 (1999)). Nachteile dieser Verfahren sind die aufwendige, technische Umsetzung der Steuerung bzw. Regelung des Zulaufes von frischen Medium, der physiologische Stress den die Bakterienzellen durch abwechselnde Substratüberschuss-und Substratmangelbedingungen ausgesetzt sind, die Verwendung komplexer, nicht definierter Mediumsbestandteile oder die geringen Plasmidmengen innerhalb der Bakterienzellen (Plasmidmassenanteil). Die ausgewogene Zusammensetzung des Nährmediums der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Kultivierung im Satzverfahren zu hohen Zelldichten mit gleichzeitig hoher Produktkonzentration bzw. hohen Plasmidmassenanteil ohne das wachstums-inhibierende Stoffwechselnebenprodukte gebildet werden.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass das Medium zur Kultivierung der Bakterienzellen keine komplexen, nicht definierten Bestandteile enthält wie beispielsweise Hefeextrakte, Peptone oder Tierhydrolysate bzw. andere Bestandteile, die aus Tieren gewonnen werden, die bei Verfahren gemäß dem Stand der Technik verwendet werden (siehe zum Beispiel Wan et al., US005487986 (1996), O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000), 175-183). Komplexe Medienbestandteile können mit unerwünschten Substanzen verunreinigt sein, die schwer nachzuweisen sind und damit in das Nährmedium gelangen. Im Zuge der BSE-Problematik ist der vollkommene Verzicht auf tierische Komponenten bei der Produktion von Pharmazeutika sehr vorteilhaft.

Ein anderer Nachteil bei der Verwendung komplexer Medienbestandteile betrifft die unterschiedliche Qualität des Ausgangsmaterials. Von Charge zu Charge können große Unterschiede in der Zusammensetzung auftreten, so dass die Kultivierung nicht reproduzierbar durchgeführt werden kann. Deshalb ist ein das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von plasmidhaltiger Biomasse in einem synthetischen Medium dem Stand der Technik überlegen. Die definierten Bestandteile, die synthetisch hergestellt werden, können in höchster Reinheit ohne Verunreinigung mit unerwünschten Substanzen eingesetzt werden und variieren auch nicht in ihrer Zusammensetzung.

Die ausgewogene Zusammensetzung des definierten, synthetischen Mediums aus organischer Kohlenstoffquelle, anorganischer Stickstoffquelle, Mineralsalzmischung und einer zusätzlichen, definierten stickstoff-haltigen Komponente, die den Produktstoffwechsel verstärkt, ist ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und erlaubt es den transformierten Bakterienzellen, die Substrate zu verstoffwechseln und Nukleinsäuren in großen Mengen zu produzieren, ohne das wachstums-inhibierende Nebenprodukte gebildet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Bakterienzellen aus dem Kultivierungsmedium isoliert. Dieses kann durch Filtration, Zentrifugation oder anderen Methoden geschehen, die dem Stand der Technik entsprechen.

Nach der Isolierung können die Bakterienzellen zusätzlich noch mit einer Flüssigkeit gewaschen werden, die die Zellen nicht verändert, um Reste des Kultivierungsmedium zu entfernen.

Die Nukleinsäuren werden innerhalb der Bakterienzellen produziert. Deshalb werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Nukleinsäuren aus den Bakterienzellen isoliert und von den Zellen und anderen Zellinhaltsstoffen gereinigt. Die Zelllyse und die Reinigung kann dabei durch im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, wie alkalische Lyse mit anschließendem Chromatographie-Schritt erfolgen (siehe zum Beispiel Marquet et al., Biopharm 8 (1995), 26-37) oder Colpan et al., US 5990301,1999 oder Ferreira et al., J. Mol. Recogn. 11 (1998), 250-251 oder Green et al., Biopharm 10 (1997), 52-62)). Mit Hilfe dieser Verfahren können die Nukleinsäuren in pharmazeutischer Qualität isoliert werden, so dass sie als Wirkstoff in Zell-bzw. Gentherapie und genetischer Impfung verwendet werden können.

In einer anderen bevorzugten Verkörperung der Methode der Erfindung werden die Zellen nach der Kultivierung eingefroren oder gefriergetrocknet. Dieses ist sehr nützlich, wenn eine sofortige Isolierung und Reinigung der Nukleinsäuren nicht gewünscht ist und die Bakterienzellen längere Zeit gelagert werden sollen.

Die Bakterienzellen können gram-positiv oder gram-negativ sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die transformierten Bakterienzellen Escherichia coli-Zellen. Insbesondere wird ein E. coli K12-Stamm mit Genotyp recA oder recAl verwendet. Diese Bakterienstämme produzieren sehr homogene Nukleinsäuren.

Deshalb ist ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren, dass die Nukleinsäuren in

den Zellen superspiralsiert sind, insbesondere zu mehr als 90 % in der ccc-Form vorliegen.

Ein weiterer, entscheidender Vorteil der Erfindung ist, dass die gereinigten Nukleinsäuren in pharmazeutischer Qualität als Wirkstoff in Zell-bzw. Gentherapie und genetischer Impfung eingesetzt werden können. Es werden bei der Herstellung keine unerwünschten bzw. toxische Substanzen benutzt, die die Verwendung als Pharmazeutikum in der Klinik ausschließen.

Ein entscheidender Vorteil des Verfahrens der Erfindung betrifft die Tatsache, dass eine Vielzahl von zirkulären Nukleinsäuren, wie Plasmide, Cosmide oder noch größere Nukleinsäuremoleküle damit hergestellt werden können. Die Größe der Moleküle hat dabei keinen Einfluss auf die Ausbeute oder Qualität der Produkte.

Die definierte, organische Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise aus der Gruppe der Monosaccharide, Disaccharide, Polysaccharide oder Polyole, insbesondere wird Glucose, Maltose, Raffinose, Galactose, Trehalose, Sucrose, Fructose, Mannose, Sorbose, Fucose, Rhamnose, Arabinose, Xylose, Ribose, Manitol, Sorbitol oder Glycerin als organische Kohlenstoffquelle verwendet. In einer bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Verfahren wird die Kohlenstoffquelle im Medium in einer Konzentration im von 1 bis 500 g/L, vorzugsweise 10 bis 300 g/L und insbesondere 50 bis 100 g/L eingesetzt. Die Kohlenstoffquellen können in höchsten Reinheitsstufen chemisch synthetisiert werden und sind deshalb nicht mit unerwünschten Substanzen bzw. tierischen Bestandteilen verunreinigt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Ammoniumsalze, wie zum Beispiel Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphate, Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat bzw.

Ammoniak selbst als anorganische Stickstoffquelle verwendet. Ammoniumionen bilden in höheren Konzentrationen zusammen mit Phosphat-und Magnesiumionen, die ebenfalls in einem definierten, synthetischen Medium enthalten sein können, schwerlösliches Magnesiumammoniumphosphat. Um während der Zubereitung des Mediums oder während der Kultivierung die Bildung dieser Salzausfällung zu vermeiden, werden die Ammoniumsalze vorzugsweise in einer Konzentration von 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20 bis 80 mM und insbesondere 40 mM eingesetzt.

Mineralsalze sind ein wichtiger Bestandteil bakterieller Nährmedien. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden mindestens wasserlösliche anorganische Phosphaten, Chloride, Natriumsalzen, Kaliumsalze und Magnesiumsalze, vorzugsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikalium- hydrogenphosphat, Natriumchlorid und Magnesiumsulfat als Mineralsalzmischung eingesetzt.

Insbesondere werden die Salze in den Konzentrationen Kaliumdihydrogenphosphat 1 bis 50 g/L, vorzugsweise 1,5 bis 10 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat 1 bis 75 g/L, vorzugsweise 2,3 bis 15 g/L, Natriumchlorid 1 bis 20 g/L, vorzugsweise 2,5 bis 10 g/L und Magnesiumsulfat 0,1 bis 20 g/L, vorzugsweise 0,3 bis 10 g/L.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird der Mineralsalzmischung zusätzlich noch eine Spurenelement-Lösung bestehend aus Eisen (ici) chlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Kobaltsulfat, Kupferchlorid, Borsäure, Natriummolybdat und Zitronensäure zugesetzt, insbesondere Eisen (in) chlorid in einer Konzentration von 20 mM, Zinksulfat in einer Konzentration von 5 mM, Mangansulfat in einer Konzentration von 11 mM, Kobaltsulfat in einer Konzentration von 2 mM, Kupferchlorid in einer Konzentration von 1 mM, Borsäure in einer Konzentration von 16 mM, Natriummolybdat in einer Konzentration von 11 mM und Zitronensäure in einer Konzentration von 24 mM.

In einer weiteren Verkörperung der Erfindung werden dem Medium wirtsstamm-spezifische Supplementierungen, z. B. Vitamine oder andere Komponenten, die der verwendete Wirtsstamm nicht selbst synthetisieren kann, zugesetzt. Zahlreiche Bakterienstämme besitzen beispielsweise eine Thiamin-Auxotrophie, wie zum Beispiel E. coli DHl oder E. coli DH5ct, weshalb bei der Verwendung dieser Wirtsstämme das Vitamin dem Medium zugesetzt wird.

Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können in einem definierten synthetischen Medium im Satzbetrieb große Mengen Biomasse und Nukleinsäureprodukt gewonnen werden. Mit Satzkultivierungsverfahren aus dem Stand der Technik (siehe beispielsweise Wan et al., US005487986 (1996) oder Raiiiiltainen et al., Biotechnol. Bioeng. 33 (19989), 386-393, O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000), 175-183) werden mit komplexen Nährmedien deutlich geringere Biomasse- und Nukleinsäureproduktmengen erhalten, weil die eingesetzten Nährquellen auch in Stoffwechselprodukte umgewandelt werden, die Bakterienwachstum und Produktbildung inhibieren können. Deshalb ist ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der Einsatz einer zusätzlichen, definierten stickstoff-haltigen Komponente, die den Produktstoffwechsel verstärkt.

Die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente ist idealerweise eine Vorstufe in der Biosynthese der Nukleotidbasen der Nukleinsäuren und trägt damit zum Aufbau der Purin-und Pyrimidinbasen im Stoffwechsel der Bakterienzellen bei. In einer bevorzugten Verkörperung der Erfindung ist die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente ausgewählt aus der

Gruppe bestehend aus Aminosäuren, Peptide, Kohlensäureamiden, und Nukleotide bzw. die Phosphate dieser Verbindungen. Insbesondere ist die zusätzliche definierte Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus : Aspartat, Glutamat, Glutamin, Glycin, Adenosin, Cytosin, Guanin, Thymin, oder Harnstoff bzw. die Phosphate dieser Verbindungen. Die Verwendung dieser Verbindungen ist vorteilhaft, weil diese chemisch synthetisiert hergestellt werden können. Die Konzentration der zusätzlichen, definierten stickstoff-haltigen Komponente im Medium ist 25 bis 1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass zur Kultivierung der transformierten Bakterienzellen keine Antibiotika zur Erhöhung der Plasmidstabilität dem Medium zugesetzt werden müssen. Vor allem für eine Verwendung der gereinigten Nukleinsäuren als Wirkstoff in Zell-und Gentherapie oder genetischer Impfung ist dieses vorteilhaft.

In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Kohlenstoff- und/oder die Stickstoffquelle vollständig verstoffwechselt werden. Die Bakterienzellen können auch vorher vom Medium getrennt werden, vorteilhafter ist aber eine Trennung nach vollständiger Verstoffwechslung der Nährquellen, weil in diesem Fall Biomasse-und Produktkonzentration am höchsten sind.

Eine besondere Verkörperung des Verfahren der Erfindung ist die Durchführung der Kultivierung in einem temperierbaren Bioreaktor. Dabei wird die Kultivierung in einem Temperaturbereich von 25-42 °C, vorzugsweise im Bereich von 36-38 °C durchgeführt. In einer besonderen Ausführung werden die Bakterienzellen während der Kultivierung durch das Einblasen von Luft in das Medium mit Sauerstoff versorgt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Kultivierung in einem pH-Bereich von 6,0-8,0, vorzugsweise im Bereich von 6,5 bis 7,5. Insbesondere wird während der Kultivierung das pH durch Zugabe einer Säure und/oder Base geregelt. Außerdem kann während der Kultivierung gegebenenfalls Antischaummittel zugegeben werden, um ein Überschäumen zu vermeiden.

Ein weiterer entscheidender Vorteil des beschriebenen Verfahrens betrifft die Tatsache, dass schon die Vorkultivierung in einem definierten, synthetischen Medium erfolgen kann. Damit ist ein Kontakt der Bakterienzellen mit komplexen Mediumsbestandteilen völlig ausgeschlossen.

Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Abbildungen erläutert : Abbildungen Die Abbildungen zeigen Abbildung 1 Gelöstsauerstoffkonzentration (p02), Rührerfrequenz und Kohlendioxidgehalt der Reaktorabluft bei der Kultivierung von pUK21CMVß in E. coli DH5a in einem definerten, synthetischen Medium mit 2 g L'1 Ammoniumchlorid im 7 L-Bioreaktor.

Abbildung 2 Plasmidmassenanteil, Biotrockenmasse-und Plasmidkonzentration während der Kultivierung von pUK21CMVß in E. coli DH5a in dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.

Abbildung 3 Verlauf der Glutamat-, Glycerin,-Ammonium-und Acetatkonzentration der Kultivierung von pUK21CMVß in E. coli DH5a in dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.

Abbildung 4 0,8 % iges Agarosegel der pUK21CMVß Proben aus der Kultivierung in dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor (-DNA, BStE II geschnitten, R : pUK21CMVß-Referenz).

Abbildung 5 Wichtige Betriebsvariablen bei der Kultivierung von pUT649 in E. coli DH5a in dem synthetischen Medium mit 2 g L l Ammoniumchlorid im 30 L-Bioreaktor.

Abbildung 6 0,8 % iges Agarosegel der pUT649 Proben der Kultivierung in dem definierten, synthetischem Medium mit 2 g L'1 Ammoniumchlorid im 30 L-Bioreaktor nach 19 und 22 h (19-DNA, BStE II geschnitten).

Abbildung 7 Qualitätsanalyse des Plasmids pUT649 der Kultivierung im 30 L Bioreaktor mittels Kapillargelelektrophorese.

Abbildung 8 Plasmidkonzentration, Plasmidmassenanteil und Biotrockenmasse- konzentration bei der Kultivierung von pUK21CMVß in E. coli DH5a in dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.

Abbildung 9 Glutamat-, Glycerin,-Ammoniumionen-und Acetatkonzentration im Verlauf der Kultivierung von pUK21CMVß inE. coli DH5a in dem synthetischen Glycerinmedium im 7 L-Bioreaktor.

Abbildung 10 Plasmidmassenanteil, Biotrockenmasse-und Plasmidkonzentration bei der Kultivierung von E. coli DH5a mit dem Plasmid pUK21CMVß in synthetischem Medium mit 4 g L'1 Ammoniumchlorid im 7 L Bioreaktor.

Abbildung 11 Satzkultivierung von E. coli DH5a pUK21CMVß in M9-Minimalmedium im 7 L Bioreaktor.

Abbildung 12 Plasmid-, Biotrockenmassekonzentration und Plasmidmassenanteil während der Kultivierung von pUK21CMVß in E. coli DH5a im halbsynthetischem Vollmedium mit Glutamat im 7 L Bioreaktor.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht in beschränkender Weise aufzufassen.

Beispiele Beispiel 1 : Herstellung des Plasmids pUK21CMVß durch Bakterienzellen in einem definierten synthetischem Medium im Satzverfahren in einem 7 It Bioreaktor Zur Herstellung des 7,6 kBp großen Plasmids pUK21CMVß wurde der E. coli-Stamm DH5a (Clontech, Heidelberg, Deutschland, Cat.-Nr. C2007-1) verwendet. Das Plasmid pUK21CMVß ist ein pUC21-Abkömmling mit Kanamycin-Resistenz (siehe Viera et al., Gene 100 (1991), 189-195) und enthält die ß-Galactosidase aus E. coli unter dem CMV (Cytomegalus)-Promotor. Die Kultivierung wurde in einem 7 L-Bioeaktor (MBR, Wetzikon, Schweiz) in einem wäßrigen, antibiotika-freien, definierten synthetischen Medium bestehend

aus 60 g L 1 Glycerin (87 %), 2 g L-1 Ammoniumchlorid, 30 g L-1 Natrium-L-Glutamat, 1,5 g L-I KH2P04, 2,3 g L-1 K2HP04, 2,5 g L''NaC !, 5 g L'1 Zitronensäure x H20, 1,0 g L-l MgSO4 x 7 H2O, 10 mg L-1 Thiaminhydrochlorid und 2 mL L'1 Spurenelementekonzentrat durchgeführt. Das Spurenelementekonzentrat bestand aus 5,4 g L-l FeCl3 x 6 H2O, 1,38 g L'1 ZnS04 x 7 H2O, 1,85 g L''MnS04 x H20, 0,56 g L''CoS04 x 7 H2O, 0,17 g L'1 CuCl2, 1,0 g L-1 H3B03, 2,5 g L'1 NaMo04 x 2 H2O und 5,0 g L-1 Citronensäure x H2O.

Alle Medienkomponenten mit Ausnahme von Magnesiumsulfat, Thiaminhydrochlorid und der Spurenelementelösung wurden im Bioreaktor hitzesterilisiert. Das Thiaminhydrochlorid wurde in Wasser aufgenommen, sterilfiltriert und zur sterilen Spurenelementelösung gegeben.

Das Magnesiumsulfat wurde in Wasser gelöst, separat hitzesterilisiert und dann ebenfalls zur sterilen Spurenelementelösung gegeben. Die so hergestellte Mischung aus Spurenelementekonzentrat, Magnesiumsulfat und Thiaminhydrochlorid wurde über einen Animpfkolben zum sterilen Medium im Bioreaktor hinzugefügt.

Zur Herstellung der Inokulationskultur wurden 200 mL eines sterilen Mediums mit einer Glycerinkultur von pUK21CMVß in DH5α beimpft. Nach 8 Stunden Inkubation auf einem Tischschüttler bei n = 150 min-1 und einer Temperatur von T = 37 °C wurden 5 L des sterilen, synthetischen Mediums im 7 L Bioreaktor mit 50 mL der Inokulationskultur beimpft.

Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37 °C und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt.

Die Luftzufuhr erfolgte mit 5 L min~1 und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure (10 %) und/oder Ammoniaklösung (25 %) geregelt. Die Drehzahl des Rührers wurde ausgehend von einer Minimalfrequenz von 150 min-1 durch die Gelöstsauerstoffkonzentration (p02) geregelt. Die Probennahme zur Prozesskontrolle erfolgte im Abstand von 2 Stunden. Dabei wurde die Biotrockenmassekonzentration und die Plasmidkonzentration mittels Kapillarelektrophorese (siehe Schmidt et al., J. BiotechnoL 49 (1996), 219-229) nach der Isolierung mit einem handelsüblichen Kit nach Vorschrift des Herstellers ermittelt. Weiterhin wurde die Konzentration von Mediumsbestandteilen verfolgt.

In Abbildung 1 ist der typische Verlauf der wichtigsten Kultivierungsparameter Rührerfrequenz, Gelöstsauerstofflconzentration (p02) und der Kohlendioxidkonzentration in der Abluft dargestellt. Abbildung 2 zeigt den Verlauf der Biotrockenmasse-, der Plasmidkonzentration und des Plasmidmassenanteils während dieser Kultivierung. Die Biotrockenmassekonzentration nahm exponentiell zu und erreichte einen maximalen Wert von X = 20 g L-1. Die maximale Produktkonzentration betrug P = 50 mg L-1 bei einem Plasmidmassenanteil von wp = 3 mg g-1. Nach 34 Stunden Kultivierungsdauer waren die Substrate Ammoniumstickstoff, Glutamat und Glycerin vollständig verbraucht (siehe

Abbildung 3) und die Bakterienzellen erreichten die stationäre Phase, d. h. es wurde keine weitere Zunahme der Biomasse erhalten. Auch die maximale Produktkonzentration von P = 50 mg L'1 wurde zu diesem Zeitpunkt erreicht. Das 0,8 % ige Agarosegel der isolierten Plasmid DNA zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Plasmid-DNA weist eine sehr hohe Homogenität auf und lag während des gesamten Kultivierungszeitraums fast ausschließlich in der ccc-Monomerform (ca. 94 %). Aus 5 L Kulturlösung konnten 250 mg DNA isoliert werden. Diese Produktausbeute ist deutlich höher als bisher mit synthetischen Medien im Satzverfahren erhalten wurden (siehe Beispiel 4).

Beispiel 2 : Herstellung des Plasmids pUT649 durch Bakterienzellen in einem definierten synthetischem Medium im Satzverfahren in einem 30 L- Bioreaktor Zur Herstellung des 4,6 kBp großen Plasmids pUT649 (Eurogentec, Liege, Belgien) im Grammmaßstab wurde das antibiotika-freie, definierte, synthetische Medium, welches in Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet. Als Inokulationskultur wurden 200 mL eines sterilen Mediums mit einer Glycerinkultur von pUT649 in E. coli DH5a beimpft. Nach 8 Stunden Inkubation auf einem Tischschüttler bei n = 150 min l und einer Temperatur von T = 37 °C wurden 20 L des sterilen Mediums, dessen Zusammensetzung in Beispiel 1 beschrieben ist, im 30 L Bioreaktor (MBR, Wetzikon, Schweiz) mit 200 mL der Inokulationskultur beimpft.

Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37 °C und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt.

Die Luftzufuhr erfolgte mit 30 L min'und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder Ammoniaklösung geregelt. Die Rührerfrequenz betrug zu Beginn der Kultivierung nO = 150 min l und wurde mit Hilfe der Gelöstsauerstoffkonzentration auf einen Sollwert von 40 % geregelt. In Abbildung 5 sind die typischen Kultivierungsparameter Rührerfrequenz, Gelöstsauerstofflonzentration und der Kohlendioxidgehalt der Reaktorabluft dargestellt. Nach Erreichen der stationären Wachstumsphase nach 22 Stunden Kultivierungszeit wurden X = 21,9 g L'1 Biotrockenmasse und eine sehr hohe Plasmidkonzentration von P = 68 mg L 1 erreicht. Dies entspricht einem Plasmidmassenanteil von wp = 3,1 mg g'. Die isolierte DNA wies eine sehr hohe Homogenität auf, was durch das Agarosegel in Abbildung 6 dargestellt ist. Die Qualitätsanalyse der DNA mittels Kapillargelelektrophorese zeigt, dass mehr als 97 % der DNA in der ccc-Monomerform vorliegen. Dieses Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf unterschiedliche Plasmide anwendbar ist und auch einfach in einen größeren

Prozessmaßstab übertragen werden kann. In einem KultivierungsmaBstab von 20 L können mit Hilfe der Erfindung 1,3 g sehr homogener Plasmid DNA gewonnen werden. Die erhaltene Produktkonzentration P = 68 mg L'ist die bislang höchste, die durch Satzkultivierungsverfahren auf synthetischen Medien erhalten wurde. Im Stand der Technik werden vergleichbar hohe Produktausbeuten nur mit Hilfe von Zulaufkultivierungsverfahren erhalten.

Beispiel 3 : Einfluss der Ammoniumkonzentration bei der Herstellung eines Plasmids durch Bakterienzellen in einem definierten, synthetischen Medium im Satzverfahren.

Im folgenden Beispiel wird der Einfluss der Konzentration der anorganischen Stickstoffquelle bei der Satzkultivierung von E. coli DH5a mit dem Plasmid pUK2ICMVß in dem gleichen synthetischen Medium aus Beispiel 1 und 2 im 7 L-Bioreaktor illustriert. Die Kultivierung wurde unter gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Lediglich die Ammoniumchloridkonzentration im Medium wurde vor der Kultivierung geändert.

Abbildung 8 zeigt den Verlauf der Kultivierung ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Nur durch die pH-Regulierung wurden geringe Mengen Ammonik dem Medium zugeführt. Die Biotrockenmassekonzentration erreichte nach 40 Stunden einen maximalen Wert von X = 17, 5 g L-t. Die Produktkonzentration erreichte bereits nach 30 Stunden einen maximalen Wert von P = 20 mg L, fiel aber im folgenden Verlauf der Kultivierung auf 15 mg L-'ab. Der Plasmidmassenanteil blieb nicht konstant, sondern stieg zunächst auf einen maximalen Wert von wp = 2,7 zmg g~'an und fiel nach 22 h Kultivierungszeit auf Werte unter wp = 1 mg g-1 stark ab. Abbildung 9 zeigt den Verbrauch von Ammoniumionen, Glycerin und Glutamat, sowie die Bildung von Acetat. Nach 22 Stunden Kultivierungsdauer konnte Ammoniumstickstoff im Medium nicht mehr nachgewiesen werden. Parallel dazu stieg die Konzentration von Acetat von 0, 3 g L l auf 1 gL-l an. Da zu diesem Zeitpunkt waren Glutamat und Glycerin noch ausreichend vorhanden, so dass Ammonium als limitierendes Substrat identifiziert wurde.

Deshalb wurde in einer weiteren Kultivierung die Ammoniummenge durch Einsatz von 4 g L- 'Ammoniumchlorid deutlich erhöht. Die Biotrockenmassekonzentration nach 34 h Kultivierungsdauer betrug X = 26,6 g L'1 (siehe Abbildung 10). Die Produktkonzentration stieg parallel zur Biotrockenmassekonzentration an und erreichte nach 30 Stunden einen

maximalen Wert von P = 41 mg L'1, was einem Plasmidmassenanteil von wp = 1,5 mg g~ entspricht. Gegenüber der Kultivierung mit 2 g L'1 Ammoniumchlorid (Beispiele 1 und 2) konnte keine weitere Erhöhung der Produktmenge erreicht werden, so dass bei diesen kein limitierender Einfluss vorlag.

Beispiel 4 : Herstellung des Plasmids pUK21CMVß durch Bakterienzellen in synthetischem M9-Minimalmedium im Satzverfahren in einem 7 1,- Bioreaktor Dieses Beispiel zeigt eine Satzkultivierung in einem synthetischen Medium, welches dem Stand der Technik entspricht. Dazu wurde wie in Beispiel 1 und 3 das Plasmid pUK21CMVß in E. coli DH5a wurde durch Kultivierung im literaturbeschriebenen, synthetischen M9- Minimalmedium (Sambrock et al., Molecular Cloning, CSH Press, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor New York), bestehend aus 11 g L'1 Glucose x H20, 1,0 g L-l Na2HPO4 x 7 H2O, 3,0 g L-KH2PO4, 0,5 g L-1 NaCl, 2,5 g L-' (NH4) 2S04, 1, 4 mg L-1 ZnS04 x 7 H20, 5,4 mg L-1 FeCl2 x 6 H2O, 1,6 mg L-1 MnSO4, 0,167 mg L'1 CuCl2, 0,56 g L'1 CoS04 x 7 H20, 0,22 g L-1 MgCl2 x 7 H20 und 14,7 mg L'1 CaCl2 im 7 L Bioreaktor produziert.

Zur Anfertigung einer Vorkultur wurden 200 mL steriles Medium mit einer Glycerinkultur beimpft und bei 37 °C für 8 Stunden unter Rühren auf einem Tischschüttler bei n = 150 min-, inkubiert. Mit 50 mL dieser Vorkultur wurden 5 L steriles M9-Medium in einem 7 L Bioreaktor inokuliert. Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37 °C und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt. Die Luftzufuhr erfolgte mit 5 L min'l und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder Ammoniaklösung geregelt.

Der Verlauf der Prozessparameter Biotrockenmassekonzentration, Plasmidkonzentration und Plasmidmassenanteil über die gesamte Kultivierungsdauer von 46 Stunden ist in Abbildung 11 dargestellt. Während einer Kultivierungszeit von 44 h wurde eine Biomasse von X = 3,55 g L'1 erhalten. Die Produktkonzentration auf P = 4,65 mg L'1 nach 44 Stunden beim Erreichen der stationären Phase an. Der Plasmidmassenanteil war mit wp = 1,3 mg il nach 44 Stunden deutlich geringer als mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in den Beispielen 1 und 2. In diesen Beispielen wurde eine fünffach höhere Biomassemenge und sogar eine zehnfach höhere Plasmidkonzentration erhalten.

Beispiel 5 : Erhöhung der Produktausbeute Zur Illustration der Erhöhung der Produktausbeute durch Zugabe von Glutamat wurde das Plasmid pUK21CMVß in E. coli DH5a in einem 7 L Bioreaktor in einem reichen halbsynthetischen Vollmedium, welches Glycerin, Sojapepton und Hefeextrakt enthielt, mit und ohne Glutamat hergestellt.

Zur Herstellung einer Inokulationskultur wurden 200 mL Medium mit einer Glycerinkultur beimpft und auf einem Tischschüttler bei n = 150 min-'und 37'C für 10 Stunden inkubiert.

Im 7 L Bioreaktor wurden 5 L des sterilen Mediums mit 50 mL der Inokulationskultur beimpft. Die Kultivierung wurde bei 37 °C und 0, 2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt. Die Luftzufuhr erfolgte mit 5 L min'* und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder Ammoniaklösung einreguliert.

Ohne Glutamat-Zusatz wurde am Ende der Kultivierung nach 20 Stunden eine Biotrockenmassekonzentration von X = 7,6 g L-'und eine Plasmidkonzentration von P = 26 mg L-l erhalten.

Durch Zugabe von 30 g L'1 Glutamat zu dem halbsynthetischen Vollmedium in einer weiteren Kultivierung konnte die Produktausbeute deutlich erhöht werden (siehe Abbildung 12). Nach 20 Stunden Kultivierungsdauer wurde eine maximale Biotrockenmassekonzentration von X = 23,9 g L'* erhalten und dabei die Produktkonzentration deutlich auf P = 45 mg 1. :' erhöht.

Dieses Beispiel zeigt, dass selbst bei der Kultivierung in halb-synthetischen Vollmedien die Produktmenge durch Glutamatzugabe noch deutlich gesteigert werden kann. Glutamat ist ein wichtiger Medienbestandteil bei der Produktion von Nukleinsäuren und deshalb ein wichtiger Bestandteil im erfindungsgemäßen Verfahren.