(1)シソからの粗色素の抽出
 赤シソの葉2600gをミキサーで粉砕し、0.5%TFA( トリフルオロ酢酸)含有50%MeOH 8.85Lに、4℃で� �晩浸漬した。次に、浸漬した葉を取り出し� �これを0.5%TFA含有50%MeOH 2.55Lを用いてハンド� �クリュー圧搾機で圧搾し、抽出液を回収し� �。圧搾後の残渣を、再度0.5%TFA含有50%MeOH 3L� �、4℃で一晩浸漬し、同様にして圧縮抽出処� ��を行った。得られた抽出液を先の抽出液と� ��合し(約15L程度)、エバポレーターと真空ポ� �プとを用いて、減圧下で濃縮乾固を行った(1 15.9g)。得られた乾固物49.58gを、1%HCl含有MeOH水 溶液で溶解し、濾過した後、溶液中の色素を イオン交換カラムクロマトグラフィー(商品� �Amberlite(登録商標)XAD-7、カラムφ25mm×450mm)に� �着させた。そして、糖やタンパク質等の極� �成分を除去するため、0.5%TFA水溶液1Lを流し� �後、さらに、0.5%TFA含有80%MeOH水溶液1.5Lを流� �て吸着した色素を溶出した。回収した溶出� �を、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮� �固し、さらに、微量水分と揮発性酸であるTF Aとを除去するため、真空ポンプを用いて乾� �した。これにより粗色素12.3gを得た。

 (2)ツユクサからのフラボコンメリンの単離
 (2-1)粗コンメリニンの単離
 ツユクサの青色花弁の凍結物4.4kgをハンド� �クリュー圧搾機で圧搾し、3.64Lの青色の搾汁 を得た。これに21Lのエタノールを加えて-20℃ で一晩放置し、色素画分を沈殿させた。これ を遠心分離に供し(商品名SCR20B、HITACHI社製、5 000ppm、10分間)、上清と沈殿とに分離し、沈殿 を回収した。この回収した沈殿を、減圧下、 塩化カルシウム上で乾燥した。これにより、 青色固形物として14.5gの粗コンメリニンを得� ��。なお、粗コンメリニンの吸収スペクトル� ��ータならびにその測定条件を以下に示す。

・UVスペクトル測定条件
   装置:日本分光社製。商品名V-520-SR型分光 光度計
   溶媒:0.05M酢酸緩衝液(pH5.6)
   セル長:1mm
・コンメリニン吸収スペクトルデータ
   UV-visλnm(ε):645(66000)、590(140200)

 (2-2)フラボコンメリンの単離精製
 前記(2-1)のエタノール沈殿後に分離した上� �を、エバポレーターと真空ポンプとを用い� �、減圧下で濃縮乾固した。これにより、フ� �ボコンメリンの多く含まれる紺色の油状物� �黄色の固形物とを得た。黄色の固形物をジ� �チルスルホキシドに溶解させ、その溶液をHP LC分析した結果、フラボンの1種「フラボコン メリン」であることが確認できた。この溶液 と、超純水で希釈した前記紺色の油状物とを 混合して濾過した後、溶液中のフラボコンメ リンをイオン交換カラムクロマトグラフィー (商品名Amberlite(登録商標)XAD-7、カラムφ25mm×45 0mm)に吸着させた。まず、前記カラムに、1%塩 酸水溶液0.72Lを流した。これにより、イオン� ��換樹脂に吸着したフラボコンメリンがツユ� ��サ由来アントシアニンと複合体を形成して� ��る場合でも、前記ツユクサ由来アントシア� ��ンをフラボコンメリンから解離させること� ��できる。続いて、前記カラムに、超純水7.5L 、20%MeOH水溶液6L、30%MeOH水溶液6L、40%MeOH水溶� �9L、60%MeOH水溶液3Lをこの順序で流して、吸着 したフラボコンメリンを溶出した。フラボコ ンメリンは、20%MeOH水溶液を2L流した時点から 溶出が確認された。そこで、この時点から40% MeOH水溶液を5L流した時点までをフラクション Iとして回収し、さらに、40%MeOH水溶液5L流し� �時点から60%MeOH水溶液を1L流した時点までを� �ラクションIIとして回収し、さらに、60%MeOH� �溶液を1L流した時点から60%MeOH水溶液を3L流し た時点までをフラクションIIIとして回収した 。フラクションIを減圧下で濃縮して、乾固� �6.98gを得た。フラクションIIおよびIIIからは� ��固物が得られなかった。前記フラクションI から得られた乾固物に超純水50mLおよびアセ� �ニトリル100mLを加え、加熱することによって 、フラボコンメリンを析出させた。析出した フラボコンメリンを減圧下で乾燥することに よって、5.28g(純度90%)のフラボコンメリンを� �た。なお、得られたフラボコンメリンの吸� �スペクトルデータならびにその測定条件を� �下に示す。コンメリニンは、前記非特許文� �2に示すように、可視部吸収スペクトルの長� ��長シフト、可視部の強い励起子型の負のコ� ��トン効果により判断できる。

・UVスペクトル測定条件
   装置:日本分光社製。商品名V-520-SR型分光 光度計
   溶媒:超純水
   セル長:1mm
・フラボコンメリン吸収スペクトルデータ
   UV-visλnm(ε):326(19800)、271(22260)

 (2-3)ツユクサ残渣からの粗色素およびフラ� �コンメリンの単離
 前記(2-1)で得られた圧搾後の残渣を、0.5%TFA� ��有50%MeOH 3Lに、4℃で1ヶ月浸漬した後、抽出 液と残渣とに分離した。この残渣を、再度、 0.5%TFA含有50%MeOH 3Lに浸漬し、同様にして抽出 を行い、抽出液を回収した。この抽出液をと 先の抽出液とを混合し、エバポレーターと真 空ポンプとを用いて、減圧下で濃縮乾固した (10.18g)。この乾固物10.18gを超純水で溶解し、� ��過した後、溶液中の色素画分およびフラボ� ��ンメリンをイオン交換カラムクロマトグラ� ��ィー(商品名Amberlite(登録商標)XAD-7、カラムφ 25mm×450mm)に吸着させた。そして、糖やタンパ ク質等の極性成分を除去するため、0.5%TFA水� �液4Lを流した後、さらに、10%MeOH水溶液2L、30% MeOH水溶液4L、40%MeOH水溶液2Lをこの順序で流し て、吸着したフラボコンメリンを溶出した。 フラボコンメリンは、30%MeOH水溶液を流した� �点から溶出が確認されたので、この時点か� �の溶出液を回収した。回収したフラクショ� �を減圧下で濃縮し、乾固物を得た。この乾� �物に超純水20mLおよびアセトニトリル150mLを� �え、加熱することにより、フラボコンメリ� �を析出させた。析出したフラボコンメリン� �減圧下で乾燥することによって、0.61gのフラ ボコンメリンを得た。続いて、フラボコンメ リンを溶出した後、前記イオン交換カラムに 、0.5%TFA含有80%MeOH水溶液1.5Lを流し、吸着した 色素画分を溶出させた。回収した溶出液を、 エバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固し 、さらに、微量水分と揮発性酸であるTFAとを 除くため、真空ポンプによって乾固した。こ れにより、ツユクサの粗色素0.82gを得た。

 (3)シソ由来アントシアニンとツユクサ由来� ��ラボコンメリンとの複合体形成
 前記(1)で調製したシソ由来の粗色素(乾固物 )3mgに超純水1mLを加え、0.5Nアンモニア水1mLで� ��和した後、減圧下で濃縮乾固した。なお、� ��和により、シソ由来粗色素に含まれるアン� ��シアニンは、アンヒドロベース型に変換さ� ��る。この乾固物に、超純水50μLと、前記(2-2) で調製したフラボコンメリン3mgを水50μLに溶� ��したフラボコンメリン溶液を加え、さらに� ��0.5M酢酸マグネシウム水溶液25μLを加えた。� ��の混合液は、混合によって瞬時に青色とな� ��た。この混合液を減圧下で濃縮し、混合液� ��の複合体をゲル濾過カラムクトマトグラフ� ��ー(商品名sephadexG-10、カラムφ10mm×150mm)に吸� ��させ、水で溶出することにより精製した。� ��して、濃い青色の溶出画分を、複合体含有� ��分として回収した。なお、シソ由来アント� ��アニンとツユクサ由来フラボコンメリンと� ��含む複合体の形成は、前述のコンメリニン� ��同様に、可視部吸収スペクトルの長波長シ� ��ト、可視部の強い励起子型の負のコットン� ��果により判断した。

 シソ由来アントシアニンとツユクサ由来� ��ラボコンメリンとの複合体の収率を確認し� ��。まず、複合体形成に使用した粗色素を1%TF A含有MeOHに溶解して、吸光度測定を行った。� ��方、形成した複合体には、前記粗色素と同� ��希釈倍率となるように1%TFA含有MeOHを添加し� ��。そして、この溶液を10分間超音波処理し� �、前記複合体からシソ由来アントシアニン� �解離した後、吸光度測定を行った。そして� �複合体の吸光度(C)を粗色素の吸光度(P)で割� �た値の百分率(100×C/P)を、複合体の収率(%)と� ��た。その結果、粗色素の吸光度(P)が0.514、� �合体の吸光度(C)が0.144であったことから、収 率(100×C/P)は、「約28.02%」となった。

・UVスペクトル測定条件
   装置:日本分光社製。商品名V-520-SR型分光 光度計
   溶媒:1%TFA含有MeOH
   セル長:1mm
   波長:529nm(粗色素)、529nm(複合体)

 以上のように、複合体の形成が確認され� ��ことから、夾雑物が含まれる粗色素を用い� ��も、アントシアニンとフラボコンメリンと� ��複合体を形成でき、アントシアニンを解離� ��ることによって、アントシアニンを精製で� ��ることがわかった。また、赤シソの葉には� ��少なくとも4種類のアントシアニンが含まれ ることが知られている。このように2種類以� �のアントシアニンが含まれる粗色素を使用� �ても、アントシアニンとフラボコンメリン� �の複合体を形成できることがわかった。こ� �結果から、本発明によれば、例えば、赤シ� �の葉を原料とする場合、複合体(金属錯体)を 形成するのみで、アントシアニンを精製する ことができる。

 なお、シソ由来アントシアニンとツユク� ��由来フラボコンメリンとの複合体は、ツユ� ��サ由来アントシアニンとツユクサ由来フラ� ��コンメリンとの複合体よりも、紫がかった� ��色を呈していた。前者の複合体が、後者の� ��合体に比べ、可視における極大吸収波長が� ��波長側にシフトしたためと考えられる。こ� ��は、シソ由来アントシアニンは、母核がシ� ��ニジンであるのに対し、ツユクサ由来フラ� ��コンメリンに元来含まれるツユクサ由来ア� ��トシアニンは、母核がデルフィニジンであ� ��ことに起因すると推測される。

 (4)複合体の構成成分の分析
 つぎに、フラボコンメリンが、各種アント� ��アニンと複合体を形成しているか否かを確� ��した。前述のように赤シソの葉には、少な� ��ともシソニン(S)、マロニルシソニン(MS)、(� �チルマロニル)シソニン(MMS)およびシアニン(C )が含まれている。そこで、どのような組成� �で各種アントシアニンとフラボコンメリン� �が複合体を形成しているのかを確認した。

 前記(3)で使用した粗色素と前記(3)で形成� ��た複合体とについて、下記条件によりHPLC分 析を行った。この結果を、図1および図2に示� ��。図1は、粗色素のHPLCクロマトグラム、図2� ��、複合体のHPLCクロマトグラムを示す。なお 、下記HPLC条件に示すように移動相AおよびBは 、酸性溶媒であることから、複合体をHPLCに� �することによって、前記複合体からアント� �アニンが解離する。したがって、図2のピー� ��は、直接的には、解離したアントシアニン� ��ピークであるが、間接的には、それぞれの� ��ントシアニンを含む複合体のピークである� ��つまり、図2のピークから、各アントシアニ ンを取り込んだ複合体の量や、各複合体の比 率等を求めることができる(以下、同様)。

 図1の上段に示すように、粗色素のクロマ トグラムでは、紫外部(280nm)において夾雑物(� ��えば、タンパク質や有機酸、アントシアニ� ��以外のフラボノイド類、高分子化したポリ� ��ェノール類等)のピークが見られるが、図2� �上段に示すように、複合体のクロマトグラ� �では、フラボコンメリンと微量の不純物の� �ークが検出されただけであった。このこと� �ら、粗色素に含まれるほとんどの夾雑物、� �に、従来問題となっていた、アントシアニ� �以外のフラボノイド類や高分子化したポリ� �ェノール類は、複合体形成には適さない物� �であって、複合体形成に使用されず、前述� �カラムクロマトグラフィーによって除去さ� �たことがわかる。

・HPLC分析条件
   送液ポンプ:JASCO社製、商品名PU-980×2
   検出器:JASCO社製、商品名MD2010Plusフォト� �イオードアレー検出器
   カラム:商品名Develosil ODS-HG-5 250mm×4.6mm
   移動相A: 酢酸:アセトニトリル:水:リン� �=2:2.5:94:1.5
   移動相B: 酢酸:アセトニトリル:水:リン� �=20:25:53.5:1.5
   サンプル注入量:10μL
   流速:1mL/min
   カラム温度:40℃

 そして、粗色素については、540nmクロマ� �グラムから、各アントシアニン(S、MS、MMSお� ��びC)のピーク面積の割合(%)を求め、これを� �色素における各アントシアニンの組成割合(% )とした。また、シアニン(S)のピーク面積の� �合(%)を1として、他のアントシアニンのピー� ��面積の比率をそれぞれ求めた。他方、前記( 3)で形成した複合体についても、540nmクロマ� �グラムから、複合体に含まれていた各アン� �シアニンのピーク面積の割合(%)を求め、こ� �を各アントシアニンが含まれている複合体� �組成割合(%)とした。また、複合体について� �、Sのピーク面積の割合(%)を1として、他のア ントシアニンのピーク面積の比率を求めた。 この結果を下記表に示す。なお、複合体の形 成は、3回行い、平均値ならびに標準偏差を� �めた。

 前記表3に示すように、粗色素には、主成 分としてS、MS、MMSおよびCのアントシアニン� �上記の比率で含まれていることが確認され� �。そして、複合体についても、S、MS,MMSおよ� ��Cのアントシアニンを含む複合体がそれぞれ 上記比率で形成されていることが確認された 。この結果から、前記粗色素のように複数の アントシアニンが存在する場合であっても、 アントシアニンとフラボコンメリンとの複合 体が形成できること、また、フラボコンメリ ンは、各種アントシアニンとの複合体を形成 できることがわかった。なお、この実施例で は、赤シソの葉からの抽出物からタンパク質 等の極性成分を除去するためにAmberliteで処理 を行っているが、この処理を行っていない粗 色素であっても、同様に複合体が形成され、 複合体の形成によってアントシアニンが精製 できることは確認済みである。

 前記実施例1に示すように、複数のアント シアニンが存在する場合であっても、各種ア ントシアニンとフラボコンメリンとの複合体 を形成できることがわかった。そこで、粗色 素中のアントシアニンの組成比を変化させる ことによって、複合体形成時における各種ア ントシアニンの選択性を確認した。

 (1)粗色素の調製
 (1-1)粗色素の酸加水分解
 前記実施例1で調製したシソ粗色素20.6gを1%HC l含有MeOH水溶液に溶解し、HPLCによって加水分 解反応を観察しながら、室温で2日間放置し� �前記粗色素に含まれるマロニルシソニンか� �マロン酸を除去して、シソニンに変換した� �この反応液を減圧下で濃縮乾固し、さらに� �微量水分と揮発性酸であるHClとを除くため� �真空ポンプにより乾固した。これにより、� �ソニンを主成分とした粗色素13.45gを得た。� �れを粗色素Aという。また、前記実施例で調� ��したシソ粗色素2.0gを3%HCl含有MeOH水溶液に溶 解し、HPLCによって加水分解反応を観察しな� �ら、室温で1日放置し、前記粗色素に含まれ� ��マロニルシソニンからマロン酸を除去して� ��シソニンに変換した。この反応液を減圧下� ��濃縮乾固し、さらに、微量水分と揮発性酸� ��あるHClとを除くため、真空ポンプにより乾� ��した。これにより、シソニンを主成分とし� ��粗色素1.7gを得た。これを粗色素Bという。

 (1-2)粗色素の配合調整
 前記酸加水分解処理で得られた前記粗色素A および前記粗色素Bと、前記実施例1で調製し� ��粗色素とを混合し、組成の異なる粗色素を� ��製した。前記組成比は、シソニン(S)とマロ� ��ルシソニン(MS)の比(物質量比S:MS)が、所定比 (1:0.25、1:0.4、1:0.49、1:2.42、1:3.71、1:4.31)とな� �ようにした。なお、組成比は、HPLC分析を行� ��、MSとSとのピーク面積比から確認した。

 (2)複合体の構成成分の分析
 前記実施例1の(3)と同様にして、複合体を形 成し、カラムクロマトグラフィーにより精製 を行った。そして、前記実施例1の(4)と同様� �して、複合体含有画分のHPLC分析を行い、各� ��成の粗色素ならびに複合体について、ピー� ��面積の割合(%)と、シアニン(S)のピーク面積� ��割合(%)を1としたピーク面積の比率とを求め た。さらに、各アントシアニンについて、複 合体形成前の粗色素のピーク面積比(B)と、複 合体形成後の複合体のピーク面積(A)との比(� �後比A/B)を求めた。前後比A/Bは、相対的に大� ��い程、そのアントシアニンが、選択的に複� ��体に取り込まれていることを意味する。な� ��、複合体の形成は、3回行い、平均値及び標 準偏差を求めた。これらの結果を下記表に示 す。

 前記表4~9に示すように、マロニルシソニ� ��(MS)の前後比(A/B)は、シソニン(S)の前後比(1)� ��りも大きい値を示した。例えば、表4(S:MS=1:0 .25)では、粗色素において、MSがSの0.25倍量で� ��るのに対して、複合体においては、MSがSの2 .08倍量にまで増加している。同様に、表5(S:MS =1:0.4)では、粗色素において、MSがSの0.4倍量� �あるのに対して、複合体においては、2.25倍� ��増加し、表6(S:MS=1:0.49)では、粗色素におい� �、MSがSの0.49倍量であるのに対して、複合体� ��おいては、2.20倍に増加した。このことから 、マロニルシソニンは、シソニンよりも、選 択的に複合体形成において取り込まれている ことがわかる。このような結果から、複合体 形成時、周囲に存在するアントシアニンが非 選択的に複合体に取り込まれるのではなく、 選択性をもって、アントシアニンが取り込ま れているといえる。さらに詳しく説明すると 、アントシアニンの構造により、複合体に取 り込まれる速度が異なり、MSとSとでは、MSの� ��が、選択的に取り込まれていることがわか� ��た。

 前記実施例2において、アントシアニンの 選択性が確認されたが、前記実施例2におい� �は、各種アントシアニンを含む粗色素とツ� �クサ由来フラボコンメリンとを等量(重量比1 :1)で使用している。アントシアニンまたはフ ラボコンメリンが過剰に存在した場合、アン トシアニンとフラボコンメリンとの衝突確率 が異なるため、選択性に影響がある可能性が 考えられる。そこで、アントシアニンまたは フラボコンメリンが過剰量存在する条件にお ける、アントシアニンの選択性を確認した。

 粗色素とフラボコンメリンの使用量を以� ��のように変更した以外は、前記実施例2と同 様にして、複合体の形成、ならびに、HPLC分� �による構成成分の分析を行った。アントシ� �ニンとフラボコンメリンが重量比1:1の等量� �件として、粗色素3mg、フラボコンメリン3mg� �使用した。フラボコンメリン過剰の条件と� �て、粗色素2mg、フラボコンメリン8mgを使用� �た。アントシアニン過剰の条件として、粗� �素8mg、フラボコンメリン2.7mgを使用した。な お、粗色素ならびにフラボコンメリンは、前 記実施例1と同じものを使用した。これらの� �果を下記表に示す。

 フラボコンメリン過剰の条件(表11)では、 マロニルシソニン(MS)とシアニン(C)の前後比� �、それぞれ1.07と1.12であった、この結果は、 等量条件(表10)におけるマロニルシソニン(MS)� ��シアニン(C)の前後比1.37および1.3と比較して 低い値であり、すなわち、複合体の形成前後 で、構成成分の変化が少ないことを示した。 フラボコンメリン過剰の条件では、等量条件 と比較すると、フラボコンメリンがアントシ アニンより過剰に存在するため、両者の衝突 確率が上がり、マロニルシソニン(MS)とシソ� �ン(C)の選択性の差が小さくなったと考えら� �る。一方、アントシアニン過剰の条件(表12)� ��は、マロニルシソニン(MS)とシアニン(C)の前 後比は、それぞれ1.29と1.25であった。この結� ��は、等量条件(表10)におけるマロニルシソニ ン(MS)とシアニン(C)の前後比1.37および1.3と同� ��の値であり、大きな差は見られなかった。� ��の条件は、アントシアニンがフラボコンメ� ��ンの3倍存在する条件であるが、等量条件と 同程度の結果であることから、アントシアニ ンの量は、アントシアニンの選択性には影響 を与えないことがわかった。

 粗色素に含まれる4種のアントシアニンを 分離し、任意の2成分間における複合体への� �り込みの選択性を確認した。

 (1)アントシアニンの単離
 中圧液体クロマトグラフィーによって、実� ��例1で調製した粗色素から、マロニルシソニ ン(MS)、シソニン(S)、シアニン(C)、(メチルマ� ��ニル)シソニン(MMS)をそれぞれ単離した。ま� ��、アントシアニンの分離を良くするために� ��予め、前記カラム内に、以下に示す100%原液 (移動相溶液)100mL、20%原液(100%原液を0.5%TFA水� �液で希釈、以下同様)100mLを、この順序で流� �2mL/minの条件下30分間以上流した。実施例1で� ��製した粗色素1gを20%原液に溶解し、前記ガ� �スカラムの先端に粗色素を吸着させた。そ� �て、そのまま20%原液を流し続け、前記ガラ� �カラムの2/3の所まで色素が移動した時点で� �30%原液(100%原液を0.5%TFA水溶液で希釈)に変え� ��。以後、30%原液を流しながら溶出液を分取� ��、目視確認により、色素濃度の高いフラク� ��ョン(200mL/フラクション)を回収した。引き� �き、溶媒を、60%原液、80%原液、100%原液の順� ��流し、同様にして溶出液の分取、ならびに� ��色素濃度の高いフラクションの回収を行っ� ��。その結果、40%原液で5フラクション、60%原 液で3フラクション、80%原液で1フラクション� ��計9フラクションを回収した。この操作を繰 り返し、合計7gの粗色素の分取を行った。
・MPLC条件
   送液ポンプ:日本分光社製、商品名PU-980
   カラム:商品名ODS Develosil 10~20μm ガラス カラム300×25mm i.d.
   移動相溶液:酢酸:アセトニトリル:水:ト� �フルオロ酢酸=20:2.5:54.5:0.5を100%原液とする。

 MPLC分取の結果、シアニン(Cy3,5-diglc)72mg、� ��ソニン(Cy3-pc・glc-5-glc)76mg、マロニルシソニ� ��(Cy3-pc・glc-5-Ma・glc)90mg、(メチルマロニル)シ ソニン(Cy3-pc・glc-5-Methoxy Ma・glc)44mgを得た。� ��お、マロニルシソニンの純度は20%、シソニ� ��の純度は65%であった。

・UVスペクトル測定条件
   装置:日本分光社製、商品名V-520-SR型分光 光度計
   溶媒:0.1%HCl含有MeOH
   セル長:1mm
・マロニルシソニン吸収スペクトルデータ
   UV-visλnm(ε):529(5640)、313.4(3200)、292.5(3580)
・シソニン吸収スペクトルデータ
   UV-visλnm(ε):527(13360)、313.4(9560)、292.5(10760)

 (2)アントシアニンの2成分の組合せ
 下記の組合せで、2成分の物質量が当量とな るように混合し、アントシアニン混合物1お� �び2を調製した。
 アントシアニン混合物1: MS/MMS
 アントシアニン混合物2: S/MMS

 (3)複合体の構成成分の分析
 粗色素に代えて、2種類のアントシアニン混 合物(1~2)を使用した以外は、前記実施例2と同 様にして、複合体の形成、ならびに、HPLC分� �による構成成分の分析を行った。これらの� �果を下記表に示す。

 前記表13に示すように、アントシアニン� �合物1(MS/MMS)を使用した系では、前後比が、MS 1.4倍、MMS0.76倍の結果であることから、MSの方 がMMSよりも選択性が高いといえる(MS>>MMS) 。前記表14に示すように、アントシアニン混� ��物2(S/MMS)を使用した系では、前後比が、S1.10 倍、MMS0.92倍の結果であることから、Sの方が� ��ずかにMMSよりも選択性が高いといえる(S>M MS)。

 以上の結果から、複合体形成におけるア� ��トシアニンの選択性については、SとMMS間で は顕著な差はなく、特にMSの選択性が高いこ� ��が示唆された(MS>>S≒MMS)。なお、マロニ ルシソニン(MS)とシソニン(S)では、その構造� �ら、マロニルシソニンの方が構造安定性に� �れると考えられる。したがって、本実施例� �結果によれば、複合体形成において、複合� �の安定性とアントシアニンの選択性とに相� �関係があると推測される。

 自然界におけるツユクサ由来コンメリニ� ��は、アントシアニン(マロニルアオバリン)� �フラボン(フラボコンメリン)およびマグネシ ウム(マグネシウムイオン)が6:6:2の比率で構� �される金属錯体である。そこで、複合体の� �成において、アントシアニンに対するマグ� �シウムの量を変化させ、これがアントシア� �ンの選択性に与える影響を確認した。

 前記実施例4で単離したマロニルシソニン(MS )とシソニン(S)とを用いて、下記に示すよう� �アントシアニン混合物を調製した。なお、MS とSとは、100%の精製物ではないため、両者の� ��率を物質量比で表す。
・アントシアニン混合物
   組成 MS:S=0.4:1(物質量比)
      MS=1mg
      S=1mg

 そして、粗色素に代えて、前記アントシ� ��ニン混合物を使用し、アントシアニン混合� ��とフラボコンメリンの添加量(3mg:3mg)を下記� ��に変更し、さらに、酢酸マグネシウム水溶� ��の添加量を下記所定量に変更した以外は、� ��記実施例1と同様にして、複合体の形成を行 った。

・アントシアニン混合物の物質量
   1.1μmol(S=1mg、MS=1mg)
・フラボコンメリンの物質量
   1.1μmol(1.5mg)
・0.5酢酸マグネシウム水溶液の添加量
 0.72μL(0.36μmol)、
    5μL(2.5μmol)
   25μL(12.5μmol)
  100μL(50μmol)
  125μL(62.5μmol)

 そして、アントシアニン混合物と、形成� ��た複合体について、それぞれ前記実施例1と 同様にして吸光度測定を行い、収率(100×C/P)� �求めた。さらに、実施例2と同様にして、複� ��体のHPLC分析を行った。この結果を下記表に 示す。

*1 アントシアニン混合物の物質量を1とした� ��合のMg ²⁺ の物質量比
*2 アントシアニン混合物におけるシソニン� �ピーク面積(%)を1として、アントシアニン混� ��物におけるMS、ならびに、各複合体のMSのピ ーク面積の比率を、ピーク面積比として求め た。
*3 MSについて、複合体形成前のアントシアニ ン混合物におけるMSピーク面積比(B)と、複合� ��形成後の複合体(MS)のピーク面積(A)との比を 、前後比(A/B)として求めた。

 また、混合アントシアニンに対するMg ²⁺ のモル比(物質量比)と、マロニルシソニンの� ��後比とをプロットしたグラフを図3に示す。

 前記表および図3に示すように、マグネシ ウムがアントシアニン(アントシアニン混合� �)の1/3当量(対アントシアニン物質量比0.33)の� ��件では、MSが複合体形成前後で3.18倍(前後比 A/B)に増加した。そして、アントシアニンに� �するマグネシウムの量が増加するにしたが� �て、複合体形成前後におけるMSの比率(A/B)は� ��少していき、具体的には、マグネシウムが� ��ンパク質の56.82当量(対アントシアニン物質� ��比56.82)の条件で、MSが複合体形成前後で1.43� ��にまで減少した。この結果から、アントシ� ��ニンに対するマグネシウムの物質量が少な� ��程、MSが取り込まれた複合体の増加率が高� �なり、アントシアニンに対するマグネシウ� �の物質量が多い程、前記増加率は低くなる� �とがわかった。したがって、複合体形成に� �いてマグネシウム量を調整すれば、例えば� �シソニンとマロニルシソニンの組成をコン� �ロールすることが可能となるため、アント� �アニンの精製において、複合体に含まれる� �ソアントシアニンを選択的に抽出できると� �うさらなる効果が得られる。特に、マロニ� �基は酸に不安定であることから、マロニル� �ソニンよりもシソニンを選択的に単離する� �に有用である。

 複合体の形成において、アントシアニン� ��対するフラボコンメリンの量を変化させ、� ��れがアントシアニンの選択性に与える影響� ��確認した。なお、マグネシウムイオンは過� ��量とした。

 以下に示す条件に変更した以外は、前記実� ��例1と同様には、以下と同様にして、複合体 の形成を行った。

 そして、アントシアニン混合物と、形成� ��た複合体について、それぞれ前記実施例1と 同様にして吸光度測定を行い、収率(100×C/P)� �求めた。さらに、実施例2と同様にして、複� ��体のHPLC分析を行った。この結果を下記表17� ��よび18に示す。表17は、前記条件1の複合体� �結果であり、表18は、前記条件2の複合体の� �果である。

*1 アントシアニン混合物の物質量を1とした� ��合のフラボコンメリンの物質量比
*2 アントシアニン混合物におけるシソニン� �ピーク面積(%)を1として、アントシアニン混� ��物におけるMS、ならびに、各複合体のMSのピ ーク面積の比率を、ピーク面積比として求め た。
*3 MSについて、複合体形成前のアントシアニ ン混合物におけるMSピーク面積比(B)と、複合� ��形成後の複合体(MS)のピーク面積(A)との比を 、前後比(A/B)として求めた。
*4 フラボコンメリン
 

*1 アントシアニン混合物の物質量を1とした� ��合のフラボコンメリンの物質量比
*2 アントシアニン混合物におけるシソニン� �ピーク面積(%)を1として、アントシアニン混� ��物におけるMS、ならびに、各複合体のMSのピ ーク面積の比率を、ピーク面積比として求め た。
*3 MSについて、複合体形成前のアントシアニ ン混合物におけるMSピーク面積比(B)と、複合� ��形成後の複合体(MS)のピーク面積(A)との比を 、前後比(A/B)として求めた。
*4 フラボコンメリン

 前記表17に示すように、アントシアニン� �合物(MS:S=0.40:1)を使用して、フラボコンメリ� ��量を変化させた場合、フラボコンメリン量� ��かかわらず、MSの複合体形成前後の増加率(A /B)は、1.5前後であった。また、前記表18に示� ��ように、アントシアニン混合物(MS:S=5.44:1)を 使用して、フラボコンメリン量を変化させた 場合、フラボコンメリン量にかかわらず、MS� ��複合体形成前後の増加率(A/B)は約1倍と、組� ��の変化はほとんど見られなかった。これら� ��結果から、マグネシウム過剰の条件下にお� ��ては、フラボコンメリンの量は、アントシ� ��ニンの選択性に特に影響を与えていないこ� ��がわかった。

 なお、本実施例では、アントシアニン混� ��物に対してマグネシウムを45当量使用する� �グネシウム過剰条件であり、フラボコンメ� �ンもアントシアニンに対して1当量から10当� �の過剰量を使用した。このため、理論上、� �てのアントシアニンが複合体形成に使用可� �な条件といえる。しかしながら、条件1(MS:S=0 .40:1)では、全てのアントシアニンが取り込ま れることはなく、前述のように、複合体形成 後、MSの組成比は1.5倍前後増加している。一� ��、条件2(MS:S=5.44:1)では、アントシアニン混� �物と複合体とでMSの組成比はほとんど変化し ていない。また、条件1(MS:S=0.40:1)では、複合� ��の最大収率が57.01%であるのに対して、条件2 (MS:S=5.44:1)では、複合体の最大収率が43.28%で� �り、前記条件1と比較して約14%低下している� ��以上の点から、複合体形成においては、条� ��1のようにMSの組成比が低い粗色素原料(アン トシアニン混合物)であっても、選択性の高� �MSがSよりも先に取り込まれるため、複合体� �成後のMSの比は増加し、反対に、複合体の収 率は低下すると考えられる。

 実施例1~6ではフラボコンメリンを用いた� ��、以下では、他のフラボンを用いて複合体� ��形成を確認した。

 まず、シソ粗色素のTFA塩を準備した。シ� ��粗色素のTFA塩は、実施例1(1)の方法で抽出し た赤シソ葉の色素抽出液を乾固したものであ り、カラムクロマトグラフィーによる精製は 行っていない。一方、フラボンとして、apigen in 7-glucoside(フナコシ社製)を使用した。

 次に、前記シソ粗色素TFA塩約9mgを超純水1 50μLに溶解させ、この溶液に0.5Mアンモニア水 溶液を1mL加え、直ちに減圧下濃縮乾固させた 。ここへ、測り取った前記apigenin 7-glucoside 1 0μmolを、固体のまま加えた。さらに、0.5M酢� �マグネシウムを含む50%エタノール水溶液600μ L(300μmol)を加えた。これを適宜超音波で溶解� ��せ、濃縮乾固し、分析時まで冷凍保存した� ��次に、冷凍保存しておいたサンプルを最小� ��の超純水に溶解させ、sephadexG-10(商品名)ゲ� �濾過カラムクロマトグラフィー(0.8~1.0cm×10.5~ 11.5cm)に吸着させ、超純水を流した。そして� �sephadexG-10で最も早く溶出し、最も色素濃度� �高い2つのフラクションを分取した。その結� ��、Shephadexにて溶出時間が早いフラクション� ��、色素とapigenin 7-glucosideとが溶出するフラ� ��ションがあった。これは、エタノールを加� ��ることにより、色素とこのフラボンとが共� ��殿したことを示す。すなわち、apigenin 7-gluc osideによりシソ由来アントシアニンを精製で� ��ることが確認された。

 さらに、apigenin 7-glucosideに代えて、フラ� ��コンメリン、柑橘由来のフラボンであるhesp eridin、diosmin、柑橘由来のフラボンであるnarin genin 7-glucoside、そば由来のフラボンであるrut in、apigenin、apigenin 7-o-neohesperidoside、silymarin� �オリーブ由来のフラボンであるluteolin 7-gluco side(全てフナコシ社製)をそれぞれ用いる以外 は、実施例7と同様の操作を行った。この結� �、各フラボンとシソ由来アントシアニンと� �共沈殿が確認された。