MICROALGUES

La présente invention se rapporte à un procédé d'enrichissement en protéines de la biomasse de microalgues, plus particulièrement du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella sorokiniana ou Chlorella protothecoides. La présente invention se rapporte également à un procédé d'enrichissement en protéines de la biomasse de certaines microalgues, plus particulièrement de Chlorella protothecoides, protéines dont la teneur en arginine et glutamine est remarquablement élevée.

Les algues, macro et micro, ont une richesse spécifique en grande partie inexplorée. Leur exploitation à des fins alimentaire, chimique ou bioénergétique est encore très marginale. Elles recèlent cependant des composants de grande valeur, en richesse comme en abondance.

Les microalgues sont en effet des sources de vitamines, lipides, protéines, sucres, pigments et antioxydants.

Les algues et microalgues intéressent ainsi le secteur industriel qui les utilise pour la fabrication de compléments alimentaires, d'aliments fonctionnels, de cosmétiques, de médicaments ou pour l'aquaculture.

Les microalgues sont avant tout des microorganismes photosynthétiques qui colonisent tous les biotopes exposés à la lumière.

A l'échelle industrielle, leur culture monoclonale est réalisée dans des photobioréacteurs (conditions autotrophiques : à la lumière avec du C0 ₂ ) ou pour certaines d'entre elles, également dans des fermenteurs (conditions hétérotrophiques : à l'obscurité en présence d'une source carbonée).

Quelques espèces de microalgues sont en effet capables de pousser en absence de lumière : Chlorella, Nitzschia, Cyclotella, Tetraselmis, Crypthecodinium, Schizochytrium.

Il est d'ailleurs estimé que la culture en conditions hétérotrophiques coûte 10 fois moins chère qu'en conditions phototrophiques car, pour l'Homme du métier, ces conditions hétérotrophiques autorisent :

- l'utilisation de fermenteurs identiques à ceux utilisés pour les bactéries et les levures et permettent le contrôle de tous les paramètres de culture.

- la production de biomasses en quantité bien plus élevée que ce qui est obtenu par culture basée sur la lumière.

L'exploitation rentable des microalgues nécessite généralement la maîtrise des conditions de fermentation permettant d'accumuler ses composants d'intérêt, tels que : - les pigments (chlorophylle a, b et c, β-carotène, astaxanthine, lutéine, phycocyanine, xanthophylles, phycoérythrine...) dont la demande est croissante, tant pour leurs remarquables propriétés antioxydantes, que pour leur apport de couleurs naturelles dans l'alimentation,

- les lipides, ceci afin d'optimiser leur contenu en acides gras (jusqu'à 60 %, voir

80 % en poids de leur matière sèche) notamment pour :

• les applications biocarburants, mais aussi

• les applications en Alimentation humaine ou animale, lorsque les microalgues sélectionnées produisent des acides gras polyinsaturés ou PUFAs dits "essentiels" (i.e. apportés par l'alimentation car ne sont pas naturellement produits par l'homme ou l'animal), ou

- les protéines, ceci afin d'en optimiser les qualités nutritives ou par exemple de favoriser l'apport en acides aminés d'intérêt.

Dans le cadre de l'apport en acides aminés d'intérêt, il peut être en effet avantageux de disposer de sources de protéines riches en arginine et en glutamate

L'arginine est un acide aminé qui présente de nombreuses fonctions dans le règne animal.

L'arginine peut être dégradée et ainsi servir de source d'énergie, de carbone et d'azote à la cellule qui l'assimile.

Chez divers animaux, dont les mammifères, l'arginine est décomposée en ornithine et en urée. Cette dernière est une molécule azotée qui peut être éliminée (par excrétion dans les urines) de manière à réguler la quantité de composés azotés présente dans les cellules des organismes animaux.

L'arginine permet la synthèse du monoxyde d'azote (NO) par la NO synthétase, intervenant ainsi dans la vasodilatation des artères, ce qui réduit la rigidité des vaisseaux sanguins, augmente le flux sanguin et améliore ainsi le fonctionnement des vaisseaux sanguins.

Les compléments alimentaires qui contiennent l'arginine sont recommandés pour promouvoir la santé du cœur, la fonction vasculaire, pour prévenir « l'agrégation des plaquettes » (risque de formation de caillots sanguins) et pour abaisser la pression artérielle.

L'implication de l'arginine dans la cicatrisation des plaies est liée à son rôle dans la formation de la proline, un autre acide aminé important pour la synthèse de collagène.

L'arginine est enfin un composant fréquemment utilisé, notamment par les sportifs, dans les boissons énergisantes.

L'acide glutamique quant à lui n'est pas seulement l'une des briques élémentaires utilisées pour la synthèse des protéines, mais est aussi le neurotransmetteur excitateur le plus répandu dans le système nerveux central (encéphale + moelle épinière) et est un précurseur du GABA dans les neurones GABAergiques.

Sous le code de « E620 », le glutamate est utilisé comme exhausteur de goût des aliments. Il est additionné aux préparations alimentaires pour renforcer leur goût.

Outre le glutamate, le Codex Alimentarius a reconnu aussi comme exhausteurs de goût ses sels de sodium (E621 ), de potassium (E622), calcium (E623), ammonium (E624) et magnésium (E625).

Le glutamate (ou ses sels) est souvent présent dans les plats tout prêts (soupes, sauces, chips, plats cuisinés). Il est aussi couramment utilisé en cuisine asiatique.

II est actuellement fréquemment utilisé en combinaison avec des arômes dans les apéritifs (goût bacon, goût fromage). Cela permet de rehausser le goût de bacon, du fromage, etc. Il est rare de trouver un apéritif qui n'en contienne pas.

On en trouve aussi dans certaines capsules de médicaments mais pas pour ses fonctions gustatives.

Enfin, il est le composant majoritaire des auxiliaires de cuisine (bouillons cubes, fonds de sauces, sauces, etc.).

Pour parvenir à exploiter les richesses métaboliques des microalgues, de premiers procédés de fermentation permettant d'obtenir de hautes densités cellulaires (acronyme anglais : HCD pour High-Cell-Density) ont été ainsi beaucoup travaillés, de manière à obtenir des rendements et productivités maximales en protéines ou en lipides.

L'objectif de ces cultures HCD était l'obtention de la concentration la plus élevée possible du produit souhaité dans le laps de temps le plus court.

Ce précepte se vérifie par exemple pour la biosynthèse d'astaxanthine par Chlorella zofingiensis, où la croissance de la microalgue s'est avérée corrélée directement avec la production de ce composé (Wang and Peng, 2008, World J Microbiol. Biotechnol., 24(9), 1915-1922).

Cependant, le fait de maintenir la croissance à son taux maximal (μ, en h ¹ ) n'est pas toujours corrélé avec la production élevée du produit souhaité.

II est en effet vite apparu aux spécialistes du domaine qu'il faut par exemple soumettre les microalgues à un stress nutritionnel qui limite leur croissance lorsqu'on souhaite leur faire produire d'importantes réserves lipidiques.

Il est donc procédé désormais au découplage croissance / production dans les procédés fermentaires.

Par exemple, pour favoriser l'accumulation d'acides gras polyinsaturés (ici l'acide docosahexaénoïque ou DHA), la demande de brevet WO 01/54510 recommande de dissocier la croissance cellulaire et la production d'acides gras polyinsaturés. Il y est plus particulièrement revendiqué un procédé pour la production de lipides microbiens, comprenant les étapes consistant à :

(a) effectuer une fermentation d'un milieu comprenant des microorganismes, une source de carbone et une source nutritive limitante et assurant des conditions suffisantes pour maintenir un taux d'oxygène dissous d'au moins environ 4 % de la saturation dans ledit milieu de fermentation pour augmenter la biomasse ;

(b) puis fournir des conditions suffisantes pour maintenir un taux d'oxygène dissous approximativement égal ou inférieur à 1 % de la saturation dans ledit milieu de fermentation et fournir des conditions suffisantes pour permettre auxdits microorganismes de produire lesdits lipides ;

(c) et recueillir lesdits lipides microbiens, dans lequel au moins environ 15 % desdits lipides microbiens sont constitués de lipides polyinsaturés ;

et dans lequel une densité de biomasse d'au moins environ 100 g/l est obtenue au cours de la fermentation.

Chez la microalgue Schizochytrium sp souche ATCC 20888, il est ainsi plus particulièrement procédé à une première phase de croissance en présence d'une source carbonée et d'une source azotée mais sans limitation en oxygène, de manière à favoriser l'obtention d'une haute densité cellulaire puis, dans une deuxième phase, arrêter la fourniture d'azote et ralentir progressivement l'apport en oxygène (gestion de la pression en oxygène dissous ou p0 ₂ de 10 %, à 4 %, puis 0,5 %), afin de stresser la microalgue, ralentir sa croissance et enclencher la production des acides gras d'intérêt.

Chez la microalgue Crypthecodinium cohnii, la teneur la plus élevée en acide docosahexaénoïque (DHA, acide gras polyinsaturé) est obtenue à faible concentration en glucose (de l'ordre de 5 g/l), et ainsi à faible taux de croissance (Jiang and Chen, 2000, Process Biochem., 35(10), 1205-1209).

Ces résultats illustrent bien le fait que les cinétiques de formation des produits peuvent aussi bien être associées de façon positive que de façon négative avec la croissance des microalgues, voire même avec une combinaison des deux. De ce fait, dans les cas où la formation des produits n'est pas corrélée avec une croissance cellulaire élevée, il est judicieux de maîtriser le taux de croissance cellulaire.

En général, l'homme du métier choisit de contrôler la croissance des microalgues par la maîtrise des conditions de fermentation (Tp, pH...), ou par l'alimentation régulée en composants nutritionnels du milieu de fermentation (conditions semi continues dites « fed- batch »).

S'il choisit de contrôler la croissance des microalgues en hétérotrophie par l'apport en sources carbonées, l'homme du métier choisit généralement d'adapter la source carbonée (glucose pur, acétate, éthanol...) à la microalgue (C. cohnii, Euglena gracilis...) en fonction du métabolite produit (par exemple un acide gras polyinsaturé de type DHA).

La température peut-être également un paramètre clef :

- il a par exemple était rapporté que la synthèse d'acides gras polyinsaturés chez certaines espèces de microalgues, tel que ΙΈΡΑ par Chlorella minutissima, est favorisée à une plus basse température que celle requise pour la croissance optimale de ladite microalgue;

- au contraire le rendement en lutéine est plus élevé chez Chlorella protothecoides cultivée en hétérotrophie, lorsque l'on augmente la température de production de 24 à 35°C.

Chlorella protothecoides est justement reconnue comme une des meilleures microalgues productrices d'huile.

En conditions hétérotrophiques, elle transforme rapidement les hydrates de carbone en triglycérides (plus de 50 % de sa matière sèche).

Pour optimiser cette production en triglycérides, l'homme du métier est amené à optimiser le flux carboné vers la production d'huile, en agissant sur l'environnement nutritionnel du milieu de fermentation.

Il est ainsi connu que l'accumulation en huile se produit lors d'un apport carboné suffisant, mais dans des conditions de carence en azote.

Le rapport C/N est donc ici déterminant, et il est admis que les meilleurs résultats sont obtenus en agissant directement sur la teneur en azote, la teneur en glucose n'étant pas limitante.

De manière non surprenante, cette carence en azote affecte la croissance cellulaire, ce qui résulte en un taux de croissance de 30 % plus faible que le taux de croissance normal de la microalgue (Xiong et al., Plant Physiology, 2010, 154, pp1001 - 101 1 ).

Pour expliquer ce résultat, Xiong et al, dans l'article cité supra, démontrent en effet que si l'on divise la biomasse de Chlorella en ses 5 composants principaux, i.e. hydrates de carbone, lipides, protéines, ADN et ARN (représentant 85 % de sa matière sèche), si le rapport C/N n'a aucun impact sur la teneur en ADN, ARN et hydrates de carbone, il devient prééminent pour le contenu en protéines et en lipides.

C'est ainsi que les cellules de Chlorelles cultivées avec un rapport C/N faible contiennent 25,8 % de protéines et 25,23 % en lipides, tandis qu'un rapport C/N élevé permet la synthèse de 53,8 % de lipides et 10,5 % de protéines.

Pour optimiser sa production en huile, il est donc primordial pour l'homme du métier de contrôler le flux carboné en le déviant vers la production d'huile, au détriment de la production des protéines ; le flux carboné est redistribué et s'accumule en substances de réserve lipidiques quand les microalgues sont placées en milieu carencé en azote.

Fort de cet enseignement, pour la production de biomasses riches en protéines, l'homme du métier est donc amené à prendre l'opposé de ce contrôle métabolique, i.e. travailler les conditions de fermentation en favorisant plutôt un rapport C/N faible, et ainsi :

réaliser un apport important en source d'azote au milieu de fermentation, tout en maintenant constant la charge en source carbonée qui sera convertie en protéines et

- stimuler la croissance de la microalgue.

Il s'agit de modifier le flux carboné vers la production de protéines (et donc de biomasses), au détriment de la production des lipides de réserve.

Dans le cadre de l'invention, la société Demanderesse a au contraire choisi d'explorer une voie originale en proposant une solution alternative à celle classiquement envisagée par l'homme du métier.

L'invention porte ainsi sur un procédé d'enrichissement en protéines d'une microalgue cultivée en hétérotrophie, microalgue du genre Chlorella, plus particulièrement encore Chlorella sorokiniana ou Chlorella protothecoides, procédé de culture hétérotrophique qui comporte une étape visant à limiter la croissance de ladite microalgue par une carence du milieu de fermentation en une source nutritionnelle non azotée.

Cette étape est une étape de culture hétérotrophique où un facteur nutritif non- azoté est apporté en quantité insuffisante dans le milieu pour permettre la croissance de la microalgue.

Au sens de l'invention, « l'enrichissement » s'entend d'une augmentation de la teneur en protéines de la biomasse d'au moins 15 %, de préférence d'au moins 20 % en poids, de manière à atteindre une teneur en protéines de la biomasse de plus de 50 %, 60%, 65% ou 70% en poids.

L'invention couvre plus précisément un procédé de culture hétérotrophique desdites microalgues comportant une étape visant à limiter la croissance de ladite microalgue par une carence du milieu de fermentation en une source nutritionnelle non azotée. Optionnellement, la température de fermentation peut également être modifiée de façon à ralentir la croissance de la microalgue. La température de fermentation peut notamment être augmentée de 1 , 2, 3, 4 ou 5 degrés par rapport à la température optimale de fermentation qui est habituellement d'environ 28 °C. De préférence, la température de fermentation en augmentée d'environ 3 °C, par exemple en passant de 28°C à 31 °C. Tel qu'utilisé ici, le terme « environ » se réfère à une valeur +/- 20%, 10%, 5% ou 2%. Ainsi la présente invention est relative à un procédé d'enrichissement en protéines d'une microalgue cultivée en hétérotrophie, microalgue du genre Chlorella, plus particulièrement encore Chlorella sorokiniana ou Chlorella protothecoides, le procédé comprenant la culture hétérotrophique qui comporte une étape visant à limiter la croissance de ladite microalgue par une carence du milieu de fermentation en une source nutritionnelle non azotée, permettant ainsi d'atteindre une teneur en protéines de la biomasse de plus de 50, 60 ou 70 % en poids.

Par « carence du milieu de fermentation en une source nutritionnelle non azotée » on entend une culture dans laquelle au moins un des facteurs nutritifs non-azoté est apportée à la microalgue en quantité insuffisante pour permettre sa croissance. Cette carence se traduit par un taux de croissance de la microalgue inférieur à celui de ladite microalgue en absence de limitation nutritionnelle.

Cela se traduit par une absence de facteur nutritif résiduel non-azoté dans le milieu de culture, la microalgue consommant ce facteur nutritif au fur et à mesure de son apport.

Au sens de l'invention, le critère essentiel est donc bien la limitation de la croissance cellulaire induite par un stress, stress cellulaire provoquée par la carence d'une substance nutritive non azotée du milieu de fermentation.

Cette stratégie va donc bien à rencontre du préjugé technique selon lequel pour augmenter la teneur en protéines de la biomasse, il faut immanquablement augmenter cette biomasse et donc la croissance cellulaire.

On entend par "une source nutritionnelle non azotée", une substance nutritive choisie par exemple dans le groupe constituée du glucose et des phosphates.

Comme il sera exemplifié ci-après, on peut choisir avantageusement de limiter la croissance de :

- Chlorella sorokiniana par une carence en glucose du milieu de fermentation,

- Chlorella protothecoides par une carence en phosphates du milieu de fermentation.

De manière optionnelle, la limitation de la croissance de ladite microalgue peut être obtenue par l'ajout dans le milieu de culture de substances inhibitrices de la croissance cellulaire, comme les sulfates.

Le ralentissement de la croissance de ladite microalgue peut également être suscité en modifiant la température de fermentation, par exemple en l'augmentant de 1 à 5°C environ, de préférence d'environ 3°C, par rapport à la température optimale de fermentation. Cette température optimale de fermentation est habituellement d'environ Par ailleurs, sans être liée par une quelconque théorie, la société Demanderesse a trouvé que le flux de glucose est normalement utilisé chez les microalgues du genre Chlorella sorokiniana selon un ordre de priorité bien précis :

1 . le métabolisme basai,

2. la croissance, i.e. formation d'une biomasse riche en protéines,

3. les substances de réserve (lipides et hydrates de carbone tel l'amidon).

Ce principe permet d'expliquer les variations naturelles de teneur en protéines au cours de la croissance de la microalgue, malgré l'apport constant en azote.

La société Demanderesse a ainsi trouvé que, pour enrichir la biomasse de microalgues en protéines, il faut limiter la croissance de la microalgue et contrôler sa consommation en source nutritive autre que l'azote, par exemple en glucose de manière à :

- dédier la consommation en glucose toute entière aux voies de production de protéines,

- éviter l'accumulation de substance de réserve comme les lipides.

En effet, éviter une carence en azote permet d'empêcher la déviation des flux métaboliques vers la production de lipides.

De manière optionnelle, il peut être avantageux d'aller jusqu'à bloquer complètement toute synthèse de matériel de réserve, en agissant par l'intermédiaire d'inhibiteurs spécifiques.

Il est connu en effet un certain nombre d'inhibiteurs des voies de synthèse des lipides voire même de l'amidon (hydrate de carbone de réserve par excellence des microalgues vertes) :

- pour les lipides, la cérulénine est décrite comme inhibiteur de la synthèse des acides gras, ou la lipstatine, substance naturelle produite par Stœpîomyces toxyiricini, comme inhibiteur des lipases...

- pour l'amidon, les iminosucres (obtenu par simple substitution de l'atome d'oxygène endocyclique des sucres par un atome d'azote) sont historiquement connus en tant qu'inhibiteurs puissants des glycosidases, des glycosyltransférases, des glycogènes phosphorylases, ou de l'UDP-Galp mutase.

Ainsi, le procédé comprend la fermentation d'une biomasse de microalgues en conditions hétérotrophiques avec une première étape de croissance de la biomasse et avec une deuxième étape de carence du milieu de fermentation en une source nutritionnelle non azotée. Cette deuxième étape permet d'enrichir la biomasse en protéine. En particulier, elle permet d'atteindre une teneur en protéines de la biomasse de plus de 50, 60, 65 ou 70 % en poids (en poids de matière sèche). Dans un premier mode préféré de réalisation conforme à l'invention, le procédé de culture hétérotrophique desdites microalgues, notamment Chlorella sorokiniana, comprend:

o une première étape de croissance des microalgues, où la quantité de glucose dans le milieu (en mode discontinu) ou le débit d'apport en glucose (en mode continu ou semi-continu) est ajusté à leur capacité de consommation, de façon à obtenir rapidement une biomasse importante,

o une deuxième étape de production de protéines par les microalgues, où le débit d'apport en glucose est fixé à une valeur nettement en dessous de leur capacité de consommation du glucose, de façon à empêcher l'accumulation supplémentaire de substances de réserve, voire favoriser leur consommation.

Comme il sera exemplifié ci-après, la première étape de croissance des microalgues peut être réalisée en mode discontinu ou "batch", dans lequel le glucose apporté initialement est entièrement consommé par la microalgue, conduisant à la production d'une biomasse de base.

La deuxième étape de production de protéines est conduite dans des conditions où on réalise :

a) soit un apport de milieu complet en mode semi-continu, dit « fed-batch », après la consommation du glucose apporté initialement ; les autres paramètres de conduite de la fermentation sont inchangés. Dans ce cas, le glucose est apporté en continu et la vitesse d'apport est alors inférieure à la vitesse de consommation que la souche pourrait réaliser de sorte que la teneur résiduelle en glucose dans le milieu est maintenue nulle. La croissance de la souche est alors limitée par la disponibilité en glucose (condition glucose-limitant).

b) un fonctionnement en continu de type chemostat, dans lequel le taux de croissance de la souche (μ) est maintenu à sa valeur minimale, la croissance de la souche étant limitée par l'apport en glucose. Ce mode de fonctionnement permet d'obtenir une biomasse à forte teneur en protéines grâce à la limitation en glucose et au faible taux de croissance imposé tout en assurant une très bonne productivité. Dans un deuxième mode préféré de réalisation conforme à l'invention, le procédé de culture hétérotrophique desdites microalgues, notamment Chlorella protothecoides, comprend une étape de croissance des microalgues dans laquelle une limitation de l'apport en phosphates limite la vitesse de croissance et entraîne une augmentation de la teneur en protéines. Ainsi, la culture hétérotrophique des microalgues de l'espèce Chlorella protothecoides comprend une étape de culture hétérotrophique avec une carence en phosphates, la vitesse de croissance étant ainsi réduite et entraînant une augmentation de la teneur en protéines.

Dans une variante de ce deuxième mode préféré de réalisation conforme à l'invention, la température de fermentation durant cette étape de croissance est augmentée de 1 à 5°C environ, de préférence d'enviion 3 °C, par rapport à la température optimale de fermentation. La température optimale est habituellement d'environ 28°C. Selon un mode particulièrement préféré, la température de fermentation durant l'étape de croissance est d'environ 31 °C.

Ainsi, selon un mode particulier de réalisation la culture hétérotrophique des microalgues de l'espèce Chlorella protothecoides comprend une étape de culture hétérotrophique à plus haute température par rapport à la température optimale qui est d'environ 28 °C, avec une carence en phosphates. Ce mode de réalisation permet de réduire encore la vitesse de croissance et ainsi d'augmenter encore la teneur en protéines.

Comme il sera exemplifié ci-après, l'élévation de la température de fermentation permet d'augmenter la capacité de refroidissement de l'échangeur thermique du fermenteur. Une augmentation de la température de fermentation de 28°C à 31 °C permet ainsi de doubler la capacité de refroidissement de l'échangeur thermique du fermenteur.

Par ailleurs, ces conditions visant à limiter la croissance des microalgues de l'espèce Chlorella protothecoides, par une limitation de la disponibilité en nutriments autre que l'azote, se traduisent ici non seulement par une augmentation de la richesse en protéines, mais conduisent également à en augmenter de manière remarquable la teneur en arginine et en glutamate.

Sans être liée par une quelconque théorie, la société Demanderesse considère que la limitation de la croissance de ces microalgues particulières se traduit par un ralentissement de leur activité métabolique globale (impactant le taux de croissance) et à l'accumulation de molécules riches en C et N (de type acides aminés), dont les voies de biosynthèse « résistent » le mieux à la carence nutritionnelle.

Chez Chlorella protothecoides, il s'agira de l'arginine et du glutamate. Plus particulièrement, comme il sera d'ailleurs exemplifié ci-après, la culture hétérotrophique des microalgues de l'espèce Chlorella protothecoides comprenant une étape de culture avec une carence en phosphates qui limite la vitesse de croissance et entraîne une augmentation de la teneur en protéines, conduit à donc produire plus de 40 % d'acide glutamique et d'arginine sur les acides aminés totaux.

Ainsi, la présente invention est également relative à un procédé d'enrichissement de la teneur en acide glutamique et/ou en arginine d'une microalgue cultivée en hétérotrophie, de préférence d'une microalgue de l'espèce Chlorella protothecoides, le procédé comprenant la culture hétérotrophique des microalgues, de préférence de l'espèce Chlorella protothecoides comprenant une étape de culture avec une carence en phosphates, cette culture résultant en la préparation d'une biomasse de microalgues comprenant plus de 40 % d'acide glutamique et d'arginine sur les acides aminés totaux. De préférence, ce procédé permet en outre d'enrichir la teneur en acide glutamique et en arginine. En particulier, ce procédé permet en outre d'enrichir la teneur en protéine. Ainsi, la biomasse produite comprend de préférence plus de 60, 65 ou 70 % en poids de matière sèche de protéines. Dans un mode de réalisation, la température de fermentation est d'environ 28°C. Dans un autre mode de réalisatbn, la température de fermentation est augmentée de 1 , 2, 3, 4 ou 5° C par rapport à la tem érature optimale de fermentation. De préférence, elle est d'environ 31 °C.

La présente invention est relative à une biomasse produite par ce procédé d'enrichissement. Elle est également relative à une biomasse susceptible d'être obtenue par ce procédé. Ladite biomasse comprend plus de 60, 65 ou 70 % en poids sec de protéines et plus de 40 % d'acide glutamique et d'arginine sur les acides aminés totaux. Notamment, la biomasse comprend 40, 45, 50, 55, 60 ou 65 % d'acide glutamique et d'arginine sur les acides aminés totaux ou plus. Plus particulièrement, la biomasse peut comprendre 20, 25, 30 ou 35 % d'acide glutamique sur les acides aminés totaux ou plus. Elle peut comprendre 20, 25 ou 30 % d'ariginine sur les acides aminés totaux ou plus. La biomasse est une biomasse de Chlorella protothecoides.

Dans un mode de réalisation particulier, ce sont les protéines dont la richesse en acide glutamique et/ou en arginine, de préférence en acide glutamique et en arginine, qui sont augmentées.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs. Exemples

Exemple 1 : Production de Chlorella sorokiniana en fermentation de type « batch séquentiel » sans limitation de l'apport en milieu nutritif

La souche utilisée est une Chlorella sorokiniana (souche UTEX 1663 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA).

Préculture :

- 600 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 2 L ;

- Composition du milieu (tableau 1 ci-dessous)

Tableau 1 .

Le pH est ajusté à 7 avant stérilisation par ajout de NaOH 8N.

L'incubation se déroule dans les conditions suivantes :

- durée : 72 h ;

- température : 28 °C ;

- agitation : 1 10 rpm (Incubateur Infors Multitron).

La préculture est ensuite transférée dans un fermenteur de 30L de type

Sartorius. Culture pour production de biomasse :

Le milieu est identique à celui de la préculture, mais l'urée est remplacée par du Tableau 2.

Le volume initial (Vi) du fermenteur est ajusté à 13,5 L après ensemencement. Il est porté à 16 - 20 L en final.

Les paramètres de conduite de la fermentation sont les suivants :

Tableau 3.

Lorsque le glucose apporté initialement est consommé, un apport de milieu identique au milieu initial, sans l'antimousse, est réalisé sous forme d'une solution concentrée contenant 500 g/L de glucose et les autres éléments dans les mêmes proportions par rapport au glucose que dans le milieu initial, de façon à obtenir une teneur en glucose de 20 g/L dans le fermenteur. Deux autres ajouts identiques sont réalisés de la même manière à chaque fois que la concentration résiduelle en glucose devient nulle.

De l'antimousse Clerol FBA 3107 est ajouté à la demande pour éviter un moussage excessif.

Résultats :

Après 46 h de culture, on obtient 38 g/L de biomasse à une teneur en protéines (évalué par le N 6,25) de 36,2 % Exemple 2 : Production de C. sorokiniana en fermentation de type « fed batch » avec apport en glucose limitant

Dans cet exemple, un apport de milieu complet (mode « fed-batch ») est démarré après la consommation du glucose apporté initialement. Les autres paramètres de conduite de la fermentation sont inchangés.

Le glucose est apporté en continu à l'aide d'une solution concentrée à 500 g/L. La vitesse d'apport est inférieure à la vitesse de consommation que la souche pourrait réaliser de sorte que la teneur résiduelle en glucose dans le milieu est maintenue nulle, c'est-à-dire que la croissance de la souche est limitée par la disponibilité en glucose (condition glucose-limitant).

Cette vitesse est augmentée au cours du temps de façon exponentielle. La formule servant à calculer le débit d'ajout est caractérisée par un facteur μ qui correspond au taux de croissance que la souche peut adopter si elle consomme tout le glucose fourni :

S = So x exp (μ . t)

S = débit d'apport en glucose (en g/h)

So = débit d'apport initial en glucose, déterminé en fonction de la biomasse présente en fin de batch. Il est de 12 g/h dans nos conditions.

μ = facteur d'accélération du débit. Il doit être inférieur à 0, 11 h ¹ qui est le taux de croissance de la souche en absence de limitation nutritionnelle.

t = durée du fed-batch (en h)

Les sels sont apportés si possible en continu, séparément ou en mélange avec le glucose. Mais ils peuvent être aussi apportés séquentiellement en plusieurs fois.

Le tableau 4 ci-dessous donne les besoins en sels pour 100 g de glucose. Tableau 4.

Les concentrations des autres éléments que le glucose ont été déterminées de façon à être en excès par rapport aux besoins nutritionnels de la souche.

De l'antimousse Clerol FBA 3107 est ajouté à la demande pour éviter un moussage excessif.

Résultats : effet de la vitesse d'apport en glucose durant le fed-batch

Des essais ont été effectués à différentes vitesses d'apport du glucose en « fed- batch ». Ils sont caractérisés par le μ appliqué. La teneur en protéine de la biomasse obtenue est évaluée par la mesure de l'azote total exprimée en N 6.25.

Tableau 5.

Ces résultats montrent que le fait de travailler à glucose limitant permet d'augmenter la teneur en protéines.

Il est en effet observé que, même avec un μ élevé de 0,09, on obtient une teneur en protéines plus élevée que celle obtenue sans limitation comme dans l'exemple 1 (39,3 % au lieu de 36,2 %).

Accentuer la limitation du métabolisme par le glucose entraine une amélioration supplémentaire de la teneur en protéines. Dans les conditions de ces essais, il est nécessaire d'imposer à la souche un μ inférieur à 0,06 h-1 pour obtenir une teneur en protéines supérieure à 50%.

Il est à noter que cette condition va de pair avec une réduction de la productivité : 0,56 g/L/h au lieu de 1 ,35 g/L/h avec l'essai 3.

Exemple 3 : Production de C. sorokiniana en fermentation continue de type chemostat avec apport de glucose limitant

Dans cet exemple, le fermenteur utilisé est un 2L de type Sartorius Biostat B. II est réalisé comme l'exemple 2, mais avec des volumes 10 fois plus faibles : l'inoculum est de 60 ml et le volume initial de 1 ,35L.

L'apport en continu du milieu est démarré selon le même principe que dans l'exemple 2, les sels étant dans ce cas mélangés avec le glucose dans la nourrice d'alimentation. La vitesse d'apport est accélérée selon la même formule exponentielle que dans l'exemple 2 en appliquant un μ de 0,06 h-1 .

Chemostat

Lorsqu'un volume de 1 ,6 L est atteint, soit une concentration en biomasse d'environ 50 g/L, le fonctionnement en continu de type chemostat est mis en place :

1 . Le fermenteur est alimenté en continu à un débit de 96 ml/h par une solution de milieu nutritif à 100 g/L de glucose de composition suivante :

Tableau 6.

Les concentrations des autres éléments que le glucose ont été déterminé de façon à être en excès par rapport aux besoins nutritionnels de la souche.

2. Du milieu est soutiré en continu du fermenteur grâce à un tube plongeant relié à une pompe de façon à maintenir le volume de la culture à 1 ,6L.

Ainsi, le milieu est renouvelé d'une fraction 0,06 (6 %) par heure. Ce taux de renouvellement est appelé taux de dilution (D).

Conformément au principe de la culture en chemostat, le taux de croissance de la souche (μ) s'établit à la même valeur car la croissance de la souche est limitée par l'apport en glucose :

D = μ = 0,06 h ¹

Résultats

Après 97 h de fonctionnement en chemostat, la concentration en biomasse se stabilise à 48 g/L +/- 2 g/L et la teneur en protéine à 53 +/- 2 %.

Ce mode de fonctionnement permet d'obtenir une biomasse à forte teneur en protéine grâce à la limitation en glucose et au faible taux de croissance imposé tout en assurant une très bonne productivité, de l'ordre de 2,9 g/L/h, grâce à la concentration élevée en biomasse.

Exemple 4 : Production de Chlorella protothecoides en fermentation de type batch avec ou sans limitation de l'apport en phosphate

La souche utilisée est une Chlorella protothecoides (souche CCAP21 1/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK).

Préculture : o 150 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ;

o Composition du milieu : 40 g/L de glucose + 10 g/L d'extrait de levure.

L'incubation se déroule dans les conditions suivantes : durée : 72 h ; température : 28°C ; agitation : 1 10 rpm (Incubateur Infors Multitron).

La préculture est ensuite transférée dans un fermenteur de 2 L de type Sartorius Biostat B. Culture pour production de biomasse :

La composition du milieu de culture est la suivante (en g/L) :

Tableau 7.

L'apport en phosphate est calculé pour être en excès dans l'essai 1 et limitant pour les essais 2 et 3.

De l'antimousse Clerol FBA 3107 est ajouté à la demande pour éviter un moussage excessif.

Le volume initial (Vi) du fermenteur est ajusté à 1 L après ensemencement.

Les paramètres de conduite de la fermentation sont les suivants :

Tableau 8.

Résultats :

Tableau 9.

La valeur du μ cumulé correspond au taux de croissance de la biomasse depuis l'inoculation.

Le taux de protéines est estimé par la mesure du taux d'azote N x 6,25

Ces résultats montrent qu'une limitation de l'apport en phosphate, confirmée par l'absence de phosphate résiduel en fin de fermentation, limite la vitesse de croissance (mesurée par le taux de croissance) et, comme la limitation par le glucose dans les exemples précédents, entraine une augmentation de la teneur en protéines pour atteindre des valeurs nettement supérieures à 50 %.

Exemple 5 : Production de Chlorella protothecoides à 28° C en fermentation de type fed-batch à partir d'un milieu synthétique limité en phosphate

Pour obtenir une concentration en biomasse élevée, le glucose est apporté en cours de culture (Fed-batch) pour éviter une inhibition de la croissance par le glucose.

Les apports en sels, en particulier le phosphate, sont classiquement effectués au départ de la fermentation (mode Batch).

Le milieu de culture est dépourvu d'extrait de levure.

La souche utilisée est, comme dans l'exemple 4, une Chlorella protothecoides (souche CCAP21 1/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK).

Préculture :

500 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 2L ;

Composition du milieu :

Tableau 10.

L'incubation se déroule dans les conditions suivantes :

- durée : 72 h ;

- température : 28 °C ;

- agitation : 1 10 rpm (Incubateur Infors Multitron).

La pré-culture est ensuite transférée dans un fermenteur de 30L de type Sartorius.

Culture pour production de biomasse :

Le milieu est le suivant :

Tableau 1 1 .

Le volume initial (Vi) du fermenteur est ajusté à 17 L après ensemencement. Il est porté à 20 à 25 L environ en final.

Les paramètres de conduite de la fermentation sont les suivants : Tableau 12.

Température 28 °C

PH 5,0 - 5,2 par NH ₃ 28% w/w

p0 ₂ 20% +/- 5% (maintenue par agitation)

Agitation 300 RPM mini

Débit d'air 15 L/min

Lorsque la concentration résiduelle en glucose tombe en dessous de 10 g/L, un apport de glucose sous forme d'une solution concentrée à 800 g/L environ est réalisé de façon à maintenir la teneur en glucose entre 0 et 20 g/L dans le fermenteur.

Résultats

Les résultats sont donnés en fonction du temps et du ratio C/P qui représente la quantité de carbone consommé (provenant du glucose) ramenée à la quantité de Phosphore apporté (par le phosphate).

Tableau 13.

Ces résultats montrent que le taux de protéines augmente nettement en fin de fermentation à partir du moment où tout le phosphate apporté est consommé et le C/P dépasse une valeur de 60.

Au niveau énergétique, la capacité de refroidissement de l'échangeur de ce fermenteur, alimenté avec une eau à 25°C, se situeà 1 ,7 kW/m2 d'échange.

Exemple 6 : Production de Chlorella protothecoides à 31 °C en fermentation de type fed-batch à partir d'un milieu synthétique limitée en phosphate Cet essai est réalisé dans les mêmes conditions que l'exemple précédent, excepté la température qui est portée à 31 °C (au leu de 28°C). Résultats

Les résultats sont donnés en fonction du temps et du ratio C/P qui représente la quantité de carbone consommé (provenant du glucose) ramenée à la quantité de Phosphore apporté (par le phosphate).

Le μ cumulé correspond au taux de croissance de la biomasse depuis l'inoculation.

Le taux de protéine est estimé par la mesure du taux d'azote N x 6.25.

Tableau 14.

Ces résultats confirment tout d'abord ceux obtenus à 28 °C. De plus, l'augmentation de la température à 31 °C permet de éduire encore la vitesse de croissance et d'augmenter le taux de protéines (de l'ordre de 5 %). Par ailleurs, l'augmentation de la température à 31 °C au lieu de 28 °C permet d'améliorer très nettement l'efficacité de l'échangeur du fermenteur car cela augmente l'écart de température entre l'eau alimentant l'échangeur et le moût de fermentation : la capacité de refroidissement de l'échangeur est portée à 3.5 kW/m2 au lieu de 1 ,7 kW/m2. Exemple 7 : Composition en acides aminés de la biomasse de Chlorella protothecoides produite en conditions carencées en phosphates

On détermine la composition en acides aminés totaux des biomasses de microalgues produites selon la méthode détaillée dans la norme ISO 13903 : 2005.

Sont analysées les biomasses de :

Lot (A) : biomasse de Chlorella protothecoides produite selon les conditions de l'exemple 6, et présentant une teneur en protéines comprise entre 60 et 70 % (exprimée en N6x25).

Lot (B) : biomasse de Chlorella protothecoides produite selon les conditions de l'exemple 5, et présentant une teneur en protéines comprise entre 45 et 60 % (exprimée en N6x25). Lot (C) : biomasse de Chlorella protothecoides préparée selon l'essai 1 de l'exemple 4, et présentant une teneur en protéines comprise entre 45 et 50 % (exprimée en N6x25).

Lot (D) : biomasse de Chlorella sorokiniana produite selon les conditions de l'exemple 3, et présentant une teneur en protéines comprise entre 50 et 60 % (exprimée en N6x25)

Le tableau 15 suivant présente la composition en acides aminés totaux de la biomasse, exprimé en % relatif.

Tableau 15.

Les résultats obtenus montrent bien que, sur la composition totale en acides aminés des biomasses de Chlorella protothecoides, plus de 40 % (en relatif) des acides aminés sont de l'acide glutamique et de l'arginine si Chlorella protothecoides est cultivée dans des conditions qui enrichissent sa teneur en protéines (pas plus de 30 % en conditions de culture classique - cf. Lot C).

Par ailleurs, ce résultat n'est obtenu que pour Chlorella protothecoides, ce qui tente à montrer les particularités métaboliques de cette microalgue, au regard de Chlorella sorokiniana. En effet, bien que présentant une teneur élevée en protéines, C. sorokiniana - Lot D - ne produit pas plus de 20 % d'acide glutamique et arginine).