La présente invention a pour objet un procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae.

L'invention a également pour objet un vaccin contre les infec¬ tions provoquées par des bactéries Streptococcus pneumoniae à base de polyosides ainsi puri iés.

On sait que plusieurs types de Streptococcus pneumoniae provo¬ quent diverses infections telles que des méningites, des pneumonies, des otites et diverses bactériémies.

Il est connu également que la purification de polyoside capsu- laire purifié extrait de bactéries Streptococcus pneumoniae permet de réaliser des vaccins pour l'immunisation contre les infections provoquées par lesdites bactéries.

La demande de brevet européenne n°78.400135.1 décrit notamment un procédé de purification de polyoside de Streptococcus pneumoniae par précipitation fractionnée à 1'alcool puis élimination des protéines et des acides nucléiques. L'élimina¬ tion des protéines et des acides nucléiques est effectuée soit par des traitements à l'aide d'enzymes soit par des traitements à l'aide de tensio-actif cationique, ces traitements étant suivis d'une diafiltration.

Dans cette demande de brevet européenne, la précipitation fractionnée par l'alcool est appliquée directement au milieu de culture, sans lyse préalable, et, en raison de la présence d'impuretés variées, les divers traitements de purification nécessitent la réalisation systématique sur chaque lot d'essais préliminaires de détermination des quantités de matières premières à utiliser pour les précipitations alcooliques fractionnées, et pour le traitement par le tensio-actif cationi¬ que.

Le procédé de la présente demande est effectué sur un produit de départ lysé dont les débris cellulaires ont été éliminés (clarification) _,

Ce procédé permet d'éviter la réalisation d'essais préliminaires systématiques.

D'une façon générale, ce procédé permet de raccourcir de façon importante la durée de l'ensemble des étapes de purification des polyosides de Streptococcus pneumoniae.,

La présente invention a pour- objet un procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que le produit de départ est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant des impuretés ^' protéiques, obtenue par iyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae puis clarifica¬ tion et concentration du polyoside, ^' que l'on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol, à température de 5 à 30°C environ, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol jusqu'à ce que la teneur en protéines de la phase aqueuse soit inférieure à un seuil prédéterminé.

Ce procédé de traitement au phénol permet donc de réaliser l'élimination de la majeure partie des protéines présentes dans la solution impure de départ. On a découvert que ce traitement au phénol ne modifie pas la structure moléculaire et donc l'activité biologique du polyoside.

On notera que ce traitement, au phénol est effectué ici à un stade précoce du procédé de purification, sur un produit de dé¬ part contenant au moins 20% en poids, et généralement de 30 à 50% en poids, de protéines (sur produit de départ sec) .

Selon des modes de réalisation particuliers actuellement préférés, ce procédé présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison:

- la solution aqueuse de départ contient de 1 à 30g/litre de polyoside impur;

- on opère à température de 10 à 20°C environ;

- on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange, phénol-eau;

- le mélange phënol-eau est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute;

- on effectue le, traitement au phénol à un pH de 6,9 + ^• 0,5 environ;

- la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée

- la solution tamponnée est par exemple un tampon acétate de sodium;

- le. phénol est ajouté sous la forme d'un mélange phénol- solution tamponnée;

- on ajoute de 10 à 60% vol/vol du mélange phénol-eau ou phénol-solution tamponnée;

- la quantité d' au ou de solution tamponnée dudit mélange correspond sensiblement à la quantité maximum pouvant être dissoute dans le phénol;

- ledit seuil correspond à une teneur en protéines de 5% en poids, c'est-à-dire de 5g de protéines pour 100g de polyoside brut;

- on soumet la- phase aqueuse recueillie à une dialyse pour éliminer le phénol résiduel.

Pour mettre en oeuvre ce procédé de dëprotéinisation par un phénol, on procède avantageusement de la façon suivante: on

^•

ajoute le phénol à la solution de polyoside à purifier puis on soumet le mélange à une ultracentrifugation. On obtient ainsi une séparation en trois phases: une phase inférieure phénolique une interphase protéique et une phase aqueuse supérieure contenant le polyoside. Cette phase aqueuse est recueillie et soumise si nécessaire à un nouveau traitement au phénol. Le processus peut être ainsi recommencé jusqu'à l'obtention d'une teneur en protéines inférieure au seuil fixé.

La détermination du taux de contamination protéique peut être réalisée après isolement, par précipitation alcoolique puis dessication sous -vide, d'une quantité aliquote de polyoside _ contenu dans la phase aqueuse, par dosage colori êtrique selon la technique de Lowry et coll. décrite dans J. Biol. Chem. 143, 265 (1951) avec la sérum-albumine bovine comme étalon.

Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le nombre de traitements au phénol (généralement 1 ou 2) nécessaires pour chaque type de polyoside.

Afin de purifier davantage le polyoside, on peut effectuer, outre le traitement de déprotéinisation par le phénol, d'autres traitements, et notamment des traitements permettant d'éliminer les contaminants nucléiques.

Selon un mode de réalisation du procédé tel que défini ci- dessus, et afin d'éliminer les contaminants nucléiques, on ajoute en outre à la solution de polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside.

Selon des modes de réalisation particuliers, ce traitement- supplémentaire par un alcool en présence d'ions calcium,

présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolé¬ ment ou en combinaison:

- on ef ectue cette précipitation fractionnée à 1'alcool généralement après le traitement au phénol; il est toutefois possible de l'effectuer avant le traitement au phénol, comme illustré à l'exemple 17 ci-après;

- l'alcool utilisé est l'éthanol;

- on effectue la précipitation f actionnée à 1'alcool à une température de 0 à +- 15 ^β C environ;

- on ajoute l'alcool jusqu'à une- concentration de 10 à 35% environ (vol/vol) pour précipiter les contaminants nucléiques, puis on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation .complète du polyoside;

- on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25- 2 environ.

Selon un autre mode de réalisation du procédé de purification de l'invention, pour éliminer les contaminants nucléiques, il est encore possible de soumettre la solution à- purifier à un traitement supplémentaire au charbon actif en quantité suffi¬ sante pour adsorber la majeure partie des contaminants nucléi¬ ques, puis d'éliminer le charbon actif sur lequel les contami¬ nants nucléiques sont adsorbés.

Généralement, on ajoute de 0,1 à 12% (poids/volume) ^• de charbon actif. Si la teneur en acides nucléiques, après un premier traitement au charbon actif, est supérieure au seuil que l'on s'est fixé, on peut répéter ledit traitement.

Ce traitement au charbon actif peut être effectué soit à la place du traitement à l'alcool en présence d'ions calcium, soit en complément de ce traitement.

82/01995

-6- Si le taux initial de contamination nucléique est supérieur à 15% en poids, on effectue d' ^' abord la précipitation fractionnée à l'alcool en présence d'ions calcium.

Si, après- la précipitation fractionnée à l'alcool, la teneur en acide nucléique du polyoside est supérieure au seuil fixé (par exemple supérieure à 1 ou 2% en poids) , on peut remettre en solution le précipité de polyoside et le soumettre alors à un traitement au charbon actif tel que décrit précédemment.

Si le taux initial de contamination nucléique est inférieur à 15% en poids, l'élimination des acides nucléiques est de- préférence réalisée uniquement par un traitement au charbon actif.

Le taux de contamination nucléique peut être apprécié par mesure spectrophoto etrique de l'absorption à 260nm d'une solution aqueuse polyosidique préparée par redissolution dans l'eau distillée d'une quantité aliquote de polyoside obtenu par dessiccation du précipité provenant du traitement à 1'étha- nol d'une partie aliquote de la solution obtenue après le traitement au phénol et dialyse- Dne valeur égale à 1 est attribuée à l'absorbance de 50 microgrammes d'acide nucléique dans 1ml d'eau, dans une cuve ayant un trajet optique de 1cm.

Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le type et le nombre de traitements nécessaires pour une élimination satisfaisante des contaminants nucléiques. La concentration optimale en charbon actif, qui est celle qui permet la plus forte réduction du taux d'acides nucléiques, est déterminée par des essais préliminaires sur chaque lot de polyoside à purifier. Cette concentration en charbon actif varie en pratique de 0,1 à 12% (poids/volume).

Pour la purification finale du polyoside, on peut soumettre le polyoside à une précipitation puis laver le précipité. On peut

-7- effectuer par exemple la précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium ou avec un alcool. On lave ensuite le précipité avec au moins un agent de lavage choisi dans le groupe constitué par un alcool (tel que l'éthanol) , l'acétone ou l'éther éthylique.

Généralement, pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ, on ajoute à une solution aqueuse de polyoside à purifie (obtenue après lyse, clarification et concentration) un alcool miscible à l'eau de façon à précipiter le polyoside puis l'on remet le précipité en solution. On peut effectuer cette précipi tation en plusieurs étapes (généralement deux étapes) en ajoutant l'alcool en quantités croissantes de façon à précipite d'abord des impuretés puis le polyoside. On peut également dans certains cas, en particulier lorsque le polyoside précipit pour une concentration d'alcool relativement faible, effectuer une précipitation alcoolique directe. C'est en particulier le cas pour les polyosides des types 3 et 8, comme cela est illustré ci-après dans la partie expérimentale. De préférence la précipitation à l'alcool est effectuée en présence d'un sel soluble dans le milieu, afin d'augmenter la force ionique. On peut utiliser par exemple un sel de sodium. On peut également effectuer cette précipitation préliminaire à 1 ^• alcool en présence de sels de calcium. Dans ce cas ce stade préliminaire permet d'éliminer la majeure partie des contaminants nucléiques, avant le stade d'élimination des protéines par le phénol.

La concentration du sel peut varier de 0,1 à 2M.

La précipitation directe consiste en l'addition d'un volume d'alcool suffisant pour permettre d'obtenir 1'insolubilisation du polyoside. Celui-ci est récupéré par centrifugation avec ou sans décantation préalable du surnageant.

La précipitation alcoolique fractionnée est réalisée de préféren en deux temps. Dans un premier temps on ajoute un volume

-8- d'éthanol permettant la précipitation sélective des contaminant (principalement protéines et acides nucléiques) . Au surnageant obtenu après centrifugation, on ajoute dans un deuxième temps le volume d'alcool suffisant pour provoquer la précipitation complète du pσlysacσharide. Après centrifugation le sédiment est remis en solution en vue du traitement par le phénol.

Généralement une concentration en alcool de 10 à 30% (vol/vol) ^' est suffisante pour insolubiliser une partie des contaminants protêiques et nucléiques. Une concentration finale variant selon les cas entre 30 et 80% est généralement nécessaire pour la précipitation des polyosides. Toutefois, lorsque ^" le polyosid précipite déjà pour une faible concentration en alcool (par exemple pour une concentration de 15-20%) on effectue alors ^' une précipitation directe du polyoside.

-L'alcool utilisé est de préférence l'ëthanol. On effectue la précipitation à 1'alcool généralement à une température de 0 à -τ-l5°C environ.

Cette précipitation préliminaire à l'alcool peut être remplacée par une précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de concentration suffisante pour précipiter le polyoside.

Comme il a été indique ci-dessus, le produit de départ a été soumis à une concentration préalable après lyse du milieu de culture et élimination des débris de culture cellulaire par clarification. Pour réaliser cette concentration on opère de préférence par ultrafiltration. Le facteur de concentration peut varier de 4 à 15 environ, suivant le volume et la viscosit du surnageant à concentrer. L'ultrafiltration est réalisée par exemple à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10.000. Il est également possible d'utiliser des membranes qui retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50.000, ou supérieur à 100.000.

-9-

Selon un mode de réalisation préféré, pour obtenir la solution de polyoside de départ, on effectue la culture de Streptococcu pneumoniae en milieu semi-synthétique exempt de protéines. La culture comporte de -préférence trois étapes de préculture de 3-4 heures chacune.

L'utilisation d'un milieu semi-synthétique pour une culture industrielle de Streptococcus pneumoniae n'avait jamais été réalisée. Elle permet de simplifier les purifications ultérieu res en évitant l'addition de protéines étrangères difficiles à éliminer.

Les précultures liquides et la culture industrielle sont effectuées en milieu semi-synthétique. Pour la culture en grand fermenteur, il est avantageux de prévoir une régulation du pH et une addition de glucose automatiques.

Le pH est, suivant les cas, régulé entre 6,0 et 7,4 environ par addition de soude 5N ou de toute autre solution alcaline.

Afin d'obtenir un taux optimal en polysaccharide, il y a lieu d'arrêter la culture après complet développement des corps microbiens, soit environ après 12-18 heures à température de 37+ Û,2°C.

En fin de cycle, la culture est stérilisée par exemple par addition d'une faible quantité de phénol (par exemple 0,5%) et les germes sont lysés par addition d'un agent lysant tel que le désoxycholate de sodium.

Pour la culture on utilise comme milieu de base, le milieu suivant:

- Hydrolys-at acide de caséine 22,230g

- L Cystine , 0,166g

- L Tryptophane 0,022g

- L tyrosine 0,220g

- Phosphate bipotassique I H PO. 5,560g

- Eau distillée q.s.p 1000ml

Le pH est ajusté à 7,6 par addition de soude.

Le milieu complet utilisé pour effectuer la deuxième préculture et les suivantes ainsi que la culture industrielle correspond à la formule suivante:

- milieu de base 900ml

- solution de glucose à 50% 25ml

- solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance 50ml

- solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique 25ml.

Le pH est ajusté à 7,6.

La solution de glucose à 50% est préparée par dissolution de 50g de glucose anhydre dans 100ml d'eau distillée. On stérilise pendant 30 minutes à 120°C.

La solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance a la formule suivante:

- solution de vitamines 200ml

- solution de sels 40ml

- L-Glutamine 12,5g

- Asparagine 2 g

- Chlorhydrate de choline 0,2g

- eau distillée q.s.p 1000ml

Cette solution filtrée stérilement est conservée à -s* 4°C.

La solution de vitamines peut avoir la composition suivante:

-11-

- Biotine 0,15mg

- Ac. Nicotinique lOOmg

- Pyridoxal lOOmg

- Calcium pantothenate 500mg

- Thiamine lOOmg

- Riboflavine lOOmg

- Adenine sulfate* lOOOmg

- ϋracil lOOOmg

- Eau distillée froide qsp 1000ml

La solution de sels a la formule suivante:

₂

- Sulfate de magnésium g S0 ₄ ,7H O 250g

2

- Sulfate ferreux Fe SO . , 7H O 2 , 5g

— Sulfate de zinc Zn SO _d , 7H 2 O 0 , 400g

- Sulfate de manganèse Mn SO. , H 2O 0,180g

- Acide chlorhydrique 10ml

- Eau distillée q.s.p 1000ml

La solution de bicarbonate et d ' acide thioglycolique a la formule suivante:

- bicarbonate de sodium 40g

- acide thioglycolique 10% 40ml

- eau distillée q.s.p 1000ml

On donne ci-après le schéma d'une technique de culture:

Préculture I

On ensemence des boites de gélose à 5% de sang de cheval avec le Streptococcus pneumoniae choisi lyophilisé. On dilue le contenu de l'ampoule lyophilisée avec 1ml de bouillon trypticas soja et on répartit à la surface des boîtes de Pétri- On place à l'ëtuve pendant 16-17 heures à 36°C.

FEUILLE DE RE?ΛPLACΞ8ΛENT OMPI

82/01995

-12- Préculture II

Dans des récipients contenant 45ml de milieu de base on ajoute stérilement 1,25ml de la solution de glucose à 50%, 2,50ral de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 1,25ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycoliq

On ensemence à partir du produit de la préculture I et on cultive à 36°C pendant 3 à 4 heures sous agitation lente.

Préculture IIX

Dans un flacon de 51 renfermant 2,4 litres de milieu de base, on ajoute 60ml de la solution dé glucose, 120ml de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 60ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.

On ensemence avec 500ml de la prêculture II, puis on cultive pendant 3 à 4 heures en agitant à 36°C.

Culture proprement dite

On utilise 361 de milieu de base stérilisés que l'on sature en gaz carbonique. On ajoute à ce milieu de base 1 litre de la solution de glucose, 21 de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance, et 1 litre de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.

On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N.

On cultive à température de 36°C, en agitant, sans aération, de préférence sous gaz inerte ou sous gaz carbonique, le pH étant régulé entre 6,0 et 7,4 avec de la soude 5N.

Au bout de 8 heures de culture environ, on ajoute le mélange suivant:

-13-

- 1 litre de la solution de glucose à 50%

- 0,3351 d'une solution d'acétate d'ammonium à 46,2g%

Arrêt de la culture

L'arrêt de la culture est fonction de la lyse des germes:

a) lyse naturelle : elle survient au bout de 60 à 96 heures de culture et on peut la suivre par l'examen microscopique de la- morphologie des germes;

b) lyse provoquée au bout de 12-17 heures de culture: à la culture refroidie et transvasée dans un récipient, on ajoute sous agitation 10% d'une solution de désoxycholate de sodium à 10%, soit une concentration finale de 1%. On agite pendant 30 minutes.

Clari ication

Pour éliminer les débris cellulaires, on effectue une centrifu¬ gation et on récupère le surnageant clarifié.

Comme il- a été indiqué ci-dessus, les polyosides. purifiés de Streptococcus pneumoniae permettent de réaliser des vaccins.

L'invention a également pour objet un vaccin pneumococcique contenant au moins un polyoside purifié selon le procédé décrit dans la présente demande.

Un exemple de réalisation et d'utilisation d'un tel vaccin est donné ci-après dans la partie expérimentale.

Un vaccin pneumococcique monovalent est constitué par dissoluti d'un polyoside purifié dans un soluté isotonique tamponné. Un vaccin pneumococcique polyvalent est constitué d'au moins 2 polyosides purifiés dissous dans un soluté isotonique tamponné.

82/01995

-14- On sait que l'on peut "distinguer plusieurs types sêrologiques de Streptococcus pneumoniae, qui sont répertoriés selon la nomenclature rappelée dans le Tableau I ci-après.

-15-

TABLEAU I

TYPE

•

Nomenclature danoise Nomenclature américaine

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 A 6

6 B 26

7 F 51

8 8

9 N 9

10 A 34

12 A 83

12 F 12

14 14

15 B 54

17 F 17

18 C 56

19 F 19

20 20

22 F 22

23 F 23

25 25

2/01995

-16- Dans la présente demande, on a utilisé la nomenclature danoise.

On donne ci-après des modes d'exécution non limitatifs du procédé de 1'invention pour certains polyosides particuliers:

- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 10A, 12 F, 15B, 17F, 18 C, 20, 22F, 23 F ou 25, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarificati et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible- à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés,- puis après élimination ^" de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, et que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence 'ions calcium puis par le traitement au charbon actif.

- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type. 2, 6 A, 6 B ou 19 F, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord, des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipite le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminant nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium.

- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 7 F, 9 N, 12- A ou 14 , et selon la revendi¬ cation 17, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarificatio et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du

-17- polyoside un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on dissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.

- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 3 ou 8, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter directement le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la •» teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.

- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 6 B, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à 1'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité et ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside puis que l'on soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines. s.

L'invention a également pour objet un procédé de purification présentant tout ou partie des caractéristiques des procédés décrits dans les exemples non limitatifs suivants.

Dans ces exemples 1'acétate de sodium utilisé est 1'acétate de sodium hydraté AcNa,3H20.

2/01995

-18- L'acide acétique utilisé est l'acide acétique pur appelé acide acétique glacial.

On rappelle que l'eau physiologique est une solution aqueuse apyrogëne de chlorure de sodium à 8g/l.

D'une façon générale, pour les précipitations à l'éthanol, on utilise de l'éthanol prê-refroidi à -20°C afin d'éviter une augmentation notable de température due à la dissolution de l'éthanol.

EXEMPLE N°l : Purification du polyoside pneumococcique type 1

Stade 1 : Culture Précultures

1ère préculture:

A partir de germes lyophilisés on ensemence des boîtes de Roux de 2 1 renfermant de la gélose à 5% de sang de cheval. On laisse incuber 16h à 36° C + 1, de préférence en atmosphère humide et sous gaz carbonique.

2ème préculture:

Après un contrôle de pureté on ensemence, avec la suspension obtenue à partir de ces 6 boîtes de gélose, 6 erlens renfer¬ mant 500ml de milieu complet. On cultive pendant 2 à 2h30mn à 36°C + 1 avec une agitation modérée.

3ème préculture:

On utilise à ce stade soit un fermenteur soit un récipient comportant un système permettant une légère agitation de l'ordre de 50 rp . Après un contrôle de pureté, on transfère la culture obtenue à partir des erlens dans 12 1 de milieu complet frais et on laisse incuber à 3 °C + 1 pendant 3 à 3h30mn.

-19-

Culture

On utilise un fermenteur de capacité utile de 200 1 comportant une agitation de type Vortex.

Après l .stérilisation du milieu et l'introduction des facteur de croissance, on procède à un balayage par du gaz carbonique jusqu'à stabilisation, du pH à 6,2 + 0,2. On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N et on ensemence à raison de 6% d'inoculum. On maintient la culture à 36°C + 1 sous une agitation de 600 rp avec une régulation de pH à 6,8 avec de la soude 5N. Au bout de 8h de culture on procède à une addition de glucose- et d'acétate d'ammonium à raison respectivement de 12,50g et 4g par litre de milieu.

Au bout de 16h de culture on vérifie la pureté et l'identité de la culture puis on procède à la lyse des germes par additio de 1% d'une solution de desoxycholate de sodium à 10%.

Après une demi-heure de contact sous agitation on vérifie que ^' la lyse est totale. On ajoute 0,5% de phénol aqueux puis on centrifuge. Le surnageant est collecté dans une cuve préalable ment stérilisée et refroidie.

Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococciqu

Concentration

Le surnageant de culture (3 x 200 litres) préparé comme précé¬ demment décrit est concentré, lavé avec 3 x 60 litres d'eau physiologique phénolëe à 0,5% et à nouveau concentré par

_ ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000 (type Amicon ou Romicon) .

-20- Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée (110 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5% (poids/ volume) .

Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préfé- rentiellement 20%) . L'agitation est poursuivie pendant 20 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm à + 4 ^β C.

La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (153 litres) est amenée à 5g% (poids/volume) et le pH est ajusté-à 5,8 par l'acide acétique glacial.

On ajoute, sous agitation, de l'éthanol absolu déshydraté pré¬ refroidi à -20°C jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 40-65% (préfërentiellement 44,4%). Après une demi- heure d'agitation, le.pH est, si nécessaire, ajusté à 6,8 avec 1*acide acétique. Le mélange est laissé au repos à +4 ^a C pendan 16 heures, le précipité est alors recueilli par décantation et centrifugation à 4200 rpm, à + 4°C. Il constitue le polyoside brut.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (1900g poids humide) est mis en solution dans environ 40 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,4 volume (préfëren¬ tiellement 0,33 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1 : Q,4 vol/vol).

Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur on soumet l'émulsion obtenue à une ultracentrifu-

-21 - gation à 35000 rpm, à + 14°C. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitement phénolique. Le processus est recommencé, si nécessaire, jusqu'à ce que la phase aqueuse contienne moins de 5g% de protéines (généralement 2 cycles sont suffisants) . Le dosage des protéine est effectué selon la technique de Lo ry et coll., J; Biol. Chem. 14_3, 265 (1951) .

La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C pour éliminer le phénol résiduel.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

a) Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution dialysée obtenue au stade 3 (44,7 litres) on ajoute lentement 6,4 litres d'une ^' solution aqueuse de CaCl_ 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtentio d'une concentration finale comprise entre 10 et 30% (prëféren- tiellement 15%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à -s- 4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 30000 rpm à + 4°C.

La concentration êthanolique du surnageant est, sous agitation vive, amenée à une valeur comprise entre 40 et 60%, générale¬ ment 44,4%.

Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures puis centrifugée en continu à 15000 rpm, à + 4°C.

Le précipité ainsi obtenu (430g poids humide) est remis en solution dans 40 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M.

DE REMPLACEMENT

2/01995

-22- b) Traitement au charbon actif

On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidiq le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9, pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8g% (préfërentiellement 3g%) .

Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4'C.

Le charbon est ensuite éliminé par filtration.

Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures _. à + 4°C.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution polyosidique dialysée (57 litres) on ajoute 3420g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acid acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'ëthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -20°C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre 40 et 65% (préfërentiellement 44,4%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation à 4200 rpm à + 4°C.

Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20"C puis centrifugé comme indiqué ci- dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 x 500ml d'acétone pré¬ refroidi à -20°C et par 3 x 500ml d'ëther éthyliσue pré- refroidi à -20°C. On filtre sur verre fritte de porosité 5.

-23-

Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide durant une nuit à 0°C.

Le polyoside déshydraté est réduit en poudre.

On obtient ainsi 80g de polyoside purifié type 1.

En opérant de façon analogue à celle décrite ci-dessus, on a purifié les polyosides pneumococciques de- types 10 A, 15 B, 17 F, 20 et 22 F.

EXEMPLE N°2 : Polyoside pneumococcique type 4

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de fermentation et de préparatio du surnageant sont analogues à celles décrites dans 1' xemple n°l, exception faite de la régulation pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 ± 0,2.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (600 litres) est réduit à un volume d'environ 50 litres et lavé plusieurs fois par dilution-con¬ centration avec 100-200 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par fil ration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000.

Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors à nouveau concentré par ultrafiltration. Le facteur de concentration dépend du volume et de la viscosité du surnageant initial, il est compris généralement entre 4 et 15.

2/01995

-24- Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée (47 litres) , on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6% (poids/ volume) . Le pH est ajusté à 5,40 par l'acide acétique et on ajoute lentement, sous agitation vive, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale en alcool comprise entre 30 et 50% (préfërentiellement 37,5%).

Après 30 minutes d'agitation à + 4°C, le mélange est ultracen¬ trifugé.

La concentration en acétate de sodium du surnageant (73 litres est amenée à 7,5g% et le pH ajusté à 5,80 par l'acide acétique On- ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 60-80% (préfërentiellement 75%) .

Au bout d'une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos à + ^• 4°C pendant 16-18 heures. Le surnageant est éliminé par décantation et le précipité de polyoside brut récupéré par centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (530g poids humide) est mis en solution dans environ 20 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9.

A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume, généralement 0,25 volume, du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1 : 0,4 vol/vol).

Après agitation vive pendant 30 secondes à l'aide d'un disper- seur, le mélange est ultracentrifugé comme à l'exemple 1.

La phase aqueuse contenant le polyoside est soumise à un deuxième cycle de traitement phénolique. Le processus est

-25- recommencé, si nécessaire, jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5g% de protéines.

La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

a) Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,5 litres) on ajoute lentement 2,65 litres d'une solution de CaCl- 4M. Après 15 minutes d'agitation à + ^• 4°C, on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concen¬ tration finale comprise entre 15 et 35% (préfërentiellement 25%) . L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm, à + 4°C.

La concentration en éthanol du surnageant est, sous agitation, ^• amenée à une valeur comprise entre 60 et 80%, généralement 75. Après une demi-heure d'agitation le mélange est laissé au repos à +4°C pendant 16 heures.

Après décantation, le précipité est récupéré par centrifuga¬ tion à 4200 rpm à + 4°C puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 (8 litres) .

b) Traitement au charbon actif

A la solution polyosidique on ajoute rapidement, sous agita¬ tion, le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif •comprise entre 0,1 et 5g% (préfërentiellement 0,5%). Le mélang est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 4°C.

O 82/0199

-26-

Le charbon est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 15 heures à +* 4°C.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution obtenue après dialyse (11 litres) on ajoute 1320g d'acétate de,sodium et on ajuste le pH à 5,40 par addi¬ tion d'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à - 20°C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique comprise entre 60 et 80% (pré ërentiellement 75%) . Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 - + 0,1 et la solution est laissée au repos- à + 4°C pendant 16- 18 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centri fugation. Il est mis en suspension par agitation manuelle dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 x 300ml d'acétone pré¬ refroidi à -20°C et par 3 x 300 ml d'éther êthylique pré¬ refroidi à -20°C. On filtre sur verre fritte de porosité 5.

Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché à 0°C et réduit en poudre. On obtient ainsi 64g de polyoside purifié type ₍ 4.

EXEMPLE N°3 : Polyoside pneumococcique type 5

Stade 1 : Culture

Les conditions de culture et de préparation du surnageant de culture sont identiques à celles utilisées pour la préparatio du polyoside pneumococcique type 4 (exemple 2) .

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

-27-

Le surnageant de culture (43 litres) est concentré, lavé avec 3 x 12 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouvea concentré par ultrafiltration de façon à retenir les substanc dont le poids moléculaire est supérieur à 10000. Le facteur d concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosi du surnageant initial.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée (8 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g% (poids/volume) . Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 15 et 40%. L'agitation es poursuivie pendant 30 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm à + 4°C.

La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (11,1 litres) est amenée à 7,5g% et le pH est ajusté à 5,8-6,0 par addition d'acide acétique.

On ajoute, sous agitation, un volume d'éthanol permettant la précipitation complète du polyoside (concentration finale comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 + 0,2 avec l'acide acétique glacial. Le mélange est laissé au repos à + 4°C pendant environ 24 heures. Le précipité de polyoside brut est recueilli par décantation et centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (400g poids humide) est mis en solution dans, environ 3 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,6 volume du mélange phénol- tampon acétate de l'exemple 1. Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifugation comme à l'exemple 1. La

2/01995

-28- phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitemen-p phénolique. Le processus est éventuelle ment recommencé jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidiqu contenant moins de 5g% de protéines. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C pour éliminer le phénol résiduel.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

a) Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution dialysée obtenue au stade 3 (2,1 litres) , on ajoute lentement 0,3 litre de solution aqueuse de Cad- 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentemen sous agitation vive, de l'ëthanol jusqu'à 1'obtention d*une concentration finale comprise entre 10 et 35%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à -f- 4°C puis le mélange est ultracentrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes à + 4°C.

On dilue le surnageant avec un à deux volumes d'éthanol pour précipiter complètement le polyoside. Le mélange est laissé au repos pendant environ 24 heures à + 4°C puis on recueille le précipité par centrifugation.

b) Traitement au charbon actif

Le précipité (2g) est mis en solution dans 0,6 litre de tampo NaCl 0,14 M pH 6,9 + 0,2 puis on ajoute rapidement sous agita¬ tion le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids volume) dans une solution de chlorure de sodium 0,14 M pH 6,9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g%. Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minut à + 4*0.

Le charbon est éliminé par centrifugation et/ou par filtratio

-29- Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

La concentration en acétate de sodium de la solution dialysée obtenue précédemment est amenée à une valeur comprise entra β et I2g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5.4-5,8 par l'acide acétique glacial.

On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi. à -20°C permettant la précipi¬ tation complète du principe actif, (concentration finale en alcool comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agi¬ tation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 24 à 48 heures. Le polyoside est récupéré par ultracentrifugatio en continu à 35000 rpm, à + 4°C-

Le précipité est mis en suspension dans de l'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé à 4200 rpm à +4°C.

Cette opération est recommencée une fois puis le précipité est lavé successivement par l'acétone et l'éther, comme décrit aux exemples précédents.

Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide à 0°C.

Le polyoside purifié est réduit en poudre.

EXEMPLE N°4 : Polyoside pneumococcique type 12 F

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de culture et de préparation du surnageant sont analogues à celles décrites dans 1'exemple

-30- n ^α l, exception faire du pE qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N.

. S_ _• _ _• t____._a___________d_>•___--__e___----•________ ______2_._______> : Purification p—réliminaire -d_u —o _l o _l lv—oside oneumo. -cocciσ-u

Concentration

Le surnageant de culture (2 x 220 litres) préparé comme ^' récé¬ demment décrit est concentré, lavé avec 2 x 60 litres d'eau physiologique phënolëe à 0,5% et à nouveau concentré, par ultrafiltration, comme décrit à l'exemple 1, stade 2.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée (91 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,2% (poids/volume)

Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol, jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préfërentiellement 25%) , puis on centrifuge.

La concentration en acétate de sodium (AcNa, 3H20) du surnagea (131 litres) est amenée à 6,9g% (poids/volume) et le pH est: ajusté à 5,8 par l'acide acétique.

On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 45-75% (préfërentiellement 56,5%) . Après une demi-heure d'agitation, le mélange est laissé au repos à -r 4°C pendant lβ heures; le précipité est alors recueilli par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (1100g poids humide) est mis en solution dans environ 50 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pK 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préféren-

O PI

-31- tiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de l'exemple 1.

Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifugation. Le processus est recommencé plusieurs fois _/ si nécessaire, jusqu'à l'obtention d'une phase aqueuse contenant moins de 5g% de protéines (généralement 1 ou 2 cycles sont suffisants) .

La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques _ '

a) Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution dialysée (60,4 litres) on ajoute lentement 8,6 litres d'une solution aqueuse de CaCl- 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 10 et 35% (préfërentiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé.

La concentration éthanolique du surnageant est amenée entre 45 et 70%, généralement 56,5%.

Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures puis centrifugée. Le précipité ainsi

•obtenu est remis en solution dans 50 litres d'une solution de

^• chlorure de sodium 0,14M pH 6,9.

P) Traitement au charbon actif

On opère comme à 1'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8g% (préfëren¬ tiellement 2g%) .

2/01995

-32- Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution polyosidique dialysée (70 litres) on ajoute 6400g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acid acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre 45 et 75% (préfërentiellement 56,5%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à + 4 ^β C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centri¬ fugation.

Le précipité est. mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé comme indiqué ci- dessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à 1'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.

On obtient ainsi 76g de polyoside purifié type 12 P.

EXEMPLE N°5 : Polyoside pneumococcique type 18 C

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de fermentation et de préparatio du surnageant de culture sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2.

Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococciqu

Concentration

Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 35 litres, lavé avec 3 x 40 litres d'e-au physiologique phênolëe à 0,5% et à nouveau concentré à 60 litres par ultrafiltration sur A icon H10 P10.

-33- Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée, on ajoute 3000g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 ^' avec l'acide acétique.

De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 20-35% (préférentiellement 28,5%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14g%, le pH est. ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50- 80% (préférentiellement 63,6%).

Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le précipité est ensuite recueilli par centrifugation. IL constitue le polyoside brut.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (1143g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6.9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,33 volume) du mélange phénol-acétate de l'exemple 1 stade 3, et on opère comme à 1'exemple 1.

Stade 4 : Elimination des acidesnucléiques

a) Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution dialysée (26,1 litres) on ajoute lentement, sous agitation, 8,7 litres d'une solution de chlorure de calcium 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, comme à l'exemple 1, stade 4a, d'abord avec une concentration en alcool de 15-35% (préférentiellement 25%), puis de 45-75%, généralement 63,6%.

-34- b) Traitement au charbon actif

Le précipité (400g poids humide) est dissous dans 40 litres de chlorure de sodium 0,14M et on opère ensuite comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10g% (préférentiellement 2g%) .

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution dialysée (51 litres) on ajoute 2560g d'acétate de sodium et on a uste le pH à 5,4 avec 1'acide acétique. On - ajouta de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-80% (préférentiellement 63,6%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos 16 heures à -t- 4°C. Le précipité est récupé par décantation et centrifugation puis mis en- suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -2Q°C.

Après centrif gation, le processus est recommencé une fois.

On procède ensuite à des lavages à 1*acétone et à 1'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à 1'exemple 1.

On obtient ainsi 108g de polyoside purifié type 18C.

EXEMPLE N°6 : Polyoside pneumococcique type 23 F

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de fermentation et de préparatio du surnageant de culture sont identiques à celles de l'exemple 2.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

-35- Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à un volume d'environ 80 litres, lavé plusieurs fois par dilution- concentration avec 240 litres d'eau physiologique phénclée à 0,5% puis à nouveau concentré (facteur de concentration = 5,6) . Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration res¬ pectivement sur A icσn type H10 P10 et sur Romicon PM 10.

Préciσ -i* ta..t..i..o.—n .-a...lc.ooliσ.-ue _t frac.t—ionnée

A la solution concentrée (71,4 litres) .on ajoute 3570g d'acét de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique.

De açon analogue à celle décrite à 1'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 17-37 (préférentiellement 28%) , et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,20g%, le pH est ajusté à 5,90 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finaie de 50-75 (préférentiellement 60%) .

Après une demi-heure d'agitation à + 4°C, le pH est, si néces saire, ajusté à 6,80. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.

Stade 3 : Déprotéinisation

La polyoside brut (500g poids humide) est mis en solution dans 42 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9.

A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentielle¬ ment 0,2 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et 1'on opère comme à 1' xemple 1, stade 3.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

a) Précipitation alcoolique fractionnée

-36- On opère de f çon analogue à celle décrite à 1'exemple , stade 4a.

A la solution polyosidique obtenue après dialyse (56 litres) on ajoute 7,9 litres de solution CaCl- 4M. On effectue ensuite le fractionnement à l'éthanol, avec une concentration en alcool de 10-35% (préférentiellement 25%) , puis de 50-75% (généralement 60%) . Le précipité (350g poids humide) est récupéré par centrifugation puis dissous dans 36 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M pH 6,9.

b) Traitement au charbon actif

De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution obtenue au charbon actif avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10g% (préférentiellement 1,5%), puis on élimine le charbon et on dialyse.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution obtenue après dialyse (47,7 litres) on ajoute 5700g d'acétate de sodium e-t on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%) . Après 30 minutes d'agitation, et repos à + 4°C pendant 16-18 heures, le précipité est recueilli par centrifugation, puis mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C et centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à 1'exemple 1.

On obtient ainsi 100g de polyoside purifié type 23 ?.

EXEMPLE N°7 : Polyoside pneumococcique type 25

Stade 1 : Culture

-37-

Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite de la régulation du pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 + 0,2.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (600. litres) est réduit à un volume d'environ 100 litres et lavé plusieurs fois par dilution- concentration avec 200 à 300 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est. réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000 (type A icon ou Romicon) .

Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 96 litres par ultrafiltration.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,6g%. Le pK est ajusté à 5,70 par l'acide acétique. De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-35% (pré érentiellement 28,5%) , et, après ultracentrifugatio la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,l4g%, le pH est ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l' éthanol- jusqu'à une concentration finale de l'or¬ dre de 40-70% (préférentiellement 62%) .

Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par ultra¬ centri ugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (335g poids humide) est mis en solution dans

82/01995

-33- 48 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pE 6,9.

A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume (généralement 0,29 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et 1'on opère comme à 1'exemple 1 , stade 3.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

a) Précipitation alcoolique fractionnée

On opère de façon analogue à celle décrite à 1'exemple 1 , stade 4a. ^•

A la solution dialysée obtenue au stade 3 (55,7 litres) on ajoute lentement 8 litres de CaCl-, 4M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentratio de 15-35% (pré érentiellement 30%) , puis de 40-70% (générale¬ ment 62%) . Après décantation, le précipité est récupère par centrifugation puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M pH 6 ,9 (20 litres) .

b) Traitement au charbon actif

De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solutio obtenue par le charbon actif en quantité comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 2g%) , puis on élimine le charbon et on dialyse.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution obtenue après dialyse (27,76 litres) , on ajoute 2760g d'acétate de sodium et on ajuste le pK à 5,80 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentra¬ tion de 40-70% (préférentiellement 62%) . Après 30 minutes d'agitation, le pfï est, si nécessaire, ajusté à 6,30 + 0,1 et on laisse au repos à -r 4°C pendant 16-18 heures. Le précipit

-39- est récupéré par décantation et centrifugation, mis en suspen¬ sion dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther ethylique, puis on sèche, comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 35g de polyoside purifié type 25.

EXEMPLE N°8 : Polyoside pneumococcique type 2

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de fermentation sont celles décrites à l'exemple n°2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le dësoxyσholate de sodium, les débris- cellulaires sont éliminés par centrifugation.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (200 litres) est concentré à 40 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 34,5 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romiσon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétat de sodium jusqu'à une concentration finale de 7,5g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-30% (préférentiellement 18%), et, après ultracentri¬ fugation, jusqu'à une concentration finale de 45-65% (préfé¬ rentiellement 55,5%).

-40-

Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décan¬ tation et centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (690g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.

Après dialyse, le principe actif est extrait de la solution par précipitation éthanolique (concentration finale=45-65%) en présence d'acétate de sodium- Le précipité est récupéré par centrifugation (430g poids humide) et mis en solution dans 12 litres d'eau distillée stérile apyrogène.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

On opère de façon analogue à celle décrite à 1'exemple 1, stade 4a.

A la solution obtenue au stade 3 (12 litres) on ajoute lenteme sous agitation, 4 litres de solution de CaC12 2M. On effectue ensuite la double précipitation à 1'êthanol, d*abord avec une concentration de 15-35% (généralement 25%) , puis, après ultra¬ centrifugation, avec une concentration finale de 45-65% (pré¬ férentiellement 55,5%)."

Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centri¬ fugation.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

Le précipité obtenu au stade 4 est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé

-41 - comme indiqué ci-dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à 1'acétone et à 1'êther ethylique, et on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 69g de polyoside purifié.

EXEMPLE N°9 : Polyoside pneumococcique type 6 A

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de«culture et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans 1'exemple n°l, exception faite du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (2 x 200 litres) préparé comme précé¬ demment décrit est concentré à 40 litres, lavé à l'eau phy¬ siologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré (volume final-≈33,6 litres), sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (type Amicon H10 P10) . Le facteur de concentration varie de 4 à 15 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-35% (préférentiellement 27%) , puis, après ultracentrifugatio la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée

2 1

-42 - à 8,75g%, le pH est ajusté à 5,6 par l'acide acétique, et l'on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%) . Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (469g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à- 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

On opère de façon analogue à l'exemple 1, stade 4a.

Pour cela à la -solution dialysée obtenue au stade 3 (18,2 litres) on ajoute lentement 6 litres de solution aqueuse CaCl.- 2M. Après agitation on ajoute l'éthanol (concentration filiale comprise entre 15 et 35%, généralement 25%) puis le mélange est ultracentri gé, et on ajoute au surnageant de 1'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%) . Le précipité est récupéré par décantation et centrifuga¬ tion.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20 ^β C puis centrifugé comme indiqué ci- dessus.

Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, et on sèche le précipité comme décrit à 1'exemple 1, stade 5.

-43- On obtient ainsi 119g de polyoside purifié type 6A.

EXEMPLE N^lO : Polyoside pneumococcique type 19 F

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales- de fermentation sont celles utilisées à l'exemple n°2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires ^" sont éliminés par centrifugation.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolëe à 0,5% puis à nouveau concentré à 40,3 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acéta de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exempl 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à -une concentration de 15-35% (préférentiellement 27%) , et, après ultracentrifuga¬ tion, la concentration en acétate de sodium du surnagean recueilli est amenée à 7,3%, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 55-75% (préférentiellement 63,5%) , et le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par centrifugation.

OMPI

2/01995

-44- Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (427g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (pré érentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme décrit à 1'exemple 1, stade 3.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1 _/ stade 4a.

A la solution obtenue au stade 3 (18,9 litres) on. ajoute 2,7 litres de solution de CaCl2 4M. On ajoute de l'éthanol (con¬ centration finale en alcool comprise entra 15 et 35%, généra¬ lement 25%) , et, après ultracentrif gation, on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale dé 55-75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

Le précipité est mis en suspension dans trois litres d'éthanol absolu pré—refroidi à -20"C puis centrifugé comme indiqué ci- dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à 1'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 120g de polyoside purifié, type 19 F.

EXEMPLE N°ll : Polyoside pneumococcique type 7 F

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 1, stade 1, exceptions faites de la régulation pH (6,2-6,8) et

-45- de l'addition de glucose (addition toutes les 2h30mn) .

Stade 2 : Purification préliminaire du ool oside pneumococcique

Concentration

Le surnageant de culture (200 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultra iltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (Type- A icon ou Romicon) . Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée (41 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7g%. Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajouté de l'éthanol jusqu'à une concentration de 35-55% (préférentiellement 45%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8,2g% et le pH est ajusté à 6,8 par l'acide acétique, puis on ajouta de l'éthanol jusqu'à une concentration de l'ordre de 60-80% (préférentiellement 75%). Après une demi-heure d'agita¬ tion, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique glacial. Lé mélange est laissé au repos à + 4°C pendant 16 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifu¬ gation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (110g poids humide) est mis en solution dans environ 30 litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préférentiellement 0,15 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1:0,4 vol/vol).

-46-

Après agitation douce (manuelle ou magnétique) pendant enviro 10 minutes pour créer l'émulsion, la solution phénolée est: ultracentrifugée. La phase aqueuse contenant le polyoside est, si nécessaire, soumise à un deuxième traitement phénolique, mais généralement 1 cycle est suffisant.

La phase aqueuse est alors dialysée contre 1' au déminéralisé pendant 16 heures à + 4'C pour éliminer le phénol résiduel.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosi¬ dique dialysée (36 litres) le volume nécessaire d'une suspens de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M pH 6,9 ou dans l'eau distillée apyrogène pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement l,5g%) .

Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 4°C.

Le charbon est ensuite éliminé par filtration.

Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution polyosidique dialysée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à l'obtention d'une concentration de 15g% et on ajuste le pH à 6,00 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation ,vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -20°C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale de 60-80% (préférentiellement 75%) . Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,9 et la solution es laissée au repos à -t- 4°C pendant 16 heures.. Le polyoside est

-47- récupéré par centrifugation. Le précipité est mis en suspen¬ sion dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus.

Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther ethylique, puis- on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade ^' 5.

On obtient ainsi 20g de polyoside purifié type 7F.

EXEMPLE N°12 : Polyoside pneumococcique type 9N

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple n°2, stade 1. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolëe à 0,5% puis à nouveau concentré à 42 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétat de sodium jusqu'à une concentration finale de 6g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On opère comme à l'exemple 1, stade 2, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration

^• ^Q ^' RE ATT ι ^O O ^M M ^H PI

2/01995

-48- de 20-40% (préférentiellement 33%) , puis, après ultracentrifu¬ gation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 6g% , et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement 55,5%).

Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (660g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium, et on opère comme à 1'exemple 1 , stade 3.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

On effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialys en opérant de façon analogue à celle de l'exemple 1, stade 4b.

On ajouta, à la solution polyosidique dialysée (30 litres) obtenue au stade 3, la suspension de charbon actif Norit jusqu'à une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,2 et 8g% (pré érentiellement 3,33%). -

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution obtenue au stade 4 (38 litres) on ajoute 3420g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, de l'étha nol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préféren- - tiellement 55,5%).

Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifu gation, et mis en suspension dans deux litres d'éthanol absol

^/ JREA

-49- pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. L'opération est recom¬ mencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche le précipité, comme à l'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 68g de polyoside purifié type 9N.

EXEMPLE JST°13 : Polyoside pneumococciq-ie type 12 A

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 4.

Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococciqu

Concentration

Le surnageant, de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concen tré à 9 litres- par ultrafiltration à l'aide d'un système Amicon supportant 5 colonnes H10 P10.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute 468g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,8 avec l'acide acétique. En opérant comme à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentra¬ tion de 15-35% (préférentiellement 25%), puis, après ultracen¬ trifugation, la concentration en acétate de sodium du surnagean est amenée à 7,lg%, le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 45-75% (préférentiellement 58,5%) .

Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par cent ifugation.

_/ ^aJRÊ ( O PI ^*

-50- Stade 3 : Déprotéinisation

Le précipité précédemment obtenu (174g poids humide) est mis en solution dans 8 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9.

A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentielle¬ ment 0,5 volume) du mélange froid phénol-acétate de l'exemple 1 _f stade 3, et on opère comme à 1'exemple 1.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

En opérant de façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse.

A la solution dialysée obtenue au stade 3 (7,6 litres) on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 7g% (préférentiellement 3g%) .

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution dialysée obtenue au stade 4 (9 litres) on ajouta 450g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 avec l'acid acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 45-75% (préférentiellement 66,6%), et on ajuste le pH, si nécessaire, à 6,6-6,-8. Le polyoside est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthano absolu pré-refroidi à -20°C et centrifugé. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche le précipité, comme décrit à l'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 2g de polyoside purifié type 12 A.

Le polyoside 12 A, ainsi obtenu, se distingue du polyoside type 12 F par l'absence de galactose dans sa composition chimique.

-51- La détermination quantitative des hexosamines et des oses (glucose, galactose) a été effectuée, après hydrolyse ménagée, respectivement par dosage colorimétrique selon la technique de G. Ashwell, "Methods in Enzymology" 3_ (1957) pages 95-97, S. P. Colowicic & N. 0. Kaplan, Ξds. Académie Press, N. Y. et par dosage spectrophotométrique des co-enzy es" réduits (NADH et NADPH) obtenus après action enzymatique de la galactose déshy- drogënase pour le dosage du galactose et du système pluri- enzymatique hexokinase-glucose 6 phosphate déshvdrogénase pour le dosage du glucose. Le polyoside type 12 A ainsi obtenu contient 33-38% d'hexosamines et 23-28%.de glucose (poids/poid

EXEMPLE N°14 : Polyoside pneumococcique type 14

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2, stade 1.

Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococciqu

Concentration

Le surnageant de culture (30 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à • un volume égal à 9 litres, par ultra iltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (type A icon H10 P10) .

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de

/01995

-52-

15-35% (préférentiellement 20%) , et, après ultracentrifugation la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8g% et le pH est ajusté à 5,8, puis on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8. Le mélange est laissé au repos à ^• +• 4°C pendant 16 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par cent ifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (110g poids humide) est mis en solution dans environ 4 litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pH. 6 , 9 . A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellemen 0,3 volume) de mélange phénol-tampon acétate de sodium, et on opère comme à 1'exemple 1, stade .

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

En opérant de façon analogue à l'exemple 1 , stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela la concentration en chlorure de sodium de la soluti obtenue après dialyse au stade 3 (4,3 litres) est amenée à 0,14M puis on ajoute la suspension de charbon actif Norit à 20g% pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 3,6g%).

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution dialysée (6 litres) obtenue au stade 4 on ajout de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration de 10g% et o ajuste le pH. à 5,8 par l'acide acétique. On ajoute de l'éthan jusqu'à une concentration de 50-70% (préférentiellement 60%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,8. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20" puis centrifugé.

-53- Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche le précipité, comme à 1'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 4,4g de polyoside purifié type 14.

EXEMPLE N°15 : Polyoside pneumococcique type 3

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple n°l, stade 1, exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (200 litres) est réduit à un volume d'environ 80 litres et lavé plusieurs fois à l'eau physio¬ logique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10.000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 50 litres.

Précipitation alcoolique directe

A la solution concentrée on ajoute 2500g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 15-40% (préférentiellement 33,3%) .

Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à +• 4°C. Le précipité est récupéré par

-54- centrifugation. Le précipité recueilli est remis en solution dans 60 litres de tampon- acétate de sodium.0,37M, pH 5,4, puis est à nouveau précipité par addition, sous agitation, de 0,15 à 0,7 volume (préférentiellement 0,5 volume) d'éthanol. Après 30 minutes d'agitation et lβ heures de repos à +• 4°C, le précipité de polyoside brut est récupéré par centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (2180g poids humide) est dissous dans 85 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette soluti est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,2 volume) du mélange . hénol-tampon acétate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

Comme à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela la concentration en chlorure de sodium de la solution obtenue au stade 3 après dia yse (115 litres) est amenée à Q,14M et on ajoute la sus¬ pension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préféren¬ tiellement 4g%) .

Stade 5 : Obtention du polyoside purifie

A la solution dialysée (139 litres) obtenue au stade 4 on ajoute 6950g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concen¬ tration de 15-40% (préférentiellement 33,3%). Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans dix litres d'éthanol absolu pré-refroidi à - 20°C.

Après centrifugation, le processus est recommencé une fois.

-55- On procède ensuite à des lavages à 1'acétone et à 1'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 235g de polyoside purifié type 3.

EXEMPLE N°16 : Polyoside pneumococcique type 8

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrite dans l'exemple n°l, stade 1 exception faite de la régulation • pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (400 litres) est réduit à un volume d'environ 60 litres et lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette concentration est réalisée par ultrafiltration su fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10.000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 51,5 litres.

Précipitation alcoolique directe

A la solution concentrée (51,5 litres) on ajoute 3090g d'acéta de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthano pour obtenir une concentration finale de 18-40% (préférentiel¬ lement 33,3%) .

Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à + 4"C. Le précipité de polyoside brut est récupéré par décantation et centrifugation.

, _ΛΛff /01995

-56- Stade 3 : Déprotéinisation

Le polyoside brut (2260g poids humide) est dissous dans 32 litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pH 6,9. A cette solut est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium, en opérant comme 1'exemple 1, stade 3.

En outre, après dialyse, le polyoside est extrait de la phase aqueuse par précipitation éthanolique en présence de 10g% d'acétate de sodium (pH=5,4), avec 0,15 à 0,7 volume (préfére tiellement 0,37 volume) d'éthanol absolu déshydraté pré¬ refroidi à -20°C.

Stade 4 : Elimination des acides nucléiques

Le précipité du stade 3 (1400g poids humide) est mis en solut dans 27 litres de tampon de sodium 0,14M pH 6,9. Sur cette solution on effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, comme à l'exemple 1, stade 4b, en ajoutant une suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentra¬ tion finale en charbon actif comprise entre 1 et 10g% (préfé¬ rentiellement 10g%) .

Stade 5 : Obtention du polyoside purifié

A la solution obtenue au stade 4 après dialyse (27 litres) on ajoute 1350g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 18-40% (préférentiellement 33,3%), et, après centrif gation, le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à de lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à 1'exemple 1, stade 5.

-57- On obtient ainsi 52g de polyoside purifié type 8.

EXEMPLE N°17 : Polyoside pneumococcique type 6 B

Stade 1 : Culture

Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles décrites dans 1' exemple 9, stade 1, exception faite de la durée de la culture qui est prolongée à 42 heures. La culture est alors stérilisée par le phénol et les germes entiers et les débris cellulaires sont éliminés par centrifu-- gatiαn.

Stade 2 : Purification préliminaire

Concentration

Le surnageant de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concen¬ tré à 8,2 litres. Ces opérations sont effectuées par ultrafiltrati sur fibres creuses Amicon type H10 P10.

Précipitation alcoolique fractionnée

A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de calcium jusqu'à une concentration finale de 5g%, et le pH est—ajusté à 5,4 avec l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute, de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-35% (préférentiellement 25%) , et, après ultracentrifugation, on ajoute au surnageant le volume d'éthanol nécessaire à la précipitation complète du polyoside (concentration éthanolique finale comprise entre 45 et 70%, généralement 50%). Le préci¬ pité de polyoside brut est ensuite recueilli par décantation et centrifugation.

Stade 3 : Déprotéinisation

2/01995

-53 -

La polyoside brut (40g poids humide) est mis en solution dans quatre litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pK 6,9. A ceûr solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,5 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pK 6, (1:0,4 vol/vol) . Après agitation vigoureuse pendant 30 second à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracentrifugé.

La phase aqueuse supérieure est récupérée puis soumise à un deuxième traitement au phénol froid. Le processus, est recom¬ mencé au total 3 fois.

La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisé pendant 18 heures à -s- 4°C.

Stade 4 : Obtention du -polyoside purifié

A la solution dialysée obtenue au stade 3 (5,2 litres) , on ajoute 260g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir la précipitation complète du polyoside (concentration finale en alcool compris entre 45 et 70% (préférentiellement 55,5%) .

Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, puis mi en suspension -dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à - 20°C et centrifugé. Cette opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à 1'acétone et à i'êther ethylique, puis séché comme à l'exemple 1, stade 5.

On obtient ainsi 9g de polyoside purifié type 6 B.

Remarque-; Le polyoside pneumococcique type 6 3 peut être également purifié selon les techniques décrites dans l'exempl 9.

-59- ΞXEMPLE N°13 : Polyoside 7F-

Cet exemple illustre la purification finale par précipitation du polyoside (7F) au sulfate d'ammonium.

La solution de départ sur laquelle est effectuée la précipita tion au sulfate d'ammonium est la solution dialysée obtenue après traitement au charbon actif, c'est-à-dire la solution obtenue à l'exemple 11 stade 4.

La concentration en NaCl est amenée à 0,85g%.

Le pH de cette solution est ajusté à 6,5 par 1' cide acétique dilué et on ajoute lentement, sous agitation, le volume néces¬ saire d'une solution saturée de sulfate d'ammonium, ou la quantité de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ suffisante pour obtenir une concentratio finale en (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ comprise entre 30 et 80g%, préférentielle¬ ment 74g%.

Le mélange est laissé au repos (30 minutes à 4 heures) puis ultracentrifugé à 15.000 rpm pendant 30 minutes.

Le précipité est récupéré et mis en solution dans environ 10 litres d'eau distillée apyrogène. Les sels résiduels sont éliminés par dialyse ou diafiltration.

Le principe actif est ensuite récupéré par précipitation directe à l'éthanol en présence de sels de sodium comme décrit à l'exemple 11, stade 5.

EXEMPLE N°19 : Réalisation et utilisation d'un vaccin

Exemple de formule vaccinale

-^ ^EAy^

-60-

- Polyoside purifié de Streptococcus pneumoniae 50 microgrammes de chacun des 14 types suivants: 1, 2, 3, 4, 6A, 7F, 8, 9N, 12 , 14, 18C, 19F, 23F, 25

- Soluté tamponné isotonique, q.s.p 0,5ml

- Phénol (conservateur) . au maximum l,25mg

Le soluté tamponné isotonique a la formule suivante:

- Chlorure de sodium. 4,15mg

- Phosphate disodique (Na-HPO. , 2H-0)... 0,065mg

- Phosphate monosσdique (NaH_P0 ₄ , 2H ₂ 0) . 0,023mg

- Eau pour préparations injectables 0,5ml

Mode et voie d'administration

Voie sous—cutanée ou intramusculaire.

Exemple de posologie

Adultes : 25 à lOOμg de chaque polyoside en une seule injection.

Enfants : 10 à 50μg de chaque polyoside en une ou plusieurs injections, à quelques semaines d'intervalle.

Indications thérapeutiques

Prévention de 1*infection pneumococcique en fonction de 1'épidémiologie. Elles concernent plus particulièrement:

- les personnes âgées de plus de 50 ans d'une façon générale,

-61 -

- les bronchitiques chroniques, insuffisants respira¬ toires et tabagiques,

- les patients fragilisés par une maladie chronique (insuffisance cardiaque, diabète, insuffisance hépatique ou rénale, cancer viscéral ou alcoolisme chronique) ,

- les splénectomisés,

- les enfants drépanoc taires homozygotes,

- les personnes exposées aux méningites à pneumocoque en raison d'un traumatisme crânien avec fistule osteo-méningée ou d'une otite chronique,

- et probablement les enfants sujets aux infactions otitiques récidivantes ou atteints de syndromes néphrotiques.

Contre-indications

Par prudence, il convient de ne pas utiliser le vaccin antipneumococcique chez la femme enceinte.

Il en est de même pour les personnes présentant une infection aigûe en évolution, en particulier pneumococcique, pour les enfants de moins de 2 ans qui ne s'immunisent pas régulière¬ ment contre plusieurs sérotypes souvent en cause dans 1' in¬ fection pneumococcique à cet âge, et pour les personnes atteintes d'un déficit immunitaire (cancer - chimiothérapie) et en particulier d'une agranulocytose ou d'une aplasie médullaire.

OMPI