La présente invention se rapporte à un procédé de raffinage du squalène produit par voie fermentaire, à partir de microorganismes, plus particulièrement de microalgues, plus particulièrement encore celles issues de la famille des Thraustochytriales sp .

On entend au sens de l'invention par « microalgues de la famille des Thraustochytriales sp . » des microalgues appartenant aux espèces Schizochytrium sp . , Aurantiochytrium sp . et Thraustochytrium sp .

Le squalène est un lipide présent dans tous les organismes supérieurs, et est le précurseur commun des hormones stéroïdes, aussi bien animales que végétales, et de quelques vitamines, comme les vitamines D.

Il est présent dans de nombreuses membranes cellulaires dont il assure ainsi la fluidité.

Cet hydrocarbure linéaire insaturé, est un isoprénoide à trente atomes de carbone et cinquante atomes d'hydrogène, de formule : 2,6,10,15,19,23 — Hexaméthyl

2,6,10,14,18,22 - tétracosahexène, C ₃ oH ₅ o, c'est-à-dire qu'il est constitué de 6 unités isoprènes, toutes en conformation trans .

Il est, comme tous les terpènes, formé à partir du pyrophosphate d'isopentyle qui se couple avec le pyrophosphate de diméthylallyle pour fournir successivement les pyrophosphates de géranyle, puis de farnésyle, dont deux molécules se condensent après réduction par le NADPH pour former du squalène sous l'action de la squalène synthase.

Chez les végétaux et de nombreux microorganismes, cette voie coexiste avec d'autres voies métaboliques conduisant au phytoène, précurseur de la chlorophylle, de pigments caroténoïdes et des terpènes dans les latex.

Le squalène, comme son dérivé époxydé sur la double liaison terminale, possèdent la propriété de se transformer, grâce à des enzymes spécialisées (les cyclases), et de manière remarquablement régio- et stéréosélective, en triterpènes polycycliques d'une grande variété structurale : hopène et diploptérol chez les eucaryotes et tétrahymanol chez les protozoaires (triperpènes pentacycliques ) ; lanostérol chez les levures, les champignons et les mammifères et cycloarténol chez les végétaux (triperpènes tétracycliques ) .

Les applications du squalène .

Le squalène est de longue date, notamment au Japon, utilisé comme complément alimentaire.

C'est d'ailleurs un chimiste japonais, Mitsumaru Tsujimoto, qui l'a découvert en 1906 et a déterminé sa structure en 1916.

Il est considéré comme un antioxydant efficace, doté de nombreuses vertus dans les médecines naturelles.

Parmi ses utilisations classiques, on trouve la cosmétique, quoique l'on y utilise plus couramment son dérivé hydrogéné, le squalane, qui ne s'oxyde pas, donc ne rancit pas .

Lorsqu'il est de haute pureté, associé à des adjuvants stimulants du système immunitaire, le squalène a été, et est toujours, utilisé dans certains vaccins : sous forme d'émulsion « huile-dans-l'eau », il joue un rôle de tensioactif, augmentant ainsi la réponse du vaccin.

On l'utilise dans les vaccins expérimentaux ciblant des virus émergents, comme H5N1 et H1N1, mais surtout en association avec les antigènes de la grippe saisonnière, dans la composition des 22 millions de doses administrées depuis 1997 (le MF59 à raison de 10 mg par dose de FLUAD®) , sans réactions postvaccinales sérieuses.

L'addition d'adjuvants, squalène ou sels d'aluminium (utilisés depuis 1926) , est actuellement nécessaire pour certains vaccins qui, inactivés ou sous-unitaires, ne contiennent pas les signaux permettant au système immunitaire de mettre en œuvre les mécanismes de défense appropriés .

Le squalène évite le recours à des injections répétées pour assurer une bonne protection. Ces usages du squalène renforcent la détermination de l'homme du métier à disposer de procédés sécurisés de production de squalène de haute pureté.

Par ailleurs, cette qualité peut ouvrir d'autres voies d'application dans le domaine médical.

Le couplage chimique du squalène avec des analogues nucléosidiques pourrait ainsi constituer à l'avenir un progrès considérable dans le traitement de certains cancers ou dans des maladies virales type VIH.

Les différentes sources du squalène.

Le squalène est classiquement extrait du foie de requin des profondeurs.

Mais le foie accumule de nombreux composés toxiques, comme les métaux lourds (dont le mercure) et autres toxines liposolubles .

Les études toxicologiques ont montré qu'aux concentrations utilisées dans les cosmétiques, le squalène et sa forme hydrogénée, le squalane, ne présentent pas de toxicité et ne sont pas irritants ou sensibilisants pour la peau humaine.

Cependant, le niveau de pureté du squalène est essentiel lorsque utilisé dans le domaine médical, notamment comme adjuvants aux vaccins.

Il est donc indispensable de disposer de squalène de haute qualité, exempt d'impuretés (traces de métaux, notamment de mercure, et d'autres toxines) .

Un certain nombre de voies de production du squalène, alternatives à son extraction à partir du foie de requin, sont proposées dans la littérature.

En première alternative : il est possible de l'isoler de l'huile d'olive, l'huile de palme, et dans d'autres huiles céréalières ou provenant de l'amarante, des semences, du son de riz, de germes de blé.

Cependant, l'inconvénient majeur est ici que le squalène en est extrait en très faibles quantités, de l'ordre de 0,1 à 0, 7 % en poids, et nécessite de nombreuses étapes de purification lourdes et coûteuses.

En seconde alternative, de premiers procédés de production de squalène ont été proposés à partir de microorganismes, plus particulièrement à partir de levures naturelles ou levures recombinantes, notamment de type Saccharomyces .

C'est ainsi que Saccharomyces cerevisiae est connue pour sa capacité à produire du squalène, toutefois en très faible quantité : de l'ordre de 0,041 mg/g de biomasse (BHATTACHARJEE, P. et al, 2001, dans World J. Microb. Biotechnol . , 17, pp 811- 816) .

L'optimisation de ces capacités de production a donc été travaillée, par le biais de la recombinaison génétique.

Cependant, comme le présente la demande de brevet WO 2010/023551 pour le domaine médical (production de squalène d'une pureté supérieure à 97 % comme adjuvant de vaccins), cette première alternative n'est industrialisable que si l'on peut disposer de levures recombinantes hyperproductrices de squalène (à plus de 15 % en poids de cellules sèches) .

Or, l'obtention de ces cellules recombinantes nécessite la mise en œuvre de nombreuses étapes lourdes, longues et complexes d'ingénierie métabolique, par la mise en œuvre d'outils de biologie moléculaire, conduisant à la stimulation des voies de biosynthèse du squalène et à l'inhibition des voies du catabolisme du squalène.

En effet, comme le rappelle d'ailleurs ladite demande de brevet WO 2010/023551, les gènes impliqués dans la biosynthèse du squalène sont multiples : incluant la mévalonate kinase, la phosphomevalonate kinase, la pyrophosphomevalonate décarboxylase, 1 ' isopentenyl pyrophosphate isomérase, la HMGR ( 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA réductase) , et la squalène synthétase .

Pour les voies du catabolisme, les gènes codant pour de nombreuses enzymes impliquées dans la conversion du squalène en ergostérol incluant la squalène époxidase (ERG1), la lanostérol synthétase, la C14-diméthylase, la dl4-réductase, la C4- méthyloxidase, la C4-décarboxylase (ERG26) , la 3-cétoréductase, la C24-méthyltransférase, la C8-isomérase, la C5-désaturase , la d22-désaturase et la d24-réductase .

Par ailleurs, d'autres enzymes du catabolisme doivent être également considérées : la LEU2 ( [beta] -isopropylmalate déshydrogénase) , l 'oxydosqualène cyclase, la zymostérol-24- méthyltransférase et 1 ' ergosta-5 , 7 , 24 ( 28 ) -triénol-22- déshydrogénase .

En troisième alternative aux procédés d'extraction à partir de foies de requins, ont été proposés des procédés prometteurs de production de squalène à partir de microalgues notamment de la famille des Thraustochytriales (comprenant les genres Thraustochytrium, Aurantiochytrium et Schizochytrium) , plus particulièrement Schizochytrium mangrovei ou Schizochytrium limacinum.

Ces microalgues produisent par ailleurs du squalène en conditions hétérotrophiques (absence de lumière ; apport de glucose comme source carbonée) , et peuvent donc être manipulées aisément par l'homme du métier du domaine de la fermentation des microorganismes .

Chez ces microalgues de la famille des Thraustochytriales, le squalène est cependant le coproduit d'autres composés lipidiques d'intérêt, tel l'acide docosahexaénoïque (ou DHA) , acide gras polyinsaturé de la famille des G)3.

Il apparaît ainsi que le squalène est surtout décrit comme l'un des composants de la fraction insaponifiable des huiles commerciales de DHA (à côté des caroténoïdes et des stérols) .

A titre de comparaison, la souche de Schizochytrium mangrovei FBI produit du DHA à raison de 6,2 % en poids sec de cellules, pour 0,017 % de squalène.

De ce fait, ces microorganismes qui produisent naturellement du squalène le font en faibles quantités :

de l'ordre de 0,1 mg/g de biomasse, pour Thraustochytrid ACEM 6063 (cf. LEWIS et al, Mar . Biotechnol . , 2001, pp 439-447) ,

de l'ordre de 0,162 mg/g de biomasse, pour Schizochytrium mangrovei FBI (cf. JIANG et al, J. Agric. Food Chem. , 2004, 52, pp 1196-1200)

Toutefois, par l'optimisation des productions fermentaires , les spécialistes du domaine sont parvenus à produire de l'ordre de : 1 mg à 1,2 mg de squalène par g de biomasse de Thraustochytride ACEM 6063 (cf. QIAN Li et al, J. Agric. Food Chem., 2009, 57, 4267-4272 ou LEWIS et al, dans Mar . Biotechnol., 2001, 3, 439-447) .

- 0,72 mg de squalène par g de biomasse de Schizochytrium (cf. G. CHEN et al, New Biotechnology, 2010, 27-4, pp 382-389) .

0,53 mg de squalène par g de biomasse d' Aurantiochytrium mangrovei FB31 (cf. K. W. FAN et al, World J. Microbiol. Biotechnol. , 2010, 26-3, pp 1303-1309)

1,17 ± 0,6 mg de squalène par g de biomasse de Schizochytrium mangrovei (cf. C-J YUE et Y. JIANG, Process Biochemisty, 2009, 44, 923-927) .

La société demanderesse a elle aussi contribué à améliorer encore la production de squalène par des microalgues de la famille des Thraustochytriales sp. en proposant un procédé permettant de produire le squalène à un niveau encore jamais atteint dans la littérature du domaine, i.e. d'au moins 8 g de squalène pour 100 g de biomasse (dans ses demandes de brevet françaises en cours d'examen) .

Ainsi, si les microalgues de la famille des Thraustochytriales sp. permettent désormais de produire du squalène en quantité appréciable, il est cependant encore nécessaire de le raffiner pour répondre aux besoins alimentaires, cosmétiques et surtout médicaux.

Un certain nombre de procédés de purification du squalène sont proposés dans la littérature, ces procédés étant adaptés cependant par l'homme du métier aux sources classiques de production du squalène (animale, végétale ou microorganisme de type levure) .

Quatre technologies principales sont généralement mises en œuvre, seule ou en combinaison :

la cristallisation,

la chromatographie ,

la distillation ou

l'extraction à l'aide de fluide supercritique (tel le C0 ₂ supercritique) .

Comme il sera présenté ci-après, les deux dernières technologies sont celles les plus souvent rencontrées. Pour la purification du squalène d'origine végétale, il est par exemple revendiqué, dans la demande de brevet US 2003/130532, un procédé d'extraction des insaponifiables d'une huile végétale comprenant au moins une étape de saponification par laquelle ladite huile est transformée en une solution hydro-alcoolique, une étape d'extraction à contre courant de la solution hydro-alcoolique par un solvant organique tel que le chloro-l-butane, une étape de cristallisation des stérols et/ou des alcools triterpéniques coproduits et enfin l'isolement du squalène par distillation.

De préférence, l'huile végétale traitée est une huile d'avocat ou de soja.

Dans la demande de brevet internationale WO 2010/004193, également à partir de végétaux, pour éviter l'usage de solvants organiques, il est par exemple décrit un procédé global d'extraction des stérols, vitamine E, squalène et autres hydrocarbures à partir des distillats de désodorisation d'huiles végétales .

Après une estérification des acides gras libres, puis une transesterification des acides gras combinés (glycérides et stérides) par le même alcool « court », trois distillations successives permettent de récupérer successivement : les hydrocarbures, puis les esters d'alkyle, et enfin les esters d'alkyle les plus lourds avec le squalène.

Le troisième distillât sert ainsi à la production de squalène qui sera isolé d'une première fraction, avec une deuxième fraction d'hydrocarbures résiduels.

Le résidu de la troisième distillation servira à la production des stérols et vitamine E.

Le procédé permet donc d'extraire chacun des quatre insaponifiables sans aucun solvant d'origine pétrolière et de revendiquer les labels de produits obtenus par des procédés physiques et chimiques naturels.

Mais comme énoncé plus haut, ces procédés d'extraction du squalène végétal restent des procédés difficilement extrapolables à l'échelle industrielle, soit par la mise en œuvre de solvants toxiques, soit par un prix peu attractif. Quant aux procédés permettant la purification du squalène produit par des microorganismes de type S. cerevisiae, ils mettent classiquement en œuvre des méthodes d'extraction par solvant .

Une première étape d'extraction est généralement réalisée au méthanol/chloroforme (2:1) sur les lipides récupérés après lyse cellulaire, suivie d'une étape de chromatographie.

L'extraction par le C0 ₂ supercritique est quant à elle souvent préférée pour minimiser l'utilisation de solvants organiques, comme le présente par exemple l'article de BHATTACHARJEE et SINGHAL, dans World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2003, 19-6, pp 605-608.

On compte également de nombreux articles ou brevets décrivant la mise en œuvre de cette technologie pour extraire surtout le squalène d'origine végétale (telles les demandes de brevet JP 2005/087998 à partir d'huile de palme, ou US 2004/0015033 à partir d'huile d'olive) .

Dans la demande de brevet internationale WO 94/026683, il est présenté un procédé et un dispositif permettant de produire du squalène à partir de résidus d'huile d'olive.

Ce procédé comprend les quatre étapes suivantes : saponification, craquage, estérification des acides gras et extraction par fluide supercritique.

Pour l'extraction par fluide supercritique , on utilise cependant un produit préalablement estérifié avec des catalyseurs métalliques qui est. ensuite pulvérisé dans une tour d' extraction haute pression munie de zones à températures variables .

Ces procédés et dispositifs permettent d'obtenir du squalène commerciali sable d'une pureté de plus de 90%, mais sont difficilement extrapolables à l'échelle industrielle à des coûts attractifs .

Très peu de documents décrivent les modes préférentiels de raffinage du squalène produit par des microalgues.

On peut trouver par exemple l'article scientifique de LU et al, publié dans Journal of Chromatography, 2003, 994, 37-43, qui vante les mérites de la chromatographie à haute vitesse et à contre courant pour la séparation préparative et la purification du squalène produit par Thraustochytrium ATCC 26185.

Selon ces auteurs, cette technologie a le mérite de proposer une méthode bien plus efficace que la CLHP ( chromatographie Liquide haute Pression) plus classique, car elle propose une partition chromatographique unique liquide/liquide sans support solide (et donc sans perte de matière par adsorption irréversible sur ledit support solide) .

Cependant, comme il est détaillé dans cet article, ce procédé n'est envisageable qu'à l'échelle du laboratoire, et nécessite encore une étape préalable d'extraction au méthanol/ chloroforme .

Dans l'état de l'art, quelques travaux préliminaires d'extraction par fluide supercritique ont été entrepris sur Botryococcus braunii , Scenedesmus obliquus ou Torulaspora delbrueckii .

Cependant, les conditions opératoires préconisées sont également difficilement transposables à l'échelle industrielle.

A la connaissance de la société Demanderesse, aucun procédé efficace et industrialisable de raffinage du squalène produit à partir de microalgues, à l'aide de technologie de type fluide supercritique ou distillation moléculaire, n'est réellement accessible à l'homme du métier.

Soucieuse de mettre au point un procédé efficace de raffinage du squalène produit par microalgues, la société Demanderesse a développé ses propres recherches et a réussi à adapter les technologies d'extraction par fluide supercritique et de distillation moléculaire de manière à garantir une richesse en squalène à plus de 95 %, de préférence de plus de 97 %, voire de l'ordre de 100 %.

Ce niveau de pureté permet l'utilisation du squalène ainsi obtenu non seulement dans les domaines médicaux, mais permet d'envisager également son hydrogénation aisée en squalane pour les applications cosmétiques.

La présente invention est donc relative à un procédé de préparation d'une composition de haute richesse en squalène produit par fermentation de microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de purification choisie dans le groupe constitué de l'extraction par C0 ₂ supercritique sur colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait, et de la distillation moléculaire dite de « court trajet ».

Les microorganismes sont préférentiellement des microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales sp . , plus préférentiellement encore des microalgues appartenant aux espèces Schizochytrium sp . , Aurantiochytrium sp . et Thraustochytrium sp .

Au sens de l'invention, on entend par « composition de haute richesse en squalène », une composition présentant une richesse en squalène de plus de 95 % en poids, de préférence de plus de 97 % en poids, plus préférentiellement encore de l'ordre de 100 % en poids.

Mise en œuvre de deux étapes successives d'extraction par C0 ₂ supercritique .

Dans ce premier mode préférentiel de réalisation du procédé conforme à l'invention, on met en œuvre un procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

1) préparer une biomasse de microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales,

2) traiter la biomasse de manière à obtenir une huile brute contenant au moins 10 % en poids de squalène, de préférence au moins 15 % en poids de squalène,

3) fractionner l'huile brute ainsi obtenue par contact avec un fluide à pression supercritique sur colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait de manière à produire un extrait présentant une richesse en squalène compris entre 70 et 75 % et un raffinât présentant moins de 1,5 % de squalène,

4) mettre en contact l'extrait ainsi obtenu avec un fluide à pression supercritique sur la même colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait que celle de l'étape 3) de manière à obtenir une teneur en squalène comprise entre 95 et 99 % en poids,

5) recueillir la composition de squalène ainsi obtenue. La première étape de ce premier mode préférentiel consiste à préparer une biomasse de microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales.

Comme microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales, les souches commercialisées suivantes sont par exemple disponibles :

- Schizochytrium sp . référencée ATCC 20888,

- Aurantiochytrium sp . référencée ATCC PRA 276,

Par ailleurs, la société Demanderesse dispose également de sa propre souche de production, une Schizochytrium sp . déposée le 14 avril 2011 en France auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n°CNCM 1-4469 et également déposée en Chine auprès du CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION de l'université de Wuhan, Wuhan 430072, P.R. China sous le n° M 209118.

La culture est réalisée en conditions hétérotrophiques . Généralement, l'étape de culture comprend une étape de préculture, pour revivifier la souche, puis une étape de culture ou de fermentation proprement dite. Cette dernière étape correspond à l'étape de production des composés lipidiques d ' intérêt .

Les conditions de culture de ces microalgues sont bien connues dans le domaine.

Par exemple dans l'article de G. CHEN dans New Biotechnology, 2010, 27-4, pp 382-389, on trouve un procédé comprenant les étapes successives suivantes :

partir de la souche maintenue sur milieu nutritif gélosée comprenant du glucose, du glutamate monosodique, de l'extrait de levures et des oligoéléments divers,

réaliser une préculture en Erlenmeyers sur agitateur orbital, à un pH de 6, à une température de 25°C afin d'obtenir une biomasse revivifiée,

- ensemencer une autre série d' Erlenmeyers de production, avec le même milieu de culture que celui utilisé en préculture, avec d'environ 0,5 % (v/v) de la biomasse obtenue à l'étape précédente, et maintenir la température à 25 °C.

La seconde étape de ce premier mode préférentiel consiste à traiter la biomasse de manière à obtenir une huile brute contenant au moins 10 % en poids de squalène, de préférence au moins 15 % en poids de squalène.

Ces traitements peuvent être réalisés par toute méthode connue par ailleurs de l'homme du métier, et la richesse de squalène d'au moins 10 % en poids peut être obtenue à partir de la souche CNCM 1-4469 décrite ci-dessus.

Comme il sera exemplifié ci-après, la société

Demanderesse recommande :

d'ajuster la biomasse à une matière sèche comprise entre 6 et 12 %, de préférence à une matière sèche comprise entre 10 et 12 % avec de l'eau déminéralisée, de traiter la biomasse ainsi obtenue à l'aide d'une enzyme de type alcalase de manière à rompre la paroi cellulaire desdites microalgues,

d'ajouter de l'éthanol à plus de 5 % (v/v) , de préférence d'environ 10 % (v/v) dans le mélange réactionnel (forme émulsion huile dans eau)

de centrifuger le mélange réactionnel ainsi obtenu afin de séparer l'huile de la phase aqueuse, de récupérer la phase supérieure huileuse enrichie en squalène .

Cet enrichissement s'entend d'une teneur en squalène d'au moins 10 % en poids, de préférence d'au moins 15 % en poids.

La troisième étape de ce premier mode préférentiel consiste à fractionner l'huile brute ainsi obtenue par contact avec un fluide à pression supercritique sur colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait de manière à produire un extrait présentant une richesse en squalène compris entre 70 et 75 % et un raffinât présentant moins de 1,5 % de squalène

A la connaissance de la société Demanderesse, cette conduite particulière d'extraction du squalène, à l'aide d'une colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre- courant avec reflux d'extrait, n'a jamais été exploitée pour du squalène produit par fermentation de microorganismes en général, et pour des microorganismes de type microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales en particulier. La société Demanderesse a ainsi tiré partie de la différence importante de solubilité entre le squalène (hydrocarbure non polaire) et les triglycérides constituant les lipides de l'huile dans le dioxyde de carbone à pression supercritique, le squalène étant beaucoup plus soluble que les triglycérides .

Pour ce faire, la société Demanderesse a trouvé que l'utilisation d'une colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec un reflux d'extrait, colonne dotée d'un garnissage structuré, permettait d'atteindre de façon inattendue le squalène à haute pureté avec un excellent rendement par rapport à l'huile de départ.

Il est connu de l'homme de l'art que l'extraction par un fluide à pression supercritique conduit à des extraits de très grande qualité.

L'un des avantages principaux des procédés mettant en œuvre les fluides à pression supercritique réside dans la facilité de réaliser la séparation entre le solvant (le fluide) et les extraits et solutés, ainsi qu'il a été décrit dans de nombreuses publications et, pour certains aspects importants de mise en œuvre, dans le brevet français FR 2584618.

L'un des autres avantages importants des fluides supercritiques réside dans leur sélectivité « adaptable » vis-à- vis des composants d'un mélange.

Cette très haute sélectivité est liée aux propriétés particulières des fluides supercritiques, et particulièrement de celles du dioxyde de carbone à pression supercritique : Le pouvoir solvant peut être finement réglé en jouant sur la pression et la température du fluide.

La société Demanderesse a vérifié que des conditions « douces » sont les plus sélectives car le solvant est d'autant plus sélectif que son pouvoir solvant est plus faible.

La société Demanderesse recommande ainsi d'utiliser préférentiellement le dioxyde de carbone pur, plutôt qu'additionné de co-solvant qui augmenterait son pouvoir solvant . Il est choisi également une pression d'opération comprise entre 10 et 50 MPa, préférentiellement comprise entre 15 et 25 MPa, et une température comprise entre 40 et 80 °C.

Le fluide à pression supercritique est pompé à haute pression par une pompe et porté à la température souhaitée dans un échangeur de chaleur avant d'être injecté en pied de colonne à un débit maintenu constant et affiché sur un débitmètre massique .

La charge est injectée via une pompe haute pression au milieu de la colonne dotée d'un garnissage structuré, entre les sections 1 et 2, ou 2 et 3, ou 3 et 4, comptées à partir du bas de la colonne, à un débit maintenu constant et affiché sur un débitmètre massique.

Le fluide chargé de l'extrait sort en tête de colonne après quoi il est partiellement décomprimé vers 6 MPa et envoyé vers plusieurs étages de séparation, comportant notamment des séparateurs cycloniques montés en série, dont le corps est réchauffé par circulation d'eau dans une double-enveloppe.

L'extrait liquide est récupéré en pied de ces séparateurs tandis que le fluide à l'état gazeux est ensuite recyclé de façon classique : condensation dans un condenseur refroidi vers 0 à 5°C, stockage intermédiaire dans un ballon tampon dont le niveau de liquide est maintenu constant par alimentation en fluide frais depuis un stockage extérieur, pompage à haute pression et réchauffage à la température désirée.

Le raffinât est évacué en pied de colonne via une vanne de détente pilotée par une sonde de niveau maintenant ainsi l'interface huile-fluide dans la partie inférieure de la colonne ; afin d'éviter des à-coups de pression préjudiciables au fractionnement dans la colonne, ce raffinât est recueilli dans deux récipients-décanteurs en série, la pression dans le premier étant maintenue à une valeur inférieure d'environ 1 à 4 MPa en-dessous de la pression régnant dans la colonne.

Ces récipients permettent ainsi le soutirage du raffinât sans à-coups avec des pertes minimales de fluide dissous dans le raffinât .

Comme l'a montré la société Demanderesse, la mise en œuvre d'un contact multiétagé à contre-courant du fluide de séparation et de la charge liquide permet de tirer parti au mieux de cette sélectivité du fluide utilisé.

Par ailleurs, le reflux d'extrait contribue notablement à l'amélioration de la sélectivité globale de l'opération de fractionnement .

Le reflux d'extrait est ici provoqué et est soigneusement contrôlé par l'établissement d'un gradient thermique le long de la colonne lorsque le diamètre de celle-ci permet un bon transfert de chaleur aux parois, entre d'une part le fluide en contact avec la charge et d'autre part, l'eau chaude circulant dans la double-enveloppe divisée en plusieurs sections indépendantes pour permettre la mise en œuvre de ce gradient.

En effet, la solubilité de la plupart des composés organiques dans le dioxyde de carbone à pression supercritique, fixée dans une zone allant de la pression critique (soit 7,4 MPa) à 30 MPa, diminue lorsque la température augmente ; ainsi, quand le fluide monte dans la colonne à contre-courant de l'huile, on peut le réchauffer et provoquer ainsi la démixion d'une partie de l'extrait et son reflux en mélange avec l'huile.

Si l'on utilise des colonnes de diamètre supérieur à 200 mm, le transfert de chaleur aux parois devient insuffisant et il est préférable de mettre en œuvre un reflux externe d'extrait, une partie de l'extrait étant séparé en tête de colonne par décompression partielle du fluide sortant de la colonne, cette fraction d'extrait liquide étant alors recomprimée par une pompe et injectée en tête de colonne.

Par ailleurs, les fluides à pression supercritique présentent d'excellentes propriétés de transfert de chaleur et de matière, bien supérieures à celles des liquides, contribuant à l'excellente sélectivité observée.

La quatrième étape de ce premier mode préférentiel consiste à mettre en contact l'extrait ainsi obtenu avec un fluide à pression supercritique sur la même colonne de fractionnement multiétagée fonctionnant à contre-courant avec reflux d'extrait que celle de l'étape 3) de manière à obtenir une teneur en squalène comprise entre 95 et 99 % en poids.

Cette étape d'enrichissement en squalène est conduite dans des conditions similaires à celles de l'étape précédente, mais dans des conditions de pression et de températures légèrement différentes.

Il est ainsi choisi une pression d'opération comprise entre 10 et 30 MPa, de préférence ici comprise entre 10 et 20 MPa, et des températures comprises entre 40 et 80 °C.

La cinquième étape de ce premier mode préférentiel consiste enfin à recueillir la composition de squalène ainsi obtenue .

Comme il sera exemplifié ci-après, la composition ainsi purifiée peut contenir une teneur en squalène supérieure ou égale à 97 %.

Mise en œuvre de la distillation moléculaire .

Dans un second mode préférentiel de réalisation du procédé conforme à l'invention, on met en œuvre un procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

1) préparer une biomasse de microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales,

2) traiter la biomasse de manière à obtenir une huile brute contenant au moins 10 % en poids de squalène, de préférence au moins 15 % en poids de squalène,

3) éventuellement raffiner l'huile brute ainsi obtenue par un enchaînement d'étapes de dégommage, désacidification, décoloration et désodorisation,

4) extraire le squalène par distillation moléculaire dite de "court trajet" de manière à obtenir une fraction légère présentant une teneur en squalène supérieure à 60 % en poids, de préférence supérieure à 80 % en poids,

5) raffiner cette fraction légère par un enchaînement d'étapes de saponification, séparation biphasique, lavage, décoloration et désodorisation, de manière à obtenir un raffinât présentant une teneur en squalène comprise entre 95 et 100 %,

6) recueillir la composition de squalène ainsi obtenue.

La première et seconde étape de ce second mode préférentiel du procédé conforme à l'invention sont identiques à la première et à la seconde étape du premier mode préférentiel présenté ci-avant.

L'huile brute ainsi obtenue est constituée de glycérides (triglycérides majoritaire), d' insaponifiables (squalène majoritaire) et éventuellement d'acides gras libres et de phospholipides en proportions moindres.

Cette huile brute peut préalablement subir un raffinage grossier avant son extraction du squalène par distillation moléculaire.

Une ou plusieurs des étapes suivantes peuvent être envisagées :

- Dégommage : qui permet l'élimination des phopholipides par précipitation en milieu acide ;

- Désacidification : qui assure la neutralisation des acides gras libres par l'emploi d'une base ;

- Décoloration : classiquement mise en œuvre par charbon actif ;

Désodorisation : par distillation sous vide, dite "stripping" vapeur.

Ces étapes de raffinage sont les étapes couramment utilisées en raffinage d'huile végétale.

La quatrième étape de ce second mode préférentiel du procédé conforme à l'invention consiste à extraire le squalène par distillation moléculaire dite de "court trajet" de manière à obtenir une fraction légère présentant une teneur en squalène supérieure à 60 % en poids, de préférence supérieure à 80 % en poids .

Le squalène de l'huile brute éventuellement raffinée est extrait par distillation moléculaire.

Pour un vide poussé, inférieur à 0,1 mbar, le point d'ébullition du squalène est de l'ordre de 200°C.

Ce vide poussé permet de limiter la température et ainsi limiter les risques de dégradation/polymérisation du squalène.

De plus, le temps de séjour est maintenu très faible, inférieur à une minute.

Dans ce barème pression-température-durée de contact, la fraction triglycérides (haute masse moléculaire) n'est pas volatile .

Ainsi, la société Demanderesse a trouvé que dans ces conditions, la distillation moléculaire dite de "court trajet" est une technologie particulièrement appropriée à la séparation de ces deux fractions majoritaires triglycérides et squalène. Les conditions opératoires recommandées par la société Demanderesse sont les suivantes.

A partir du réservoir d'alimentation inerté à l'azote, l'huile est pompée à travers un premier circuit thermostaté dans une gamme de 25 à 100 °C vers le dégazeur (élimination des traces d'eau et solvant) .

En sortie du dégazeur l'huile est pompée dans la chambre d' évaporation ("court trajet") à travers un circuit thermostaté dans une gamme de température de 50 à 150°C.

La température de 1 ' évaporateur est ajustée dans une gamme de 150 à 250°C.

Le condenseur est réglé dans une gamme de température de 0 à 50°C.

La pression dans la chambre d' évaporation est ajustée dans une gamme de 10 ^~2 à 10 ^~4 mbar.

Le distillât contenant majoritairement le squalène et le résidu contenant majoritairement les triglycérides sont acheminés via les circuits de collecte vers les cuves de stockage inertées.

La teneur en squalène dans la fraction légère du distillât est supérieure à 60 % en poids, de préférence supérieure à 80 % en poids.

La cinquième étape de ce second mode préférentiel du procédé conforme à l'invention consiste à raffiner cette fraction légère par un enchaînement d'étapes de saponification, séparation biphasique, lavage, décoloration et désodorisation, de manière à obtenir un raffinât présentant une teneur en squalène comprise entre 95 et 100 %.

La saponification est effectuée préalablement afin d'hydrolyser les glycérides résiduels éventuellement entraînés au cours de la distillation mais également d'hydrolyser les stérols estérifiés.

Ces derniers, alors sous forme libres (plus polaires) seront plus facilement éliminés au cours des étapes suivantes.

La saponification est réalisée à la potasse éthanolique à une température d'environ 80°C sur une durée de 0,5 à 2h. Après refroidissement, les deux phases du mélange issues de la saponification peuvent être alors séparées par décantation ou centrifugation .

Une émulsification est susceptible de complexifier la séparation, un ajout d'eau peut alors faciliter la séparation.

La phase éthanolique concentre les acides gras libres mais également une partie des impuretés polaires générées. La phase huile concentre le squalène.

La phase squalène séparée après saponification est lavée à l'eau.

Plusieurs lavages successifs peuvent être réalisés.

Une eau basique (potassée ou sodée) peut être utilisée pour entraîner les impuretés de saponification résiduelles lors du/des premier (s) cycles (s) de lavage.

Le lavage se termine lorsque que le surnageant issu du lavage à l'eau est à pH neutre.

Entre chaque cycle, les phases (eau de lavage et squalène) sont séparées par décantation ou centrifugation.

A ce stade, la fraction squalène est purifiée d'une partie des stérols ainsi que des glycérides (mono-di- triglycérides ) résiduels.

Une étape supplémentaire de décoloration peut être réalisée à ce stade afin de réduire la coloration jaunâtre.

Cette étape de décoloration est effectuée sur charbon actif de façon similaire à la décoloration classiquement utilisée en raffinage d'huile végétale.

Le raffinage de la fraction squalène se termine par une étape de désodorisation .

La désodorisation est réalisée par "stripping" vapeur sous vide à chaud (150 - 200°C) sur une durée de 0,5 à lh.

Le squalène ainsi purifié est stocké sous atmosphère contrôlée (inertée à l'azote idéalement) .

Un ajout d' antioxydants peut être favorable à la stabilisation de cette fraction.

L'invention concerne également l'utilisation d'une composition de squalène obtenue par la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention, dans les domaines cosmétique, pharmaceutique et médical . L'invention concerne en outre un procédé de préparation d'une composition enrichie en squalane par hydrogénation de la composition de squalène de haute pureté obtenue par la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention, ainsi que l'utilisation de cette composition de squalane dans le domaine cosmétique.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs.

Exemple 1. Préparation d'une huile contenant au moins 10 % en poids de squalène par fermentation d'une microalgue appartenant à la famille des Thraustochytriales , en fermenteur de 20 1

Cet exemple illustre le procédé d'extraction d'une huile enrichie en squalène produite par fermentation de la microalgue Schizochytrium sp . appartenant à la société Demanderesse (déposée le 14 avril 2011 en France auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n°CNCM 1-4469) .

La fermentation a été conduite ici en deux phases de préculture successives préalables avant la phase de culture / production proprement dite en réacteur de 20 1.

Pour cette expérimentation, l'ajout des vitamines a été assuré dans le premier milieu de préculture, mais a été optionnel dans le second milieu de préculture et en production.

Les milieux de préculture présentaient alors la composition présentée dans les tableaux I et II suivants :

Tableau I

Milieu de la première préculture

Glucose 3

Extraits de levure 0,4

Glutamate de sodium 6,42

Na Cl 1,25

MgS04 0,4

KC1 0,05

CaC12 0,01

NaHC03 0,05

KH2P04 0,4

Mélange vitamines 0,14

Oligo-éléments 0,8 Tableau II

D'une manière générale on a utilisé de l' anti-mousse Clerol « FBA3107 » à 1 ml/1. Eventuellement on a utilisé 50 mg/1 de Pénicilline G "sodium sait" afin d'éviter la croissance de bactéries contaminantes.

Le glucose a été stérilisé avec le KH ₂ P0 ₄ et séparément du reste du milieu car on a évité ainsi la formation d'un précipité (Ammonium-Phosphate-Magnésium) . Le mélange des vitamines et les oligo-éléments ont été ajoutés après filtration stérilisante. La composition du milieu de culture / production est donné par le tableau III suivant.

Tableau III

La composition des mélanges de vitamines et des oligoéléments est donnée dans les tableaux IV et V suivants :

Tableau IV

Mélange vitamines g/L

Bl 45

B6 45

B12 0.25 Tableau V

Oligo-éléments g/L

MnC12 2h20 8.60

CoC12 6H20 0.2

NÎS04 6H20 7.50

Na2Mo04 2H20 0.15

ZnS04 7H20 5.70

Cu So4 5h20 6.50

FeS04 7 H20 32.00

ZnC12 1.50

Conditions de précultures

La première préculture a été réalisée en Erlenmeyers de 500 ml munis de baffles, dans lesquels on a ajouté une goutte d' antimousse CLEAROL FBA 3107 commercialisé par la société COGNIS GmbH Dusseldorf.

Le milieu de culture a été filtré après dissolution complète de ses constituants, complété éventuellement avec de la pénicilline G "sodium sait" à raison de 0,25 mg/1.

L'inoculation a été réalisée par prélèvement de colonies de microalgues cultivées en boîte de Pétri (à raison d'une oese de 10 μΐ) .

L'incubation a duré 24 à 36 heures, à une température de 28°C, sous agitation à 100 rpm (sur agitateur orbital) .

La biomasse décantant (ou adhérant à la paroi), on a pris bien soin de prélever 3 à 5 ml après avoir bien agité 1 ' Erlenmeyer .

Pour la seconde préculture, on a utilisé des Erlenmeyers de 2 1, muni de baffles et de tuyauterie.

On a ajouté une goutte d' antimousse et l'extrait de levures dans 100 ml d'eau.

L'ensemble des constituants du milieu a été filtré après dissolution dans 300 ml d'eau déminéralisée. On pouvait éventuellement ajouter de la pénicilline G "sodium sait" et au préalable dans l' Erlenmeyer une goutte d' antimousse avant sa stérilisation.

L'ensemencement s'est fait ensuite avec 3 à 5 ml de la première préculture.

L'incubation a été réalisée à 28°C pendant encore 24 à 36 heures, sous agitation à 100 rpm. Production en réacteur de 20 1

La culture proprement dite a été réalisée de la manière suivante en réacteur de 20 1.

stérilisation du milieu pour partie dans le réacteur, et séparément pour l'autre partie de manière à éviter la formation d'un précipité,

ensemencement réalisé à partir de la biomasse produite en fin de seconde préculture à raison de 0,5 % v/v du milieu de culture,

culture maintenue à 30 °C

taux de transfert d'oxygène fixé à 35 - 40 mmoles/l/h, - aération de 0,2 à 0,3 WM,

pH initial > 5,5.

alimentation du glucose dès que la concentration est > 20 %, de manière à maintenir une concentration en glucose comprise entre 15 et 70 g/ 1.

Le tableau IV suivant présente les résultats obtenus la Schizochytrium sp. de la société Demanderesse.

Tableau IV :

Récupération de la biomasse

La biomasse extraite du fermenteur et lavée des solubles interstitiels par succession de deux séries de concentration par centrifugation (5 minutes à 5000 g) et dilution de la biomasse (à raison de 1/3 Vculot / Veau) .

La concentration cellulaire sèche sur la matière sèche brute totale est de 95 %.

La matière sèche est ensuite ajustée à 12 % avec de l'eau distillée . Obtention de l'huile brute enrichie en squalène

La biomasse lavée est agitée dans un réacteur labo de type Fermenteur 2 1 (tel que ceux commercialisés par la société Interscience) équipé avec une hélice marine et chicanes.

Ce système permet de limiter 1 ' émulsification du lysat cellulaire généré tout en permettant un bon mélange indispensable pour l'action de l'enzyme lytique.

La température est ajustée à 60°C et le pH est régulé à environ 8 avec de la soude.

Ces conditions sont optimales pour l'activité de l'enzyme Alcalase (Novozymes) ajoutée à hauteur de 1%/sec.

La durée de la lyse est fixée à 4 h.

En fin de lyse, on ajoute 10 % d'éthanol (V _éthano i/Vi _ysat ) dans le mélange réactionnel (émulsion huile dans eau) maintenue 15 min supplémentaires sous agitation.

Le lysat est centrifugé 5 minutes à 12000g. L'huile, contenant le squalène, ayant déphasé en surface est ainsi extraite .

Exemple 2 Préparation d' une huile contenant au moins 10 % en poids de squalène par fermentation d'une microalgue appartenant à la famille des Thraustochytriales , en fermenteur de 1 m ³

A partir d'une production effectuée dans un fermenteur de 1 m ³ (conditions de fermentations similaires à celles de l'exemple 1) , la biomasse est extraite du fermenteur par une pompe volumétrique SEEPEX alimentant une sédicanteur Flott eg S3E.

La biomasse est de cette façon concentrée à 200 g/1.

Le concentrât est dilué dans une cuve 1 m ³ avec de l'eau décarbonatée (1 volume d'eau / volume de concentrât) puis reconcentrée par la même opération que celle décrite précédemment pour obtenir 620kg de biomasse lavée et concentrée à 110 g/1.

La biomasse est maintenue sous agitation à 150 rpm dans une cuve 1 m ³ , et est chauffée à 60°C.

Le pH est alors ajusté à 8 à la potasse 45 %. L'enzyme, l'Alcalase 2, 4L FG de NOVO, est ajoutée à hauteur de 1 % (/biomasse sèche) . Les paramètres de lyse sont maintenus pendant 6 h.

La qualité de la lyse est suivie au microscope optique et par centrifugation d'échantillons (2 min, 10000 g) .

En fin de lyse, 60 1 d' éthanol (~10 % vol/vol) sont ajoutés dans la cuve maintenue à 60 °C sous agitation.

De la même façon que dans l'exemple 1, La température est ensuite relevée à 80°C et on centrifuge ensuite sur module de centrifugation ALPHA LAVAL CLARA 20, configuré en mode concentrateur à 3 sorties.

Cette configuration est particulièrement bien adaptée pour la séparation d'un mélange triphasique de type solide/ liquide/1iquide .

La mise en rotation à 9 600 tr/min permet d'atteindre environ 10 000 g.

L'alimentation en lysat cellulaire est réalisée à l'aide d'une pompe volumétrique à un débit de 100 à 400 1/h.

L' interface entre la phase lourde et la phase légère est déplacée en réglant la contrepression en sortie phase lourde.

La fréquence d' autodébourbage est réglée sur une fréquence de 2 à 15 min.

13 kg d'huile brute riche en squalène sont ainsi récupérés avec un rendement de plus de 50 %.

Exemple 3 Extraction du squalène par distillation moléculaire

Une huile brute contenant 21,8 % de squalène est obtenue par extraction à partir d'une biomasse de microalgues préparée selon l'exemple 2.

A partir du réservoir d'alimentation inerté à l'azote, 8 kg d'huile sont pompés à 3,5 kg/h vers le dégazeur à une température de 120°C.

En sortie du dégazeur, l'huile traverse la chambre d' évaporation ("court trajet") à travers un circuit maintenu à 85°C. La température de 1 ' évaporateur est ajustée à 220°C. Le condenseur est réglé sur une température de 20 °C. Le vide dans la chambre d' évaporation est poussé au maximum (< 10 ^~3 mbar) .

Le distillât contenant le squalène et le résidu contenant les triglycérides sont acheminés via les circuits de collecte vers les cuves de stockage inertées. A ce stade, environ 1,5 kg de distillât et 6 kg de résidu sont récupérés.

La teneur en squalène (pourcentage massique issu d'une analyse par RMN) dans le distillât est égale à 94 %.

La teneur en squalène du résidu est inférieure à 2 %.

La suite des opérations de raffinage est réalisée ici à partir d'un échantillon de 10 g de squalène extrait par distillation moléculaire comme décrit précédemment :

L'opération de saponification est effectuée en milieu potassé (2N) en respectant le rapport 1/2 (m _hui i _e / m _potasse ét anoiique) avec solvant éthanolique (rapport 9/1 (m _éthano i/m _eau ) .

Le milieu de saponification est maintenu à 80°C en reflux pendant 45 min.

La teneur en acide gras libre augmente ainsi de 0,29 à 3, 1 (ge . acide oléique / ~° giiuile) ·

Ces acides gras libres proviennent en partie de l'hydrolyse des stérols estérifiés.

Les deux phases du mélange de saponification partiellement émulsifié sont séparées par centrifugation (10 min à 25 000 g) .

La phase huile extraite (squalène) est lavée à l'eau légèrement potassée (rapport 3/1 (m _eau /m _hui i _e ) .

Le lavage est répété à l'eau pure jusqu'à obtenir un surnageant à pH neutre.

La séparation entre chaque étape de lavage est réalisée par centrifugation 10 min à 25 000 g.

7 g de squalène sont obtenus à ce stade avec un rendement de 70%.

La fraction purifiée par saponification est décolorée au charbon actif (5 %/huile) sous agitation puis, le charbon actif est séparé par filtration à 0,2 μιτι.

L'étape finale de désodorisation est réalisée par stripage vapeur à 180°C sous vide pendant 30 min. Le squalène purifié ainsi obtenu présente une pureté proche de 98 %.

La résolution de l'analyse RMN ne permet pas d'obtenir une valeur précise de pureté mais permet d'évaluer le taux d'élimination des impuretés aux alentours de 75 %.

Exemple 4. Raffinage du squalène par la mise en œuvre de deux étapes successives d'extraction par C0 ₂ supercritique

On a utilisé 200 litres d'huile renfermant plus de 15 % de squalène produites à partir d'algues Schizochytrium cultivées dans un fermenteur de 10 m ³ selon des conditions opératoires voisines des exemples 1 et 2.

Cette huile contient plus particulièrement des triglycérides principalement avec des acides gras :

- à chaînes courtes en C14, C16 pour 27%,

- à chaînes longues en C20 et surtout en C22 pour 43% et à côté de cette quantité importante d' insaponifiables essentiellement constitués de squalène (~15,5%) .

L'objectif consiste à obtenir d'une part du squalène purifié à plus de 95% et, d'autre part, une huile débarrassée de squalène .

Le procédé de fractionnement mis en œuvre selon l'invention comprend donc deux étapes que l'on peut résumer ainsi :

- Etape 1 : Fractionnement de l'huile brute par contact avec un fluide à pression supercritique délivrant un extrait riche en squalène et un raffinât débarrassé de squalène ;

- Etape 2 : Purification du squalène par fractionnement de l'extrait obtenu à l'étape 1, par contact avec un fluide à pression supercritique ;

Ce fractionnement repose sur la différence importante de solubilité entre le squalène (hydrocarbure non polaire) et les triglycérides constituant les lipides de l'huile, le squalène étant beaucoup plus soluble que les triglycérides.

Les deux étapes de fractionnement sont opérées sur une colonne de fractionnement à garnissage fonctionnant à contre- courant avec reflux interne d'extrait. L'unité de fractionnement mise en œuvre est équipée d'une colonne de fractionnement à contre-courant d'un diamètre intérieur 125 mm et d'une hauteur de 8 m permettant d'établir un gradient de température selon 4 sections de 2 m.

Cette colonne est remplie d'un garnissage haute performance (type Sulzer BX) . Cette unité est entièrement automatisée et permet un fonctionnement en continu.

Etape 1 : Traitement de l'huile brute en vue d'extraire le squalène

L'huile est introduite dans la colonne entre les sections 3 et 4, comptées en partant du bas de la colonne. Les paramètres du procédé sont présentés dans le Tableau V suivant.

Tableau V

Le squalène est ainsi récupéré dans l'extrait avec une concentration relativement élevée.

Le traitement de l'huile brute a permis l'extraction de la plus grande partie du squalène.

Etape 2 : Purification du squalène :

Le fractionnement supercritique du squalène est conduit une nouvelle fois dans des conditions similaires à celles opérées sur l'huile brute, mais à des conditions de pression et température légèrement différente comme indiqué sur le tableau VI suivant . Tableau V

Ce procédé mettant en œuvre deux étapes successives d'extraction par C0 ₂ supercritique permet de garantir l'obtention d'une composition d'une richesse en squalène de