(Priorität: Deutsche Patentanmeldung 10 2021 000 060.9, 7. Januar 2021)

Erfinder:

Dr. Johann von Hase, Heidelberg/Germany Prof. Dr. Udo Birk, Chur/Switzerland Prof. Dr. Bruno Humbel, Okinawa/Japan Prof. Dr. Christoph Cremer, Heidelberg/Germany ¹⁾

¹⁾ Leitender Erfinder & Vertreter der Erfindergemeinschaft

Zusammenfassung

Die Erfindung beschreibt ein lichtmikroskopisches Verfahren mit sehr großem Arbeitsabstand bei gleichzeitig sehr hoher Auflösung, das eine direkte Integration in ein fokussiertes lonenstrahl-Rasterelektronenmikroskop oder in andere Systeme der Mikroskopie zur optischen Analyse oder lichtinduzierten Bearbeitung von biologischen Objekten und medizinischen Präparaten sowie von Materialproben erlaubt.

Verwendete Einheiten, Abkürzungen und Symbole

1 Nanometer = 1 nm = 10 ⁹ Meter 1 Mikrometer = 1 μm = 10 ^-6 Meter NA = Numerische Apertur (Spezifikation des Objektivs) λ Wellenlänge des Lichts (Vakuum), auch anstelle der Spezifikationen λ _exc ,λ _MINFLUX oder λ _STED λ _exc Wellenlänge des zur Anregung/Beleuchtung verwendeten Lichts (Vakuum) λ _MINFLUX Wellenlänge im MINFLUX Mode λ _STED Wellenlänge im STED Mode

G = Konstante zur Bestimmung des Auflösungsvermögens von Objektiven n = Brechungsindex (optische Eigenschaft) α: Die mit a bezeichneten Winkel sind die Winkel zwischen der Optischen Achse und den von den einzelnen Quellen S _i gemäß Abb. 1 ausgehenden Emissionen (Strahlrichtung definiert durch die Richtung des Wellenvektors), wobei der Scheitelpunkt von α der Fokusmittelpunkt O gemäß Abb. 1 ist; α _min ist der Winkel zwischen der Optischen Achse und dem Wellenvektor des innersten Strahles (kleinster Abstand einer Quelle S auf dem Ring-Array gemäß Abb. 1) von der Optischen Achse; α _max ist der Winkel zwischen der Optischen Achse und dem Wellenvektor des äußersten Strahles (größter Abstand einer Quelle S auf dem Ring-Array) von der Optischen Achse). a.u. (arbitrary units) = willkürliche Einheiten

CLEM (Correlated Light and Electron Microscopy) = korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie

Ring-Array = Ring-Array Anordnung: Erfindungsgemäße Anordnung von Quellen kohärenter Strahlung in einem Ring-Array gemäß Abb. 1 - 8, 10

Depletion = Löschung der Fluoreszenz durch stimulierte Emission

EM = Elektronenmikroskop(ie)

SEM (Scanning Electron Microscope(y)) = Rasterelektronenmikroskop(ie)

FIB-SEM (Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscope (y)) = Fokussierte(s) lonenstrahl - Rasterelektronenmikroskop(ie)

FWHM (Full-Width at Half-Maximum) = Halbwertsbreite = HWB

MINFLUX (MINimal emission FLUXes) = Minimale Emissionsflüsse: Hier: Eine spezielle Methode der Einzelmolekülmikroskopie unter Verwendung einer Torus („Donut“) förmigen Intensitätsverteilung

PSF (Point Spread Function) = Punktspreizfunktion

ROI(Region of Interest) - interessierender/interessanter Bereich

SBF (Serial Block Face) = Eine Methode zur Generierung hochaufgelöster dreidimensionaler Bilder in der Rasterelektronenmikroskopie SIM (Structured Illumination Microscopy) = Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung

SIMFLUX (Structured Illumination Microscopy with minimal emission FLUXes) = Eine spezielle Methode der Einzelmolekülmikroskopie unter Verwendung einer Intensitätsverteilung wie bei Mikroskopie mit Strukturierter Beleuchtung oder anderen ausgedehnten Beleuchtungsmustern.

SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) = Einzelmolekül basierte Lokalisationsmikroskopie = Einzelmolekülmikroskopie

SRM (Super Resolution Microscopy) = Superauflösende Lichtmikroskopie

STED (STimulated Emission Depletion) = Stimulierte Emissionsdepletion

STEM (Scanning Transmission Electron Microscope) = Rastertransmissionselektronenmikroskop(ie) (RTEM)

TEM (Transmission Electron Microscopy) = Transmissionselektronenmikroskopie Torus („Donut“) = „Reifenförmiges“ Objekt, das man erhält, indem man um einen Ring mit einem ausgeprägten Minimum (typischerweise eine Nullstelle) zwischen zwei Maxima im Abstand R zur Realisierung von STED/MINFLUX Mikroskopie;

WD (Working Distance) = Arbeitsabstand des Objektivs; hier : Arbeitsabstand L _array der Objektebene (Fokus) von der erfindungsgemäßen Ring-Array Ebene (Abb.1).

Ω (Raumwinkel) = Flächeninhalt A einer Teilfläche F einer Kugeloberfläche mit Radius R, dividiert durch das Quadrat des Radius R der Kugel, wobei die Teilfläche von beliebiger Umrissform sein kann (Abb. 18).

Anlagen

1) Abbildungen (1 - 19)/2 Tabellen

2) Patentansprüche (1 - 36)

Stand der Technik

Die Ultrastrukturmikroskopie wie zum Beispiel die Transmissionselektronenmikroskopie, die Mikroskopie mit fokussierten ionisierten Teilchenstrahlen, die Röntgenmikroskopie oder die Tomographie mit Röntgenstrahlen (im Folgenden als “Ultrastrukturmikroskopie” bezeichnet), kann feine strukturelle Details weit unterhalb der konventionellen lichtoptischen Höchstauflösung von ca. 200 nm aufdecken, in besonderen Fällen sogar bis auf die Auflösungsebene von weniger als 1 nm. Das Auffinden der Region von Interesse (ROI) kann jedoch bei diesen Verfahren sehr zeitaufwändig sein. Die Fluoreszenzmikroskopie bietet andererseits eine einfache Möglichkeit zum „Screening“ großer Objektflächen, um fluoreszenzmarkierte oder autofluoreszierende Strukturen von Interesse zu finden, die anschließend mit Ultrastrukturmikroskopie weiter analysiert werden. Mit der superauflösenden Lichtmikroskopie (SRM) gemäß dem Stand der Technik können die fluoreszierenden Strukturen bis auf wenige Zehn Nanometer aufgelöst werden. Unter optimalen Bedingungen kann sogar das Auflösungsniveau bis in den Bereich von 1 nm verbessert werden.

Ein gegenwärtiger wesentlicher Nachteil dieser SRM-Techniken besteht jedoch darin, dass nur die fluoreszenzmarkierten Elemente abgebildet werden können, und es keine Korrelation zu den nicht gefärbten zellulären Strukturen mit dem entsprechend erhöhten Auflösungsniveau gibt.

Dieser Umstand führte zur Entwicklung der sogenannten korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), bei der die Lichtmikroskopie verwendet wird, um das Ziel zu identifizieren und den interessanten Bereich zu finden, während die Elektronenmikroskopie (oder andere Ultrastrukturmikroskopieverfahren wie z.B. die Röntgentomographie) die hochaufgelösten Bilddaten und den strukturellen Kontext liefert. Je besser die optische Auflösung (Objektebenenkoordinaten: x, y; Koordinaten entlang der optischen Achse: z) des verwendeten Lichtmikroskopsystems ist, desto nützlicher wird das CLEM-Verfahren. Darüber hinaus sind Licht- und Elektronenmikroskopie/Ultrastrukturmikroskopie aufgrund unterschiedlicher Kontrastmechanismen komplementäre Techniken zur Strukturaufklärung; Je besser die optische Auflösung der Lichtmikroskopie ist, desto informativer und nützlicher ist die Kombination dieser beiden optischen Ansätze.

Superauflösende Lichtmikroskopie

Aufgrund neuartiger Entwicklungen in der optischen Technologie und Photophysik (Hell 2009; Cremer 2012; Cremer & Masters 2013; Ehrenberg 2014; Sydor et al. 2015) ist es möglich geworden, die klassische Beugungsgrenze für Objektive mit hoher numerischer Apertur (NA) (ca. 200 nm in der Objektebene, 600 nm entlang der optischen Achse) der konventionellen Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abbe 1873; Rayleigh 1896) radikal zu übenwinden. Beispiele für diese Methoden der verbesserten Auflösung der Femfeld-Fluoreszenzmikroskopie durch „Super-Resolution“ - Mikroskopie (SRM) sind die 4Pi-Mikroskopie (Cremer & Cremer 1978; Hell et al. 1994; Hänninen et al. 1995); die Lokalisationsmikroskopie unter Verwendung von Quantendots (Lidke et al. 2005) oder von Nanographenen (Xiaomin et al. 2019); von photoaktivierten Proteinen (Betzig et al. 1995, 2006; Hess et al. 2006; Lemmer et al. 2008) oder Standardfluorophoren (Cremer et al 1996, 1999; Esa et al. 2000; Rust et al. 2006; Reymann et al. 2008; Heilemann et al. 2008); die STED (Stimulated Emission Depletion)-Mikroskopie (Hell & Wichmann 1994; Hell et al. 1999; Hell 2009); oder die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (Heintzmann & Cremer 1999; Gustafsson 2000; Albrecht et al. 2002; Baddeley et al. 2007). Verschiedene Modifikationen der Lokalisationsmikroskopie (hier als SMLM bezeichnet) wurden mit unterschiedlichen Namen (Masters & Cremer, 2013) bezeichnet (z. B. Pointillism, PALM, FPALM, SPDM, STORM, dSTORM usw.). Im Rahmen dieser Patentanmeldung können alle diese "Super-Resolution Mikroskopie" (SRM)-Methoden erfindungsgemäß nach dem Stand der Technik angewandt werden. Bei den genannten SRM-Ansätzen wird sowohl die optische Auflösung (kleinster detektierbarer Abstand zwischen zwei benachbarten Punktquellen gemäß den Beziehungen (1) und (2)) als auch die strukturelle Auflösung (kleinstes strukturelles Detail, das beispielsweise anhand der Dichte der aufgelösten Punktquellen bestimmt wurde; Birk et al., 2017) sehr wesentlich verbessert.

Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik erlauben diese SRM-Verfahren unter Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) derzeit eine lichtoptische Auflösung von Biostrukturen bis zu etwa 5 nm (Galbraith und Galbraith 2011 ; Cremer et al. 2011), entsprechend ca. 1/100 der zur Fluoreszenzanregung verwendeten Wellenlänge λ _exc . Kürzlich wurde ein auf der Laser-Rastermikroskopie basierendes SRM-Verfahren namens MINFLUX (Balzarotti et al. 2017; Gwosch et al. 2020) beschrieben, durch das eine lichtoptische Auflösung bis in den Bereich von 1 nm realisiert werden kann. Nach dem Stand der Technik erfordert auch dieses letztere Verfahren Objektive mit hoher Numerischer Apertur (NA).

Die o.g. SRM Verfahren ermöglichen es, eine verbesserte laterale optische Auflösung jenseits der durch die Beziehung d _min = G × λ _exc /NA (1) angegebenen Grenzen bereitzustellen.

Dabei ist λ _exc die für die Fluoreszenzanregung angewendete Wellenlänge im Vakuum, NA die numerische Apertur der verwendeten Objektivlinse und „lateral“ die optische Auflösung in der Objektebene; NA = n sina, wobei n der Brechungsindex des Materials und a die Hälfte des Öffnungswinkels zwischen einem Punkt des Objekts und der Frontlinse des verwendeten Objektivs ist. In dem hier offenbarten Verfahren der Ring-Array Beleuchtung wird dem entsprechend unter a auch die Hälfte des Öffnungswinkels zwischen einem Punkt des Objekts und der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung verstanden (s. Abb. 1).

Für die Konstante G wird üblicherweise der Wert 0,61 angenommen (Rayleigh 1896). Nach dem Stand der Technik werden anstelle des Faktors G = 0,61 manchmal auch kleinere Faktoren zwischen 0,4 und 0,6 angegeben.

Fernfeldmikroskopie-Verfahren, die eine im Vergleich zu (1) verbesserte Auflösung bewirken (d.h. d _min < G x λ _exc /NA) werden als „Nanoscopy“ oder "Super-Resolution Microscopy" (SRM)-Methoden bezeichnet (Cremer 2012; Cremer & Masters, 2013). Der Begriff "Objektiv" bezeichnet dabei eine optische Vorrichtung, die aus für Licht (sichtbarer bis naher ultravioletter Spektralbereich) transparenten Elementen besteht und typischerweise eine oder mehrere Linsen aus Glas oder anderen transparenten Materialien enthält. Für den Zusammenhang der lateralen Halbwertsbreite (Full-Width- at-Half Maximum/FWHM _lateral ) der entsprechenden lateralen Punktspreizfunktion (PSF) mit der lateralen optischen Auflösung gemäß Beziehung (1) wird üblicherweise der Faktor G = 0.61 oder 0,51 angenommen; je nach Anwendung sind auch etwas abweichende Faktoren G möglich. “PSF” bezeichnet hier die normalisierte Intensitätsverteilung eines „punktförmigen“ (Durchmesser « Wellenlänge λ _exc ) fluoreszierenden Objekts gemäß der Definition des Standes der Technik. Da diese geringfügigen Unterschiede für die hier offenbarte Erfindung nicht relevant sind, basieren Beispielberechnungen auf Beziehung (1) mit dem Faktor G = 0,61 bzw. FWHM _lateral = 0,51.

Als Schätzwert für die konventionelle optische Auflösung der Fernfeld- Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines einzelnen Objektivs entlang der optischen Achse des Mikroskopsystems gemäß dem Stand der Technik werden die Abschätzungen d _axial ⁼ 2λ _exc n/NA ² (2a) oder d _axial = (G- λ _exc )/ [(n-sqrt(n ² -NA ² )] (2b) genutzt, wobei angenommen wird, und λ _exc , n, NA die gleiche Bedeutung wie in Beziehung (1) haben. Bei anderen Abschätzungen von d _axial und FWHM _axial (FWHM entlang der optischen Achse des Mikroskopsystems) wird jeweils ein geringfügig anderer Faktor als 2 erhalten (zwischen 1 und 2); Da diese kleinen Unterschiede jedoch für die hier offenbarte Erfindung nicht relevant sind, basieren Beispielberechnungen für d _axial und FWHM _axial auf Beziehung (2a).

Lichtoptische Mikroskopietechniken mit einer verbesserten axialen Auflösung in Bezug auf Beziehung (2) werden ebenfalls unter dem Begriff "Superauflösung" zusammengefasst. Dies ist der Fall z.B. für die konfokale Laser-Scanning-4Pi- Fluoreszenzmikroskopie, basierend auf zwei gegenüberliegenden Objektiven mit hoher NA (Hell & Stelzer 1992; Hell et al. 1994), die im Vergleich zur herkömmlichen Schätzung (z.B. λ _exc = 488 nm; NA = 1.4; n = 1.515) von d _axial = 2 x 488 nm x 1.515 /1 ,4 ² = 750 nm (gemäß Gl. 2a) bzw. d _axial = 0.88 x 488 nm/[(1.515 - sqrt(1.515 ² - 1.4 ² )] = 460 nm (gemäß Gl. 2b) eine stark verbesserte axiale Auflösung (FWHM _axial ) von etwa 80 - 100 nm ergeben.

Weiterhin wird in allen hier vorgestellten beispielhaften Ausführungsformen, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, λ _exc = 488 nm für die Anregungswellenlänge und n = 1 (Vakuum) für den Brechungsindex zwischen dem Objekt und dem Fluoreszenzdetektionssystem verwendet, bzw. n = 1.31 für den Brechungsindex einer in Eis eingebetteten Probe. Beispielwerte für andere Anregungswellenlängen und numerische Aperturen werden leicht aus den Beziehungen (1) und (2) erhalten (Born & Wolf 1980; Feynman 2006).

Als Maß für die dreidimensionale optische Auflösung („Volumenauflösung“) gilt die Beziehung (Stelzer und Lindek 1994)

Vobs = 4/3 π * FWHM _{lateral x} /2 * FWHM _{lateral y} /2 * FWHM _axial /2 (3) wobei

Vobs als Beobachtungsvolumen bezeichnet wird,

FWHM _lateralx die Halbwertsbreite der PSF in der Koordinatenrichtung (x) der Objektebene (x,y), (Für die Definition der Koordinatenachsen bzw. deren Bezeichnungen siehe Abb. 1);

FWHM _lateraly die Halbwertsbreite der PSF in der zu (x) orthogonalen Koordinatenrichtung der Objektebene (x,y), und

FWHM _axial die Halbwertsbreite der PSF entlang der optischen Achse (z) des zur Fluoreszenzdetektion verwendeten optischen Systems darstellt.

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie

Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist für die Probenvorbereitung bei Raumtemperatur gut etabliert (für eine Übersicht siehe Loussert, Fonta und Humbel, 2015); aber für die Kryo-Elektronenmikroskopie müssen noch einige Herausforderungen bewältigt werden. Insbesondere ist es beim Stand der Technik schwierig, den interessierenden Bereich auszuwählen, der im FIB-SEM-Modus untersucht werden soll.

Die Verwendung eines dedizierten Lichtmikroskopes (Verwendung von ölobjektiven hoher Numerischer Apertur, z.B. NA = 1,4) außerhalb des FIB-SEMs führt zu einer besseren x,y und z Auflösung bei Raumtemperatur. Kryoproben dagegen können nicht mit Ölimmersionsobjektiven abgebildet werden, wodurch die Numerische Apertur (NA) nicht grösser als 1 werden kann.

Ein Ansatz zur Durchführung von CLEM bei verbesserter lichtoptischer Auflösung ist die Verwendung der strukturierten Beleuchtungslichtmikroskopie (SIM) gemäß dem Stand der Technik (Gustafeson 1999; Gustafsson et al. 2000; Heintzmann & Cremer 1999). In Verbindung mit einer Objektivlinse (Ölimmersion) mit hoher Numerischer Apertur (NA) ermöglicht SIM eine (x, y) -Auflösung von etwa 100 nm und eine z- Auflösung von etwa 300 nm.

Nachteile der heutigen Technik der integrierten CLEM -Technologie

Eine sehr attraktive Methode besteht darin, die Analyse direkt im FIB-SEM durchzuführen, z.B. unter Verwendung des Verfahrens von de Winter et al. (2013). Die STEM-Tomographie bei 200 keV in einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) eröffnete neue Perspektiven für die Analyse dickerer Bereiche (bis zu 1 μm) gefroren- hydratisierter Zellen mittels Kryo-Elektronentomographie (Eibaum et al., 2016; Wolf et al., 2017

Gemäß dem Stand der Technik können gegenwärtige FJB-SEM-Techniken, wie oben beschrieben, jedoch lange Bearbeitungszeiten erfordern, um den interessierenden Bereich vorzubereiten. Darüber hinaus kann bei dicken Proben der interessierende Bereich in der z-Dimension, wegen der schlechten z-Auflösung der Lichtoptik, leicht übersehen werden.

Bei einem integrierten CLEM-Ansatz, bei dem die lichtmikroskopische Analyse der Probe direkt im FIB-SEM durchgeführt wird, können aufgrund geometrischer Einschränkungen nur Objektivlinsen mit großen Arbeitsabständen (entsprechend einer geringen Numerischen Apertur) verwendet werden. Ähnliche Einschränkungen sind auch bei der direkten Kombination mit anderen Ultrastrukturmikroskopiemethoden oder anderen abbildenden Verfahren zu beachten.

Spezielle Objektivlinsen mit einem extrem großen Arbeitsabstand (WD) von bis zu einigen cm wurden beschrieben (z. B. www.microscopyu.com/microscopy- basics/working-distance-and-parfocal-length). Gemäß den Beziehungen (1) und (2) wird als Beispiel für eine Objektivlinse von so großem Arbeitsabstand eine numerische Apertur von NA = 0,5 und λ _exc = 488 nm angenommen; daraus ergibt sich eine laterale optische Auflösung von d _min = 600 nm und eine axiale optische Auflösung d _axial = 3,9 μm (n = 1; Gl. 2a), d.h. wesentlich schlechtere Werte als die optische Auflösung, die unter Verwendung der oben genannten Techniken für Objektive mit hoher NA erreicht werden kann. Demgemäß könnte unter Verwendung einer derartigen axialen Auflösung eine zu untersuchende kleine Objektstruktur (ROI) bei der halben axialen Position (50 μm) eines 100 μm dicken Präparats auf ein Gebiet von ca. 600 nm lateral und 3,9 μm axial eingegrenzt werden. Um in einem solchermaßen eingegrenzten Gebiet durch FIB die ROI zu präparieren, wären bei einer FIB Fräsdicke von 10 nm bis zu N _slice = 3900 nm/10 nm = 390 Schnitte erforderlich; bei Verwendung von SIM wären immer noch die Hälfte (N _slice = (3900 nm/2)/10nm), also ca. 200 Frässchritte erforderlich. Je besser die axiale Auflösung ist, desto weniger Frässchritte sind erforderlich. Je besser die laterale Auflösung ist, desto genauer kann die Zielstruktur identifiziert und interessante Ziele ausgewählt werden.

Zum Beispiel haben Gorelick et al. (2019) ein integriertes kryokorrelatives Licht- und FIB-SEM-Mikroskop beschrieben, das die direkte und schnelle Identifizierung von Zellregionen (ROIs) mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. In diesem Fall wurde ein Anregungs- und Emissionselement zusammen mit einer Objektivlinse für die Fluoreszenzbildgebung direkt in das FIB-SEM integriert. Aufgrund der geometrischen Einschränkungen, die durch die Instrumentierung für FIB-SEM erforderlich waren (vergleiche Abbildung 2 von Gorelick et al. 2019), wurde jedoch nur eine Objektivlinse mit niedriger NA verwendet, in diesem Fall NA = 0,06. Gemäß den Beziehungen (1) und (2) ermöglicht eine solche Objektivlinse eine laterale Auflösung (Objektebene, xy) von 4,9 μm und eine axiale Auflösung (entlang der optischen Achse (z) des Objektivs) von 270 μm (angenommene Anregungswellenlänge λ _exc = 488 nm; n = 1).

Aus technischen Gründen ist die Numerische Apertur (NA) von Objektivlinsen mit sehr großem Arbeitsabstand auf niedrige Werte (typischerweise < 0.5) beschränkt Daher ist es äußerst wünschenswert, hochauflösende (SRM) Techniken zur Integration in korrelierte Licht- und FIB-SEM-Bauelemente für ausreichend große Arbeitsabstände (bis zum Multizentimeterbereich) mit wesentlich geringeren Beleuchtungsintensitäten zu entwickeln. Solche “Structured Illumination Microscopy” (SIM) Techniken wurden für z.B. fluoreszenzmikroskopische Ansätze beschrieben, die auf einer strukturierten Beleuchtung mit zwei Anregungsstrahlen basieren, die eine einzelne Objektivlinse passieren (Heintzmann und Cremer, 1999; Gustafsson et al. 1999; Gustafsson, 2000); bei einer gegebenen Numerischen Apertur (NA) liefern sie eine optische Auflösung, die um den Faktor zwei verbessert ist; in dem oben angegebenen Beispiel für NA = 0,2 ergibt dies eine theoretische laterale optische Auflösung von d _SIMmin = 0,75 μm lateral und d _SIMaxial = 12,2 μm; für NA = 0,1 beträgt die mit SIM erreichbare laterale optische Auflösung d _SIMmin (NA = 0,1) = [0,61λ/(NA]/2 = 1,5 μm; für die axiale Auflösung unter diesen Bedingungen (n = 1) wird d _SIMaxial = [2λ _exc /NA ² ]/2 = 49 μm erhalten; für NA = 0,06 (Arbeitsabstand in dem für integriertes Kryo-CLEM geeigneten Bereich) ergibt sich eine laterale Auflösung d _SIMmin (NA = 0,06, λ _exc = 488 nm) = 2,5 μm und eine geschätzte axiale Auflösung d _SIMaxial (NA = 0,06) = 136 μm.

„Proof-of-Principle“-Experimente mit Retina-Zellen mit einem SIM-Mikroskop mit einem Abstand von der Objektebene bis zum nächstgelegenen optischen Element eines speziellen „Large Working Distance“ SIM-Mikroskops) von ca. 4,5 cm (Best 2014) ergaben eine optische laterale Auflösung von ca. 2 μm, in Übereinstimmung mit dem theoretischen Schätzwert. Das so erhaltene Auflösungs- und Beobachtungsvolumen ist im Vergleich zur Mikroskopie bei gleichem Abstand aber ohne SIM stark verbessert, aber immer noch weit von dem Bereich entfernt, der für integrierte korrelative Mikroskopie in einem FIB-SEM gewünscht wird.

Was zur Lösung dieses Problems von großer praktischer Bedeutung für korrelative FIB-SEM-Anwendungen sowie andere Anwendungen mit großem Arbeitsabstand der lichtoptischen Elemente benötigt wird, ist eine hochauflösende Lichtmikroskopietechnik, die Folgendes ermöglicht: a) die Verwendung großer Arbeitsabstände (WD); aus geometrischen Gründen sind bei einem typischen FIB-SEM Arbeitsabstände (WDs) von mehreren cm erforderlich; b) die Identifizierung des Targets (interessante Objektstruktur, ROI) und seiner Position innerhalb einer transparenten Probe mit einer Genauigkeit möglichst im Bereich der Schnittdicke des FIB-SEM (z. B. 5 nm oder 10 nm, oder einige zehn nm), in jedem Falle aber mit einer Genauigkeit, die die zur weiteren Eingrenzung erforderliche Zahl von Schnitten im Vergleich zum Stand der Technik wesentlich einschränkt (z.B. 50 Schnitte von jeweils 10 nm statt 5,000 Schnitte).

Ein grundlegendes Konzept zur Erzielung von Superauflösung bei “beliebig” großen Arbeitsabständen auf der Basis der holographischen Laserscanning 4TT-Mikroskopie ohne Verwendung von Objektivlinsen wurde bereits in den 1970er Jahren vorgestellt (C. Cremer und T. Cremer 1972, 1978); in diesem frühen Konzept des Standes der Technik wurden ein oder mehrere "Punkthologramme" vorgeschlagen, um ein Beobachtungsvolumen (Fokusvolumen) zu erzielen, das wesentlich kleiner ist als mit einem herkömmlichen Objektivlinsenmikroskop hoher NA erreichbar; die Bildgebung sollte durch „Punkt-für-Punkt“ Abtastung des Objekts des Objekts durch den so erzeugten Fokus erfolgen.

Anstelle von Hologrammen können auch Beleuchtungsarrays mit verteilter Apertur verwendet werden (Birk et al. 2017; Cremer et al. 2019): Hierbei wird eine begrenzte Anzahl einzelner kollimierter kohärenter Strahlen verwendet, bei denen Intensität, Richtung und Phase individuell gesteuert werden im Vergleich zu der sehr großen Anzahl gebeugter Strahlen (z.B. Hunderttausende), die von den Hologrammstrukturen mit gekoppelten Intensitäten, Richtungen und Phasen erzeugt werden. Dies hat den großen Vorteil, dass die Lichtquellen grundsätzlich in beliebiger Entfernung vom Abtastfokusbereich ("Punkt") positioniert werden können, wo konstruktive Interferenzen auftreten; durch entsprechendes Ändern der Richtung der kollimierten kohärenten Strahlen kann der Scanbereich („Spot“ ) an eine beliebige Position in 3D verschoben werden. Gegebenenfalls müssen für die neue Position auch die Phasen und andere Parameter der kollimierten Strahlen neu eingestellt werden. Jedoch wurde bei diesen Ansätzen nicht berücksichtigt, dass bei vielen Anwendungen, z.B. bei der korrelierten FIB-SEM oder bei zahlreichen anderen Mikroskopieverfahren mit dem Erfordernis großer Arbeitsabstände, ein beträchtlicher Raumwinkel um die optische Achse (s. Abb.1 - 3) für die mikroskopische Bildgebung gemäß dem Stand der Technik nicht genutzt werden kann. Dieser beträchtliche Nachteil des Standes der Technik wird durch die hier offenbarte Ring-Array Beleuchtung mit kohärentem Licht beseitigt. Allgemeines Konzept der Erfindung („Ring-Array Mikroskopie“)

Im Folgenden wird eine Erfindung offenbart, die es ermöglicht, durch eine geeignete ringförmige räumliche Verteilung kohärenter Lichtquellen (“Ring-Array”) mit spezifisch angepassten Beziehungen von Phase, Polarisation, Richtung und Intensität zwischen den von den Lichtquellen des Ring-Arrays ausgehenden kohärenten Laserstrahlen (Abb. 4 - 8, 10) auch im FIB-SEM (oder in anderen Mikroskopsystemen mit dem Erfordernis eines großen Arbeitsabstandes mit hoher Auflösung) eine optische Auflösung zu realisieren, die im konfokalen Rastermikroskopiemodus fast den besten optischen Auflösungswerten mit Objektivlinsen hoher NA entspricht, also um ca. 250 nm lateral und 900 nm axial (z.B. Abb. 9; 12a - c; 14, 15; 16A/B; Tabelle 1); unter zusätzlicher Verwendung von Torusförmigen Intensitätsverteilungen im Ring-Array „STED“ Modus (z.B. Abb.12c - f; 13;17; Tabelle 2) sollte eine optische Auflösung bis zum 30 nm Bereich (ca. 1/20 λ _exc ), im Ring-Array „SMLM“ bis zum 5 nm Bereich (ca. 1/100 λ _exc ); und im Ring-Array „MINFLUX/SIMFLUX“ Modus bis zum 1-nm-Bereich (ca. 1/500 λ _exc ) erreichbar sein.

Mit der hier offenbarten Erfindung der kohärenten Ring-Array- Beleuchtungsmikroskopie mit großen Arbeitsabständen und hoher Auflösung kann der gesamte oben beschriebene Prozess der Präparation interessanter Objekte direkt im FIB-SEM durchgeführt werden. Dies hat den Vorteil, dass 1) ein Probentransfer vermieden wird; 2) dass der lonenstrahl unter lichtoptischer Kontrolle geführt werden kann, wodurch die probenschädigende Elektronenbeleuchtung stark reduziert wird; und 3) mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsmikroskopie unter Verwendung von kohärentem Licht (Abb. 1 - 8; 10, 11, 19) kann die Stelle präziser, auch 3-dimensional, lokalisiert werden, wodurch ‘leere’ Lamellen vermieden werden. Mit neuartigen Fluorochromen, basierend z.B. auf Nanographenen (Liu et al., 2019), können auch Orte in Plastik eingebetteten Proben, die für die Raumtemperatur FIB- SEM Tomographie präpariert sind, lokalisiert werden, wodurch auch diese FIB-SEM Tomographie zielsicher eingesetzt werden kann. Dadurch hat man einen erheblichen Zeitgewinn und kann genau die Stelle analysieren, die wichtig ist. Zur Zeit tappt man hier im Dunkeln und kann nur schon angeschnittene Stellen sehen, von denen man nicht weiß, ob es sich dabei um den Anfang der Zelle oder deren Ende handelt. Eine ganze Zelle, die die interessierende Information enthält, kann nur durch Glück während der Analyse ‘auftauchen’. Das erfindungsgemäße Ring-Array Prinzip bringt hier also Zeitgewinn und vor allem eine höhere Präzision der Lokalisierung!

Die hier beschriebene Erfindung wird sich nicht nur auf Kryo-FIB-SEM Anwendungen beschränken, sondern kann die gesamte Volumenmikroskopie, basierend auf dem Rasterelektronenmikroskop (SEM), revolutionieren. Das Ring- Array Prinzip kann auch für die Erstellung von 3D Datensätzen mit Hilfe der Array Tomographie Technik verwendet werden. Die mit Nanographen oder kolloidalem Gold markierten Proben werden für die Elektronenmikroskopie präpariert, und Bänder von Seriendünnschnitten werden auf eine elektrisch leitende Unterlage montiert. Diese werden in ein Feldemissions Raster EM, ausgerüstet mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung und zugehörigen Einrichtungen für Fluoreszenzanregung und Detektion gebracht. Danach werden von jedem Schnitt die Licht- und Elektronenmikroskopischen Aufnahmen gemacht. Diese direkte Anwendung zeichnet sich nicht nur durch eine bedeutende Zeitersparnis aus, sondern auch dadurch, dass zwischen den Lichtmikroskopischen und Elektronemikroskopischen Aufnahmen keine Veränderungen, Schrumpfungen, Verzerrungen etc. der Schnitte auftreten. Da z.B. Nanographene und kolloidale Goldpartikel auch nach erheblicher chemischer Behandlung, die für die Präparation von elektronenmikroskopischen Proben unerlässlich ist, ihr Fluoreszenz- und „Blink“ Verhalten bewahren, kann die erfindungsgemäße „Ring-Array-Mikroskopie“ auch auf die SBF-SEM Technologie angewendet werden. Hier werden an Steile von Ionen die Schnitte mit einem ins Mikroskop eingebauten Ultramikrotom durchgeführt. Ansonsten werden die interessanten Volumina mit demselben Prinzip wie beim FIB-SEM erhalten.

In dem hier offenbarten erfindungsgemäßen Ring-Array-Beleuchtungsmikroskopie Verfahren (auch als Ring-Array-Mikroskopie abgekürzt) und der zugehörigen Ring- Array Anordnung (Abb. 1 - 3; 4 - 8; 19) sind aufgrund der Möglichkeit, die Eigenschaften (z.B. Intensität, Phase, Polarisationszustand, Ausbreitungsrichtung, Divergenz) einer endlichen Anzahl von kohärenten Strahlen (z.B. N = 15, oder N = 190, oder N =760) individuell zu steuern, zusätzlich zu Punktabtastmerkmalen, die einem konfokalen Mikroskoptyp entsprechen (Cremer & Cremer, 1978), eine Reihe weiterer Ausführungsformen möglich, wie z.B. STED-.SIM, SMLM, MINFLUX- oder SIMFLUX Mikroskopie, Lichtblattmikroskopie („Lightsheet“), optische Projektionsmikroskopie oder Axialtomographiemikroskopie (Staier et al., 2011; Schneckenburger et al., 2020).

Statt für Konstruktionselemente eines FIB-SEM kann die von Anregungslichtstrahlen Si freie Innere Zone (Raumwinkel Ω _center , s. Abb. 1 ,2) mit Durchmesser D _{interi or} auch in anderen Mikroskopie-Anwendungen genutzt werden, in denen eine hohe lichtoptische Auflösung zusammen mit einem großen Arbeitsabstand WD erreicht werden soll, wie z.B. der Röntgenmikroskopie oder anderen Verfahren der höchstauflösenden Mikroskopie mithilfe von Partikelstrahlung oder hochenergetischer Photonenstrahlung.

Weitere vorteilhafte Anwendungen des erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahrens ergeben sich auch in bestimmten Anwendungen der Lichtmikroskopie, bei denen große Arbeitsabstände erforderlich oder wünschenswert sind. Dies ist z.B. in der Stereomikroskopie der Fall, oder bei Materialanalytischen Untersuchungen, z.B. der lichtoptischen Kontrolle von elektronischen Bauteilen. hinaus gibt es auch weitere erfindungsgemäße Anwendungen: Zum Beispiel können die in Abb. 1-3, 19 ausgewiesene Innere Zone des Ring-Arrays (zugehöriger

Raumwinkel Ω _center ) sowie der durch den Raumwinkel Ω _bottom gekennzeichnete Bereich statt für Baulemente eines FIB-SEM oder anderer Verfahren der höchstauflösenden Mikroskopie mithilfe von Partikelstrahlung oder hochenergetischer Photonenstrahlung auch für rein lichtmikroskopische Zwecke (Wellenlängenbereich vom nahen Ultravioletten zum nahen Infrarotbereich) genutzt werden. Beispielsweise könnte hier die Innere Zone des erfindungsgemäßen Ring-Arrays auch für ein linsenbasierten Objektiv geringer Apertur bei großem Arbeitsabstand und entsprechend großem Gesichtsfeld (wie z.B. in der Stereomikroskopie, oder der lichtmikroskopischen Kontrolle elektronischer Bauteile) verwendet werden, um bei entsprechend geringer optischer Auflösung näher zu analysierende interessante Objektstellen (ROIs) zu lokalisieren, die anschließend mithilfe der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung in Verbindung mit einem Rastermikroskopischen Verfahren bei stark erhöhter Auflösung (z.B. unter Nutzung des STED-, SIM, SMLM, MINFLUX/SIMFLUX Modus) näher untersucht werden. Eine derartige Kombination wäre z.B. dazu geeignet, mikroskopische Verfahren wesentlich zu beschleunigen, in denen in großen Gesichtsfeldern relative wenige lokalisierte Objekte (ROIs) mit hoher Auflösung analysiert werden müssen. Beispiele hierfür wären die Analyse von Nanostrukturen ausgewählter Zellen in Geweben (Oleksiuk et al. 2015; Neumann et al. 2020; Cremer et al. 2017, 2020); die Analyse pathogener Viren oder Bakterien (Cremer 2011 ; Cremer et al., 2014); oder die Analyse von Nanostrukturveränderungen in Oberflächen (Liu et al. 2019).

Die im Folgenden angegebenen Beispiele für erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtungsanordnungen basieren auf der Annahme, dass die kohärenten Lichtquellen, die zur Erzeugung eines entsprechend kleinen Abtastfokus (oder anderen für Methoden der Rasterlichtmikroskopie geeigneten Intensitätsverteilungen wie z.B. Torus („Donut“ förmige Intensitätsmuster) in der Objektebene verwendet werden, in Bezug auf den Winkel zwischen zwei benachbarten Quellen typischerweise gleichmäßig innerhalb des Ring-Arrays (Abb. 4 - 8) verteilt sind. (d.h. innerhalb eines Raumwinkels Ω _array (Abb. 1,2, 18) mit geeigneter maximaler Apertur, z. B. Ω _arraymax = 1 ,3 π , entsprechend einer NA im Vakuum (n = 1) von 0.94. Statt einer gleichmäßigen Anordnung der Quellen wie in den hier angegebenen Beispielrechnungen (Abb. 9; 12 - 17) sind auch andere erfindungsgemäße Verteilungen der Quellen in der Ring-Array Anordnung möglich. Die Kohärenz der von den Lichtquellen emittierten Strahlung wird durch eine geeignete Beleuchtung des Ring-Arrays (Abb. 4 - 8) mit kohärentem Licht (insbesondere z.B. durch LASER-Strahlung geeigneter Wellenlänge und Intensität) erreicht.

Im Gegensatz zur Ring-Licht-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik, wie sie z.B. in der Stereomikroskopie zur Weitfeldbeleuchtung unter Nutzung von LEDs verwendet wird, emittieren die im erfindungsgemäßen Ring-Array befindlichen Lichtquellen S (Abb. 1 ,2, 19) aufgrund der kohärenten Beleuchtung des Ring-Arrays ebenfalls kohärente Strahlung mit ganz spezifischen gegenseitigen Phasenbeziehungen, Ausbreitungsrichtungen, Polarisationszuständen und

Leistungen, die auch individuell so eingestellt werden können, dass in der Objektebene ganz spezifische, beugungsbegrenzte lokale Intensitätsverteilungen generiert werden, die unter Verwendung von rastermikroskopischen Verfahren eine hochauflösende bzw. superauflösende Lichtmikroskopie bei großen Arbeitsabständen direkt in einem Fokussierten lonenstrahl - Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM), oder einem anderen höchstauflösenden Mikroskopsystem auf der Grundlage von Partikelstrahlung oder Röntgenstrahlung, oder einem anderen Mikroskopsystem mit dem Erfordernis großen Arbeitsabstandes ermöglichen.

Das erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtungsverfahren gemäß Ansprüchen 1 - 36 kann darüber hinaus auch in anderen Anwendungsbereichen von Mikroskopsystemen mit großem Arbeitsabstand eingesetzt werden, z.B. zur Verbesserung der optischen Auflösung in der Stereomikroskopie, bei der optischen Materialanalyse - z.B. der Analyse von elektronischen Bauteilen - oder bei der Speicherung von Daten (Anspruch 33).

Um die bei Verwendung des hier beschriebenen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens zur Bildgebung erforderliche „punktweise“ Abtastung des Objekts zu realisieren, wird in den hier angegebenen Beispielanwendungen ein „Stage Scanning“ (Bewegung des Objekts) gemäß dem Stand der Technik (z.B. Cremer & Cremer 1978; Hell et al. 1994; Hänninen et al., 1995) angenommen. Ein „Beam Scanning“ (z.B. Hell et al., 1999) durch geeignete periodische Bewegungen des Ring-Arrays ist jedoch ebenfalls erfindungsgemäß. Hierdurch ermöglicht die erfindungsgemäße Ring-Array Mikroskopie zusätzlich zu einem großen Arbeitsabstand eine hohe optische Auflösung, was mit der bisherigen Ring-Licht-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik NICHT möglich ist; diese erlaubt aufgrund der fehlenden gegenseitigen Kohärenz der von der Ring-Licht Anordnung emittierten Wellen lediglich eine verbesserte Weitfeldbeleuchtung, während die optische Auflösung durch die Numerische Apertur des verwendeten Objektivs gemäß Gl.(1 ,2) gegeben ist; zum Beispiel ergibt sich für λ _exc = 488 nm und einer bei Stereomikroskopie typischen Numerischen Apertur NA = 0.15 (n = 1) bei einem Arbeitsabstand von 6 cm eine laterale optische Auflösung von ca. 2 μm und eine axiale von ca. 44 μm (gemäß Beziehung 2a) bzw. 38 μm (Gl. 2b). Im Gegensatz hierzu kann bei Verwendung der hier offenbarten erfindungsgemäßen kohärenten Ring-Array Mikroskopie bei gleichem Arbeitsabstand (6 cm) im fokussierten Modus (z.B. Abb. 9,12a,b; 14 - 16; Tabelle 1) in Verbindung mit der konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) eine laterale Auflösung erzielt werden, die ca. 4x besser ist, und eine axiale Auflösung, die ca. 170 x besser ist als mit einem Objektiv mit NA = 0.15 erreichbar. Die Volumenauflösung (Beobachtungsvolumen gemäß Gl. (3)) kann sogar um fast einen Faktor 300 verbessert werden; z.B. kann hierdurch das für das für das Auffinden der interessanten Objektregion bei Untersuchungen in einem FIB-SEM (oder in einem anderen Mikroskopiesystem mit großem Arbeitsabstand) wichtige Beobachtungsvolumen um diesen Betrag vermindert und somit wesentlich vereinfacht werden. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens in Verbindung mit superauflösenden Implementationen wie STED, SMLM, MINFLUX oder SIMFLUX (z.B. unter Verwendung von Torusförmigen Intensitätsverteilungen, s. Abb.12c-f; 13,17; Tabelle 2) kann die Auflösung der erfindungsgemäßen Ring-Array Mikroskopie Verfahrens unter Beibehaltung großer Arbeitsabstände (z.B. 5 cm, oder 6 cm, oder 10 cm) bis in den molekularen Auflösungsbereich weiter gesteigert werden.

Aufgrund der bei dem erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsverfahren möglichen großen Arbeitsabstände und verfügbaren Raumwinkel (Abb. 18) wird auch eine effiziente Detektion des in der Objektregion mit der erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtung induzierten Signals (z.B. Fluoreszenzanregung) wesentlich erleichtert (Abb. 19). Aus geometrischen Gründen ist Ω _array = 4π in einem FIB-SEM aufgrund der für die Objekthalterung und die Detektionsgeräte erforderlichen Instrumentierung nicht möglich (vgl. Abbildung 2 in Gorelick et al. 2019). Ähnliche Restriktionen ergeben sich auch bei anderen Mikroskopiesystemen. Typischerweise wird der Raumwinkel

Ω _array in erfindungsgemäßen Implementierungen der Ring-Array Beleuchtung auf Werte unterhalb π beschränkt bleiben (Abb. 18). Trotz dieser Beschränkung können jedoch durch die erfindungsgemäße Ring-Array Beleuchtung in der Objektebene lokale Intensitätsverteilungen realisiert werden (Abb. 9, 12 - 17), die auch bei sehr großen Arbeitsabständen eine hohe Auflösung ermöglichen.

Durch geeignete Konfiguration der kohärenten Lichtquellen der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung ist es überdies möglich, im Objektraum auch Muster von lokalen Intensitätsverteilungen (z.B. Vielfache von einzelnen Maxima oder Torusförmigen Verteilungen) zu erzeugen, deren Abstände größer sind als die Halbwertsbreiten (HWB/FWHM) der betreffenden Intensitätsverteilungen (Beispiele Abb. 14 - 17), und die daher geeignet sind, mithilfe derartiger Muster die Geschwindigkeit der Bildgebung nach Verfahren gemäß dem Stand der Technik (z.B. Bingen et al. 2011 ; Chmyrov et al. 2013) ganz wesentlich zu beschleunigen.

Die oben genannten theoretischen und praktischen Einschränkungen der optischen Auflösung bei großen Arbeitsabständen in einem integrierten FIB-SEM System (oder anderen Mikroskopsystemen mit großem Arbeitsstand gemäß dem Stand der Technik) sind auf die geringe numerische Apertur der für die korrelierte lichtoptische Anregung und erforderlichen Objektivlinsen zurückzuführen, die notwendig ist, um die großen Arbeitsabstände zu realisieren, die benötigt werden, um z.B. die erforderliche Lichtoptik in die Vakuumkammer des FIB-SEM ein zu passen (für eine typische Anordnung siehe z.B. Gorelick et al. 2019). In der hier offenbarten Erfindung werden diese Grenzen überwunden, d.h. die optische Auflösung wird bei großen Arbeitsabständen um ein Vielfaches verbessert, indem eine Beleuchtungsvorrichtung mit mehreren kohärenten Strahlen ausgehend von einer ringförmigen Ring-Array- Anordnung verwendet wird, die mit geeigneten wechselseitigen Phasenbeziehungen, Polarisationen, Ausbreitungsrichtungen, Leistungen und Divergenzen (z.B. kollimiert) auf einen gegebenen Objektbereich gerichtet sind, wobei die anderen Funktionen z.B. eines FIB-SEM nicht gestört werden. Bei den hier beschriebenen numerischen Beispielrechnungen (Abb. 9, 12 - 17) wurden kollimierte kohärente Strahlen angenommen; ähnliche Ergebnisse sind jedoch auch jedoch auch mit konstruktiver Interferenz von kohärenten Kugelwellen möglich; beide Möglichkeiten der Ring-Array Mikroskopie sind erfindungsgemäß.

Mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung können typischenweise (Abb. 9, 12 - 17; Tabellen 1,2) im SMLM Modus Einzelmolekülpositionen in einem Objektbereich der gewünschten Größenordnung (z.B. Durchmesser im Bereich 0,5 μm - 1 μm) vermessen werden, bei einer optischen Auflösung (kleinster Abstand der getrennt lokalisierten Einzelmoleküle) bis in den Bereich weniger Nanometer; unter zusätzlicher Verwendung der MINFLUX Option (Balzarotti et al., 2017; Gwosch et al., 2020) oder unter zusätzlicher Verwendung von strukturierter Beleuchtung (SIMFLUX, Best et al., 2014; Cnossen et al., 2020) bis in den 1 nm Bereich (ca. 1/500 λ _exc ). Da viele Zielstrukturen bei FIB-SEM und anderen Ultrastrukturmethoden einen Durchmesser haben, der wesentlich kleiner ist als 0,5 μm - 1 μm, ist die Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung im SMLM/MINFLUX/SIMFLUX Modus ebenfalls außerordentlich vorteilhaft: Zum Beispiel wird durch die direkte erfindungsgemäße Ring-Array basierte Kombination von SMLM mit MINFLUX/SIMFLUX/Strukturierter Beleuchtung es möglich, bei geeigneter Fluoreszenzmarkierung die molekulare Konformation wichtiger Proteine sehr viel vorteilhafter zu analysieren als dies gemäß dem Stand der Technik (Weisenburger et al. 2017) möglich ist. Sofern die in ein FIB-SEM integrierte Einzelmolekülmikroskopie/SMLM gemäß dem Stand der Technik mithilfe eines größeren Bestrahlungsvolumens durchgeführt werden soll, ist dies ebenfalls durch eine geeignete Änderung von Phase, Polarisation, Intensität und Richtung der von der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung emittierten Strahlen möglich. Das gleiche gilt von der weiteren Verbesserung der dreidimensionalen Auflösung mithilfe von z.B. Torusförmigen Intensitätsverteilungen entlang der optischen Achse zur Realisierung von 3D-STED Mikroskopie (Saht & Hell 2019).

Das für die Kombination von strukturierter Beleuchtungs- und Lokalisationsmikroskopie/SMLM (Best et al., US-Patent 9, 874, 737 B2) erforderliche Beleuchtungsmuster kann ebenfalls mithilfe der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung durch geeignete Kombination von Phase, Intensität und genutzter Anzahl der Lichtquellen des Ring-Arrays realisiert werden.

Kohärente Multi-Strahlen-Beleuchtuna

Die für die hier offenbarte erfindungsgemäße Verbesserung der optischen Auflösung bei gleichzeitigem großem Arbeitsabstand eingesetzte Interferenz von Mehrfachstrahlen wird durch eine geeignet platzierte Ringförmige Anordnung von z.B. kollimierten kohärenten Strahlen realisiert; d.h. die von den Lichtquellen S _i der Ring- Arrays ausgehenden Strahlen, die mittels der Beleuchtung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung erzeugt werden (Abb. 1 -8, 10, 18, 19), haben zueinander feste Phasenbeziehungen, die durch die Einzelheiten der Ring-Array Anordnung (Abb. 4 - 8, 10, 18) individuell bestimmt werden können; Die daraus resultierende kohärente Multistrahlen-Beleuchtung erfolgt unter Verwendung einer Ring-Array Zone, die frei von FIB-SEM-Instrumenten oder in anderen Mikroskopieanwendungen benötigten Bauteilen ist ("Ring-Array" - Anordnung, s. Beispiel Abb. 1 - 3, 19). Diese Ring-Array Zone, die die Ausgangspunkte (Lichtquellen S _i ) für die kohärenten Strahlen zur Beleuchtung des Objekts enthält, deckt einen Raumwinkels Ω _array ab (bestimmt von der Ringmitte aus, s. Abb. 2; Abb. 19); Der Raum mit den Beleuchtungs- und Detektionselementen z.B. eines FIB-SEM deckt einen Raumwinkel Ω _center ab und ist frei von kohärenten Ring-Array -Beleuchtungsstrahlen (s. Abb. 2). Der Raum, in dem sich die Objekthalterung z.B. eines FIB-SEM oder andere Bauteile befinden, deckt einen Raumwinkel Ω _bottom ab und ist außerdem frei von Ring-Array- Beleuchtungsstrahlen. Daher deckt die Ring-Array Zone, die die Mehrfachstrahlen für die Ring-Array -Beleuchtung enthält, einen Raumwinkel Ω _array = 4π - Ω _center - Ω _bottom ab.

Ω _center und Ω _bottom hängen von der genauen Konfiguration des betrachteten Mikroskopsystems - z.B. eines FIB-SEM - ab; gemäß der Erfindung haben sowohl

Ω _center als auch Ω _bottom Werte, die wesentlich über Null liegen, z.B. Ω _center > = 0.4 π und

Ω _bottom > π . Als absoluter Minimalwert wird Ω _center = 0.05π angenommen. Damit ist die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung wesentlich von früheren Beleuchtungsanordnungen unterschieden, die eine homogene Verteilung kohärenter Lichtquellen in einer Array Fläche vorsehen, die einem vollständigen Kugelausschnitt um die Optische Achse entspricht (Birk et al., 2017), d.h. Ω _center = 0, im Gegensatz zu der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Anordnung mit Ω _center Werten, die typischenweise wesentlich größer als Null sind (in den hier beschriebenen Anwendungsbeispielen z.B. wurde Ω _center = 2 π [1 - cos (45.5°)] = 0.598π angenommen (Abb. 18).

Soweit nicht anders angegeben, wird die hier beschriebene Erfindung in Verbindung mit ihren Anwendungen im Folgenden insgesamt abgekürzt auch als "Ring-Array- Mikroskopie" bezeichnet; der erfindungsgemäße Kern (s. Patentansprüche) bezieht sich dabei auf ein Verfahren (bzw. eine Vorrichtung) zur kohärenten Ring-Array Beleuchtung (Abb. 1 - 8; Abb. 10, 18,19).

Zusätzlich zu „Punktabtastmodi“ (einschließlich STED-, MINFLUX/SIMFLUX und Einzelmolekül-Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik) kann die vorliegende Erfindung der Ring-Array-Beleuchtung auch angewandt werden, um in einem integrierten FIB-SEM System Muster basierte Abtastmodi wie Lichtblatt („Lightsheet“) Mikroskopie, optische Projektionsmikroskopie oder Axialtomographie bei großen Arbeitsabständen zu ermöglichen (Schneckenburger et al., 2020). Im Folgenden werden einige Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung offenbart.

Neben seiner Verwendung in FIB-SEM-Systemen kann das Ring-Array- Beleuchtungsverfahren überall dort erfindungsgemäß eingesetzt werden, wo Hindernisse Beleuchtungsstrahlanordnungen oder andere zur Abbildung dienende Bauteile hemmen, die herkömmlichen Linsen oder Linsensystemen entsprechen, wie z.B. bei Stereomikroskopen oder Mikroskopen für die berührungsfreie Materialanalyse bei großen Arbeitsabständen.

Ein wesentlicher Vorteil des hier offenbarten Ring-Array-Beleuchtungsverfahrens ist die ringförmige Anordnung der zur Beleuchtung des Objekts verwendeten kohärenten Lichtquellen bei gleichzeitigem großen Arbeitsabstand. Der innere Durchmesser (D _interior ) der Ring-Array Anordnung (Abb. 1, 2, 3, 19) kann dabei z.B. so gewählt werden, dass die für die Partikelstrahlung-und Detektion in einem FIB-SEM erforderlichen Bauteile (oder in einem anderen Mikroskopsystem) von dem Ring-Array umschlossen werden.

Grundsätzlich sind auch andere geometrische Formen erfindungsgemäß, sofern sie die allgemeinen Bedingungen der Ring-Array Mikroskopie erfüllen, z.B. ovale, viereckige, oder rechteckige Anforderungen; die Anordnung der kohärenten Lichtquellen S _i (Abb. 1 ,2, 19) muss auch nicht notwend igerweise immer in einer Ebene erfolgen, sondern kann auch in einem erfindungsgemäß gestalteten Volumen erfolgen; derartige abweichende Geometrien sind in der Bezeichnung „Ring-Array“ als ebenfalls erfindungsgemäß eingeschlossen.

Insbesondere flache Ausführungen des erfindungsgemäßen Ring-Arrays erlauben eine wesentliche Vereinfachung der Herstellung der zugrundeliegenden optischen Elemente, z.B. durch nanolithographische Verfahren. Damit können mikroskopische Methoden auf der Grundlage des erfmdungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungsverfahrens vorteilhaft insbesondere überall dort eingesetzt werden, wo große Arbeitsabstände bei gleichzeitig hohen Anforderungen an die Auflösung realisiert werden müssen.

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mehrerer kohärenter Strahlen, die aus Quellen austreten, die über einen bestimmten Raumwinkel Ω _array (s. Abb. 2) innerhalb einer typischerweise flachen Ringzone im “FIB-SEM-Raum” oder allgemein im „Beleuchtungsraum“ emittiert werden, der frei von FIB-SEM-Instrumenten bzw. anderen Bauteilen ist, mit der Option, Leistung, Polarisation, Richtung und Divergenz dieser kohärenten Strahlen individuell einzustellen. Bei Integration in andere Mikroskopiesysteme, in denen eine erfindungsgemäße Ring-Array-Beleuchtung vorteilhaft ist, wird die „Innere Zone“ in Abb. 1-3, 19 (gekennzeichnet durch den Raumwinkel Ω _center , Abb. 2) statt FIB-SEM Bauteilen von Konstruktionselementen derartiger anderer Mikroskopiesysteme eingenommen (z.B. geeignete Objektive niedriger NA aber großem Arbeitsabstand wie z.B. bei der Stereomikroskopie, oder der mikroskopischen Kontrolle elektronischer Bauteile).

Aus der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung ergibt sich die Möglichkeit, dass sich eine gegebene Quelle (S _i ) irgendwo entlang einer Linie durch das Fokus Zentrum O = (0,0,0) und die tatsächliche Position ( xi , yi, z _i ) der Quelle Si befinden (s. Abb. 1 , 2, 19); unter dieser Bedingung können die Abstände der Lichtquellen (S _i zu O) theoretisch „beliebig groß“ (z.B. 5 cm, 6 cm, 10 cm oder mehr) gemacht werden, ohne die Intensitätsverteilung um das Zentrum bei O = (0,0,0) zu ändern; Daher können gemäß der vorliegenden Erfindung „beliebig große“ Arbeitsabstände (Abstand von den Lichtquellen S _i zu einem Objekt, das sich bei oder in der Nähe von O befindet) realisiert werden, ohne die Intensitätsverteilung im Fokus Zentrum O zu ändern (oder allgemeiner, ohne die Punktbildfunktion PSF der Beleuchtung eines in O befindlichen „punktförmigen“ fluoreszierenden Objekts zu ändern), im Gegensatz zur objektivlinsenbasierten Mikroskopie. Der Arbeitsabstand WD (Abstand des Ring-Array Zentrums zu O, s. Abb. 1) kann so gewählt werden, dass alle Elemente, die in einem FIB-SEM für die Partikel-/ Elektronenanregung sowie die zugehörige Detektionsoptik benötigt werden, in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt werden. Das gleiche gilt auch für andere Mikroskopiesysteme, in denen eine erfindungsgemäße Ring-Array- Beleuchtung vorteilhaft ist.

Konfiguration zur CLEM Integration

Erfindungsgemäß (siehe Abb. 1, 2) sind die Strahlen S ₁ , S ₂ ,... S _N in einem Raumwinkel Ω _array positioniert, der durch die Begrenzungsstrahlen α _min und α _max gekennzeichnet ist. Im Gegensatz zu der in (Birk et al. 2017) offenbarten Anordnung wird Ω _array durch die Innenzone begrenzt, die frei von emittierenden Strahlen ist (Durchmesser D _interior ); Der Raumwinkel dieser inneren Zone (der den Raum zwischen der Fokusposition O und den Innenkanten des Ring-Arrays umfasst), wird als Ω _center bezeichnet (s. Abb. 2). Der verbleibende Raum, der frei von den Strahlen S ₁ , S ₂ ,... S _N ist, ist durch Ω _bottom = 4π - Ω _array - Ω _center gegeben (s. Abb. 2; Abb. 18, 19). Die erfindungsgemäße Beleuchtung des Ring-Arrays erfolgt durch entsprechend konfigurierte Laserstrahlen (oder anderweitig erzeugte kohärente Strahlen), die typischenweise auf dem Ring-Array eine homogene Beleuchtung oder eine strukturierte Beleuchtung oder eine andere geeignete Intensitätsverteilung erzeugen, um die Positionen der S _i -Stellen geeignet zu bestrahlen; die S _i -Positionen, von denen die aufgrund der Beleuchtung des Ring-Arrays kohärenten (z.B. kollimierten) Strahlen ausgehen, werden im Folgenden als Lichtquellen (oder Quellen) bezeichnet. Um die erforderlichen Änderungen in Richtung, Phase, Polarisation und Intensität (wo erfindungsgemäß erforderlich) der Quellen S _i zu erzeugen, können verschiedene Verfahren gemäß dem Stand der Technik ausgewählt werden. Vom Standpunkt der Einfachheit aus kann ein entsprechend ausgelegtes diffraktives optisches Element (DOE) oder ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) verwendet werden; falls erforderlich, können die Strahlquellen S _i zusätzlich optische Elemente nach dem Stand der Technik enthalten, um individuell die Richtung, Phase, Polarisation oder die Leistung der emittierten Strahlen ändern zu können. Diffraktive Optische Elemente“ (DOEs) haben den Vorteil, eine stabile und wirtschaftliche Realisierung einer erfindungsgemäßen Ring-Arrayvorrichtung zu ermöglichen; Der Nachteil ist, dass der Ring-Array ggfs, ausgetauscht werden muss, um andere Intensitätsverteilungen in der Objektebene um O zu realisieren. Bei geeignet großen Arbeitsabständen WD = L _array (Abb. 1) sollte es jedoch möglich sein, einen Ring-Array mit mehreren Sätzen von Quellen zu realisieren, z.B. einen Array Satz A von Quellen S ₁ (fokal), S ₂ (fokal)... für fokale Intensitätsverteilung (z. B. Abb. 9; 12a-c; 14 - 16) bei Beleuchtung mit einer Anregungswellenlänge λ _exc , und einen „Array Satz B mit Quellen S ₁ (Torus),S ₂ (Torus) ...zur Erzeugung einer Torusförmigen Intensitätsverteilung (z.B. Abb. 12c-f; 13,17) bei Beleuchtung mit einer Wellenlänge λ _STED .

Spatial Light Modulators“ (SLMs) auf der anderen Seite haben den großen Vorteil der Flexibilität. Zum Beispiel ermöglichen sie eine schnelle Anpassung, um verschiedene Intensitätsverteilungen um O zu realisieren. Die Integration kann jedoch teurer und anfälliger für mechanische Beanspruchungen sein. Alle diejenigen Implementierungen erfüllen den erfindungsgemäßen Zweck des Ring-Arrays, wenn sie bei einem gegebenen großen Arbeitsabstand eine gewünschte Intensitätsverteilung in einem integrierten FIB-SEM oder einer anderen optischen Einrichtung erzeugen.

Abb. 3 zeigt schematisch ein zweites Beispiel für die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ring-Arrays in einem FIB-SEM-System oder einer anderen optischen Einrichtung, um eine Fluoreszenzbeleuchtungsvorrichtung mit einem großen Arbeitsabstand innerhalb der räumlichen Beschränkungen zu integrieren, die durch die für FIB-SEM erforderlichen Elemente auferlegt werden.

In dieser erfindungsgemäßen Implementierung ist der Ring-Array so ausgelegt, dass die an den Stellen S ₁ , S ₂ ,... S _i ... S _N innerhalb des Ring-Arrays mit geeigneter Phase, Polarisation und Intensität emittierten kohärenten Strahlen alle dieselbe orthogonale Richtung haben (parallel zur optischen Achse); Die Fokussierung (oder andere Beleuchtungsmuster um den Fokusbereich herum) wird dann durch einen Ringspiegel mit einer sphärischen oder ellipsoiden Form mit einer kreisförmigen (oder anderweitig mit der Erfindung kompatiblen) Öffnung entsprechend dem Raumwinkel Ω _center (Abb. 2) erzeugt (innerer Begrenzungswinkel α _min ; äußerer Begrenzungswinkel α _max , entsprechend wie in Abb. 1), um die angemessene Funktionsweise eines FIB-SEM in der Probenkammer zu ermöglichen.

Ein parabolisches konkaves Spiegelelement mit einer zentralen Öffnung in der Mitte für die Bestrahlungs- und Detektionsoptik des FIB-SEM sammelt das Licht von typischenweise ungefähr 200 bis 400 einzelnen kohärenten, z.B. kollimierten Strahlen mit geeigneter Phase, Intensität und Polarisationsrichtung, die an bestimmten Stellen in einem Ring-Array positioniert sind, und reflektiert die Strahlen in die Fokusebene. Eine typische Spiegelgröße hätte z.B. einen Durchmesser von 15 cm, einen Durchmesser der zentralen Öffnung von 4,5 cm, und eine Brennweite von 5,5 cm bezogen auf den Mittelpunkt der zentralen Öffnung. Der Spiegel reflektiert somit Strahlen innerhalb eines minimalen Öffnungswinkels (z.B. α _min = 45°) und eines maximalen Öffnungswinkels (z.B. α _max = 70°).

Die unten angegebenen numerischen Beispiele (Abb.9, 12 - 17; Tab. 1,2) basieren auf einer erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung unter der Annahme einer Gesamtzahl von jeweils N = 190 (in Abb. 15 N = 760) Strahlen geeigneter Phase, Winkel und Polarisation, wobei in den hier dargestellten Beispielen die Intensität aller einzelnen Strahlen als gleich groß angenommen wurde. Gemäß der Erfindung kann jede andere Ringförmige Verteilung oder Anzahl verwendet werden, solange das Ziel der Erfindung beibehalten wird, ein Fluoreszenzbeleuchtungssystem mit einem Raumwinkel Ω _array unter Verwendung kohärenter Wellen zu realisieren, der bezogen auf ein Linsenbasiertes Mikroskopiesystem einer großen NA entspricht, jedoch mit dem erfindungsgemäßen Unterschied eines geeignet großen Arbeitsabstandes (WD) und einer geeignet großen mittleren Öffnung mit einem Raumwinkel Ω _center , so dass die Vorrichtungen zur ungestörten Beleuchtung/Detektion in ein FIB-SEM oder ein anderes Mikroskopsystem eingebracht werden können. In diesem Fall kann es erforderlich sein, die Phase, Richtung, Polarisation, Divergenz und Leistung der Strahlen entsprechend in individueller Weise einzustellen. Um die erforderlichen Parameter zu bestimmen, können numerische Simulationen gemäß dem Stand der Technik (z. B. Birk et al. 2017) unter Berücksichtigung der erfindungsgemäßen Ring- Array Anordnung verwendet werden.

Konfiguration des Rina-Arravs mit Polarisationsvoraaben

Die Abbildungen 4 - 8 zeigen mehrere erfindungsgemäße Implementierungen der Polarisation der Quellen S _i (schematisch). Gemäß der Erfindung kann jede andere Verteilung physikalisch möglicher Polarisationsrichtungen verwendet werden, solange das Ziel der Erfindung beibehalten wird, ein Fluoreszenzbeleuchtungssystem mit einem Raumwinkel Ω _array zu realisieren, der bezogen auf ein Linsenbasiertes Fluoreszenzmikroskosystem einer großen NA entspricht, jedoch mit dem erfindungsgemäßen Unterschied eines ausreichend großen Arbeitsabstandes (WD) und einer ausreichend großen mittleren Öffnung mit einem Raumwinkel Ω _center , sodass die Vorrichtungen zur ungestörten Beleuchtung/ Detektion in ein FIB-SEM oder ein anderes Mikroskopsystem eingebracht werden können. In diesem Fall können alle kohärenten Strahlen, die von den Quellen S ₁ , S ₂ ,... S _N im Ring-Array emittiert werden, dieselbe Polarisationsrichtung haben; in diesem Falle würde eine Implementierung der in den Abb. 4,5 gezeigten Polarisationsbedingungen nur eine entsprechende Polarisation der kohärenten Strahlung (Wellenlänge λ _exc ) erfordern, der zur Beleuchtung des Ring-Arrays verwendet wird. Die in den Abb. 6, 7 gezeigten Polarisationsbedingungen können durch ortsspezifische Modifikation im Ring-Array (z. B. durch entsprechend gestaltete diffraktive Elemente oder durch räumliche Lichtmodulation gemäß dem Stand der Technik) realisiert werden.

Die in Abb. 4-8 angenommenen speziellen Beispiele des Ring-Arrays (lineare, zirkulare, radiale oder azimutale Polarisation der gemäß Abb. 1 ,2,19 von den Quellen S _i (i = 1,2,...N); ausgehenden Wellen können entweder in jeweils getrennten Ausführungen realisiert werden, oder in Kombinationen geeigneter Sätze von Quellen. Zum Beispiel wäre es auch erfindungsgemäß, in einem einzigen Ring-Array 2,3 oder 4 Sätze von Quellen zu plazieren, wobei z.B. Satz 1 N ₁ Quellen mit linearer Polarisation beinhaltet; Satz 2 N ₂ Quellen mit zirkularer Polarisation; Satz 3 N ₃ Quellen mit radialer Polarisation; und Satz 4 N ₃ Quellen mit azimutaler Polarisation beinhaltet.

Beispielsweise wäre die Fläche eines Ring-Arrays mit der erfindungsgemäßen Konfiguration α _min = 45°, α _max = 70° (s. Abb. 1), Arbeitsabstand WD = 5 cm ausreichend groß, um 3 Sätze von Quellen mit jeweils 190 Emittern (N ₁ = N ₂ * N ₃ ) unterzubringen (Satz 1 für Fokussierung für konfokale Laser Rastermikroskopie; Satz 2 für MINFLUX/STED in xy; Satz 3 für MINFLUX/STED in z-Richtung): Bei der obigen Konfiguration ergibt sich ein äußerer Ring-Array Radius von r _aussen = 5 cm x tg (70°) = 13.7 cm, und ein innerer Radius r _innen = 5 cm x tg (45°) = 5 cm, also eine Gesamtfläche von 511 cm ² = 51.100 mm ² . Für jede Quelle (insgesamt N ₁ + N ₂ + N ₃ = 3 x 190) wären also 51.100 mm ² /(3 x 190) = 90 mm ² vorhanden, eine gemäß dem Stand der Technik realisierbare Größe. Bei 4 Sätzen mit jeweils 190 Quellen würde sich bei den obigen Annahmen eine einer einzelnen Quelle zur Verfügung stehende Fläche von 67 mm ² ergeben, eine ebenfalls gemäß dem Stand der Technik bei geeigneter Miniaturisierung realisierbare Größe.

Die verschiedenen Bestrahlungsmodi können zusammen genutzt werden (z.B. λ _exc1 für Fokussierung/CLSM/SMLM; λ _exc2 für STED/MINFLUX; Wellenlängen gemäß dem Stand der Technik), aber durch verschiedene Polarisationen/Filter auch einzeln voneinander eingesetzt werden; eine weitere erfindungsgemäße Variante ist eine zeitliche und/oder örtlich variable Bestrahlung des Ring-Arrays mit verschiedenen Wellenlängen kohärenter Strahlung; hierdurch kann die Intensitätsverteilung in der Objektebene über die als Beispiele angegebenen Bestrahlungsmodi (fokal, Torusförmig) weiter modifiziert werden.

In den im folgenden dargestellten Anwendungsbeispielen wird angenommen, dass die von den einzelnen Quellen S _i der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung bei Anwendung eines bestimmten Bestrahlungsmodus (z.B. Fokussierung, Torus; lineare/azimutale Polarisation) jeweils alle die gleiche Leistung P ₁ ( S ₁ ) = P2 (S ₂ ) O.,.P _N (S _N ) (W/S) aufweisen und lediglich die Phase/Richtung geeignet modifiziert wird. Dies kann gemäß dem Stand der Technik auf verschiedene Weise realisiert werden (Birk et al., 2017), wobei z.B. eine nanolithographische Realisierung besonders vorteilhaft ist Um zusätzlich die Leistung Pi einzelner Quellen oder einzelner Sätze von Quellen geeignet auch unabhängig voneinander zu kontrollieren, können z.B. Mikrospiegelsysteme oder andere Elemente zur Kontrolle der Leistung von multiplen Strahlen gemäß dem Stand der Technik eingesetzt werden. Dies wird es z.B. ermöglichen, dieselbe z.B. nanolithographisch erzeugte Ring-Array Anordnung im Fokussierungsmodus (z.B. CLSM), im Torusmodus (z.B. MINFLUX/STED), oder in einer Kombination einzusetzen.

Durch geeignete Reduzierung der Zahl der Quellen ist es überdies möglich, statt einer übenwiegenden Konzentration der von der Ring-Array Anordnung emittierten Gesamtleistung auf ein einzelnes Fokus- oder Torusvolumen periodische Muster solcher Intensitätsverteilungen in der Objektebene zu erzeugen, mit einem Abstand größer als die zur Bestrahlung verwendete Wellenlänge (Abb. 14 -17). Dies ermöglicht es, derartige periodische Intensitätsverteilungen bei der Objektrasterung gemäß dem Stand der Technik ebenfalls vorteilhaft einzusetzen.

Die verschiedenen mit der Ring-Array Anordnung möglichen Bestrahlungsmodi können erfindungsgemäß auch dafür eingesetzt werden, eine Auflösungsverbesserung durch Methoden der Einzelmolekülmikroskopie/SMLM gemäß dem Stand der Technik zu ermöglichen. Dies ist z.B. im Fokussierungsmodus (Beispiele Abb.9;12a,b; 14-16; Tab. 1) vorteilhaft: Auf diese Weise können in interessanten Objektbereichen mit Dimensionen im Bereich der Anregungswellenlänge λ _exc die Positionen einzelner geeignet fluoreszierender Moleküle bestimmt und so die Nanostruktur derartiger kleiner Objektbereiche näher analysiert werden. Ober Anwendungen in der direkten FIB-SEM-CLEM hinaus würde dies zum Beispiel auch die Kombination einer erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung mit einem Weitfeld Mikroskopsystem mit großem Gesichtsfeld unter Verwendung eines Objektivs niedriger Numerischer Apertur erlauben: Einzelne sehr kleine interessante Objekte wie z.B. Bakterien oder Viren werden zunächst bei niedriger NA aber großem Gesichtsfeld positioniert (z.B. bei einer optischen Auflösung von 2 μm); anschließend wird die Nanostruktur so ausgewählter Objekte unter Verwendung der Ring-Array Beleuchtung im fokussierten Mode (Beispiele Abb. 9, 12a, b; 14 - 16; Tab. 1); oder im Torus Mode (Beispiele Abb.12c-f; 13, 17; Tab. 2) mit sehr viel höherer Auflösung (z.B. 50 nm, oder 10 nm) unter Verwendung von STED/ SMLM direkt in demselben Mikroskopsystem untersucht, indem z.B. die bei niedriger NA positionierten interessanten Objekte durch Stage Scanning (Bewegung des Objekts) in die Fokusregion O (Abb. 1) verschoben werden; durch eine derartige Kombination kann z.B. die Identifikation und Analyse von einzelnen pathogenen Bakterien oder Viren (z.B. Cremer 2011 ; Cremer et al. 2014); oder von Krebszellen in einem Gewebeschnitt (z.B. Oleksiuk et al. 2015) ganz erheblich vereinfacht und beschleunigt werden.

Ähnliche Vorteile ergeben sich auch in der Materialanalyse, z.B. der berührungsfreien mikroskopischen Kontrolle elektronischer Bauteile; Bei großem Gesichtsfeld aber niedriger Numerischer Apertur werden Orte möglicher Fehlstellen positioniert, deren Nanostruktur in einem zweiten Schritt mit dem erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahren näher analysiert wird.

Bei Kombination der Einzelmolekülmikroskopie mit der erfindungsgemäßen Ring- Array basierten fokussierten Torusbeleuchtung oder einer anderen Art von Beleuchtungsmustern (z.B. strukturierte Beleuchtung) mit Einzelmolekülmikroskopiemethoden (MINFLUX, SIMFLUX) kann die Strukturauflösung noch weiter verbessert werden (Lokalisation einzelner Moleküle mit einer Genauigkeit im 1 nm Bereich).

Anwendunasbeispiele

Anwendunasbeispiel 1 : Implementierung einer fokalen

Intensitätsverteilung

Unter Verwendung einer geeigneten Verteilung von kohärenten Strahlen, die durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erzeugt wird (z. B. Arbeitsabstand WD zwischen 5 und 10 cm, oder jeder andere Abstand, der für die Integration des hochauflösenden Fluoreszenzmodus in ein FIB-SEM-System oder ein anderes optisches System erforderlich ist) wird eine Fokusintensitätsverteilung erzeugt, die derjenigen Fokusintensitätsverteilung sehr ähnlich ist, die durch Fokussieren eines Laserstrahls mit Gaußförmigem Profil durch ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (z.B. NA = 0.9) bei geringem Arbeitsabstand (170 μm) erzeugt wird.

In allen in Abb. 9; 12 a,b, g; 14 - 16; Tabelle 1 berechneten Beispielen ergeben sich relativ kleine Unterschiede in den Fokussierungseigenschaften des Ring-Arrays, unabhängig von der Breite des Ring-Arrays (bei konstantem α _min / α _max gemäß Abb. 1- 3; 18), der Fokussierung in Vakuum, oder der Fokussierung in Eis (Abb.12c,f; Tabelle 1); dabei wird angenommen, dass die zu untersuchende Probe in eine dünne Eisschicht entsprechend dem Stand der FIB-SEM Technik eingebettet ist). Erfindungsgemäß relevant ist insbesondere, dass auch relativ große Innenwinkel (hier als Beispiel α _min = 45°, s. Abb. 18) mit einer guten Fokussierung vereinbar sind. Im Prinzip kann mit diesem Verfahren der Arbeitsabstand „beliebig“ groß gewählt werden (praktisch z.B. 5 oder 10 cm), und ein erheblicher Teil des Raumes um die Optische Achse (Abb. 1,2,3, 19) kann für andere Bauteile ausgespart werden, ohne die Fokussierung wesentlich zu beeinträchtigen.

Die Abb. 9,12,b; 14 - 16; Tabelle 1 zeigen die Ergebnisse numerischer Beispielrechnungen für die erfindungsgemäß erzeugten fokalen Intensitätsverteilungen um das Fokus Zentrum O (Abb. 1,2, 18) durch Verwendung eines Ring-Arrays mit linear polarisierten Lichtquellen bei gleichzeitig großem Arbeitsabstand WD und Aussparung des inneren Winkelbereiches (α _min = 45°, Ω _center = 1 ,84sr = 0.59 π für andere Bauteile (z.B. benötigt für die Teilchen/Elektronenoptik eines FIB-SEM oder für andere optische Systeme). Die kleinen Unterschiede in der Intensitätsverteilung in der Objektebene (x, y Richtung) ergeben sich durch die Verwendung einer linearen Polarisation der emittierten kohärenten Strahlen.

Erfindungsrelevant ist die Feststellung, dass das dabei erzielte maximale Verhältnis zwischen der Intensität des Hauptmaximums und den Nebenmaxima den Wert von 0,3 nicht überschreitet. Dies erlaubt eine vollständige Dekonvolution der bei Rastern des Objekts („Scanning“) mit einer derartigen fokalen Fokusverteilung erzielten Bilddaten (Hänninen et al. 1995), in der Weise, dass die erzielte optische Auflösung etwa derjenigen der Halbwertsbreite (FWHM) der zentralen Intensitätsverteilungen („Zentralpeaks“) um O entspricht. Bei Verwendung konfokaler Detektionsmethoden (CLSM; Cremer & Cremer 1978; Sheppard & Wilson 1978; Sheppard etal. 1987, 2007; Brakenhoff et al. 1979, 1985) kann die optische Auflösung noch einmal um den Faktor verbessert werden.

Abb. 12c-f; 13, 17; Tabelle 2) zeigen die Ergebnisse numerischer

Beispielrechnungen für erfindungsgemäß erzeugte Torusförmige

Intensitätsverteilungen um O (Abb. 1, 2, 19) wobei hier eine Ring-Array Anordnung mit N = 190 azimutal polarisierten Lichtquellen verwendet wurde, bei gleichzeitig großem Arbeitsabstand WD und Aussparung des inneren Winkelbereiches (α _min ~ 45°) für andere Bauteile (z.B. benötigt für die Teilchen/Elektronenoptik eines FIB-SEM). Die Unterschiede in den berechneten Intensitätsverteilungen für Positionen um O (hier als Mittelpunkt der Torusförmigen Intensitätsverteilung genommen) im Vakuum, an der Vakuum-Eis Grenzfläche sowie im Eis sind wiederum relativ klein. Aufgrund der azimutalen Polarisation (AP) verschwindet hier der bei linearer Polarisation (LP) an der Vakuum-Eis Grenzfläche auftretende Intensitätssprung (Abb. 9c, f; 12b) entlang der optischen Achse (z) beim Übergang vom Vakuum zu Eis.

Detaillierte numerische Rechnungen für verschiedene Dicken (Abb. 11) der Eisfläche (bis zu ca. 10 λ _exc , entsprechend ca. 5 μm für z.B. λ _exc = 488nm) zeigen, dass zumindest bis zu dieser Tiefe die durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erzeugten Intensitätsverteilungen (Abb. 16, 17) fast identisch mit derjenigen an der Eisoberfläche bleiben, wobei lediglich eine Verschiebung des Fokusmittelpunktes O um wenige λ _exc stattfindet. Auch die relative Helligkeit der Intensitätsmaxima bleibt in diesem Bereich fast konstant (Beispiele Abb. 16,17).

Als wesentliches allgemeines Ergebnis der in den Abbildungen und Tabellen dokumentierten Beispielrechungen zu den von der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung (Abb. 1- 8; 10) erzeugten Intensitätsverteilungen ergibt sich, dass mit diesem Verfahren selbst bei sehr großen Arbeitsabständen (z.B. WD = 5 cm) Intensitätsverteilungen realisiert werden können, die hochauflösende und sogar superauflösende Lichtmikroskopieverfahren ermöglichen, die den Ergebnissen bei Verwendung von Objektiven hoher Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.9) entsprechen.

Von wesentlicher Bedeutung für erfindungsgemäße Anwendungen der Ring-Array Beleuchtung ist die Möglichkeit, durch geeignete Einstellung der Polarisation der von den Quellen S _i (Abb. 1) ausgehenden Wellen entweder eine Fokussierung des kohärenten Lichtes in einen einzigen „Zentralpeak“ (umgeben von kleinen Nebenmaxima) zu erzielen (Abb. 9; 12a,b; 14 - 16); oder in der Objektebene um O eine Torus-förmige Intensitätsverteilung (umgeben von kleineren Nebenmaxima) zu erzeugen (Abb. 12c-f; 13,17), mit einem Minimum (Intensität Null) in O.

Unter den in den Abb.12c-f;13,17; Tabelle 2 zugrundegelegten Bedingungen der Anordnung, Polarisation und Phase der Quellen im Ring-Array tritt die Torusähnliche Intensitätsverteilung nur in der Objektebene (xy), nicht aber in Richtung der Optischen Achse (z) auf. Dies kann jedoch durch geeignete Anpassung der Phasen der Quellen (Birk et al. 2017; Sahl & Hell 2019) im Ring-Array ebenfalls erreicht werden; damit ist eine Verbesserung der Auflösung im STED/MINFLUX Modus auch entlang der optischen Achse möglich.

Bei Rasterung eines durch die Fokussierungsbedingungen der Abb. 9; 12a,b; 14 - 16; Tabelle 1 zur Fluoreszenz angeregten Objekts ergeben sich die einem Laserrastermikroskop nach dem Stand der Technik zugrundliegenden Beleuchtungsbedingungen (Cremer & Cremer 1978; Sheppard & Wilson 1978; Sheppard et al. 1987, 2007; Brakenhoff et al. 1979, 1985; Cremer & Masters 2013).

Bei Rasterung eines durch die Beleuchtungsbedingungen der Abb. 12c-f; 13,17 zur Fluoreszenz angeregten Objekts (Torusförmige Intensitätsverteilung in der Objektebene um O) ergeben sich die einem MINFLUX Verfahren nach dem Stand der Technik zugrundliegenden Beleuchtungsbedingungen (Balzerotti et al, 2017; Gwosch et al., 2020); bei Rasterung eines durch die fokalen Beleuchtungsbedingungen der Abb. 9; 12a,b; 14 - 16 mit einer ersten Anregungswellenlänge λ _fluor sowie zusätzlich mit einer Wellenlänge λ _STED gemäß den Torusförmigen Intensitätsverteilungen der Abb. 12c-f; 13,17 im STED-Modus angeregten Objekts ergeben sich die der STED- Mikroskopie nach dem Stand der Technik zugrundliegenden Beleuchtungsbedingungen (Hell & Wichmann, 1994; Hell et al., 1999; Ehrenberg 2014; Sahl & Hell 2019).

Wird für die Detektion des mittels erfindungsgemäßer Ring-Array Fokussierung eine Punktdetektion gemäß den Prinzipien der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie (Cremer & Cremer, 1978; Sheppard & Wilson., 1978; Sheppard et al. 1987, 2007; Brakenhoff et al., 1979, 1985) verwendet, so steigt gemäß dem Stand der Technik bei gegebener Halbwertsbreite des Hauptmaximums der Fokussierung (FWHM _xy ) die erreichbare optische Auflösung um einen weiteren Faktor von ca. 1,4 an.

Durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung wird der Arbeitsabstand bei hoher Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.95) um mehrere Größenordnungen erhöht (z. B. um den Faktor 5 cm/170 μm = 294, während im Wesentlichen die gleiche Fokusgröße (Halbwertsbreite) und damit die gleiche optische Auflösung in einer Rastervorrichtung beibehalten wird, wie sie bei einem Arbeitsabstand gleicher NA und 170 μm WD durch eine Objektivlinse hoher Numerischen Apertur erreicht wird, die sich außerhalb z.B. eines FIB-SEM in einem geeigneten Lichtmikroskopiesystem befindet (z.B. Abb. 9; 12a, b, 14 - 16; Tabelle 1). Das gleiche gilt für die mithilfe der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung realisierten Torusförmigen Intensitätsverteilungen, z.B. bei STED/MINFLUX, s. Abb. 12c-f; 13, 17; Tabelle 2.

Bei erfindungsgemäßer Anwendung des Ring-Arrays kann trotz großem Arbeitsabstand (z.B. WD = 5 cm) ein sehr kleiner Fokusdurchmesser auch genutzt werden, um dort z.B. photochemische Reaktionen in dem interessierenden Bereich (ROI) zu induzieren, oder andere photophysikalische Prozesse zu induzieren, die für das Photoschalten in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) gemäß dem Stand der Technik nützlich sind. Darüber hinaus kann ein solcher kleiner Fokusdurchmesser in Verbindung mit geeigneten Beleuchtungsintensitäten auch zur lokalisierten Materialbearbeitung genutzt werden, z.B. zur Laserinduzierten Ablation kleiner Oberflächenunebenheiten bei optischen Elementen.

Beispielsweise ergibt sich mit einer Leistung P = Summe (P _i ) der Leistung der einzelnen von den Ring-Array Quellen emittierten Strahlen im Fokusbereich eine durchschnittliche Intensität von I _average = Summe (P _I )/A _Fokus , wobei A _Fokus ~ FWHM ² ~ (d _min ) ² eine Schätzung der mittels der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung in der Objektebene um O beleuchteten Fokusfläche darstellt. Zum Beispiel ergibt sich für einen Arbeitsabstand von mehreren cm bei Verwendung eines Objektivs mit einer NA = 0,06 (λ _exc = 488 nm) gemäß dem Stand der Technik gemäß Gl. (1) ein Fokusdurchmesser von ca. 5 μm (A _spotconv = 20 μm ² ); unter Verwendung einer erfindungsgemäßen fokussierenden Ring-Array Anordnung wird noch bei einem Arbeitsabstand von 5 - 10 cm (theoretisch auch noch mehr) ein hierzu ca. 30x kleinerer Fokusdurchmesser (0.2 μm) und somit eine ca. 600x kleinere Fokusfläche ( A _Array = 0.03 μm ² ) erzielt. Die Fokusintensität in der Ring-Array Anordnung wäre bei gleicher Gesamtleistung also um den Faktor A _Array /A _spotconv ~ 600x mal höher; mit einer Objektivlinse von NA = 0,06 in einem integrierten FIB-SEM wäre also eine ca. 600mal höhere Leistung erforderlich, um die gleiche fokale Beleuchtungsintensität bei den erforderlichen großen Arbeitsabständen zu erreichen; statt einer Laserausgangsleistung von z.B. 100 mW wäre eine solche von 60 W erforderlich. Anwendunasbeispiel 2: Implementierung einer Torus (..Donut“) förmigen Intensitätsverteilung

Das Konzept des Ring-Array Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch zur Erzeugung einer fokalen “Stimulated Emission Depletion (STED)” Intensitätsverteilung angewendet werden, die derjenigen ähnlich ist, die in einem STED-Mikroskop auf der Basis einer Objektivlinse mit hoher NA gemäß dem Stand der Technik erzeugt wird (Hell und Wichmann 1994; Hell et al. 1999; Hell 2007). Die Ergebnisse eines STED Ring-Arrayimplementierungsbeispiels sind in Abb. 12c-f;13, 17 und Tabelle 2 dargestellt. Wenn eine solche Torusförmige Intensitätsverteilung auf ein zuvor angeregtes Ensemble von Fluorophoren angewendet wird (was durch eine erfindungsgemäße Ring-Arrayanordnung erreicht werden kann, z.B. Abb. 8), kann das STED-Prinzip in der Nähe des Fokus auch noch in effizienter Weise bei „beliebig großen“ Arbeitsabständen (z.B. WD = 5 -10 cm) realisiert werden, ohne dass für die STED-Beleuchtung Intensitäten erforderlich sind, die signifikant höher sind als in gegenwärtigen kommerziellen STED-Systemen gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung von Objektiven hoher Numerischer Apertur. Auf diese Weise wird eine STED-Auflösung bis in den Bereich unter 100 nm realisiert, jedoch bei Arbeitsabständen bis zu einem Bereich von mehreren cm, wie dies in einem integrierten FIB-SEM-CLEM erforderlich ist, oder auch in anderen Mikroskopiesystemen wünschenswert ist.

Durch geeignete Anpassung von Phase, Polarisation etc. der von den Quellen des Ring-Arrays emittierten Wellen ist es zudem mit der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung auch möglich, entlang der optischen Achse (z) eine Torus-förmige Intensitätsverteilung zu erzeugen, ähnlich derjenigen, wie sie mit einem Objektiv hoher Numerischer Apertur gemäß dem Stand der Technik (Birk et al., 2017) erzeugt werden kann. Die damit auch entlang der optischen Achse (z) mögliche STED/MINFLUX basierte Superauflösung erlaubt es, eine kleine fluoreszierende Zielregion auch in (z) Richtung auf wenige nm genau einzugrenzen; so kann z.B. das FIB-SEM Verfahren ganz wesentlich beschleunigt werden, da weniger Schichten durch das FIB System abgetragen werden müssen; eine stark verbesserte dreidimensionale (3D) Auflösung kann auch in anderen Mikroskopieanwendungen wünschenswert sein. Bei Anwendung des MINFLUX Verfahrens (Balzaroti et al. 2017; Gwosch et al. 2020) oder verwandter Methoden der Einzelmolekülmikroskopie wie z.B. SIMFLUX (Best et al. 2014; Cnossen et al. 2020) gemäß dem Stand der Technik nähert sich die erreichbare lichtoptische Auflösung von fluoreszierenden Objektmolekülen dem Bereich von 1 nm, also einem der FIB-SEM Auflösung bereits nahe kommenden Wert. Aufgrund der völlig verschiedenen Materialkontraste bei FIB-SEM und Einzelmolekülmikroskopie ergeben sich auch damit stark erweiterte Perspektiven der Analyse.

Anwendunasbeispiel 3: Implementierung der Rinq-Arrav-basierten

Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von in Eis eingebeteten Proben in einem integrierten FIB-SEM

Von wesentlicher Bedeutung für Anwendungen von erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnungen ist die Möglichkeit des Einsatzes zur FIB-SEM Untersuchung von Proben, die unter Kryobedingungen in Eis eingebettet sind. Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung sind dabei die durch den Übergang von Vakkum/Luft (n = 1) zu Eis (n = 1.31) gegebenen Änderungen des Brechungsindex zu beachten (Abb. 11).

Die aufgrund numerischer Simulationen fokaler Intensitätsverteilungen für eine Anregungswellenlänge von λ _exc = 488 nm erhaltenen Werte für die Halbwertsbreiten (HWB/FWHM) bei erfindungsgemäßer Verwendung von Ring-Array Anordnungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst (s. auch Abb. 9; 12a, b; 14 - 16), bzw. in Tabelle 2 für Torusförmige Intensitätsverteilungen (s. auch Abb. 12e,f; Abb. 17). Sie zeigen, dass sowohl im Fokussierten Modus (Tabelle 1) als auch im STED/MINFLUX Modus (Tabelle 2) im Eis auch bei sehr großen Arbeitsabständen Fokusdurchmesser bzw. Torus („Donut“)-Konfigurationen erzeugt werden können, die den mit Linsenbasierten Mikroskopsystemen bei Objektiven hoher Numerischer Apertur (aber sehr kleinen, für FIB- SEM und viele andere Mikroskopieanwendungen nicht brauchbaren Arbeitsabständen) entsprechen.

Als Beispiel für die gemäß Tabelle 1 , 2 erreichbaren Fokusdurchmesser/Torusmaße und dort angegeben Einheiten von λ _exc (ebenso gültig z.B. für λ _STED , λ _MINFLUX oder λ _SIMFLUX ) sei λ _exc = 488 nm angenommen, eine typische Fokusgröße (FWHM _xy ) von etwa 0,5 λ _exc sowie 2,5 λ _exc (z) entspricht dann ca. 240 nm in der Objektebene (xy) bzw. 1 ,2 μm entlang der Optischen Achse (z); dies ist für eine Grobrasterung einer Probe zur ersten Eingrenzung von interessanten Objekten ausreichend (s.u.). Die in Tabelle 2 gegebenen Werte für den Torus Mode (STED/MINFLUX) sind bei Verwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung nur relativ geringfügig verbreitert, verglichen mit einem Objektivlinsensystem der gleichen Apertur (aber einem um ein Vielfaches geringerem Arbeitsabstand).

Im „STED“ Modus wird zusätzlich zu dem zentralen Fokus eine Torus-ähnliche Intensitätsverteilung um O (Abb. 1) erzeugt. Im MINFLUX Modus (Balzarotti et al. 2017; Gwosch et al. 2020) wird anstelle eines zentralen Maximums eine Torus-ähnliche Intensitätsverteilung um O erzeugt; im SIMFLUX Modus (Best et al. 2014;

Cnossen et al. 2020) werden zur Verbesserung der SMLM Auflösung durch strukturierte Beleuchtung erzeugte Muster verwendet. Die Torushalbwertsbreite ist die Breite (D) des Torus im inneren Bereich (siehe Birk et al., 2017; Abb. 13). Im Unterschied zum Stand der Technik (Birk et al., 2017) wird hier die Möglichkeit einer STED/MINFLUX kompatiblen Torus Erzeugung durch eine flache Ring-Array Anordnung offenbart, die die in einem FIB-SEM erforderlichen großen Arbeitsabstände realisiert bei gleichzeitiger Integration der für FIB-SEM erforderlichen Vorrichtungen, sowie der Einbettung des Präparats in Eis. Eine Realisierung von Mustern strukturierter Beleuchtung kann z.B. durch die Interferenz einiger weniger Wellen erfolgen (Heintzmann et al. 1999; Gustafsson et al. 2000; Birk et al. 2017).

Prinzipien der praktischen Realisierung I

Um das durch die Fokussierung bzw. durch die Erzeugung von Torus-Mustern durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung im Objekt erzeugte Signal (z.B. Fluoreszenz) für die Bildgebung (z.B. konfokale, STED/MINFLUX Mikroskopie) zu registrieren, ist ein geeignetes Detektionssystem erforderlich (ein schematisches Beispiel für Fluoreszenzdetektion s. Abb. 19). Im folgenden Implementierungsbeispiel wird ein Arbeitsabstand im Bereich mehrerer Zentimeter angenommen.

Im Prinzip reicht zum Beispiel eine Linse mit einer Numerischen Apertur (NA) von 0,1 oder 0,2 gemäß dem Stand der Technik zur Detektion eines Fluoreszenzsignals aus; allerdings ist die Photonensammeleffizienz mit einer solchen einzelnen Sammellinse sehr gering und z.B. um den Faktor (1 ,4/0.2) ² ~ 50x oder (1.4/0.1 ) ² ~ 200x geringer als mit einem Immersionsobjektiv der Apertur NA = 1 ,4 gemäß dem Stand der Technik. Eine oder mehrere solcher Linsen können jedoch in dem erforderlichen Arbeitsabstand in dem Raumwinkel Ω _bottom , platziert werden, also ohne den Strahlengang im Raumwinkel Ω _array zu stören. Bei größerem Arbeitsabstand können auch Linsensysteme mit noch geringerer Numerischer Apertur zur ortsaufgelösten Detektion des Fluoreszenzsignals verwendet werden.

Die im erfindungsgemäßen Ring-Array-Modus erreichbare optische Auflösung hängt wie bei anderen Laser Raster („Scanning“) verfahren gemäß dem Stand der Technik von der an einem bestimmten Objektort zur Fluoreszenzanregung erzeugten lokalen Intensitätsverteilung ab; die Ortsposition ist dabei durch die Position des

Objekttischs („stage scanning“) bzw. der lokalisierten Beleuchtung gegeben (z.B. Intensitätsmaximum bei fokaler Intensitätsverteilung, oder zentraler Nullstelle bei Torusförmiger Intensitätsverteilung). Diese Ortsposition kann gemäß dem Stand der Technik mit Objektiven hoher Numerischer Apertur mit einer Genauigkeit o _toc im 1 Nanometerbereich bestimmt werden (Albrecht et al., 2002; Pertsinidis et al., 2010; Balzarotti et al., 2017; Gwosch et al., 2020). Bei konstanter registrierter Zahl der emittierten Photonen ist σ _loc umgekehrt proportional zu (NA) ² (Cremer & Edelmann 2000; Cremer et al. 2017): Näherungsweise gilt (Objektebene): σ _loc ~ FWHM/sqrt (N _phot ), wobei FWHM die Halbwertsbreite der PSF (proportional zu 1/NA) und N _phot die Anzahl der detektierten Photonen ist (proportional zu NA ² ); also ergibt sich insgesamt σ _toc ~ (1/[NA)xsqrt (NA) ² ] = 1/(NA) ² .

Zum Beispiel wird bei Verwendung desselben Objektivs für Fluoreszenzanregung und Detektion die Lokalisationsgenauigkeit σ _loc bei Verwendung eines Objektivs mit großem Arbeitsabstand (z.B. NA = 0.3) gegenüber einem Objektiv mit hoher Numerischer Apertur (NA = 1.4) aber geringem Arbeitsabstand unter sonst gleichen Bedingungen um den Faktor (1.4/0.3) ² = 22x verschlechtert; bei einem Objektiv mit NA = 0.06 wäre die Lokalisationsgenauigkeit sogar um den Faktor (1.4/0.06) ² = 544x geringer. Dies ist insbesondere bei fluoreszenzmikroskopischen Verfahren wie z.B. CLSM, SMLM, MINFLUX/SIMFLUX von größter praktischer Bedeutung: Zum Beispiel ist die mit Einzelmolekülmikroskopischen Verfahren erreichbare optische Auflösung der Lokalisationsgenauigkeit σioc proportional; d.h. unter sonst gleichen Bedingungen würde bei der Verwendung eines Objektivs mit NA = 0.3 statt eines Objektivs mit NA = 1 ,4 die optische Auflösung um den Faktor 22 schlechter ausfallen, z.B. nur noch 220 nm statt 10 nm; bei einer NA von 0.06 wären es statt 10 nm nur noch 5,4 μm (λexc = 488 nm). Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung ist die Halbwertsbreite (HWB/FWHM) des fokussierten Strahls in der Objektebene jedoch unabhängig von der NA der Detektionsoptik und entspricht z.B. bei den in Tabelle 1 gemachten Annahmen (λ _exc = 488 nm; n= 1 ; α _min = 45°; α _max = 70°) der Fokussierung mit einem linsenbasierten Objektiv einer effektiven Numerischen Apertur NA _array ~ 0.8 (Abb.9; 12a, b; 14 - 16; Tabelle 1; Abb. 18). In diesem Falle ergibt sich bei Nutzung des Einzelmolekülmodus die Abschätzung σ _loc - 1/[NA _array x sqrt (NA _det ) ² ], wobei NA _array die Apertur eines linsenbasierten Objektivs mit der gleichen effektiven Photonensammeleffizienz wäre wie bei den im Folgenden aufgeführten alternativen Möglichkeiten zur Fluoreszenzdetektion unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtung.

Im Folgenden werden einige Möglichkeiten der Fluoreszenzdetektion konkretisiert, um die Effizienz der Fluoreszenzdetektion bei Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung zu verbessern. Ein allgemeines schematisches Beispiel wird in Abb. 19 angegeben.

Beispiel 1 für einen Siqnaldetektionsmodus im RinqgArrav System, bei dem eine oder mehrere Linsen niedriger Numerischer Apertur zur Detektion des Signals verwendet werden.

Anstatt eine einzelne Objektivlinse mit niedriger numerischer Apertur zur Detektion der durch die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung im Fokussierungsmodus erzeugten lokalen Fluoreszenzemission zu verwenden, besteht eine Implementierung gemäß der vorliegenden Erfindung aus einer Anordnung von mehreren Objektivlinsen mit niedriger NA, die in einem entsprechend großem Arbeitsabstand (z.B. WD = 5 cm um den Ring-Array angeordnet sind. Die von diesen mithilfe nachgeschalteter Detektoren gemäß dem Stand der Technik registrierten einzelnen Fluoreszenzsignale werden zu einem Gesamtsignal (Gesamtzahl der detektierten Fluoreszenzphotonen) aufaddiert und zur Bildgebung im Raster („Scanning“) Modus verwendet. Dies ist möglich, da die für die Bildgebung wesentliche Ortsinformation durch den Ort O des Ring-Array erzeugten Fokus gegeben ist. Hat z.B. ein einzelnes Detektionsobjektiv eine NA von 0.3, so ergibt sich hieraus im Vakuum ein Öffnungswinkel von α = 17.5°, entsprechend einem Raumwinkel von Ω = 2π (1 - cos α) = 0,092π . Um die gleiche Photonensammeleffizienz wie ein Objektiv mit NA _det = 0.92 (Vakuum) zu erreichen (a = 67,5°; Ω = 1 ,23π , müssten demnach ca. 10 dieser Sammelobjektive in einem Abstand von 5 cm angeordnet werden. Derartige Anordnungen erscheinen grundsätzlich implementierbar (Abb. 18, 19): Da die Fluoreszenzemission weitgehend isotrop erfolgt, kann dies in dem durch den Raumwinkel Ω _bottom (Abb. 2) gekennzeichneten Raum erfolgen. Nimmt man beispielsweise eine Ringkonformation mit einem Radius von 5 cm an, so steht auf einem Kreis von 2π x 5 cm mit 31 cm Umfang pro Sammelobjektiv ein Abschnitt von 31 cm/10 = 3,1 cm zur Verfügung. Im Vergleich zur Sammeleffizienz eines Immersionsobjektivs mit NA = 1,4 ist das Gesamtsignal der Fluoreszenz (proportional zur Anzahl N _phot der insgesamt registrierten Fluoreszenzphotonen in diesem Falle lediglich um den Faktor (1,4/0,9) ² =

2.4 reduziert, ein Verlust an Sammeleffizienz, der sich z.B. durch längere Aufnahmezeiten kompensieren lässt. Bei Anwendung des Einzelmolekülmodus gemäß der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung wird die Lokalisierungsgenauigkeit σ _loc gegenüber dem Stand der Technik (Immersionsobjektiv mit NA = 1 ,4) unter den hier gemachten Annahmen insgesamt um einen Faktor [1 ,4 x

1.4 (A _{lmmersionsobjektiv} )]/[0.8 (NA _array ) X 0.9 (NA _det )] ⁼ 2,7 reduziert.

Beispiel 2 für einen Siqnaldetektionsmodus im Rinq-Arrav System unter Verwendung einer Anordnung von Glasfasern zur Detektion des Fluoreszenzsignals·

Anstelle einer einzelnen Objektivlinse mit großem Arbeitsabstand und entsprechend niedriger NA zur Signaldetektion wird eine Anordnung von endoskopischen Glasfaseranordnungen verwendet. Da die räumliche Verteilung der Lichtquellen im erfindungsgemäßen Ring-Array weitgehend variabel ist, ohne die für eine hohe Auflösung erforderliche Intensitätsverteilung nachteilig zu verändern, können die Glasfaseranordnungen auf eine Vielzahl von Arten implementiert werden. Zum Beispiel können die Glasfasern in einer Anzahl von Bündeln implementiert werden, ohne die Ring-Array Anordnung oder die für FIB-SEM erforderlichen Vorrichtungen zu stören. Wie im vorherigen Beispiel 1 ist die Position der beleuchteten Objektstelle durch die Einstellung (Position, Richtung, Polarisation etc.) des Abtaststrahls gegeben, während die optische Auflösung (Unterscheidung von zwei Fluoreszenzpunktquellen) vom Fokusdurchmesser des Abtaststrahls bzw. allgemein von der Intensitätsverteilung am Beobachtungsort abhängt. Nimmt man als Beispiel für ein einzelnes Glasfaserbündel einen Öffnungsquerschnitt von (5 mm) ² bei einem Anstand von 5 cm an, so ergibt sich für die Öffnung ein Raumwinkel (bezogen auf das Fokus Zentrum O) von 1 x 10 ² π . Um eine Sammeleffizienz eines Objektivs mit der Numerischen Apertur (Vakuum/Luft) von 0.92 (Ω = 1.23π ) zu erreichen, müssen demnach rund 90 Einzelbündel von Glasfasern anstelle der Objektive auf einem Ring im Abstand von z.B. 5 cm positioniert werden. Die von den einzelnen Glasfaserbündeln aufgenommenen Fluoreszenzsignale können dann einem einzigen Detektor zugeführt werden.

Insgesamt gibt es viele Möglichkeiten zu einer effizienten Sammlung des durch die erfindungsgemäße Ring_Array Beleuchtung induzierten Signals. Ein allgemeines Schema zeigt Abb. 19. Die schematisch als „Fluoreszenz-Sammeloptik“ bezeichneten Elemente können zum Beispiel Sammellinsen/Objektive niedriger Numerischer Apertur bezeichnen (Beispiel 1), oder Glasfaseranordnungen (Beispiel 2).

Erfindungsgemäß können auch beide Detektionsmodi (Linsen, Lichtwellenleiter) vorteilhaft kombiniert werden.

In den beschriebenen Beispielen zur erfindungsgemäßen Anwendung von Ring- Array Anordnungen wurde das Rastern („Scannen“) des Präparats für das Punkt-für- Punkt-Scannen und die Erzeugung von 3D-Bildern angenommen. Da die zu scannenden Gesichtsfelder typischerweise sehr klein sind (im Mikrometerbereich), kann die Abtastung des Gesichtsfelds durch Bewegung des Objekts („Stage Scanning“) außerordentlich schnell erfolgen.

Durch geeignete Einstellung der Beleuchtungslichtquellen ist es jedoch gemäß einer speziellen Implementierung der Erfindung ebenfalls möglich, den Abtastvorgang (Rastern) auch durch Strahlabtastung durchzuführen und somit den Abbildungsprozess stark zu beschleunigen. Dies wird durch koordinierte Änderungen der Richtungen der kollimierten Strahlen unter Beibehaltung ihrer Phasenbeziehungen realisiert. Um den Einstellaufwand zu minimieren, können hierzu die Lichtquellen im Ring-Array in einer Anzahl von „Subarrays“ angeordnet werden , die eng miteinander verbunden sind.

Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung auf größere Objekte mit räumlich weit verteilten Fluoreszenzemittern (z. B. einem zellulären Sphäroid mit GFP (Green Fluoreszenz Protein)-markierten Histonen oder immunmarkierten Rezeptoren) muss berücksichtigt werden, dass die von dem Ring-Array emittierten Mehrfachstrahlen auch Fluorophore außerhalb des Fokusbereichs anregen; diese Emission kann so stark werden, dass die in der Fokusregion erzeugte Fluoreszenz möglicherweise nicht klar von der Fluoreszenz dieses „Hintergrundes“ unterschieden wird. Eine Möglichkeit gemäß dem Stand der Technik, um dieses Problem zu übenwinden, ist die Verwendung der Zwei-Photonen-Anregung. Eine solche Implementierung erfordert aufgrund der begrenzten Kohärenzlängen kurzer Laserpulse einen zusätzlichen Anpassungsaufwand. Aufgrund der größeren Wellenlänge wird zusätzlich die erreichbare optische Auflösung verringert: Wenn beispielsweise eine Zwei-Photonen- Anregung durch 700-nm-Femtosekundenpulse anstelle von 488 nm angenommen wird, wird die optische Auflösung verringert. Da die gleiche Anforderung jedoch auch für die Fluoreszenzbildgebung unter Verwendung einer Objektivlinse mit niedriger Apertur gemäß dem Stand der Technik gilt, ändert sie nichts an der großen relativen Auflösungsverbesserung, die durch die erfindungsgemäße Anwendung von Ring- Array Systemen zur Anregung bei sehr großen Arbeitsabständen möglich ist.

Die Verwendung kohärenter Lichtquellen ermöglicht im Prinzip die Implementierung auch einer interferometrischen Signaldetektion gemäß dem Stand der Technik: Durch die Erzeugung synthetischer Aperturen kann die Extraktion von Bildern mittlerer und hoher Auflösung unter Verwendung von Mikroskoplinsen mit niedriger NA ermöglicht werden (Mico et al. 2006). Im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Ring-Array Beleuchtungskonzept unter Verwendung kohärenter Lichtquellen wurde gezeigt, dass eine inkohärente Beleuchtung von halbtransparenten Proben eine quantitative Phasenwiederherstellung unter Verwendung der Quadriwellen-Lateral- Scherinterferometrie ermöglicht (Bon et al. 2014). In Kombination mit einer Reihe polarisationsempfindlicher Detektionen kann die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung auch zum Multiplexen von ellipsometrischen Messungen verwendet werden (Egner 2002).

Im ursprünglichen Konzept eines konfokalen Laser-Scanning-4 π - Fluoreszenzmikroskops, das eine „Superauflösung“ mit großem Arbeitsabstand ermöglicht (Cremer und Cremer 1978), wurde angenommen, dass eine Punkt-für- Punkt-Anregung des Objekts in drei Dimensionen (3D) möglich ist durch die Verwendung von "4 π -Hologrammen" zum Fokussieren der einfallenden kohärenten Lichtstrahlen auf einen fokalen "Punkt" mit einem Durchmesser, der kleiner ist als derjenige, der durch Fokussierung durch eine Objektivlinse erzielt werden kann. Bei der hier offenbarten erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung (Abb. 1) wird eine geeignet hohe Anzahl N (bis zu mehreren hundert) kohärenter, kontinuierlich emittierender Punktquellen S ₁ , S ₂ ,..., S _N angenommen. Die Punktquellen S ₁ , ..,S _N haben hier feste Phasen- und Polarisationsbeziehungen zueinander. Für eine beliebige, aber feste Konfiguration (Positionen, Phasen, Polarisationen, Ausbreitungsrichtungen, Intensitäten) von Lichtquellen wird der Ursprung des Koordinatensystems auf das theoretische absolute Maximum der Beleuchtungsintensitätsverteilung (d. h. den theoretischen „Fokus“ O, s. Abb. 1) gelegt. Der Ursprungspunkt O (x,y,z = 0) definiert zusammen mit dem Schwerpunkt der Positionen der Lichtquellen in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung einen Satz von zwei Positionen im Raum. Die Linie durch beide Punkte bildet die optische Achse (z). Im Gegensatz zur Fokussierung durch 4π - Hologramme (Cremer&Cremer 1978) ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, die Richtung, Intensität, Polarisation und Phase für jeden der von einer Ring-Array Anordnung emittierten kohärenten Beleuchtungsstrahlen individuell und unabhängig von den anderen zu regulieren.

Die Erzeugung mehrerer kohärenter, insbesondere auch koilimierter Strahlen mit kontrollierten Intensitäts-, Phasen- und Polarisationsbeziehungen ist auf verschiedene Weise möglich, indem Licht von einer einzelnen Laserlichtquelle z.B. die einzelnen kohärenten Strahlen mittels eines Mikrolinsenarrays erzeugt und durch geeignete Spiegelkonfigurationen gemäß dem Stand der Technik zu den gewünschten Positionen der Punktquellen S ₁ , S ₂ ,...S _N in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung geleitet werden: Dies kann realisiert werden a) unter Verwendung einer Freiraumoptik oder b) unter Verwendung eines auf Glasfasern basierenden Ansatzes. Eine solche Mikrolinsenkonfiguration kann zusammen mit einem Flüssigkristallarray im Transmissionsmodus verwendet werden, um die Steuerung der Phasenbeziehung am Ort der Punktquellen S ₁ , S ₂ ,...S _N zu ermöglichen. Durch Einführen von intensitätsregulierenden Elementen gemäß dem Stand der Technik (z. B. Graufilter, Polarisationselemente, akusto-optische Modulatoren usw.) ist es zusätzlich möglich, auch die Intensität der Strahlen einzeln zu steuern; auf diese Weise können gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den in den gezeigten Beispielen angegebenen Intensitätsverteilungen (Fokussierung, Torus) auch andere Mikroskopiemodi unter Verwendung der gleichen erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung realisiert werden, wie beispielsweise Lichtblattmikroskopie (Light Sheet Microscopy), optische Projektionstomographie oder axiale Mikrotomographie.

Die Implementierung einer sehr kleinen Anzahl von Quellen (im Gegensatz zu der hier offenbarten erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung) wurde bereits früher als Konzept zur Verbesserung der Auflösung untersucht (Bailey et al. 1993). Solche Methoden wurden als Anregungsfeldsynthese bezeichnet. Durch die Kombination von Bildern, die mit einer Reihe feiner Interferenzmuster aufgenommen wurden, die dem Objekt überlagert sind, konnte eine sogenannte Mikroskopie mit synthetischer Apertur realisiert werden (Mermelstein 1999). Konzepte, die ähnlicher Natur sind, aber auf der Detektionsseite arbeiten, werden in der Astronomie seit vielen Jahren angewendet.

Die Verwendung vieler kollimierter Strahlen in der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung hat mehrere Vorteile: a) Die Verwendung kollimierter Strahlen kann im Prinzip durch einen beliebigen Abstand der Lichtquellen S _i realisiert werden, die die kollimierten Strahlen emittieren; b) mit zunehmendem Abstand vom Ursprung kann die Anzahl der Quellen der kollimierten Strahlen sehr groß gemacht werden; c) Die Anzahl, Intensität und räumliche Verteilung der Lichtquellen S _K (unter Verwendung von beispielsweise Mikrolinsen) kann individuell eingestellt werden. Zum Beispiel kann durch Hinzufügen einer Möglichkeit zum Steuern der Intensität l _i des von einer Lichtquelle S _i emittierten kollimierten Strahls (z. B. auf ähnliche Weise wie bei einem Projektionsbeamer) die Lichtverteilung individuell auf schnelle und effiziente Weise modifiziert werden.

Zusammenfassend wird mit der erfindungsgemäßen Ring-Array anordnung (Beispiel: Anregungswellenlänge λ _exc = 488 nm, n = 1 (Vakuum), α _min = 45°; α _max = 70°) im Fokussierungsmodus und bei konfokaler Detektion des im Objekt induzierten Fluoreszenzsignals eine laterale optische Auflösung von ca. (0.6 x 488 nm)/sqrt(2) = 0,2 μm lateral und 1 μm axial erreicht (Tab. 1), selbst bei einem sehr großen Arbeitsabstand (z.B. 5 - 10 cm), wie er z.B. in einem integrierten FIB-SEM-System erforderlich ist. Sofern eine derartige Auflösung für die beabsichtigten Analysen noch nicht ausreichend ist, kann diese unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ring- Arrayanordnung unter Verwendung des Torus-Beleuchtungsmode (Tab. 2) im MINFLUX/STED Modus weiter verbessert werden (bis auf wenige zehn nm im STED Modus bzw. bis in den Nanometerbereich im MINFLUX oder SIMFLUX Modus).

Im Gegensatz zu Lösungen gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung eines Mikroskopsystems auf der Basis einer Objektivlinse mit niedriger NA und entsprechend großem Arbeitsabstand (5- 10 cm) erlaubt die erfmdungsgemäße Ring- Arrayanordnung eine um ein Vielfaches bessere lichtoptische Auflösung bei der direkten Integration von Fluoreszenzmikroskopie in ein FIB-SEM oder ein anderes optisches System mit großem Arbeitsabstand und apparativen Restriktionen des Bereichs um die Optische Achse; dies wiederum ermöglicht bei FIB-SEM oder vergleichbaren Anwendungen eine starke Reduktion der für die Präparation der Zielregion erforderlichen Zeit. Damit stellt die Anwendung der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung eine wesentliche technische Verbesserung der FIB-SEM Analyse gegenüber dem Stand der Technik dar.

Der entscheidende Unterschied der vorliegenden Erfindung nach dem Ring-Array Verfahren ist der große Arbeitsabstand einer fluoreszenzbasierten hochauflösenden Bildgebungsvorrichtung in einem integrierten FIB-SEM odereinem anderen Mikroskop bei einer optischen Auflösung ähnlich der von objektivlinsenbasierten Geräten mit niedrigem Arbeitsabstand WD und hoher Numerischer Apertur erreichbaren. Gemäß dem implementierten Bildgebungsmodus ist eine optische Auflösung bis zu einem Bereich von 1 nm unter Verwendung der kohärenten Ring-Array Beleuchtung grundsätzlich möglich, d. h. die lichtoptische Auflösung ist bis zu mehreren Größenordnungen besser im Vergleich zum Stand der Technik z.B. bei integriertem FIB-SEM. Ein weiterer großer Vorteil des erfindungsgemäßen Ring-Array Verfahrens ist seine Flexibilität. Die Verwendung einzelner Quellen nach dem Ring-Array Prinzip ermöglicht es, Amplitude, Phase, Ausbreitungsrichtung, Intensität, Divergenz und Polarisation für jede einzelne kohärente Lichtquelle individuell einzustellen. Infolgedessen kann die Fokusfeldverteilung entsprechend den spezifischen Anforderungen geändert werden. Beispielsweise kann im Ring-Array- STED/MINFLUX-Modus ein erster Satz von Quellen S _i (i = 1 , ... .N ₁ ) verwendet werden, um einen Fokusdurchmesser für die bei STED erforderliche Fluoreszenzanregung zu erzeugen, während ein zweiter Satz von Quellen Qj (j = 1 ,2, ... N ₂ ) verwendet wird, um eine Torusförmige Intensitätsverteilung um den fokalen Brennpunkt herum für die STED Depletion der Fluoreszenz gemäß dem Stand der Technik zu erzeugen. Im Prinzip kann die Einstellung dieser Quellenparameter sogar dazu verwendet werden, um die Position des Brennflecks zu steuern, wodurch eine Strahlabtastung implementiert wird. Darüber hinaus wird eine Kompensation der Aberrationen in Bildgebungssystemen mit hoher NA (C.J.R. Sheppard und Matthews 1987) möglich, da im Prinzip jede Apodisierungsfunktion synthetisiert werden kann.

Prinzipien der praktischen Realisierung II

Berechnung der durch die Ring-Arrav Anordnung erzeugten

Intensitätsverteilung

Für die praktische Realisierung der hochauflösenden lichtoptischen Bildgebung mithilfe von erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnungen ist es wesentlich, die durch diese unter bestimmten Bedingungen in der Objektebene erzeugten Intensitätsverteilungen berechnen und so ihre Fertigung optimieren zu können. In der hier angewandten Berechnungsmethode gemäß dem Stand der Technik wird jede Quelle S _i (Abb. 1) als Ausgangspunkt einer ebenen elektromagnetischen Welle angesehen, sodass die Illumination in der Objektebene die Summe der Interferenzen all dieser ebenen Wellen ist. Wichtig ist, dass die Ausbreitungsrichtung (gegeben durch den Wellenvektor) dieser Wellen das zu erzeugende Zentrum (O) der fokalen bzw. der Torusverteilung ist, und dass die Phaseneinstellung aller Wellen geeignet vorgenommen wird, so dass z.B. die Phase in der Fokusmitte (O) für alle Wellen identisch ist (bis auf ein Vielfaches der verwendeten Wellenlänge); ferner dass die Polarisation der Wellen je nach Anwendung einem der vier Schemata aus den Abbildungen 4 bis 8 entspricht. Die Strahlungsleistung/Intensität der einzelnen Wellen kann hierbei überall die gleiche sein, oder auch individuell eingestellt werden. Die Summe aller Wellen an einem interessierenden Punkt um O ist die Amplitude und dessen Quadrat, die Intensität um O. Bei der Berechnung der Polarisationsrichtung einer Welle, die nicht parallel zur optischen Achse strahlt, geht man einerseits so vor, dass man eine zur optischen Achse parallele ebene Welle mit einer geeigneten Drehmatrix zu einer Welle, die sich senkrecht zu dem betrachteten Einstrahlwinkel ausbreitet, dreht. Andererseits ist die Phasendifferenz an einem Punkt, der nicht die Fokusmitte ist, für dessen Intensitätswert man sich aber ebenso interessiert, relativ zu allen einstrahlenden Wellen zu berechnen und über diese aufeusummieren. Die in den Abb. 9, 12-17 sowie in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Beispiele für Intensitätsverteilungen wurden auf diese Weise gemäß dem Stand der Technik berechnet.

Probenmontaqe und Detektion des Fluoreszenzsianals

Es gibt verschiedene Optionen für die räumliche Anordnung des Probenhalters und der optischen Komponenten, die zum Nachweis der mittels der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung in der Probe angeregten und von dieser emittierten Fluoreszenz verwendet werden (für ein allgemeines schematisches Beispiel s. Abb. 19). Eine einfache, aber effektive Methode zur Detektion von Fluoreszenzlicht ist die Verwendung einer Objektivlinse mit großem Arbeitsabstand. Da das Fokusvolumen, in dem die Fluoreszenz erzeugt wird, durch die räumliche Verteilung der Beleuchtungsintensität definiert wird, ist bei einer Punkt-für-Punkt Abtastung des Objekts die entscheidende Größe für den Detektionslichtweg die Gesamtmenge des gesammelten Fluoreszenzsignals (s.o.). Beispielsweise kann die Verwendung eines zementierten Dubletts, einer achromatischen Kondensorlinse oder sogar eines asphärischen achromatischen Dubletts im Vergleich zu einem Objektivlinsensystem mit großem Arbeitsabstand eine höhere Detektionseffizienz ergeben, wobei sowohl die Blendenzahl als auch die Numerische Apertur groß sind, um große Arbeitsabstände bei gleichzeitig hoher Detektionseffizienz zu haben. Solche relativ einfachen Kondensorlinsen können gemäß dem Stand der Technik (z.B. Edmund Optics, Thorlabs, Ulooptics, Newport usw.) mit viel größeren Durchmessern im Vergleich zu High-End-Objektivlinsen hergestellt werden, was z.B. eine Signaldetektion mit einer numerischen Apertur von NA = 0,53 bei einem Arbeitsabstand von mehreren cm für asphärische Dubletts (Singuletts) ermöglicht. Dubletts haben natürlich eine viel bessere Kontrolle über die Fokusposition und -ausdehnung über den Wellenlängenbereich, der von den Fluorophoren emittiert wird. Die Trennung der Optik für die Fluoreszenzanregung mittels der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung mit hoher effektiver Numerischer Apertur (NA _array ) bei sehr großen Arbeitsabständen und großer Variabilität der Positionen der einzelnen Anregungslichtquellen, und der Optik für die Fluoreszenzdetektion erlaubt insgesamt eine sehr viel höhere Auflösung und eine direkte Integration in FIB-SEM Systeme und andere Bildgebungssysteme mit spezifischen Anforderungen an die Unterbringung der lichtoptischen Vorrichtungen. STED-/MINFLUX-Bildgebung mit der Ring-Array Anordnung

Als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Ring-Array-Mikroskopie Erfindung ermöglicht die Ring-Array Anordnung die Erzeugung eines STED- Depletionsstrahls mit anpassbarem Torus-Modus oder eines Torus-Musters, das im MINFLUX-Modus verwendet werden kann. Abb. , 12c-f, 13,17 sowie Tabelle 2 zeigen, dass derartige Torusförmige Intensitätsverteilungen mit geeigneten Ring- Array Anordnungen mit Parametern realisiert werden können, die einem Objektiv hoher Numerischer Apertur gemäß dem Stand der Technik (Hell et al. 1999; Hell 2009; Sahl & Hell 2019) entsprechen.

Justierung der Rina-Arrav Anordnung

Für die erfindungsgemäße Nutzung von Ring-Array Anordnungen müssen zunächst die Phasen so eingestellt werden, dass z.B. bei Fokussierung die Intensität an einem Punkt O, der die Fokusmitte sein wird, bei linearen Polarisationseinstellungen maximal wird. Will man dann eine Torusförmige Intensitätsverteilung zur Realisierung von STED/MINFLUX Mikroskopie erhalten, braucht man z.B. nur noch die Polarisationen der von den Quellen des Ring-Arrays emittierten Wellen azimutal einzusteilen (Abb. 4). Andere erfindungsgemäße Implementierungen durch geeignete Parameterwahl sind ebenfalls möglich. Um diesen Prozess zu erleichtern, besteht eine bevorzugte Ausführungsform darin, die Ausrichtung der Phasen paarweise mit sich gegenläufig ausbreitenden Wellen durchzuführen. Dies kann folgendermaßen realisiert werden:

Die von den N Lichtquellen S ₁ , S ₂ , ...S _N emittierten kohärenten Strahlen (z. B. N = 190) sind in N/2 Paare von Gegenausbreitungsstrahlen (z. B. N/2 = 190/2 = 95) unterteilt. Die relative Phase zwischen jeweils zwei unter einem bestimmten Winkel gegeneinander stehenden und somit interferierenden Wellen wird so modifiziert, dass die Intensität des von der Detektionsoptik erhaltenen detektierten Signals unter

Verwendung eines Kalibrierungsobjekts mit Subwellenlängengröße (z. B. eines fluoreszierenden „Nanobeads“ mit einem Durchmesser von 100 nm oder kleiner) an einer gegebenen Position in der Objektebene maximiert wird (Failla et al. 2002; Baddeley et al. 2007; Lemmer et al. 2008; Reymann et al. 2008). Die Phasenanpassungen werden nacheinander durchgeführt. Falls erforderlich, können zusätzlich adaptive Optikvorrichtungen gemäß dem Stand der Technik (z. B. www.thorlabs.com/Adaptive_Optics) verwendet werden.

Da der Vorgang automatisiert werden kann, kann die Kalibrierung in kurzer Zeit durchgeführt werden. Beispielsweise kann unter Verwendung von 100-nm-Kügelchen („Nanobeads“) mit einer guten Fluoreszenzemission eine ausreichende Photonenausbeute in 100 ms erhalten werden; Wenn jeweils 30 Messungen zur Optimierung der Phase eines bestimmten Paars gegenläufiger Wellen durchgeführt werden, werden insgesamt z.B. 30 x 95 x 0,1 s ~ 300s benötigt, unter der Annahme eines ausreichend stabilen mechanischen Tisches gemäß dem Stand der Technik (z. B. www.pi-usa.us).

In Objekten mit Brechungsindexvariationen können Verfahren der Adaptiven Optik gemäß dem Stand der Technik verwendet werden, um die Phasenoptimierung durchzuführen. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn Fokussierungen bei variabler Eisschichtdicke durchgeführt werden.

Bildgewinnung durch Objektabtastung mit der Ring-Array erzeugten Intensitätsverteilung

Die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung erlaubt es, an einer bestimmten Stelle (xyz) eine bestimmte lokale Intensitätsverteilung (Fokussierung, Torus) im Bereich der Objektebene zu erzeugen, dort die Fluoreszenz eines geeigneten Objekts anzuregen, und diese mit Hilfe geeigneter Detektoreinrichtungen zu messen (s.Abb. 19 für eine schematische Darstellung einer Detektoreinrichtung).

Um mithilfe solcher lokaler Intensitätsverteilungen ein Bild des Objekts zu erzeugen, wird dieses mit Methoden der Laser-Rastermikroskopie gemäß dem Stand der Technik (Cremer & Cremer 1978; Sheppard & Wilson, 1978; Brakenhoff et al., 1979, 1985; Masters, 1996) Punkt-für-Punkt abgetastet und das zugehörige Fluoreszenzsignal Punkt-für-Punkt gemessen. Die Rasterung kann gemäß dem Stand der Technik entweder durch die Verschiebung der Objektkoordinaten („Stage Scanning“) oder durch Bewegung des Fokussierten Strahls („Beam Scanning“) erfolgen. Bei der Anwendung dieses Rasterverfahrens gemäß dem Stand der Technik in der FIB-SEM in Verbindung mit dem Ring-Array Verfahren sind jedoch einige spezifische Anforderungen zu beachten:

Zur Vorbereitung der Analyse von Kryoproben im FIB-SEM ist es vorteilhaft, zunächst mit relativ geringer Auflösung eine Probe von z.B. 2 mm Durchmesser abzurastern, um die interessanten Regionen einzugrenzen. In diesen würden dann 5 x 5 μm ² für die Hochauflösung genügen. Die dafür isolierte Zielregion (z.B. Lamelle) sollte z.B. ca. 500 nm dick und ca. 20 bis 50 μm breit werden, wobei eine lichtoptische Auflösung von 50 - 100 nm wünschenswert wäre.

Hieraus ergeben sich für die Rasterung verschiedene Anforderungen:

1. Grobrasterung eines Obiektoebietes von ca. 2 mm = 2.000 um Durchmesser: Wird hier eine Objektauflösung von z.B. 1 μm angestrebt (dies kann durch den Fokussierten Modus der erfindungsgemäßen Ring-Array Anordnung erreicht werden), so ist ein Objekt mit einer Fläche von (2.000 μm) ² in Schritten von 0.5 μm abzutasten, also insgesamt (4.000) ² Schritte von jeweils 0,5 μm Schrittweite. Bei Verwendung von empfindlicheren Detektoren mit einer Verweildauer pro Schritt von 0,1 ms gemäß dem Stand der Technik würde die Rasterzeit (4.000 x 0,0001) x 4.000 s = 1.600 s (ca. 1/2 Stunde) betragen; die Geschwindigkeit des Objekttisches (Rasterung einer Linie von 2 mm Länge) bei „Stage Scanning“ wäre V _stage = 2 mm/40s = 0.05 mm/s, also gemäß dem Stand der Technik problemlos realisierbar. Diese Beispielabschätzungen zeigen, dass auch derartig große Objektgebiete mit einem praktikablen Zeitaufwand gerastert werden können.

Eine weitere Methode, die für die Grobrasterung benötigte Zeit zu verkürzen, besteht in der durch numerische Rechnungen belegten Möglichkeit, durch eine geeignete Verminderung der für die Fokussierung bzw. die Realisierung Torusförmiger Intensitätsverteilungen verwendeten Quellen S des Ring-Arrays periodische Muster zu erzeugen, die im Abstand einiger Wellenlängen eine stark erhöhte Intensitätsverteilung mit einem Durchmesser im Bereich von einigen hundert nm aufweisen können (Abb. 14 - 17). Unter

Verwendung von multiplen Detektoranordnungen gemäß dem Stand der Technik (Birk et al., 2017) kann damit die für die Rasterung einer Objektfläche von z.B. (2 mm) ² benötigte Zeit weiter wesentlich verkürzt werden. 2. Feinrasteruna eines großen Obiektaebietes

Sofern nach der Eingrenzung des Objektgebietes (z.B. 2 x 2 mm ² ) durch die in 1. beschriebene Grobrasterung auf ein Objektgebiet von (20 - 50) μm nunmehr eine Feinrasterung bei einer Auflösung (MINFLUX/STED) von z.B. 20 nm durchgeführt werden soll, so wird eine Schrittweite von 10 nm benötigt; bei einem Objekt von z.B. 50 μm Durchmeser ergeben sich dann (50.000 nm/10 nm) = (5.000) ² Rasterpunkte. Geht man wiederum von einer Verweildauer von 100 ps pro Rasterpunkt aus, so wird für die Abrasterung der gesamten interessierenden Fläche von (50 μm) eine Zeit von (5.000 x 0.0001s) x 5.000 = 2.500 s benötigt; bei 20 μm Durchmesser wären es noch (2.000 x 0.0001s) x 2.000 = 400 s (ca. 7 min). Die Geschwindigkeit des Objekttisches wäre bei dieser Feinrasterung 50 μm/(5.000 x 0.0001s) = 50 μm/(0.5)s = 100 μm/s, also gemäß dem Stand der Technik problemlos realisierbar. Eine Schrittweite von 10 nm ist mit Piezo-Tischen gemäß dem Stand der Technik (z.B. Hii et al., 2010) ohne Schwierigkeiten erreichbar.

Vergleichbare Abschätzungen der Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Ring- Array Anordnung auf die hochauflösende Rastermikroskopie mit großem Arbeitsabstand haben auch für die Serial Block-Face SEM (Raumtemperatur im Epoxy oder Metacrylatharz) Geltung, und sind auch auf andere Mikroskopieverfahren mit großem Arbeitsabstand anwendbar. Hierzu gehören beispielsweise Anwendungen in der biomedizinischen Technik, etwa bei der hochauflösenden lichtoptischen Analyse von dreidimensionalen Zellverbänden (Organoiden); im Unterschied zum Stand der Technik (Birk et al., 2017) würde die erfindungsgemäße Ring-Array Anordnung bei sonst fast gleicher Auflösung die Möglichkeit eröffnen, den freigehaltenen Raum Ω _center (z.B. 0° ≤ α ≤ 45°) gemäß Abb. 1 ,2 zu Geräten für die Manipulation zu nutzen. Ähnliche Anwendungen könnten sich auch in der Materialanalyse/bearbeitung ergeben.

Literaturhinweise zum Stand der Technik*

*Für Vollzitate siehe Priority DPA Anmeldung 102021 000060.9, 7. Januar 2021)

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Als wesentliches Ergebnis der in den Abbildungen und Tabellen dokumentierten

Beispielrechungen zu den von der erfindungsgemäßen Beleuchtungs-Ring-Array

Anordnung (Abb. 1-3) erzeugten Intensitätsverteilungen ergibt sich, dass mit diesem Verfahren sogar bei sehr großen Arbeitsabständen (z.B. WD = 5 cm) Intensitätsverteilungen realisiert werden können, die hochauflösende und sogar superauflösende Rastermikroskopieverfahren ermöglichen, die nahezu den Ergebnissen bei Verwendung von Objektiven hoher Numerischer Apertur (z.B. NA = 0.9) entsprechen.