Domaine de l’invention

La présente invention concerne un procédé de sélection de lymphocytes, notamment de lymphocytes B ou T, ainsi qu’un procédé de préparation d’anticorps à partir des lymphocytes B sélectionnés.

Arrière-plan technique

L'intérêt pour les anticorps monoclonaux thérapeutiques ne cesse de croître, année après année. En effet, leur affinité hautement spécifique des antigènes permet de fournir des traitements médicaux très efficaces. Ainsi, de 2005 à 2017 le nombre d’anticorps monoclonaux approuvés par l’agence américaine du médicament est passé de 2 à 64.

Toutefois, il reste un obstacle critique à surmonter pour préparer des anticorps monoclonaux efficaces.

En effet, la sélection des Lymphocytes B à partir desquels sont dérivés les anticorps monoclonaux se fait souvent vis-à-vis de la structure primaire des antigènes protéiques cibles, c’est à dire des épitopes linéaires auxquels se fixent les anticorps, et ce alors que ce sont des épitopes issus de la structure tridimensionnelle, tertiaire ou quaternaire, des protéines qui permettent le plus souvent d’obtenir la meilleure affinité pour les anticorps et ainsi d’assurer au mieux leurs fonctions biologiques.

Ainsi, permettre l’obtention d’anticorps monoclonaux spécifiques d’épitopes conformationnels, reconnaissant donc la structure tridimensionnelle des antigènes cibles, devrait améliorer l’avidité de ces anticorps, et donc leur utilisation comme outils à usage expérimental, comme marqueurs à usage diagnostic, ou comme traitements immunothérapeutiques.

Dans ce cadre, Tsumoto et al. (2019) Immunotherapy 11 :1 1 -127 proposent de préparer des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels d’un antigène en immunisant des souris à l’aide de molécules d’ADN codant l’antigène, d’isoler les lymphocytes B puis de les fusionner avec des cellules de myélome exprimant cet antigène pour obtenir des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la structure tridimensionnelle de l’antigène. Toutefois, si ce procédé permet bien d’obtenir des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels, il est relativement complexe à mettre en œuvre.

Il reste donc à fournir un procédé simple à mettre œuvre permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels.

Résumé de l’invention

La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, qu’il était possible de sélectionner des lymphocytes B spécifiques d’un épitope conformationnel d’un antigène en utilisant deux peptides distincts issus de l’antigène et tridimensionnellement proches dans la structure de l’antigène.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de sélection de lymphocytes, notamment B ou T, reconnaissant un antigène protéique, notamment un épitope conformationnel d’un antigène protéique, à partir d’une population de cellules, comprenant une étape d’identification d’au moins un lymphocyte, notamment B ou T, se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique, notamment au moins trois peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirigé contre un antigène protéique, dans lequel l’anticorps, ou le fragment d’anticorps, est préparé à partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en œuvre du procédé de sélection de lymphocytes B tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d’au moins un TCR, ou fragment de TCR, dirigé contre un antigène protéique, dans lequel le TCR, ou le fragment de TCR, est préparé à partir d’au moins un lymphocyte T obtenu par la mise en œuvre du procédé de sélection de lymphocytes T tel que défini ci- dessus.

La présente invention concerne également les anticorps, ou fragments d’anticorps, et les TCR, ou fragments de TCR, susceptibles d’être obtenus par la mise en œuvre des procédés de préparation selon l’invention.

La présente invention concerne également les anticorps, ou fragments d’anticorps, et les TCR, ou fragments de TCR, susceptibles d’être obtenus par la mise en œuvre des procédés de préparation selon l’invention pour leur utilisation à titre de médicament ou d’agent diagnostic.

La présente invention concerne également l’utilisation in vitro des anticorps, ou fragments d’anticorps, et des TCR, ou fragments de TCR, susceptibles d’être obtenus par la mise en œuvre des procédés de préparation selon l’invention à des fins expérimentales ou de diagnostic. détaillée de l’invention

Comme on l’entend ici, le terme « comprenant » est synonyme « d’incluant », « contenant » ou « englobant » c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » une ou plusieurs caractéristiques, d’autres caractéristiques que celles mentionnées peuvent également être comprises dans l’objet. A l’inverse, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » une ou plusieurs caractéristiques, l’objet ne peut pas comprendre d’autres caractéristiques que celles mentionnées.

Lymphocytes

Les lymphocytes selon l’invention sont de préférence des lymphocytes B et/ou des lymphocytes T. Par « lymphocyte B » on entend toute cellule de la lignée B, comme par exemple, un lymphocyte B naïf, un lymphocyte B activé, un lymphocyte B mémoire, un plasmoblaste ou un plasmocyte, notamment à longue durée. Par lymphocyte T, on entend toute cellule de la lignée T.

Comme cela apparaitra clairement à la personne du métier, les lymphocytes B reconnaissent l’antigène protéique par l’intermédiaire des anticorps qu’ils portent et les lymphocytes T reconnaissent l’antigène protéique par l’intermédiaire du récepteur des lymphocytes T (« T cell receptor », TCR) .

Cellules

La population de cellules est de tout type susceptible de comprendre des lymphocytes, notamment des lymphocytes B ou T.

La population de cellules peut provenir d’un seul individu ou de plusieurs individus. De préférence, la population de cellules est obtenue à partir d’un échantillon ou d’un prélèvement biologique d’un ou plusieurs individus, tel qu’un échantillon ou un prélèvement de sang total ou de moelle osseuse. L’individu est de préférence un humain ou un animal, notamment un mammifère. L’individu est de préférence immunisé contre l’antigène protéique qui peut être de la même espèce ou d’une espèce différente de celle de l’individu, notamment un agent infectieux. L’immunisation peut être naturelle, par exemple lorsque l’antigène protéique est issu d’un agent infectieux qui aura précédemment infecté l’individu, ou être provoquée par administration à l’individu de l’antigène protéique ou d’une partie de celui-ci, ou d’un acide nucléique, ADN ou ARN, codant l’antigène protéique ou une partie de celui-ci, c’est-à-dire par immunisation active ou vaccination.

De préférence, la population de cellules est une population de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC).

De préférence, le procédé d’identification de lymphocytes, notamment B ou T, tel que défini ci-dessus, comprend une étape antérieure de sélection des lymphocytes, notamment B ou T, parmi la population de cellules. Comme on l’entend ici, l’étape antérieure de sélection de lymphocytes, notamment B ou T, peut aboutir une sous-population comprenant uniquement des lymphocytes, notamment B ou T, ou enrichie en lymphocytes, notamment B ou T. Cette sélection peut notamment se faire à l’aide de ligands, notamment d’anticorps, ciblant des marqueurs membranaires spécifiques de lymphocytes, notamment B ou T, les anticorps pouvant être couplés à des billes magnétiques ou à des luminophores, notamment des fluorophores, pour faciliter la détection, la sélection, l’isolement ou la purification des complexes lymphocyte-anticorps.

Peptides

Comme on l’entend ici, des séquences issues de l’antigène protéique sont des portions de séquences de résidus d’acides aminés contigus de la séquence de résidus d’acide aminés totale de l’antigène protéique.

De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement de 6 à 30 résidus d’acides aminés, 6 à 25 résidus d’acides aminés, 6 à 20 résidus d’acides aminés, 6 à 15 résidus d’acides aminés, 10 à 30 résidus d’acides aminés, 10 à 20 résidus d’acides aminés, 12 à 20 résidus d’acides aminés, 10 à 18 résidus d’acides aminés, ou 10 à 15 résidus d’acides aminés.

De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au moins 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 ou 12 résidus d’acides aminés. De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au plus 30, 25, 20 ou 15 résidus d’acides aminés.

De préférence, les au moins deux peptides comprennent des séquences non chevauchantes issues de l’antigène protéique. Comme on l’entend ici, des séquences non chevauchantes sont telles qu’elles ne se recouvrent pas au sein de la structure primaire de l’antigène, il s’agit de peptides disjoints.

De préférence, les au moins deux peptides sont à une distance entre eux de 3.10 ^-9 m, 2,5.10 ^-9 , 2.10 ^-9 m, 10 ^-9 m ou moins dans la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique.

La structure tridimensionnelle de l’antigène protéique peut être obtenue par cristallographie aux rayons, par résonnance magnétique nucléaire (RMN), microscopie ou encore par prédiction informatique de structure tridimensionnelle.

La distance entre les au moins deux peptides distincts peut être calculées de nombreuses manières bien connues de la personne du métier. Il peut s’agir de la moyenne des distances entre chaque résidu d’acide aminé d’un des peptides vis-à- vis de chaque résidu d’acide aminé de l’autre ou des autres peptides. De préférence, il s’agit de la distance minimale parmi les distances respectives entre chaque résidu d’acide aminé d’un des peptides vis-à-vis de chaque résidu d’acide aminé de l’autre ou des autres peptides.

Comme on l’entend ici, la distance entre deux résidus acides aminés est la distance entre les centres respectifs de carbones en alpha de chaque résidu.

Antigène protéique

L’antigène protéique selon l’invention peut être une protéine ou un complexe protéique de tout type. Il peut notamment s’agir d’une protéine monomérique ou multimérique, notamment homomultimérique ou hétéromultimérique. Dans un mode de réalisation de l’invention, notamment dans le cadre d’un procédé de sélection de lymphocytes T tel que défini ci-dessus, l’antigène protéique est un complexe entre un peptide, un polypeptide ou une protéine antigénique et une protéine de présentation d’antigène, notamment une molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

De préférence, l’antigène protéique comprend au plus 5000, 2500, 1000 ou 500 résidus d’acides aminés. De préférence, l’antigène protéique comprend au moins 25, 50, 75, 100 ou 200 résidus d’acide aminés.

De préférence, l’antigène protéique comprend de 25 à 5000, plus préférablement de 50 à 2500, encore plus préférablement de 75 à 2000 résidus d’acides aminés.

L’antigène protéique peut être constitué uniquement de résidus d’acides aminés ou comprendre des composants aprotéiques en plus des résidus d’acides aminés. La protéine peut être substituée par au moins polysaccharide et/ou au moins lipide. Par ailleurs, la protéine peut comprend un ou plusieurs groupements prosthétiques, tels qu’un groupement héminique, un cofacteur, un acide nucléique ou un cluster fer-souffre.

L’antigène protéique peut être issu de tout type d’organisme. De préférence, l’antigène protéique est issu d’un agent infectieux ou d’une protéine humaine ou animale.

L’antigène protéique peut notamment être obtenu par purification à partir de l’organisme le produisant naturellement ou par voie recombinante, à partirde cultures cellulaires de tout type (eucaryotes ou procaryotes).

Identification

Comme cela sera clair pour la personne du métier, l’étape d’identification d’au moins un lymphocyte, notamment B ou T, se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique comprend la mise en contact des peptides avec la population de cellules pour identifier au sein de la population de cellules au moins un lymphocyte qui se lie au au moins deux peptides distincts.

De préférence, le procédé de sélection tel que défini ci-dessus comprend une étape supplémentaire d’isolement d’au moins un lymphocyte, notamment B ou T, se liant aux au moins deux peptides distincts de l’antigène protéique.

L’identification, et éventuellement l’isolement, de lymphocytes, notamment B ou T, se liant aux au moins deux peptides distincts peut être réalisée par de nombreuses techniques bien connues de la personne du métier. A titre d’exemple on peut citer le passage successif de cellules sur des colonnes chromatographiques sur lesquelles sont fixées les peptides (un premier peptide puis sélection, un deuxième peptide puis sélection), ou des liaisons-sélections successives avec des billes magnétiques portant les peptides (un premier peptide puis sélection, un deuxième peptide puis sélection), ou des accrochages-sélections successifs à des plaques présentant les peptides, ou encore en tri cellulaire associé à la cytométrie en flux où les cellules sont identifiées d’une part puis triées. Dans le cas des lymphocytes B, il est également possible de cloner les cellules par dilution limite et de tester les anticorps du surnageant qui reconnaissent à la fois les au moins deux peptides. Une fois les lymphocytes sélectionnés et clonés pour la reconnaissance d’au moins deux peptides distincts, on peut séquencer leurs séquences variables directement ou après amplification du clone sélectionné.

De préférence, l’étape d’identification, et éventuellement d’isolement, est mise en œuvre par cytométrie en flux, avec éventuellement triage de cellules.

Lorsque l’étape d’identification, et éventuellement d’isolement, est mise en œuvre par cytométrie en flux, les aux moins deux peptides distincts sont de préférence marqués par des luminophores, notamment des fluorophores, distincts. Ceci permet de s’assurer que les peptides distincts sont bien reconnus par le même lymphocyte, notamment B ou T.

Par ailleurs, lorsque l’étape d’identification, et éventuellement d’isolement, est mise en œuvre par cytométrie en flux, l’identification de la liaison des peptides au lymphocyte peut être mise en œuvre en mettant en contact la population de cellules avec les peptides distincts ajoutés tous en même temps, c’est-à-dire lors d’un même tri, ou de manière séquentielle, peptide par peptide, c’est-à-dire en plusieurs tris successifs, par exemple en isolant des lymphocytes grâce à un premier peptide, puis en utilisant un deuxième peptide sur les lymphocytes triés avec le premier peptide, puis éventuellement en utilisant un ou plusieurs peptide supplémentaire sur les lymphocytes triés grâce aux deux premiers peptides etc... La mise en contact de la population de cellules avec les peptides ajoutés en même temps nécessitera en général que chaque peptide soit marqué par un marqueur différent. A contrario, la mise en contact de la population de cellules et des peptides ajoutés de manière séquentielle ne nécessite pas le marquage de chaque peptide par un marqueur différent, voire permet de n’utiliser qu’un seul type de marquage des peptides.

De préférence, le procédé de sélection de lymphocytes, notamment B, reconnaissant un épitope conformationnel d’un antigène protéique, à partir d’une population de cellules selon l’invention, comprend :

- une étape de sélection de lymphocytes parmi la population de cellules ; - une étape d’identification d’au moins un lymphocyte, notamment B, se liant à au moins deux peptides distincts, notamment de 6 à 30 résidus d’acides aminés, comprenant des séquences, notamment non chevauchantes, issues de l’antigène protéique, les au moins deux peptides distincts étant en particulier à une distance entre eux de 3.10 ⁹ m ou moins dans la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique ;

- une étape d’isolement d’au moins un lymphocyte identifié à l’étape précédente.

Anticorps - TCR

Comme on l’entend ici, le terme « anticorps » englobe les anticorps en entier ainsi que les fragments d’anticorps comprenant au moins une partie de liaison à l’antigène, tels que les fragments VL et/ou VH, Fab, F(ab')2, et scFv. L’anticorps selon l’invention peut être issu d’une seule espèce, être chimérique, humanisé ou encore humain. L’anticorps selon l’invention peut être monospécifique ou bispécifique. Par ailleurs, l’anticorps selon l’invention peut être monomérique ou multimérique, notamment dimérique ou pentamérique. L’anticorps selon l’invention peut être d’isotype A, D, E, G ou M, de préférence G.

L’anticorps, ou le TCR, dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps, ou un TCR, reconnaissant un épitope conformationnel de l’antigène protéique.

L’anticorps, ou le TCR, dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps, ou un TCR, spécifique d’une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique.

L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps monoclonal.

L’anticorps dirigé contre un antigène protéique peut être préparé à partir d’un lymphocyte B purifié, par de nombreuses techniques bien connues de la personne du métier.

A titre d’exemple, le lymphocyte B, éventuellement après multiplication clonale, peut être fusionné avec une cellule de myélome pour donner un hybridome producteur d’anticorps monoclonal. A titre d’exemple également, les portions du génome du lymphocyte B codant pour tout ou partie de l’anticorps, notamment ses parties variables, peuvent être clonées, puis être exprimées, par voie recombinante, par des cellules de culture, éventuellement après insertion dans une structure d’anticorps chimérique, humanisés ou humain.

Le TCR dirigé contre un antigène protéique peut être préparé à partir d’un lymphocyte T par de nombreuses techniques bien connues de la personne du métier.

A titre d’exemple, les portions du génome du lymphocyte T codant pour tout ou partie du TCR, notamment ses parties variables, peuvent être clonées, puis être exprimées, par voie recombinante, par d’autres cellules. Les TCR peuvent notamment être produits sous forme de protéines chimériques fusionnées pour les stabiliser et faciliter leur utilisation, par exemple avec des parties constantes d’immunoglobulines.

L’invention est davantage explicitée à l’aide des Exemples et des figures, non limitatifs, qui suivent.

Description des fiqures

Figure 1

La figure 1 montre quatre graphes (panneaux) de cytométrie en flux représentant des évènements triés :

- en fonction de la lumière diffractée mesurée en face du rayon laser du cytomètre (paramètre FSC-A::FSC-A) et mesurée sur le côté (paramètre SSC-A::SSC-A) (panneau en bas à gauche),

- en fonction de la lumière diffractée mesurée en face du rayon laser du cytomètre (paramètres FSC-H::FSC-H/FSC-A::FSC-A) (panneau en haut à gauche),

- en fonction de la lumière émise par les fluorophores allophycocyanin (APC) et BV71 1™ (paramètres comp-VL4-A::CD27-BV71 l-A/comp-RLl-A::CD19-APC-A) (panneau en haut à droite),

- en fonction de la lumière émise par les fluorophores BV510™ et PE (paramètres comp-VL2-A::S059-BV510-A/comp-BL2-A::S051-PE-A) (panneau en bas à droite).

Figure 2

La figure 2 montre quatre graphes (panneaux) de cytométrie en flux représentant des évènements triés : - en fonction de la lumière diffractée mesurée en face du rayon laser du cytomètre (paramètre FSC-H) et mesurée sur le côté (paramètre SSC-H) (panneau en haut à gauche),

- en fonction de la lumière diffractée mesurée en face du rayon laser du cytomètre (paramètres FSC-A et FSC-H) (panneau en bas à gauche),

- en fonction de la lumière émise par les fluorophores allophycocyanin (APC) et BV71 1™ (paramètres Comp-BV71 1-A::CD27- / Comp- APC-A::CD19) (panneau en haut à droite),

- en fonction de la lumière émise par les fluorophores BV510™ et PE (paramètres Comp- BV510-A::S059- / Comp- PE-A::S051-) (panneau en bas à droite).

EXEMPLES

Exemple 1

Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) d’un individu immunisé contre la Covid-19 ont été purifiées par Ficoll.

Les cellules ont ensuite été marquées en utilisant les anticorps suivants : anti- CD19-APC, anti-CD27-BV71 1 qui permettent de marquer les lymphocytes B mémoire.

Puis, les cellules ont été marquées avec les deux peptides S051 et S059 biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseurThermo Scientific™ (EZ-Link™ Sulfo-NHS- LC-Biotinilation kit) et couplés à des conjugués fluorescent Streptavidine-BV510™ et Streptavidine-phycoérythrine (PE). Le peptide S051 est constitué des résidus 201 à 215 de la protéine Spike de SARS-CoV-2 et le peptide S059 est constitué des résidus 233 à 247 de la protéine Spike de SARS-CoV-2. Les peptides S051 et S059 sont disjoints (non- chevauchants) dans la séquence de la protéine Spike, mais voisins sur le plan tridimensionnel dans la mesure où ils sont localisés à moins de 25 Angstroms l’un de l’autre dans la structure tridimensionnelle de la protéine de Spike.

Les inventeurs ont analysé 231 000 évènements en cytométrie en flux, desquels ils ont éliminé visuellement les débris acellulaire (panneau en bas à gauche de la Figure 1 ), puis éliminé les doublets (panneau en haut à gauche de la Figure 1 ). Ils ont ensuite sélectionné les évènements CD19 ⁺ CD27 ⁺ (panneau en haut à droite de la Figure 1 ) correspondant aux lymphocytes B mémoires. Parmi ces cellules, 4 possèdent à leur surface des anticorps ayant une affinité en même temps pour S051 et S059 (panneau en bas à droite de la Figure 1 ).

Les statistiques de la population CD19+/CD27+ sont résumées dans le Tableau

1 ci-dessous :

Tableau 1

Les inventeurs ont ainsi pu identifier et isoler quatre lymphocytes B distincts reconnaissant à la fois les peptides S051 et S059 distincts et non chevauchants. Ceci indique que les lymphocytes B identifiés portent des anticorps reconnaissant à la fois le peptide S051 et le peptide S059 qui sont disjoints dans la structure primaire de Spike, ces anticorps reconnaissent donc un épitope conformationnel de la protéine Spike de SARS-CoV-2.

Exemple 2

1 . Tri des lymphocytes B mémoires spécifiques et mise en culture des clones.

Deux tubes 8mL BD Vacutainer® CPT™ citratés ont été collectés chez un individu sain ayant suivi un schéma vaccinal complet et ayant subi 2 infections SARS- CoV-2. Ces tubes permettent de séparer très simplement les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Les PBMC ainsi purifiés ont ensuite été marqués par 2 peptides couplés à un fluorophore, S051 et S059, peptides identifiés dans l’Exemple 1 comme faisant partie d’un épitope conformationnel de la protéine Spike. Ces deux peptides S051 et S059 ont été couplés respectivement à la phycoérythrine (PE) et au fluorochrome brilliant violet 510 (BV510™) comme indiqué dans l’Exemple 1.

Le marquage des lymphocytes B mémoires a été réalisé par des anticorps marqués (anti-CD19-APC, anti-CD27-BV71 1™).

Le tri a ensuite été réalisé sur une plateforme de cytométrie en flux (Cytek Aurora cell sorter) comme illustré en Figure 2, et au bout du compte, quarante-huit cellules uniques marquées par tous les fluorophores (PE+, BV510+, APC+, BV71 1 +) ont été triées sur tapis cellulaire de cellules Feeder MS5-CD40L préalablement étalées sur des plaques de 96 puits à fond plat.

Les milieux ont été changés 2 fois par semaine pendant 4 semaines. (RPMI-1640 additionné de 10 % de FCS, 55 uM de 2-ME, 1 % de Pen Strep (100 unités/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine), lO mM d'HEPES, 1 mM de sodium pyruvate et 1 % de MEM NEAA avec de l’IL-2 humaine recombinante (Peprotech 200-02, 500 g ; concentration finale pour la culture de 50 ng/ml), de l’IL-4 humaine recombinante (Peprotech 200-04,100 g ; concentration finale de 10 ng/ml), de l’IL-21 humaine recombinante (Peprotech 200-21 , 100 pg ; concentration finale de 10 ng/ml), et du BAFF humain recombinant (Peprotech 310-13 , 100 pg ; concentration finale de 10 ng/ml).

Les surnageants ont été collectés et congelés à -20°C avant d’être testés pour la présence d’anticorps.

B. Test des surnageants pour présence d’IgG spécifiaues.

Les surnageants ainsi préparés ont été testés pour leur présence d’ IgG en ELISA. Les puits positifs ont ensuite été testés en Western blot pour la présence d’IgG spécifiques de la protéine Spike. La présence d’IgG est mise en évidence grâce à un anticorps anti-IgG-HRP et la densité optique mesurée par luminescence.

30 surnageants testés provenant des 48 clones triés initialement présentent des niveaux variables d’anticorps, dont 7 des niveaux élevés (allant de 4 à 15 unités de luminescence). 2 de ces 7 surnageants répondent positivement pour la présence d’IgG spécifiques de la protéine Spike recombinante déposée sur membrane de nitrocellulose.

Cela met en évidence que le tri des lymphocytes B mémoire par cytométrie en flux grâce aux 2 peptides marqués par fluorescence permet bien d’obtenir des anticorps monoclonaux reconnaissant un épitope conformationel au sein de la protéine Spike.

Par ailleurs, il est vérifié que ces surnageants reconnaissent également chacun des deux peptides isolés.