本明細書において使用される記号、略号の� ��味を以下に示す。
(1)Boc:tert-ブトキシカルボニル
(2)Z:ベンジルオキシカルボニル
(3)Fmoc:9-フルオレニルメトキシカルボニル
(4)Bsmoc:1,1-ジオキソベンゾ[b]チオフェン-2-イ� �メトキシカルボニル
(5)Alloc:アリルオキシカルボニル
(6)Ac:アセチル
(7)Me:メチル
(8)Et:エチル
(9)iPr:イソプロピル
(10)tBu:tert-ブチル
(11)Bzl:ベンジル
(12)Fm:9-フルオレニルメチル
(13)Trt:トリチル
(14)HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
(15)HOCt:6-クロロ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾ� ��ル
(16)HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾー� ��
(17)HOOBt:3-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1.2 .3-ベンゾトリアジン
(18)HOSu:N-ヒドロキシスクシンイミド
(19)HOPht:N-ヒドロキシフタルイミド
(20)HONb:N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカ� �ボキシイミド
(21)Bt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール-1-イル
(22)Ct:1-ヒドロキシ-6-クロロベンゾトリアゾー ル-1-イル
(23)At:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール -1-イル
(24)OBt:3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1.2.3-ベンゾトリ� �ジン-3-イル
(25)Su:スクシンイミドイル
(26)Pht:フタルイミドイル
(27)Nb:5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド� ��ル
(28)DCC:N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド
(29)EDC:N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチ� ��カルボジイミド
(30)EDC.HCl:N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エ チルカルボジイミド塩酸塩
(31)DIC:N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド
(32)BOP:(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)ト� �ス(ジメチルアミノ)ホスホニウム ヘキサフ� ��オロホスフェート
(33)PyBOP:(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)ト リピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロ� ��スフェート
(34)PyBroP:ブロモトリピロリジノホスホニウム� �ヘキサフルオロホスフェート
(35)HBTU:O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N ’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロ ホスフェート
(36)TBTU:O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N ’-テトラメチルウロニウム テトラフルオロ ボレート
(37)HCTU:O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル) -N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサ� ��ルオロホスフェート
(38)HATU:O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N, N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフ� ��オロホスフェート
(39)CDI:カルボニルジイミダゾール
(40)DMT-MM:4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-� �ル)-4-メチルモルホニウム クロリド
(41)AA _n :アミノ酸残基(下付のnは1以上の任意の整数� �あり、ペプチドC末端からの順番を示す。)
(42)PG ₀ :ペプチドのC末端カルボキシル基の保護基
(43)PG _n :アミノ基の保護基(下付のnは1以上の任意の� �数であり、AA _n のアミノ基の保護基であることを示す。)
(44)HOE:活性化剤
(45)E:活性エステル基
(46)Gly:グリシン
(47)Ala:アラニン
(48)Val:バリン
(49)Leu:ロイシン
(50)Ile:イソロイシン
(51)Met:メチオニン
(52)Phe:フェニルアラニン
(53)Tyr:チロシン
(54)Trp:トリプトファン
(55)His:ヒスチジン
(56)Lys:リジン
(57)Arg:アルギニン
(58)Ser:セリン
(59)Thr:トレオニン
(60)Asp:アスパラギン酸
(61)Glu:グルタミン酸
(62)Asn:アスパラギン
(63)Gln:グルタミン
(64)Cys:システイン
(65)Pro:プロリン
(66)Orn:オルニチン
(67)Sar:サルコシン
(68)β-Ala:β-アラニン
(69)GABA:γ-アミノ酪酸
(70)Dap:2,3-ジアミノプロピオン酸

 PG ₀ で示されるC末端カルボキシル基の保護基と� �ては、Me、Et、iPr、tBuなどのアルキル基、Bzl� ��Fm、Trt、ジフェニルメチル、1-1-ジメチルベ� ��ジル、ジメチルフェニル等が挙げられる。
 PG _n で示されるアミノ基の保護基としては、Boc、 Z、Fmoc、Bsmoc、Alloc、Ac等が挙げられる。
 Eで示される活性エステル基とは、アミノ基 による求核攻撃を受けて「EO ^- 」として容易に脱離し、アミド結合を生成さ せうる基を意味し、Bt、Ct,At、OBt、Su、Pht、Nb� ��ペンタフルオロフェニル等が挙げられる。

1.ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法
 本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方� ��は、Fmoc基で保護されたアミノ酸化合物をア ミンと反応させることにより脱保護して得ら れる反応混合物を、炭素数5以上の炭化水素� �媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性� �機溶媒(但し、アミド系有機溶媒を除く。)中 で攪拌、分層させ、ジベンゾフルベン及び/� �はジベンゾフルベンアミン付加体が溶解し� �炭化水素溶媒層を除去する工程を含むこと� �特徴とする。
 かかる操作により、意外なことに脱保護さ� ��たアミノ酸化合物が極性有機溶媒層に優先� ��に移行し、炭化水素溶媒層にはほとんど抽� ��されず、かつ、ジベンゾフルベン誘導体は� ��化水素溶媒層に効率的に抽出されるので、� ��出操作という大規模反応に適した簡便な操� ��のみでジベンゾフルベン誘導体を淘汰する� ��とができる。したがって、結晶化やクロマ� ��グラフィーなどの操作によることなく、所� ��のアミノ酸化合物を簡便に精製または単離� ��ることができる。

 なお、WO 03/018188(特許文献1)の実施例9に� �、ペプチドの液相合成に際し、シクロヘキ� �ンとN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)を分層さ� �て、シクロヘキサン層からアミノ酸エステ� �またはペプチドを回収する方法が記載され� �いるが、アミノ酸エステルまたはペプチド� �極性溶媒中から回収する本発明の方法とは� �成が異なる。またこの方法は、アミノ酸エ� �テルまたはペプチドを炭化水素溶媒である� �クロヘキサン層に移行させるため、脂溶性� �極めて高い可溶性担体である(3,4,5-トリオク� ��デシルオキシフェニル)メタン-1-オールをペ プチドのC末端にエステル結合させている。� �化水素溶媒層にジベンゾフルベン誘導体を� �汰し、アミノ酸エステル又はペプチドを極� �有機溶媒に移行させる本発明とは発想も全� �異なっている。

 「Fmoc基で保護されたアミノ酸化合物」の「 アミノ酸化合物」とは、分子内に、1級アミ� �基および/または2級アミノ基、並びにカルボ キシル基および/またはエステル化、チオエ� �テル化またはアミド化されたカルボキシル� �を有する化合物であって、本発明の炭化水� �溶媒-極性有機溶媒の分層において極性有機� ��媒層に効率的に移行するものであれば、特� ��限定されない。かかるアミノ酸化合物の好� ��な例としては、ペプチド、アミノ酸エステ� ��が挙げられる。
 ここで、ペプチド、アミノ酸エステルは、N 末端としての1級アミノ基または2級アミノ基� ��他に、アミン性の側鎖官能基(アミノ基、イ ンドール、グアニジン等)を有していてもよ� �、これらアミン性の側鎖官能基は保護基で� �護されていても良い。またペプチドのC末端� ��カルボキシル基も保護されていても、保護� ��れていなくてもよい。またペプチド、アミ� ��酸エステルがカルボキシル基及びアミノ基� ��外の側鎖官能基を有する場合、該側鎖官能� ��保護されていても、保護されていなくても� ��い。なお、カルボキシル基が保護されてい� ��場合、(3,4,5-トリオクタデシルオキシフェニ ル)メチルのようなペプチドの保護基として� �通常使用しない極めて脂溶性が高い基でカ� �ボキシル基等を保護すると、アミノ酸エス� �ル又はペプチドが炭化水素溶媒層にも移行� �やすくなるので適切ではない。好ましいカ� �ボキシル基の保護基としてはメチル、エチ� �、tert-ブチル等の炭素数1~6のアルキル、ベン ジル、p-ニトロベンジル、p-メトキシベンジ� �、ジフェニルメチル、アリルが挙げられる� �

 「Fmoc基で保護されたアミノ酸化合物」は、 アミノ酸化合物が有する第1級アミノ基およ� �/または第2級アミノ基並びにアミン性側鎖官 能基の少なくとも一つがFmoc基で保護されて� �ればよい。Fmoc基で保護されていない第1級ア ミノ基および/または第2級アミノ基並びにア� ��ン性側鎖官能基は、無保護であっても、Fmoc 基以外のアミノ基の保護基(アミン保護基)(例 えば、Boc、Z、Bsmoc、Alloc、Ac等)で保護されて� ��てもよい。
 「Fmoc基で保護されたアミノ酸化合物」は、 N末端アミノ基がFmoc基で保護されており、ア� ��ン性の側鎖官能基がある場合、該アミン性� ��側鎖官能基はFmoc基以外のアミン保護基で保 護されている態様が好ましい。

 「アミン」としては、Fmoc基を脱保護させる 程度の求核性を有するものであれば特に限定 されず、例えば、ジエチルアミン、ジメチル アミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリ ン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデセン-7-エ� ��(DBU)等が挙げられる。
 該アミンは、減圧濃縮で淘汰できる低沸点( 沸点:0~120℃程度)のものが好ましく、例えば� �ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリ� �ン、ピペリジン、モルホリンが好ましい。

 ジベンゾフルベンとは、Fmoc基が脱保護す る際に生成する副生成物である。ジベンゾフ ルベンアミン付加体とは、脱保護に用いたア ミンが第2級アミンの場合に、ジベンゾフル� �ンに付加した化合物を意味する。これらを� �とめて「ジベンゾフルベン誘導体」と総称� �るのは、前記で述べたとおりである。

 「ジベンゾフルベン誘導体の淘汰」とは� ��脱保護によって得られるアミノ酸化合物と� ��ベンゾフルベン誘導体を含む反応混合物か� ��、洗浄、結晶化その他精製操作によってジ� ��ンゾフルベン誘導体を除くことを意味する� ��

 「炭素数5以上の炭化水素溶媒」としては 、n-ペンタン、n-ヘキサン、n-ヘプタン、n-オ� ��タン、デカリン、ナフタレンまたはこれら� ��混合溶媒が挙げられ、n-ヘプタン、n-オクタ ンが好ましい。混合溶媒とする場合は、任意 の割合で混合することができる。炭素数が4� �下の炭化水素溶媒は極性溶媒と混和しやす� �。炭素数の上限は特に限定はないが、溶媒� �留去等の取り扱いやすさ、溶媒としての存� �性を考慮すると、炭素数20以下のものが好ま しい。

 「炭素数5以上の炭化水素溶媒に混和しない 極性有機溶媒」は、当該性質を有するものか ら制限なく選択することができるが、但し、 当該極性有機溶媒にアミド系有機溶媒(例え� �、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N-ジメチ� ��アセトアミド(DMA))などは含まれない。アミ� ��系有機溶媒を用いた場合でも、炭化水素溶� ��と分層させることができるが、ジベンゾフ� ��ベン誘導体が炭化水素溶媒層に効率的に分� ��されにくいので、アミド系有機溶媒層を炭� ��水素溶媒で数多く洗浄する必要があり効率� ��悪い(後掲比較例5、6参照)。また、アミド系 有機溶媒は比較的高沸点であるために高温で 留去しなければならず、効率が悪く、脱保護 されたアミノ酸化合物が分解する恐れもある 。さらには、水洗でアミド系有機溶媒を除く 場合でも、酢酸エチル、ジエチルエーテルな どを用いた抽出操作を行わなければならず、 煩雑である。
 かかる極性有機溶媒としては、アセトニト� ��ル、メタノール、アセトン等またはそれら� ��混合溶媒が挙げられ、アセトニトリルまた� ��メタノールが好ましい。混合溶媒とする場� ��は、任意の割合で混合することができる。

 本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方� ��は、具体的には、まず、
(1)Fmoc基で保護されたアミノ酸化合物とアミ� �を、有機溶媒中で混合し、アミノ酸化合物� �ジベンゾフルベン誘導体を含む反応混合物� �得、次いで
(2)該反応混合物を炭化水素溶媒および極性有 機溶媒中で攪拌後、静置して分層させ、炭化 水素溶媒を除去することにより行うことがで きる。

 アミンの使用量は、Fmoc基で保護されたア ミノ酸化合物に対して、通常2~100当量、好ま� ��くは5~20当量である。この範囲より少ないと 、未反応のFmoc基で保護されたアミノ酸化合� �が残りやすく、多いとアミンが淘汰困難に� �りやすい。

 脱保護反応の溶媒としては、脱保護反応� ��阻害しない溶媒であればいずれでもよく、� ��保護の対象となるFmoc基で保護されたアミノ 酸化合物にもよるが、例えば、DMF、N-メチル� ��ロリドン(NMP)、酢酸エチル、アセトニトリ� �、テトラヒドロフラン(THF)、クロロホルムな どまたはそれらの混合溶媒が挙げられる。混 合溶媒とする場合は、任意の割合で混合する ことができる。溶媒の使用量は、Fmoc基で保� �されたアミノ酸化合物に対して、通常3~100倍 重量であり、好ましくは5~20倍重量である。

 反応温度は、脱保護の対象となるFmoc基で 保護されたアミノ酸化合物にもよるが、通常 0~40℃、好ましくは5~30℃の範囲内である。反� ��時間は、上記温度範囲内で、通常1~20時間で ある。

 反応終了後、反応液を濃縮することにより� ��アミノ酸化合物とジベンゾフルベン誘導体� ��含む混合物を得ることができる。低沸点の� ��ミンを用いた場合には、当該濃縮操作によ� ��てアミンを淘汰することができる。
 このようにして得られた該混合物に極性有� ��溶媒と炭化水素溶媒を加え、攪拌後、静置� ��て、極性有機溶媒と炭化水素溶媒を分層さ� ��ることができる。
 あるいは、脱保護反応に本発明の極性有機� ��媒および/または炭化水素溶媒を使用した場 合は、濃縮することなく、必要に応じて極性 有機溶媒および/または炭化水素溶媒を追加� �て、攪拌後、静置して、極性有機溶媒と炭� �水素溶媒を分層させることができる。
 この際に、加熱により極性有機溶媒と炭化� ��素溶媒を均一系にした後に冷却して分層さ� ��てもよいが、操作が煩雑であり、攪拌、静� ��のみで本発明の効果を十分奏することがで� ��るので、加熱と冷却を伴う操作は不要であ� ��。

 極性有機溶媒は、炭化水素溶媒との分層性� ��向上させたり、ジベンゾフルベン誘導体除� ��率、目的物の極性有機溶媒層への抽出率を� ��上させるためにさらに水を添加しても良い� ��水の含有量は、極性有機溶媒に対して1~50%(v /v)が好ましい。水の含有量がこの範囲より多 い場合はFmoc基で保護されたアミノ酸化合物� �抽出効率が低下する場合がある。
 極性有機溶媒の使用量は、本発明の効果を� ��なわないかぎり特に限定はないが、Fmoc基で 保護されたアミノ酸化合物の濃度が極性有機 溶媒に対して0.5~30%(w/v)となる範囲から適宜選 択すればよい。

 炭化水素溶媒の使用量は、本発明の効果� ��損なわないかぎり特に限定はないが、ジベ� ��ゾフルベン誘導体の濃度が炭水化物溶媒に� ��して0.2~3%(w/v)となる範囲から適宜選択すれ� �よい。

 (極性有機溶媒)/(炭化水素溶媒)比(v/v)は、 本発明の効果を損なわないかぎり特に限定は ないが、好ましくは1/10~1/0.2であり、より好� �しくは1/3~1/0.5である。

 攪拌、静置後、炭化水素溶媒層を除去する� ��とにより、ジベンゾフルベン誘導体を淘汰� ��ることができる。極性有機溶媒層にさらに� ��化水素溶媒を加え、攪拌、静置後および炭� ��水素溶媒層除去の操作を複数回繰り返すこ� ��によって、極性有機溶媒層に残留したジベ� ��ゾフルベン誘導体をさらに淘汰することが� ��きる。
 極性有機溶媒層を濃縮することにより、ジ� ��ンゾフルベン誘導体が淘汰されたアミノ酸� ��合物を含有する粗製物を得ることができる� ��この段階でアミノ酸化合物が単離できる場� ��もあるが、ジベンゾフルベン誘導体以外の� ��純物(例えば、脱保護に使用したアミンなど )が含まれる場合には、自体公知の単離精製� �作(水洗、塩基性または酸性水溶液洗浄など) を組み合わせることにより、所望のアミノ酸 化合物を単離することができる。

2.ペプチド液相合成法
 アミノ酸化合物がペプチドまたはアミノ酸� ��ステルである場合、本発明のジベンゾフル� ��ン誘導体の淘汰方法は、ペプチドの液相合� ��法に好適に適用できる。以下、本発明のジ� ��ンゾフルベン誘導体の淘汰方法をペプチド� ��液相合成法に適用した一態様(以下、本明細 書において、「本発明のペプチド液相合成法 」という。)について説明するが、本発明が� �れに限定されないことはいうまでもない。

2-1.用語の説明
 本発明のペプチド液相合成法に使用される� ��語の意義について説明する。
 本発明のペプチド液相合成法において「Fmoc 基で保護されたペプチドまたはアミノ酸エス テル」の脱保護は、ペプチドの液相合成法に 含まれるFmoc基の脱保護であれば、特に限定� �れない。例えば、後掲のN末端脱保護工程で� ��ってもよいし、最終脱保護における側鎖ア� ��ノ基の脱保護であってもよい。好ましくは� ��後掲のペプチド伸長反応において、次工程� ��カップリングの対象となるアミノ基を生成� ��せる脱保護である。
 本発明のペプチド液相合成法においてアミ� ��酸を「H-AA-OH」と表示した場合は、左側がア ミノ基、右側がカルボキシル基であることを 意味し、アミノ基およびカルボキシル基がそ れぞれ保護されていないことを意味する。
 この場合において、例えば、カルボキシル� ��が保護されている場合は、「H-AA-OPG ₀ 」と表示され、アミノ基が保護されている場 合は、「PG _n -AA-OH」と表示される。
 アミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキ� ��ル基が活性エステル化されている場合は、� ��PG _n -AA-OE」と表示される。
 PG _n -AA-OHの対称酸無水物は、「(PG _n -AA) ₂ -O」と表示される。
 アミノ酸が側鎖官能基を有する場合に、該� ��能基が保護されている場合は、「H-AA(PG)-OH� �(PGは側鎖官能基の保護基を示す)と表示され� ��。

 本発明のペプチド液相合成法においてペプ� ��ドを「H-AA _n’ -AA _n’-1 -・・・-AA ₁ -OH」(下付けのn’は2以上の任意の整数を示す 。)と表示した場合は、左側がN末端、右側がC 末端であり、N末端およびC末端がそれぞれ保� ��されていないアミノ酸残基をn’個有するペ プチドであることを意味する。ここで、N末� �とはアミノ酸残基のα位アミノ基に限定され ず、ペプチド伸長が側鎖アミノ基(例えば、Ly sのεアミノ基)を介して行われる場合は、当� �側鎖アミノ基もN末端に含まれる。以下、同� ��。
 この場合において、例えば、C末端が保護さ れている場合は、「H-AA _n’ -AA _n’-1 -・・・-AA ₁ -OPG ₀ 」と表示し、さらにN末端が保護されている� �合は、「PG _n’ -AA _n’ -AA _n’-1 -・・・-AA ₁ -OPG ₀ 」と表示するものとする。

 本発明のペプチド液相合成法により合成さ� ��るペプチドの構成単位となるアミノ酸残基� ��しては、天然アミノ酸または非天然アミノ� ��が特に限定されることなく含まれ、また、� ��れらのL体あるいはラセミ体も包含される。
 天然アミノ酸としては、Gly、Ala、Val、Leu、I le、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Cys、M et、Phe、Tyr、Trp、His、Pro、Orn、Sar、β-Ala、GABA 等が挙げられる。
 非天然アミノ酸としては、Dap等が挙げられ� ��。
 また、当該アミノ酸が側鎖に官能基を有す� ��場合に、該官能基を保護基により保護した� ��ミノ酸とすることもできる。かかる側鎖保� ��アミノ酸としては、例えば、Gluのγ位又はAs pのβ位のカルボキシル基をベンジル基で保護 したγ-Bzl-Glu又はβ-Bzl-Asp;、Gluのγ位又はAspの� �位のカルボキシル基をtert-ブチル基で保護し たγ-tBu-Glu又はβ-tBu-Asp;Lysのεアミノ基を保護� ��たε-Z-Lys、ε-Boc-Lys、ε-iPr-ε-Boc-Lys;CysのSH基� �フェニルカルバモイル基で保護したS-フェニ ルカルバモイル-Cys;CysのSH基をトリチル基で� �護したS-Trt-Cys;Tyr及びSerの水酸基の酸素をBzl� ��保護した誘導体等が挙げられる。

 本発明のペプチド液相合成法において「N-� �護アミノ酸」とは、アミノ基が保護されて� �り、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を� �味し、上記表記法によれば、「PG _n -AA-OH」と表示される。
 本発明のペプチド液相合成法において「N-� �護アミノ酸活性エステル」とは、アミノ基� �保護され、カルボキシル基がEにより活性エ� ��テル化されたアミノ酸を意味し、上記表記� ��によれば、「PG _n -AA-OE」と表示される。
 なお、N-保護アミノ酸活性エステルとして� �離可能なものは、Eがペンタフルオロフェニ� ��、SuまたはNbであるものであり、その他のN-� ��護アミノ酸活性エステルは、N-保護アミノ� �を縮合剤(例えば、EDC)および活性化剤(例え� �、HOBt)と反応させることにより、反応系中で 生成される。

 本発明のペプチド液相合成法において「N-Fm ocアミノ酸」とは、アミノ基がFmocで保護され ており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸 残基を意味し、上記表記法によれば、「Fmoc-A A-OH」と表示される。
 本発明のペプチド液相合成法において「N-Fm ocアミノ酸活性エステル」とは、アミノ基がF mocで保護され、カルボキシル基がEにより活� �エステル化された任意のアミノ酸残基を意� �し、上記表記法によれば、「Fmoc-AA-OE」と表� ��される。
 N-Fmocアミノ酸活性エステルとして単離可能� ��ものは、Eがペンタフルオロフェニル、Suま� ��はNbであるものであり、その他のN-Fmocアミ� �酸活性エステルは、N-Fmocアミノ酸を縮合剤(� ��えば、EDC)および活性化剤(例えば、HOBt)と反 応させることにより、反応系中で生成される 。

 本発明のペプチド液相合成法において「C-� �護ペプチド」とは、C末端が保護されており� ��N末端が保護されていない任意の個数のアミ ノ酸残基を有するペプチドを意味し、上記表 記法によれば、「H-AA _n’ -AA _n’-1 -・・・-AA ₁ -OPG ₀ 」(n’は2以上の整数を示す)と表示される。
 本発明のペプチド液相合成法において「C-� �護アミノ酸」とは、カルボキシル基が保護� �れており、アミノ基が保護されていないア� �ノ酸を意味し、上記表記法によれば、「H-AA- OPG ₀ 」と表示される。
 本発明のペプチド液相合成法において「N,C- ジ保護ペプチド」とは、N末端とC末端の両方� ��保護されている任意の個数のアミノ酸残基� ��有するペプチド意味し、上記表記法によれ� ��、「PG _n’ -AA _n’ -AA _n’-1 -・・・-AA ₁ -OPG ₀ 」(n’は2以上の整数を示す)と表示される。� �た、例えば、N末端がFmocで保護されていて、 C末端が保護されているN,C-ジ保護ペプチドは� ��N-Fmoc-C-保護ペプチド」と表示するものとす� ��。
 本発明のペプチド液相合成法において「中� ��体ペプチド」とは、ペプチド液相合成にお� ��る各工程で得られる合成中間体であるペプ� ��ドであって、最終的に目的とするペプチド� ��りアミノ酸残基数が少ないものを意味する� ��好ましい中間体ペプチドは、後掲のN末端脱 保護後に得られるC-保護ペプチドである。

 本発明のペプチド液相合成法において「縮� ��剤」としては、DCC、EDC(塩酸塩およびフリー 体を含む。)、DIC、BOP、PyBOP、PyBroP、HBTU、HCTU� ��TBTU、HATU、CDI、DMT-MM等が挙げられる。
 本発明のペプチド液相合成法において「活� ��化剤」とは、縮合剤との共存化でカルボキ� ��ル基を活性エステル、対称酸無水物などに� ��いてアミド結合を形成させやすくする試薬� ��あり、「HOE」で示される。具体的には、HOBt 、HOCt、HOAt、HOOBt、HOSu、HOPht、HONB、ペンタフ� ��オロフェノール等が挙げられる。

 本発明のペプチド液相合成法において「� ��ンポット合成」とは、ペプチドの液相合成� ��において、各工程で得られる中間体ペプチ� ��を反応容器から取り出さずに目的とするペ� ��チドまで合成することを意味する。

2-2.ペプチド液相合成法
 本発明のペプチド液相合成法により最終的� ��合成されるペプチドは特に限定されるもの� ��ないが、合成医薬ペプチド、化粧品、電子� ��料(有機ELなど)、食品などの合成に好適に利 用可能である。
 該ペプチドの構成アミノ酸残基数は特に限� ��されないが、一般的な合成ペプチドにみら� ��る2~20残基程度が好適である。
 また、本発明のペプチド液相合成法は、ア� ��ノ酸側鎖官能基および/またはC末端保護基� �酸で脱保護される保護基で保護されたC-保護 ペプチド(例えば、ε-Boc-Lysなどを含むペプチ� ��)を使用したペプチド液相合成法などに適し ている。

 「ペプチドの液相合成法」とは、固相法� ��はないことを意味し、全ての試薬が溶媒に� ��解している場合の他、試薬の全部または一� ��が溶媒に溶解せず、懸濁などしているいわ� ��る不均一反応も本発明の方法に含まれる。

 ペプチドの液相合成法は、ペプチド合成化� ��で常用される一般的な方法を特に制限なく� ��用することができる。
 具体的には、下記スキームに示す方法、す� ��わち、
(1)C-保護ペプチド(P _n’ )(n’は、2以上の任意の整数を示し、アミノ� �残基がn’個のペプチドであることを意味す� ��。以下、同様。)または一回目のペプチド伸 長においてはC-保護アミノ酸(A ₁ )(以下、本明細書において「C-保護ペプチド(P _n )等」(nは、1以上の任意の整数を示し、nが1の 場合は、C-保護アミノ酸(A ₁ )を意味する。以下、同様。)と総称する。)を 、N-保護アミノ酸(PA _n+1 )と、縮合剤(および好ましくは活性化剤)の存 在下、縮合させるか、あるいは
(2)C-保護ペプチド(P _n )等を、N-保護アミノ酸活性エステル(PAE _n+1 )と縮合させて、
アミノ酸残基が一つ伸長したN,C-ジ保護ペプ� �ド(PP _n+1 )を得る工程(以下、本明細書においてそれぞ� ��「カップリング工程(1)」および「カップリ� ��グ工程(2)」という。)、
得られたN,C-ジ保護ペプチド(PP _n+1 )のアミノ保護基を脱保護してC-保護ペプチド (P _n+1 )を得る工程(以下、本明細書において「N末端 脱保護工程」という。)を1サイクルとする反� ��(以下、本明細書において「ペプチド伸長反 応」という。)の繰り返しからなる方法であ� �、
最終段階で、C-保護ペプチド(P _m )のカルボキシ保護基および側鎖官能基が保� �されている場合は当該保護基を脱保護する� �とにより(以下、本明細書において「最終脱� ��護工程」という。)、目的のペプチド(P)が得 られる。
 本発明のペプチド合成法において、n番目の ペプチド伸長反応を「ペプチド伸長反応(n)」 、ペプチド伸長反応(n)を構成する各工程をそ れぞれ「カップリング工程(1-n)」、「カップ� ��ング工程(2-n)」および「N末端脱保護工程(n)� ��と表示するものとする。

(式中、mは目的とするペプチドのアミノ酸残� ��数を示し、他の記号は上記で定義した通り� ��ある。)
 本発明は、一連のペプチド伸長反応の少な� ��とも一回で、N-Fmocアミノ酸を使用してカッ� ��リング工程(1)を行うか、またはN-Fmocアミノ� ��活性エステルを使用してカップリング工程( 2)を行いN-Fmoc-C-保護ペプチドを得、
続くN末端脱保護工程でN-Fmoc-C-保護ペプチド� �アミンと反応させることにより脱保護して� �C-保護ペプチド(P _n+1 )とジベンゾフルベン誘導体を含む混合物を� �、その後のワークアップにおいて、該混合� �を極性有機溶媒と炭化水素溶媒中で分層さ� �て、ジベンゾフルベン誘導体が溶解した炭� �水素溶媒層を除去することを特徴とする(以� ��、「本発明のペプチド伸長反応」といい、n 回目のペプチド伸長反応を「本発明のペプチ ド伸長反応(n)」と表示する。)。
 本発明のペプチド液相合成法において、少� ��くとも1回、本発明のペプチド伸長反応が含 まれていればよいが、全ての工程を本発明の ペプチド伸長反応で行うことが好ましく、そ れにより目的のペプチドまでワンポットで合 成することができる。
 以下に、本発明のペプチド伸長反応(n)のス� ��ームを示す。

(式中、DBFはジベンゾフルベンを、DBFAはジベ� ��ゾフルベンアミン付加体を示し、NR ₂ は、脱保護に使用したアミン(第2級アミンの� ��合)に相当し、その他の記号は前記と同義で ある。)

 C-保護ペプチド(P _n+1 )とジベンゾフルベン誘導体を含む混合物を� �性有機溶媒と炭化水素溶媒中で分層させる� �とにより、意外なことにC-保護ペプチド(P _n+1 )は極性有機溶媒層に優先的に移行し、炭化� �素溶媒層にはほとんど抽出されず、かつ、� �ベンゾフルベン誘導体は炭化水素溶媒層に� �率的に抽出されるので、抽出操作という大� �模反応に適した簡便な操作のみでジベンゾ� �ルベン誘導体を淘汰することができる。し� �がって、結晶化やクロマトグラフィーなど� �単離精製操作をすることなく、得られたC-保 護ペプチド(P _n+1 )を次のペプチド伸長反応(n+1)に供することが でき、ワンポット合成に繋げることができる 。

 以下に、本発明のペプチド液相合成法につ� ��て詳述する。
2-2-1.カップリング工程(1)
 本発明のペプチド伸長反応のカップリング� ��程(1)においては、例えば、溶媒中において� ��N-Fmocアミノ酸(FA _n+1 )、C-保護ペプチド(P _n )等および縮合剤を(好ましくは、活性化剤と� ��に)混合することによって一つアミノ酸残基 が伸長したN-Fmoc-C-保護ペプチド(FP _n+1 )が得られる。添加順序は特に限定はないが� �C-保護ペプチド(P _n )等が一つ前のペプチド伸長反応(n-1)によって 得られたものである場合は、反応容器中のC-� ��護ペプチド(P _n )等の溶液にN-Fmocアミノ酸(FA _n+1 )および縮合剤を添加すればよい。

 N-Fmocアミノ酸(FA _n+1 )の使用量は、C-保護ペプチド(P _n )等に対して、通常0.9~4.0当量、好ましくは1.0~ 1.5当量である。この範囲より少ないと、未反 応のC-保護ペプチド(P _n )等が残りやすく、多いと過剰のN-Fmocアミノ� �(FA _n+1 )を除去しにくくなる。

 C-保護ペプチド(P _n )等を酸付加塩として使用した場合には中和� �るため、塩基が添加される。該塩基として� �、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチ� �アミン、ピリジン、N-メチルモルホリンなど が挙げられる。該塩基の使用量は、C-保護ペ� ��チド(P _n )等に対して、通常0.5~2.0当量、好ましくは1.0~ 1.5当量である。塩基の使用量がこの範囲より 少ないと中和が不十分となり反応が進行しに くくなる。

 縮合剤は上記で例示したものを特に制限な� ��使用することができ、EDC(フリー体または塩 酸塩)、DIC、DCC、PyBOP、HBTU、HCTU、DMT-MMが挙げ� ��れ、EDCが、残留した縮合剤や縮合剤の分解� ��を洗浄により淘汰することが容易であるた� ��好ましい。縮合剤の使用量は、N-Fmocアミノ� ��(FA _n+1 )に対して通常0.8~4.0当量、好ましくは1.0~1.5当 量である。

 カップリング工程(1)において、反応を促進� ��、ラセミ化などの副反応を抑制するために� ��好ましくは、活性化剤が添加される。活性� ��剤を存在させた場合は、反応系中で一時的� ��N-保護アミノ酸の活性エステルなどが生成� �る。
 活性化剤は上記で例示したものを制限無く� ��用することができ、HOBt、HOOBt、HOCt、HOAt、HO Nb、HOSu等が好ましい。活性化剤の使用量は、 N-Fmocアミノ酸(FA _n+1 )に対して通常、0~4.0当量、好ましくは0.1~1.5� �量である。

 溶媒としては、本反応を阻害しない溶媒で� ��ればいずれでもよく、例えば、N,N-ジメチル ホルムアミド(DMF)、N-メチルピロリドン(NMP)、 酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、アセ� ��ニトリル、クロロホルム、塩化メチレンな� ��またはそれらの混合溶媒が挙げられ、酢酸� ��チルまたはDMFが好ましい。溶媒の使用量は� ��C-保護ペプチド(P _n )等に対して、通常3~100倍重量であり、好まし くは5~20倍重量である。

 反応温度は、通常-20~40℃、好ましくは0~30 ℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範 囲内で、通常0.5~30時間である。

 カップリング工程(1)反応終了後のワーク� ��ップは、カップリング工程(2)と同様である� ��で、後掲の2-2-3においてまとめて説明する� �

2-2-2.カップリング工程(2)
 本発明のペプチド伸長反応のカップリング� ��程(2)においては、例えば、溶媒中において� ��N-Fmocアミノ酸活性エステル(FAE _n+1 )およびC-保護ペプチド(P _n )等を混合することによってN-Fmoc-C-保護ペプ� �ド(FP _n+1 )が得られる。添加順序は特に限定はないが� �C-保護ペプチド(P _n )等が一つ前のペプチド伸長反応(n-1)によって 得られたものである場合は、反応容器中のC-� ��護ペプチド(P _n )等の溶液にN-Fmocアミノ酸活性エステル(FAE _n+1 )を添加すればよい。

 N-Fmocアミノ酸活性エステル(FAE _n+1 )の使用量はカップリング工程(1)におけるN-Fmo cアミノ酸(FA _n+1 )と同様である。
 また、塩基、溶媒およびその使用量、反応� ��度、反応時間等のその他の反応条件は、カ� ��プリング工程(1)と同様である。

2-2-3.カップリング工程(1)および(2)のワークア ップ
 カップリング工程(1)および(2)の反応終了後� ��N-Fmocアミノ酸活性エステル(FAE _n+1 )、N-Fmocアミノ酸のイソウレアエステル、N-Fmo cアミノ酸の対称酸無水物などのアミン成分� �縮合しうる反応混合物中の残留物や副生成� �を淘汰するため、チオール基担持シリカゲ� �等の固相求核剤除去試薬(例えば、SHシリカ� �NHシリカ(富士シリシア化学(株)製)など)を加� ��、攪拌後、濾去してもよい。また、洗浄工� ��にて、炭酸ナトリウムなど弱アルカリ性の� ��溶液で洗浄して、積極的に活性エステルを� ��活させてもよい。

 カップリング工程(1)および(2)のワークア� ��プでは、好ましくは、酸性水溶液洗浄およ� ��/または塩基性水溶液洗浄が行われる。酸性 水溶液洗浄により、C-保護ペプチド、残留し� ��縮合剤またはその分解物、塩基などを水層� ��淘汰することができる。塩基性水溶液洗浄� ��より、活性化剤、残留したN-Fmocアミノ酸な� ��を水層に淘汰することができる。

 酸性水溶液洗浄は、例えば、反応混合物� ��希塩酸水溶液(例えば、1N塩酸水溶液)、硫酸 、ギ酸、クエン酸、リン酸などの水溶液と攪 拌後、分液して水層を除去することにより行 われる。

 塩基性水溶液洗浄は、例えば、反応混合� ��を炭酸水素ナトリウム水溶液(例えば、5%炭� ��水素ナトリウム水溶液)、炭酸ナトリウム水 溶液、炭酸カリウム水溶液などの水溶液と攪 拌後、分液して水層を除去することにより行 われる。

 必要に応じてさらに水洗し、有機層を濃縮� ��ることにより、N-Fmoc-C-保護ペプチド(FP _n+1 )を得ることができ、そのまま容器から取り� �すことなく、N末端脱保護工程に供すること� ��できる。また、濃縮することなく、N-Fmoc-C-� ��護ペプチド(FP _n+1 )の溶液としてN末端脱保護工程に用いてもよ� ��。

 本発明のペプチド液相合成法において、F moc以外のアミン保護基を使用するカップリン グ工程が含まれる場合も、上記と同様に行え ばよい。

2-2-4.N末端脱保護工程
 本発明のペプチド伸長反応におけるN末端脱 保護工程においては、N-Fmoc-C-保護ペプチド(FP _n+1 )を、溶媒中、アミンと反応させることによ� �C-保護ペプチド(P _n+1 )が得られる。具体的には、カップリング工� �で得られたN-Fmoc-C-保護ペプチド(FP _n+1 )の溶液中にアミンを添加すればよい。
 該脱保護反応によって得られる、C-保護ペ� �チド(P _n+1 )とジベンゾフルベン誘導体の混合物を炭素� �5以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒� ��混和しない極性有機溶媒(但し、アミド系有 機溶媒を除く。)中で攪拌、分層させ、炭化� �素溶媒層を除去することにより、ジベンゾ� �ルベン誘導体を淘汰することができる。
 伸長反応開始時はC-保護ペプチド(P _n )等がC-保護アミノ酸となる。該C-保護アミノ� ��の調製は以下のようにして行うことができ� ��。すなわちN-Fmocアミノ酸のカルボキシル基� ��常法によりエステル化し、N-Fmoc-C-保護アミ� ��酸を得る。上記と同様、得られたN-Fmoc-C-保� ��アミノ酸を、溶媒中、アミンと反応させる� ��とによりC-保護アミノ酸(アミノ酸エステル) が得られる。上記と同様に、該脱保護反応に よって得られる、C-保護アミノ酸とジベンゾ� ��ルベン誘導体の混合物を炭素数5以上の炭化 水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない 極性有機溶媒(但し、アミド系有機溶媒を除� �。)中で攪拌、分層させ、炭化水素溶媒層を� ��去することにより、ジベンゾフルベン誘導� ��を淘汰することができる。かかるN-Fmoc-C-保� ��アミノ酸のFmoc基の脱保護も、ここでいうN� �端脱保護工程に含まれる。

 本発明のペプチド液相合成法におけるN末端 脱保護工程は、上記1の「ジベンゾフルベン� �導体の淘汰方法」において、「Fmoc基で保護� ��れたアミノ酸化合物」を「N-Fmoc-C-保護ペプ� ��ド(FP _n+1 )」又は「N-Fmoc-C-保護アミノ酸」に、「アミ� �酸化合物」を「C-保護ペプチド(P _n+1 )」又は「C-保護アミノ酸」にそれぞれ読み代 えて、同様に行うことができる。
 N末端脱保護工程により単離されたC-保護ペ� ��チド(P _n+1 )の溶液を濃縮するか、または濃縮すること� �く、次のペプチド伸長反応にそのまま用い� �ことができる。

 本発明のペプチド合成において、Fmoc以外の N末端保護基を使用したN末端脱保護工程が含� ��れる場合は、ペプチド合成化学で常用され� ��アミノ基保護基の種類に応じた一般的なN-� �端脱保護方法により行えばよい。
 以上のように、本発明の方法により、N末端 脱保護工程において、Fmoc基で保護されたア� �ノ酸化合物をアミンと反応させることによ� �脱保護して得られる反応混合物からジベン� �フルベン及び/又はジベンゾフルベンアミン� ��加体を簡便に淘汰できるため、ペプチドの� ��相合成法において、次の縮合工程、すなわ� ��次のペプチド伸長反応を、中間体ペプチド� ��反応容器から取り出すことなく行うことが� ��きる。すなわち、得られた中間体ペプチド� ��晶析等により固体として単離せずに次の縮� ��工程を行うことができる。このように、本� ��明の方法によれば、ペプチドの液相合成法� ��より、目的とする最終ペプチドをワンポッ� ��合成することが可能である。

2-2-5.最終脱保護工程
 本発明のペプチド合成で、目的のペプチド� ��で構築されたC-保護ペプチド(P _m )のPG ₀ や側鎖保護基を脱保護することにより、目的 のペプチド(P)を得ることができる。
 最終脱保護工程は、PG ₀ または側鎖保護基の種類に応じた自体公知の 脱保護法を特に制限なく採用することができ る。
 例えば、Me、Etなどの低級アルキル基の場合 は、水又は水性有機溶媒などの溶媒中、水酸 化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基と 、-20~40℃で、0.5~10時間反応させることができ る。
 tBuの場合は、クロロホルム、塩化メチレン� ��酢酸エチル、ジオキサンなどの溶媒中、ト� ��フルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、� ��シル酸、ギ酸などの酸と、-20~40℃で、0.5~10� ��間反応させることにより脱保護することが� ��きる。
 Bzlの場合は、メタノール、DMF、酢酸などの� ��媒中、パラジウム炭素などの触媒を用いて� ��0~40℃で、0.5~100時間、水素化反応させるか� �あるいはフッ化水素、トリフルオロメタン� �ルホン酸などの強酸と、-20~40℃で、0.5~10時� �反応させることにより脱保護することがで� �る。
 Alloc基の場合は、テトラキストリフェニル� �スフィンパラジウム等の0価パラジウム均一� ��触媒と反応させる。0価パラジウム均一系触 媒は、0.01~1.0当量、好ましくは、0.05~0.5当量� �用される。
 最終脱保護工程において、Fmoc基で保護され た側鎖アミノ基を脱保護する場合も、N末端� �保護工程と同様にワークアップにおいて本� �明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法が� �用できる。

 本発明の方法により、合成されたペプチ� ��(P)は、ペプチド化学で常用される方法に従� ��て単離精製することができる。例えば、C末 端脱保護工程のワークアップにおいて、反応 混合物を抽出洗浄、晶析、クロマトグラフィ ーなどによって、ペプチド(P)を単離精製する ことができる。