MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con la industria mitilicultora. En particular, la presente invención se refiere a un conjunto (pool) oligonucleótidos/sondas, método, kit y su uso para diferenciar e identificar especies del género Mytilus y sus híbridos de primera y otras generaciones, (Fi , F2, F _n ), a través de método multi -locus basado en PCR y una posterior etapa de HRM (High Resolution Melting), mediante un conjunto de marcadores de SNPs. Este método permite detectar e identificar cinco especies de mejillones (/W. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. platensis), y sus híbridos de primera y siguientes generaciones a través de un método multi -locus basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y una posterior etapa con la técnica de “High Resolution Melting” (HRM) por medio de un conjunto de partidores específicos. En donde, la presente invención, permite realizar la identificación de las especies propuestas con mayor precisión que los métodos divulgados previamente en el estado del arte. La presente metodología incorpora un mayor número de marcadores utilizando panel de 10 loci de SNP's, lo que permite identificar un mayor número de especies, además de sus híbridos de primera y siguientes generaciones, en donde la primera generación se define como Fi, la segunda generación se define como F ₂ y así sucesivamente F _n .

El problema técnico que la presente tecnología resuelve es la necesidad de identificación de al menos cinco especies de mejillones en el género Mytilus. Dicha identificación no es trivial, ya que en productos desconchados los caracteres morfológicos, tales como color o forma de las valvas, no son útiles para este fin. Adicionalmente, estas especies cuando conviven en una misma área geográfica hibridan entre sí, lo que dificulta aún más la identificación genética de las mismas. Para realizar la identificación de especies de mitílidos, se han desarrollado vahos métodos moleculares basados en la amplificación de secuencias específicas del ADN (métodos mono-tocus). Sin embargo, los métodos basados en el análisis de un solo locus no permiten diferenciar todas las especies, no permiten reconocer híbridos de segunda o más generaciones y muestran resultados inconsistentes al ser usados al mismo tiempo ya que analizan regiones del genoma con distintas historias evolutivas.

Para solucionar este problema técnico, los inventores proponen el análisis de un panel de 10 loci de polimorfismos de una sola base o SNP, que permite la identificación de cinco especies de mejillones del género Mytilus (M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus) así como posibles híbridos entre estas especies, ya sean de primera o siguientes generaciones. Este método es más simple ya que no requiere el uso de herramientas de secuenciación o digestión enzimática, lo que favorece una rápida identificación de la especie a un costo y tiempo menor en comparación con métodos que requieren las etapas mencionadas, cabe de mencionar que el presente conjunto (pool) de oligonucleótidos/sondas, método, kit y su uso obtienen resultados inequívocos en su identificación, dicho de otra manera evitando al 100% errores de falsos positivos y de falsos negativos, lo que implica que el presente método obtiene resultados de manera precisa, robusta, con certeza y seguridad, logrando así que sea reproducible.

La tecnología desarrollada es de utilidad para su aplicación y comercialización, ya sea, por empresas o laboratorios que prestan servicios a la industria mitilicultora o a entidades fiscalizadoras para poder responder a las demandas de trazabilidad, específicamente, certificar o autentificar la especie, así como sus híbridos en la materia prima usada de mitílidos.

ESTADO DEL ARTE

Los mitílidos (Mytilidae) son moluscos bivalvos que corresponden a una familia de gran interés económico y gastronómico, que incluye especies de importancia comercial pertenecientes al género Mytilus. Como otros bivalvos, son animales filtradores que viven fijados al sustrato. Son exclusivamente marinos y viven tanto en zonas intermareales como zonas sumergidas de las costas de todo el mundo.

Actualmente en la industria de la miticultura, se presenta el inconveniente de identificar en el género Mytilus en más de tres especies y sus híbridos de manera segura, fácil y económica y en el estado del arte se han encontrado diversas soluciones, que resuelven de manera parcial el problema técnico planteado. Dentro de lo conocido está la patente EP3315612B1 (equivalente a los documentos WO2016207857 y CL 201501833). En dichas patentes equivalentes se describe un método mono-/ocus basado en la utilización de dos partidores, amplificación por PCR y su resolución mediante HRM. Se utiliza un marcador de SNP del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAPM-SNP). Las especies que se pueden detectar con el método desarrollado en EP3315612B1 son las siguientes tres especies: M. chilensis, M. edulis y M. galloprovincialis y sus híbridos M chilensis x M galloprovincialis. Este método describe las mismas regiones de la proteína adhesiva polifenólica para la separación e identificación que uno de los marcadores descritos en la presente solicitud (L1/BM151 ), y dicho marcador permite identificar solo tres de las cinco especies que detecta el método de la presente invención (/W. chilensis, M. edulis y M. galloprovincialis.), así como uno de los tres híbridos (/W chilensis x M galloprovincialis, M chilensis x M edulis y M galloprovincialis x M edulis) mediante HRM. Sin embargo, EP3315612B1 no divulga la detección de dos especies adicionales (/W. trossulus y M. platensis) ni de otros híbridos con estas especies, como se describe en la presente invención.

Otro documento del estado del arte es el artículo científico que lleva por título: Single nucleotide polymorphisms in native South American Atlantic coast populations of smooth shelled mussels: hybridization with invasive European Mytilus galloprovincialis. (Zbawicka et al. Genet Sei Evol (2018) 50:5), que divulga un panel de 51 SNPs, para identificar mitilidos de la costa atlántica de Sudamérica. En dicho documento las muestras se genotiparon usando el sistema de Sequenom MassARRAY ¡PLEX. Se diferenciaron individuos de las especies M. trossulus, M. galloprovincialis, M. edulis, M. chilensis y M. platensis. Se detectaron además híbridos de M. platensis x M. galloprovincialis También se identificaron como híbridos nativos un individuo de M. chilensis x M. platensis y un M. platensis x M. edulis. En el estudio se definió un panel de 19 SNPs efectivos para diferenciar poblaciones de mitílidos en Argentina. Este documento requiere del uso de 19 marcadores para obtener la diferenciación de las cinco especies, lo que es ineficiente en el uso de los recursos y dificultoso de analizar y además, no divulga el uso un ensayo de PCR-HRM como en la presente solicitud. Por lo tanto, el estado del arte no logra mejorar o realizar de manera eficiente lo que logra la presente invención, la cual con prácticamente la mitad de los marcadores analizados obtiene la diferenciación de las cinco especies de mitílidos señaladas, así como híbridos de ellos. Otro documento es el Artículo científico Titulado: Comparison between single and multi-tocus approaches for specimen identification in Mytilus mussels (Scientific Reports (2019) 9:19714). Este documento corresponde a una publicación de los mismos inventores de la presente invención. En ella se realiza una comparación entre un método mono -locus y un método multi -locus para diferenciar mitílidos. Las especies diferenciadas corresponden a M. galloprovincialis, M. edulis, M. chilensis y M. trossulus. Los marcadores utilizados son Me 15-16, mac-1 , ITS, COI Xbal y 16s rFINA, los cuales se analizaron mediante reacciones de PCR-RFLP y se resolvieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). En este documento la estrategia mono-locus permite diferenciar solo cuatro especies señaladas usando Me 15-16, pero no las introgresiones, mientras que con la estrategia multi-tocus además de las cuatro especies, se identifican introgresiones de M. galloprovincialis x M. chilensis. Sin embargo, este documento se diferencia del presente método en que no se identifican las cinco especies de la presente invención, ya que no menciona a M. platensis. Además, sólo menciona la identificación de híbridos de primera generación (Fi) y la introgresión M. galloprovincialis x M. chilensis, pero no la identificación de otros híbridos, tales como los de segunda generación F ₂ ni los de las siguientes generaciones. Por otra parte, tampoco utiliza el análisis de HRM para resolver los amplicones.

En el artículo científico titulado: High resolution melting analysis for identification of commercially important Mytilus species (Food Chemistry 229 (2017) 716-720), se describe un método mono-locus basado en la utilización de dos partidores, amplificación por PCR y su resolución mediante HRM. Se utiliza un marcador de SNP del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAPM-SNP). Las especies que se pueden detectar con el método desarrollado son M. chilensis, M. edulis y M. galloprovincialis y sus híbridos M chilensis x M galloprovincialis, M. chilensis x M. edulis y M. galloprovincialis x M. edulis. La publicación menciona que el método divulgado tiene a la solicitud de patente CL 1833-2015 (equivalente a la ya citada EP3315612B1) en trámite. Este documento se diferencia del presente método en que no se identifican las cinco especies señaladas, ya que no menciona M. platensis. Sí menciona la identificación de híbridos M chilensis x M galloprovincialis, M. chilensis x M. edulis y M. galloprovincialis x M. edulis, pero se diferencia de la presente invención en que no menciona la identificación de híbridos con M. platensis y M. trossulus. El método usado es de PCR-HRM al igual que el presente método, con la diferencia que es mono-locus. El marcador usado es uno de los marcadores usados en el presente método (BM151/PAPM). Los métodos mono-locus más comúnmente utilizados para la identificación de especies en mejillones como el PCR-HRM PAPM (CL201501833; EP3315612B1 ), Me15-16, ITS, mac-1 , 16S rFINA y COI, pueden dar resultados contradictorios cuando se usan independientemente, ya que analizan regiones genómicas con diferentes historias evolutivas. Además, estos métodos no identifican todas las especies de interés ni todos sus híbridos.

Otra ventaja del presente método es el uso de las restantes parejas de partidores que revelan polimorfismos informativos para realizar la identificación de las especies propuestas con mayor certeza que el método mono-locus. Esta metodología incorpora un mayor número de marcadores el cual logra identificar un mayor número de especies que en el método ya presentado, lo que resulta en una metodología con un mejor alcance en comparación al método ya patentado. Ninguno de los documentos del estado del arte mencionados, propone la identificación de cinco especies de mejillones del género Mytilus (M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus) así como posibles híbridos entre estas especies de primera o siguientes generaciones (Fi, F ₂ , ... , F _n ) mediante el análisis de polimorfismos utilizando un panel reducido de 10 marcadores de SNPs. Además, el método desarrollado en la presente invención no requiere el uso de herramientas de secuenciación o digestión enzimática, lo que favorece una rápida identificación de la especie a un costo y tiempo menor en comparación con métodos que requieren las etapas mencionadas.

SOLUCIÓN AL PROBLEMA TÉCNICO

Para subsanar el problema planteado, se presenta un conjunto (pool) de oligonucleótidos/sondas, método, kit y su uso para diferenciar e identificar especies del género Mytilus y sus híbridos de primera y otras generaciones, (Fi, F ₂ , ... , F _n ), a través de método multi -locus basado en PCR y una posterior etapa de HRM (High Resolution Melting), mediante un conjunto de marcadores de SNPs. En donde las especies de mejillones son: M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. platensis, y sus híbridos de primera y generaciones siguientes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Etapas del método de análisis de identificación de especies de mejillón del género Mytilus mediante método PCR-HRM multi-tocus. Etapa 1 : Preparación de muestras y reactivos; 1 a. Preparación de muestras de ADN ya extraídas; 1 b. Preparación de reactivos HRM; Etapa 2: Determinación del genotipo mediante HRM; 2a. Preparación de placa con muestras a evaluar en equipo HRM; 2b. Reacción PCR y HRM; 2c. Determinación del genotipo; Etapa 3: Identificación de la especie; 3a. Análisis con GeneClass2; 3b. Obtención del resultado.

Figura 2: Diagrama de flujo de toma de decisiones para determinar el genotipo de Mytilus. IC (Intervalo de confianza al 95%) según datos obtenidos para cada locus SNP en el equipo utilizado.

Figura 3: Árbol de decisión.

Figura 4: Ejemplo de curvas de “melting” de cada uno de los SNPs del panel de identificación de especies usado.

4A: SNP L1. Curvas de PCR-HRM para marcador L1. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos TT(+), homocigotos alelo GG (x), heterocigotos GT (*) y polimorfirmos de tamaño P (o)

4B: SNP L2. Curvas de PCR-HRM para marcador L2. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos AA (x), homocigotos alelo TT (+) y heterocigotos AT (o)

4C: SNP L3. Curvas de PCR-HRM para marcador L3. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos AA (x) y homocigotos alelo CC (+)

4D: SNP L4. Curvas de PCR-HRM para marcador L4. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos AA (x) y homocigotos alelo GG (+) 4E: SNP L5. Curvas de PCR-HRM para marcador L5. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos TT (x), homocigotos alelo CC (+) y heterocigotos TC (o)

4F: SNP L6. Curvas de PCR-HRM para marcador L6. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos AA (x) y homocigotos alelo GG (+)

4G: SNP L7. Curvas de PCR-HRM para marcador L7. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos TT (x), homocigotos alelo CC (+) y heterocigotos TC (o)

4H: SNP L8. Curvas de PCR-HRM para marcador L8. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos TT (x), homocigotos alelo GG (+) y heterocigotos TG (o)

4I: SNP L9. Curvas de PCR-HRM para marcador L9. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos TT (x), homocigotos alelo CC (+) y heterocigotos TC (o)

4J: SNP L10. Curvas de PCR-HRM para marcador L10. Cada curva corresponde a cada uno de los genotipos observados. Homocigotos AA (x), homocigotos alelo GG (+) y heterocigotos AG (o)

Figura 5: Diagrama de flujo para toma de decisiones em el caso de tener una muestra que no presenta amplificación en uno o más loci.

Figura 6: Expresión de resultados en GeneClass2.

6A Funcionamiento GeneClass2;

6B: Ejemplo de resultado de GeneClass 2. DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud describe un conjunto de oligonucleótidos/sondas (Tabla 1 ), método, kit y su uso para diferenciar e identificar especies del género Mytilus de cinco especies de mejillón del género Mytilus (M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. platensis), y los respectivos híbridos posibles entre estas 5 especies (M. chilensis x M. edulis, M. chilensis x M. galloprovincialis, M. chilensis x M. trossulus, M. chilensis x M. platensis, M. edulis x M. galloprovincialis, M. edulis x M. trossulus, M. edulis x M. platensis, M. galloprovincialis x M. trossulus, M. galloprovincialis x M. platensis, M. trossulus x M. platensis), mediante la técnica de PCR-HRM (High Resolution Melting), utilizando un panel de 10 loci de SNPs o sus combinaciones para distinguir entre especies especificas (Tabla 2).

Tabla 1 : Conjunto de oligonucleótidos/sondas (partidores) para amplificar 10 toe/ SNPs para la detección e identificación de 5 especies de mejillón del género Mytilus (M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. platensis), y sus respectivos híbridos posibles. TABLA 2: Loci SNP’s específicos que permiten identificar entre dos especies de Mytilus. Combinaciones para identificar entre especies.

Como se observa en la Tabla 2, el uso de los loci L1 a L7 permite identificar y diferenciar una especie conocida (ej. M. chilensis) e identificar si corresponde o no a dicha especie, así como también a un híbrido y de qué generación se trata. Mientras que el uso de los loci L8 a L10 no se incluyen en la Tabla 2 ya que éstos solo permiten identificar que la muestra pertenece al género Mytilus.

Se trabajó con dos sets de datos: (a) 49 SNPs (Zbawicka et al. 2012 y 2014) identificados en tres taxas europeos a partir de secuencias de EST y genotipados usando el método de Sequenom en M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus y (b) 74 SNP (Araneda et al. 2016) descubiertos por RADseq en M. chilensis y genotipados por GT- seq, en M. chilensis, M. edulis y M. galloprovincialis.

En ambos casos se identificó la especie de cada individuo usando el método mono- locus basados en la proteína adhesiva polifenolica PCR-RFLP Me15/16 y PCR-HRM PAPM (Jilberto et al. 2017).

Se seleccionaron los 9 loci de SNPs más informativos: BM101 (L2), BM10B (L3), BM11A (L4), BM12A (L5), BM54 (L6), BM6C (L7), MityUCH2120_24 (L8), MityUCH4408_32 (L9) y MityllCH7529_32 (L10). Además, se incluyó el marcador asociado al método PCR- HRM PAPM (BM151 - L1 ).

A partir de las secuencias de los loci de SNPs seleccionados se diseñaron partidores adecuados para la técnica de High Resolution Melting (HRM). En la Tabla 1 se detalla la denominación de los toe/ utilizados, código, las secuencias de los partidores para amplificarlos y Sequence ID NO:.

El principio de High Resolution Melting (HRM) consiste en observar en tiempo real, la separación de las hebras de un fragmento de ADN amplificadas en presencia de tintes fluorescentes, que se intercalan en la doble hebra de ADN. Por lo tanto, a medida que aumenta la temperatura de la muestra, las hebras de ADN se separan y la fluorescencia del tinte disminuye, lo que queda reflejado en la curva de “melting” (absorbancia versus temperatura). Un cambio en la secuencia de ADN induce una variación en la temperatura y cinética de “melting” del ADN que queda en evidencia al comparar las curvas del individuo con las de los controles utilizados.

El procedimiento consiste en preparar las muestras de ADN a evaluar, para luego ser genotipadas mediante un equipo PCR en tiempo real con capacidad de análisis HRM, comparando las curvas de “melting” resultantes de las muestras con las del material de referencia, para genotipar las muestras en los diez loci. A partir de la información de los genotipos multi-tocus, realizar la asignación a especie usando algoritmos de asignación de individuos a grupos previamente establecidos (especies que el método identifica).

La tecnología propuesta se diferencia en que: además de las especies identificadas en el método mono-tocus del arte previo, el presente método permite identificar dos especies más (/W. trossulusy M. platensis). Este método basa la identificación en el análisis de en vahas regiones del genoma o múltiples loci (multi -locus).

El análisis multi -locus presenta las siguientes ventajas:

1 . Permite identificar más especies.

2. Permite identificar híbridos Fi y de siguientes generaciones (F ₂ ).

3. Da mayor certeza a la identificación, al superar los resultados contradictorios derivados de análisis mono -locus, dicho de otra manera, el presente conjunto (pool) de oligonucleótidos/sondas, método, kit y su uso obtienen resultados inequívocos en su identificación, dicho de otra manera evitando al 100% errores de falsos positivos y de falsos negativos, lo que implica que el presente método obtiene resultados de manera precisa, robusta, con certeza y seguridad, logrando así que sea reproducible.

La presente técnica ha sido desarrollada para genotipar marcadores genéticos como son los SNP (Single Nucleotide Polymorphism por su sigla en inglés o polimorfismo de un solo nucleótido) o inserciones/deleciones en presentes en el genoma. Este método logra la identificación de las cinco especies ya mencionadas a un bajo costo y es fácil de implementar en cualquier laboratorio que posea un termociclador para PCR en tiempo real con capacidad para hacer análisis de HRM. La identificación de los marcadores genéticos se logra gracias al uso de partidores especialmente diseñados y de fluorocromos intercalantes que se unen a saturación al ADN sin inhibir la reacción de PCR, asociado a un análisis posterior de la curva de disociación (melting) de los amplicones generados por la reacción de PCR. La detección e identificación de cada marcador genético se logra porque las curvas de melting generadas son diferentes para los distintos alelos analizados.

El panel de marcadores seleccionado fue evaluado como test diagnóstico, genotipando 225 individuos de las especies objetivo: M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus. El protocolo de PCR-HRM utilizado fue: 96°C por 2 minutos seguido por 35 ciclos a 96°C por 15 segundos y 59°C por 30 segundos. El análisis de melting se realizó desde los 60°C hasta los 95°C con incremento de 0,1 °C por segundo. La reacción contiene 0,01 pM de los partidores forward y reverse, 10 ng de ADN genómico y Kit para HRM SensiFast™ (Bioline®) o EvaGreen® qPCR Master Mix (Biotium®) en un volumen final de 8 pL. La asignación a especie se realizó usando el programa GeneClass2.0, calculando los parámetros para evaluar test (prueba) diagnóstico de Sensibilidad (S) y Especificidad (E). El 100% de los individuos fue correctamente re-asignado a la especie respectiva. La especificidad y sensibilidad del panel seleccionado fue de 1 ,0; lo que muestra la alta capacidad de asignación a especie del grupo de SNP usados.

Cabe de mencionar que para evaluar el desempeño del test diagnóstico, se consideran los parámetros de desempeño de sensibilidad y especificidad, en donde: la sensibilidad corresponde al número de individuos correctamente asignados a su especie, dividido por el total de individuos pertenecientes a dicha especie (de acuerdo a la referencia); y la especificidad corresponde al número de individuos correctamente excluidos de una especie, dividido el total de individuos que no pertenece a dicha especie (de acuerdo a la referencia); en donde cuando la sensibilidad y especificidad son más cercanos a 1 , presenta mayor desempeño, se evalúa el método en comparación a uno de los paneles de 50 SNP, en base a la concordancia de dichos resultados se determina la sensibilidad y especificidad en una escala de 0 a 1 .

El panel de SNP tiene una probabilidad de asignación del 100% a M. chilensis y M. trossulus. Para las otras dos especies, M. edulis y M. galloprovincialis, si bien la probabilidad es algo menor esta sigue siendo muy alta de 98.95% y 99.98% respectivamente. Cabe de mencionar que los porcentajes refieren a probabilidad de asignación, entendiéndose que reducen los errores que pueden producirse en los otros métodos, en donde estos porcentajes los asigna GeneClass de acuerdo con las frecuencias alélicas. Esto es calculado como la probabilidad de asignación a especie considerando los genotipos del individuo en los 10 loci, en base a la tabla 1 1 de frecuencias alélicas presentada más abajo.

Se genotiparon además, individuos de especies cercanas al género Mytilus (PeruMytilus purpuratus y SemiMytilus algosos, 20 individuos por especie) e individuos de otras especies de mejillones comunes en alimentos (Aulacomya afra y ChoroMytilus chorus, 20 individuos por especie). Dos SNPs mostraron amplificación en alguna de estas especies, el SNP BM6C en ChoroMytilus chorus y el SNP UCH4408 en PeruMytilus purpuratus y Aulacomya atra. Sin embargo, debido al enfoque multi -locus del método, esto no resulta ser un problema mayor porque los individuos de estas especies no muestran amplificación en los SNP restantes, lo que previene que sean mal identificados asignándolos a alguna de las especies objetivo. Con el presente método además se puede obtener como resultado la identificación de los individuos mediante dos o más subconjuntos de partidores.

Se procedió a la validación interna del método en conjunto con la transferencia a un segundo laboratorio. En la etapa de validación interna, se estableció la aplicabilidad, practicabilidad, especificidad y sensibilidad del método. Este procedimiento es aplicable a mejillones del género Mytilus (M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus) frescos, congelados y procesados en conserva, estos últimos con medio de empaque salmuera (al natural) y en aceite. El método resultó práctico de aplicar en las condiciones descritas y, como se observa en los ejemplos de aplicación, la especificidad de los partidores fue confirmada in-silico e in-vitro.

Se definió el material de referencia para el método. La tasa de falsos positivos y negativos fue cero. El método es sensible a la concentración de ADN recomendada (20 ng/ul), tanto detectando las especies objetivo como descartando las especies de mejillón comunes en alimentos, que no pertenecen al género Mytilus. El método resultó robusto en las condiciones ensayadas. Los procedimientos operacionales estandarizados (POE) se redactaron y transfirieron a un segundo laboratorio. El análisis de concordancia evaluado por el estadístico Kappa de Cohen indicó una concordancia casi perfecta (0,925) en los resultados obtenidos en ambos lugares, logrando así, que la tasa de falsos positivos y negativos sea cero, porque se desprende del resultado de sensibilidad y especificidad anterior (igual a 1 ).

El material de referencia correspondió a individuos biológicos cuya especie fue determinada por dos métodos distintos obteniendo el mismo resultado en un mismo laboratorio o, además, por dos laboratorios diferentes con un mismo método obteniendo el mismo resultado, o que estén descritos como de esa especie en la bibliografía (ver ejemplo 4).

De esta manera, se cuenta con un kit multi -locus de SNPs para la identificación de la especie de mejillones, el que consta de: 1 . Set de partidores. 2. Procedimientos operacionales estandarizados (POEs) para ejecutar cada etapa del método (extracción ADN, genotipado SNP y asignación de especie) y 3. Muestras de referencia. La metodología de ensayo desarrollada permite determinar la especie, mediante la ejecución de las siguientes etapas sucesivas: 1 . Preparación de muestras y reactivos; 2. Determinación del genotipo mediante PCR-HRM; 3. Identificación de la especie.

En la actualidad, existen varias metodologías para realizar la identificación de la especie basadas en la detección de una secuencia específica del ADN (aproximación mono- locus). Los métodos desarrollados usan comúnmente la proteína adhesiva polifenólica para realizar la identificación de la especie, existiendo también métodos basados en la región ITS del rDNA o en el gen de la actina, las que son usadas a nivel científico. Sin embargo, los métodos mencionados no son capaces de identificar todas las especies de interés y/o muestran resultados inconsistentes al ser analizados en forma independiente, debido a la naturaleza de los marcadores utilizados, con distintas historias evolutivas. Por lo anterior, una metodología basada en múltiples toe/ (aproximación multi-tocus) como el método presentado, permite superar los inconvenientes de las aproximaciones basadas en un solo locus, como la identificación de solo tres especies sin mayor grado de precisión, y la reducción de la tasa de falsos positivos/negativos.

La tecnología multi -locus que propone el presente desarrollo está pensada para ser usada para la identificación de 5 especies de mejillones (/W. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus) y los respectivos híbridos entre estas especies, en productos comerciales y en individuos recolectados del medio natural. La ventaja de esta tecnología es que logra identificar inequívocamente las 5 especies de mejillones mencionadas y los híbridos entre ellas, de forma rápida y de manera simple en comparación con las metodologías usadas rutinariamente, las que solo identifican algunas de estas especies. Además cuenta con un número de hasta 10 loci (10 SNPS) en comparación con otras divulgaciones del estado de la técnica que requieren de al menos 19 loci, lo que implica mayor trabajo en laboratorio, uso de reactivos y análisis de datos experimentales por cada locus adicional no logrando identificar todas las especies que identifica el presente desarrollo.

Para evaluar el desempeño del método propuesto, se compararon los resultados obtenidos en la identificación de especies de mejillón utilizando el método multi-tocus de 10 SNP's, el método mono-locus PAPM, y un segundo método multi -locus usando 9 SNP. A continuación se muestra una comparación del desempeño identificando la especie de mejillón mediante los siguientes métodos: PAPM (método mono-tocus), multi-tocus usando 9 SNPs y multi-tocus usando 10 SNPs (PAPM + 9 SNPs).

Se trabajó con 173 mejillones provenientes de poblaciones naturales recolectadas desde distintas zonas donde se encuentran cada una de las cinco especies de interés (Tabla 3). A cada uno de estos individuos se les identificó la especie aplicando el método PAPM y el método multi-tocus de la presente invención consistente en los 10 SNP (PAPM + 9 SNPs). En este último caso, para realizar la asignación de cada individuo a su especie se utilizó el procedimiento de “training, holdout and leave-one-out” implementado en el programa GeneClass2 (Piry et al., 2004), usando el método bayesiano de Rannala y Mountain (1997). Los individuos se asignaron usando al mismo tiempo los diez marcadores (PAPM + 9 SNPs) y los 9 SNPs (sin método PAPM). Se consideró como un individuo asignado a una especie cuando la probabilidad de asignación calculada fue superior al 95%, en caso contrario, el individuo fue considerado como híbrido.

Tabla 3. Muestras de poblaciones naturales analizadas, sitio de recolección, país y cantidad (n).

Especie Localidad País

Mytilus chilensis Región de Biobío, Los Lagos y Magallanes Chile 66

Mytilus edulis Isla Prince Edward Canadá 27

Mytilus Galicia España 44 galloprovincialis Mytilus platensis Isla Grande de Tierra del Fuego Argentina 19 Mytilus trossulus Vancouver Canadá 17

Total 173 De esta manera, el kit multi-tocus de 10 SNPs permite la identificación de las tres especies que identificaba el método PAPM (CL 201501833; EP3315612B1 ), ampliando su alcance y capacidad de identificación, al ser capaz de identificar dos nuevas especies: M. platensis y M. trossulus. El método (PAPM) confunde M. platensis con M. edulis agrupando juntos a los individuos de estas dos especies, además no puede identificar M. trossulus las que no son asignadas a ninguna especie por este método (Tabla 4).

Tabla 4. Método PAPM vs Método multi-tocus 10 SNP (Asignación de la especie)

Mch: M. chilensis. Me: M. edulis. Mg: M. galloprovincialis. Mp: M. platensis. Mt: M. trossulus. NA: individuos sin asignar.

También se observa que el locus PAPM es muy informativo para esta tarea ya que al realizar la identificación sólo con los nuevos loci (9 SNPs) (Tabla 5) baja el desempeño. En este sentido, identifica híbridos entre especies que no se encuentran en la misma zona geográfica (destacado con (*)) o confunde entre dos especies correctamente identificadas por el marcador PAPM como M. galloprovincialis y M. edulis. (destacado con (*)).

Tabla 5. Asignación a especie con panel de 9 SNP.

Mch: M. chilensis. Me: M. edulis. Mg: M. galloprovincialis. Mp: M. platensis. Mt: M. trossulus. NA: individuos no asignados.

Los resultados obtenidos muestran cómo el uso de los 10 SNPs mejora la capacidad para identificar híbridos con respecto al método en base a solo un marcador (PAPM), que confunde M. edulis con M. platensis, no identifica M. trossulus y por ende no puede identificar híbridos con estas especies. El método de la presente invención también tiene mejor desempeño que usando 9 SNPs, ya que si bien puede identificar las 5 especies objetivo, confunde entre ellas y no asigna híbridos de manera correcta. De este modo, los resultados confirman que el nuevo método propuesto con los 10

SNP permite identificar con alto desempeño, las tres especies que identificaba el método PAPM (CL 201501833; EP3315612B1 ) y los híbridos entre ellas, y ampliando su alcance para incluir dos nuevas especies (/W. platensis y M. trossulus) y sus respectivos híbridos. Además, los nueve loci propuestos por sí solos, no tienen un desempeño suficiente para identificar las cinco especies de mejillones, ya que confunden entre especies o asignan erróneamente individuos como híbridos. Incluir el locus PAPM es fundamental para que el nuevo método tenga las ventajas señaladas.

Definiciones

El término Mejillón se refiere a molusco bivalvo perteneciente al género Mytilus (adaptada de NCh 3360:2014). Los mejillones son animales filtradores que viven fijados a un sustrato. Son exclusivamente marinos y viven tanto en zonas intermareales como zonas sumergidas. Nota: En Chile, el nombre “choñto” es sinónimo de mejillón, dado que Mytilus chilensis es conocido internacionalmente como “mejillón chileno”.

El término High Resolution Melting (HRM) se refiere a técnica de análisis post-PCR usada para identificar variaciones en la secuencia de ácidos nucleicos. Se basa en determinar la relación entre la temperatura y el grado de desnaturalización de los fragmentos de ADN detectando pequeñas diferencias en las curvas de disociación (melting).

El término alelo se refiere a una forma alternativa de un gen; un solo gen puede tener múltiples alelos.

El término SNP se refiere a polimorfismo de un solo nucleótido, o SNP, es la sustitución de un solo nucleótido en una posición específica del genoma.

El término Cq o ciclo de cuantificación se refiere a parámetro usado en PCR en tiempo real que indica el número de ciclos dónde la señal de amplificación por PCR alcanza un criterio matemático predefinido. Este umbral determina si la secuencia blanco está o no presente y puede ser cuantificada.

Los términos híbrido e introgresión se utilizan indistintamente y se refieren al cruce de dos organismos por reproducción sexual de variantes o diferentes especies o subespecies.

Los términos Fi, F2 y F _n se refieren a híbridos de primera y siguientes generaciones, en donde la primera generación se define como F1, la segunda generación se define como F ₂ y así sucesivamente F _n . El término oligonucleótidos/sondas se refiere a secuencias cortas de ADN (menos de 50 pares de bases), que se utilizan como cebadores o partidores en reacciones de amplificación de PCR y como sondas de hibridación.

MODALIDADES DETALLADAS:

La presente invención se refiere a un conjunto (pool) oligonucleótidos/sondas, método, kit y su uso para diferenciar e identificar especies del género Mytilus y sus híbridos de primera y otras generaciones, (Fi, F2, F _n ), en particular se refiere a un conjunto de oligonucleótidos/sondas para la identificación de especies del género Mytilus y sus híbridos de primera y otras generaciones, en donde dicho conjunto comprende a lo menos dos de los siguientes subconjuntos de oligonucleótidos/sondas:

-a) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2;

-b) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4;

-c) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6;

-d) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8;

-e) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10;

-f) SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12;

-g) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14;

-h) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16;

-i) SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18; y

-j) SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.

También se refiere a un método de para identificar especies del género Mytilus y sus híbridos de primera y otras generaciones, en donde cada subconjunto de oligonucleótidos híbrida con una secuencia objetivo específica, que comprende las etapas de: a) adicionar dos o más subconjuntos de oligonucleótidos de la reivindicación 1 a una muestra que contiene ADN de la especie del género Mytilus a identificar; y b) detectar ADN de la especie del género Mytilus a identificar de la mezcla obtenida en la etapa a).

En donde cada subconjunto de oligonucleótidos híbrida con una secuencia objetivo específica, que comprende las etapas de: a) adicionar dos o más subconjuntos de oligonucleótidos/sondas de la reivindicación 1 a una muestra que contiene ADN de la especie del género Mytilus a identificar con reactivos para la reacción de PCR y High Resolution Melting (HRM), b) amplificar los marcadores de SNPs (por las siglas de Single Nucleotide Polymorphism) que se encuentran en el ADN de la mezcla obtenida en la etapa a), con el conjunto de partidores de acuerdo con la reivindicación 1 ; c) adicionar un ciclo extra para la construcción curva de disociación con un aumento de temperatura partiendo de los 50 ^e C; d) generar, durante la etapa c), curvas de disociación de las secuencias de los segmentos amplificados en la etapa b) mediante la técnica HMR; e e) identificar la especie y sus híbridos de primera y otras generaciones a la que corresponde la muestra a partir de las curvas de disociación obtenidas con la técnica HRM, contrastando los resultados con individuos control de genotipo conocido.

En una modalidad preferente en la etapa a) la muestra de ADN contiene entre 0,1 y 100 ng/pl de ADN de la especie a identificar.

En otra modalidad preferente en la etapa a) la muestra de ADN contiene entre 15 y 25 ng/pl de ADN de la especie a identificar.

En otra modalidad preferente en la etapa b) se realiza mediante PCR, en las siguientes condiciones: activación de ADN polimerasa a una temperatura entre 70 y 100°C durante 1 a 15 minutos; 20 a 45 ciclos de amplificación con una etapa de desnaturalización a una temperatura entre 70-100°C durante 10 a 60 segundos; y unión de partidores a una temperatura entre 40-80°C por 10 segundos a un minuto.

En otra modalidad preferente en la etapa b) la activación de ADN polimerasa también se utiliza para la desnaturación in situ de ADN en muestras de tejidos, células, colonias, o combinaciones de éstas.

En otra modalidad preferente la etapa b), además comprende después de la etapa de unión de partidores: adicionar una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50 y 80°C en un tiempo de entre 10 segundos y 60 segundos. En otra modalidad preferente la etapa b), además comprende: una etapa de extensión final a una temperatura entre 60 y 95°C durante un tiempo de entre 1 y 10 minutos.

En otra modalidad preferente la amplificación de los marcadores de SNPs de la etapa b) se realiza mediante PCR-HRM en las siguientes condiciones: activación de ADN polimerasa a una temperatura entre 70 y 100°C durante 1 a 10 minutos, 20 a 45 ciclos de amplificación con una etapa de desnaturalización a una temperatura entre 70 y 100°C durante 10 a 60 segundos, unión de partidores a una temperatura entre 40 y 80°C entre 10 segundos y 60 segundos con una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50 y 80°C entre 10 a 60 segundos y una etapa de extensión final a una temperatura entre 60 y 95°C durante 1 a 10 minutos.

En otra modalidad preferente la etapa c), además comprende: adicionar un ciclo extra para la construcción curva de disociación con un aumento de temperatura de entre 60 ^e y 95 ^e C.

En otra modalidad preferente la etapa c), además comprende: una gradiente de aumento de temperatura de entre 0,01 y 2°C por segundo hasta llegar a 95°C.

En otra modalidad preferente la etapa e), además comprende: analizar cada curva de disociación obtenidas con la técnica PCR-HRM y compararlas con las curvas de control obtenidas de los resultados de individuos control de genotipo conocido, en donde la etapa e), además comprende: identificar y diferenciar al menos entre dos especies y sus híbridos de primera y otras generaciones a la que corresponde la muestra a partir de las curvas de disociación obtenidas con la técnica HRM, contrastando los resultados con individuos control de genotipo conocido.

En otra modalidad preferente la etapa e), además comprende: identificar y diferenciar la especie seleccionada de entre: M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. platensis y sus híbridos de primera y otras generaciones

En una modalidad preferente adicional la etapa e), además comprende: identificar y diferenciar las siguientes cinco especies M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. platensis y sus híbridos de primera y otras generaciones

Un kit para identificar especies del género Mytilus, y sus híbridos de primera y otras generaciones, que comprende a) un conjunto de oligonucleótidos/sondas de acuerdo con la reivindicación 1 ; y b) medios para realizar la PCR y HRM descritas en el método descrito en los párrafos superiores.

El kit descrito anteriormente, es útil para ser usado en la identificación de especies del género Mytilus, y sus híbridos de primera y otras generaciones. EJEMPLOS DE APLICACIÓN

EJEMPLOS DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

A continuación, se expondrán ejemplos de aplicación de la presente patente de invención. Dichos ejemplos se proporcionan sólo a modo ilustrativo para lograr un mejor entendimiento de la invención, pero en ningún caso debe considerarse que limiten el alcance de la protección solicitada. Adicionalmente, especificaciones de diferentes características técnicas descritas en los ejemplos pueden combinarse entre sí, o con otras características técnicas previamente descritas, sin que esto limite el alcance de la protección solicitada.

EJEMPLO 1 : Partidores de SNPs utilizados

La denominación de los loci utilizados para la diferenciación de las especies de mitílidos, los partidores diseñados, sus secuencias, tamaño de amplicón y polimorfismo se presentan en la siguiente tabla (Tabla 6 a y 6b):

Tabla 6a: Loci de SNPs utilizados y secuencia de los partidores Tabla 6a: Loci de SNPs utilizados y secuencia de los partidores (continuación)

Tabla 6b: Tamaño de amplicón y polimorfimo.

EJEMPLO 2: Implementación de la técnica PCR-HRM en sistema Multi-tocus con 10

SNPs En la presente invención, la técnica de PCR-HRM para diferenciar e identificar mejillones del género Mytilus (M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus) y los respectivos híbridos entre estas especies, se implementa mediante el siguiente procedimiento: Se preparan las muestras de ADN a evaluar, para luego ser genotipadas mediante un equipo PCR en tiempo real con capacidad de análsis HRM, comparando las curvas de “melting” resultantes de las muestras con las del material de referencia, para genotipar las muestras en los diez loci. A partir de la información de los genotipos multi-tocus, se realiza la asignación a especie usando algoritmos de asignación de individuos a grupos previamente establecidos (especies que el método identifica). Los equipos utilizados para realizar este método fueron:

• Equipo de PCR en tiempo real con análisis de HRM (por ejemplo, Eco Real Time PCR Illumina® o Míe qPCR Cycler Bio Molecular Systems®).

• Placas o tiras de tubos para reacción HRM compatibles, según el equipo a utilizar.

• Sellos o tapas para placas de reacción HRM compatibles, según el equipo a utilizar.

• Gabinete de bioseguridad para realizar PCR.

• Micropipetas monocanal p2 (2 pl), p10 (10 pl) y p200 (200 pl).

• Puntas estériles RNAsa/DNAsa free, compatibles con las micropipetas a utilizar.

• Tubos para centrífuga (eppendorf) estériles de 1 ,5 pl.

• Guantes desechadles para trabajo de laboratorio.

• Computador con software GeneClass2 instalado.

En cuanto a los reactivos, se utilizaron los siguientes:

• Kit para reacción HRM (por ejemplo, SensiFast (Bioline®) y Fast EvaGreen qPCR Master Mix (Biotium®).

• Set de Partidores en dilución de trabajo (10 ng/pl) según Tabla 1 .

• Agua para PCR, libre de DNAsa y RNAsa.

• Material de referencia (controles).

• Muestras de ADN extraídas según extracción de ADN por método CTAB y/o extracción de ADN por método Fenol-Cloroformo, cuyos índices de relación de absorbancia a 260/280 y 260/230 debe estar entre 1 ,8 -2,0 y 2, 0-2, 2 respectivamente. Se requiere como mínimo la extracción de 4 individuos (previamente rotulados) por lote para llevar a cabo el análisis descrito a continuación, ya que es la unidad mínima de análisis determinada en la practicabilidad del método.

Este método de ensayo permite determinar la especie de Mytilus spp. de los individuos presentes en la muestra, mediante la ejecución de etapas sucesivas 1 -3 (ver Figura 1 ), tal como se detalla a continuación:

Etapa 1 : Preparación de muestras, material de referencia y reactivos HRM

La extracción del ADN de la muestra debe realizarse de acuerdo con el método CTAB y/o mediante extracción de ADN por método Fenol-Cloroformo. La calidad del ADN debe ser la que se indica en dicho procedimiento (índices de relación de absorbancia a 260/280 y 260/230 debe estar entre 1 ,8 -2,0 y 2, 0-2, 2 respectivamente). Se deben diluir las muestras ya extraídas a una concentración de 1 -100 ng/pl (Concentración optima 20 ng/pil), utilizando agua para PCR en un tubo Eppendorf.

Para cada SNP a genotipar, se debe incorporar un control por alelo. En un pocilio HRM o tubo para la reacción, según corresponda al equipo utilizado, se agrega 0,5 pl del material de referencia indicado en la Tabla 7, en lugar del ADN de la muestra. Se debe diluir el material de referencia a una concentración de 1-100 ng/pl (Concentración optima 20 ng/pil), utilizando agua para PCR.

Tabla 7. Material de referencia a utilizar como control por locus y por alelo. Además, para cada uno de los diez SNPs a evaluar se debe incorporar un control negativo, que consistirá en un pocilio HRM o tubo para la reacción, que contenga 0,5 pl de agua para PCR en lugar de la muestra.

Los reactivos almacenados a -20°C deben dejarse por un corto periodo de tiempo a temperatura ambiente, para descongelarlos y poder ser utilizados.

Etapa 2: PCR en tiempo real y Análisis HRM

Para la reacción, cada pocilio o tubo a utilizar debe contener los reactivos según la siguiente Tabla 8:

Tabla 8. Reactivos a utilizar para análisis de PCR-HRM para una muestra.

Reactivo Volumen [pl]

Kit HRM* 4

Partidor Forward [10 ng/pl]** 0,075

Partidor Reverse [10 ng/pl]** 0,075

H ₂ O PCR 3,35

ADN extraído de la muestra [20 ng/pl]*** 0,5

Total 8

*Kit HRM: el funcionamiento del método se ha evaluado usando los kits SensiFast (Bioline®), Fast EvaGreen qPCR Master Mix (Biotium®) y qPCRBIO HRM mix (PCRBIO®).

**Los partidores deben utilizarse a una concentración de 1 -50 ng/pl (Optimo 10 ng/pil).

***EI ADN de la muestra a evaluar debe estar a una concentración de 1 -100 ng/pl (Optimo 20 ng/pil). a) mezclar entre 1 -50 ng/pl de una muestra de ADN de la especie a identificar con los siguientes reactivos necesarios para la reacción de PCR y HRM: entre 2-20 pl, para una concentración final de 0,01 X-4X, de un kit de fluorescencia apropiado para realizar análisis por HRM; entre 0,05-0,5 pl de partidores de SEQ ID No. 1 y entre 0,05-0,5 pl de partidores de SEQ ID No. 2 para una concentración final entre 0,1 -0,5 pM de cada uno; entre 0,01 -0,5 pl de un fluorocromo de referencia de ser necesario según el equipo a una concentración final de 0,1 -2X y entre 2-40 pL de H 2 O grado PCR (hasta completar el volumen apropiado según el equipo de PCR utilizado); b) la reacción PCR-HRM se realiza de acuerdo con el siguiente programa: a. Activación polimerasa: 1 -10 minutos a 70-100 °C. b. Reacción PCR: 10-60 segundos a 70-100°C, seguido de 10 a 60 segundos a 40-80°C. Lo anterior, por 20 a 45 ciclos. Se puede emplear una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50- 80°C por 10 a 60 segundos y una etapa de extensión final a una temperatura de 50-80°C durante 1 a 10 minutos c. Análisis de HRM: 1 -30 segundos a 70-100°C, luego 1 -30 segundos a 40-70°C, seguido de un aumento de temperatura de 0.01 -2°C por segundo hasta llegar a 95°C.

Etapa 3: Determinación del genotipo mediante HRM

Una vez obtenidas las curvas HRM, para determinar el genotipo, primero es necesario dterminar si la muestra analizada pertenece al género Mytilus. Para esto se debe seguir el árbol de toma de decisiones de acuerdo a la Figura 2. A continuación, se describe cada uno de los puntos del diagrama correspondiente a la Figura 2:

En primer lugar, para determinar si la muestra pertenece al género Mytilus, se debe analizar si los valores de Cq en los siguientes loci: L2, L3, L4, L5, L7 y L10 son menores al límite inferior del Intervalo de Confianza (IC) de la Tabla 4. Estos SNPs mostraron valores de Cq significativamente distintos en las especies blanco y en individuos de Aulacomya atra, SemiMytilus algosos, ChoroMytilus chorus y PeruMytilus purpuratus. Los valores promedio de Cq, así como la desviación estándar asociada y los intervalos de confianza (95%) para las especies que no pertenecen al género Mytilus se observan en la Tabla 9. Tabla 9. Valores de Cq promedio e intervalos de confianza (95%) para especies que no pertenecen al género Mytilus.

Des

L Pr viación Límite Límite ocus omedio estándar inferior IC superior IC

L 3 1 ,311 29,941 30,886

2 0,4141 4 3 8

L 2 1 ,918 28,725 29,579

3 9,1528 9 8 8

L 3 2,198 30,051 31 ,207

4 0,0629 1 6 5

L 3 1 ,778 29,908 30,952

5 0,4304 4 2 5

L 2 1 ,918 28,623 29,681

7 9,1528 9 9 7

L 3 1 ,505 30,221 31 ,256

10 0,7389 1 9 0

La muestra problema debe mostrar valores de Cq inferiores al límite inferior del IC de la Tabla 9. Las muestras con valores de Cq dentro del intervalo de confianza de la Tabla 9 deben considerarse como individuos que no pertenecen al género Mytilus.

Como referencia se muestran los valores de Cq, su desviación estándar, y límite superior e inferior del IC, de las cinco especies blanco (especies sobre las cuales el método aplica) para los siguientes SNPs: L2, L3, L4, L5, L7 y L10 (Tabla 10).

Tabla 10. Valores de Cq promedio e intervalos de confianza (95%) para especies del género Mytilus.

De Lím

Lo Pro sviación ¡te inferior Límite cus medio estándar IC superior IC

21 , 2,0 20, 21 ,53

L2 2308 722 9260 56

22, 1 ,9 22, 22,90

L3 6135 834 3217 52

22, 1 ,2 22, 23,10

L4 9172 782 7292 52

22, 1 ,9 22, 22,92

L5 6700 105 1566 04

22, 1 ,8 22, 22,77

L7 5050 570 2311 89

L1 22, 2,2 22, 22,73

0 3967 807 0603 31 Una vez que se determina que la muestra pertenece al género Mytilus, se realiza el genotipado de todos los toe/ del panel completo de SNP.

Otro punto para considerar, al realizar el ajuste de las curvas, es que se debe utilizar como referencia la curva con la señal más alta obtenida en el material de referencia (ver Figura 3). Se debe incluir en el rango seleccionado toda la curva, cuidando de que la base de ésta (es decir, donde empieza a subir la fluorescencia, y donde termina la señal) quede dentro de éste. Para cada locus el genotipo de la muestra problema corresponderá al genotipo del material de referencia suministrado cuya curva de “melting" sea más semejante.

Al evaluar las curvas obtenidas para asignar el genotipo en cada locus, es importante ocupar los programas correspondientes con capacidad de análisis de HRM, según el equipo utilizado. Por ejemplo, en el programa ECO-lllumina se debe ajustar la zona de análisis moviendo los ejes verticales para ubicarlos en la zona de temperatura de melting, y evaluar de acuerdo con la forma de la curva, si el genotipo corresponde a alguno de los controles utilizados (ver Figura 3). Si la muestra no amplifica o presenta amplificación inespecífica (valor de Cq > 29), no se asigna genotipo y se indica cómo “000000”.

En la Figura 4 (ítems 4A-4J) se muestra las curvas de “meltinc/’ como ejemplo de determinación del genotipo, de cada uno de los SNPs del panel de identificación de especie, obtenidas usando un equipo MIC cycler y su respectivo programa de análisis:

Por otra parte, para expresar los genotipos resultantes se debe usar la siguiente codificación por alelo: A=001 ; C=002; G=003; T=004. El polimorfismo de tamaño de L1 (P), se debe expresar como P=005. Cuando el individuo no amplifique o presente amplificación inespecífica para un SNP, el genotipo debe anotar como “000000”.

Los resultados se compilan en un archivo en formato Genepop poniéndole el nombre de “genotipos muestras problema”. Este archivo se construye en formato .txt, (se sugiere usar el programa bloc de notas).

Una vez obtenida la tabla de genotipos multi -locus, y en el caso de tener una muestra en donde no se obtuvo amplificación para uno o más loci, para descartar un problema técnico, se debe repetir el análisis PCR-HRM una vez. En caso de persistir la no amplificación, se debe seguir el árbol de decisión descrito en la Figura 5. Etapa 4: Identificación de la especie

En el programa GeneClass2 (Piry et al., 2004) se carga el archivo “genotipos de especies de referencia” (proporcionado) y el archivo “genotipos muestras problema” que contiene los genotipos multi-tocus de las muestras problema generado con anterioridad (Ver Figura 6A). Se deben utilizar los parámetros entregados por defecto por el programa GeneClass2 (Ensayo de asignación a línea base de referencia y Método Bayesiano de Rannala & Mountain), y apretar botón Start.

La salida del programa genera una tabla, en donde se debe observar lo siguiente:

• primera columna, que corresponde a la identificación de cada muestra problema,

• segunda columna, que corresponde a qué genotipo de referencia se asignó a cada genotipo muestra problema,

• tercera columna, que corresponde al % de asignación de cada genotipo muestra problema a cada genotipo de especies de referencia.

El resultado en GeneClass2 se interpretará como la identificación de especie, con no menos de un 95% de probabilidad de asignación al genotipo de especie de referencia (Ver Ejemplo de resultado, figura 6B).

EJEMPLO 3: Identificación de cinco especies del género Mytilus.

Se evaluaron los marcadores en 45 individuos de cada una las cinco especies (n=225) de interés (/W. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis, M. platensis y M. trossulus), recolectados tanto en país como en el extranjero. Estos individuos habían sido previamente analizados por dos laboratorios independientes con la misma metodología, obteniéndose el mismo resultado o analizados por un mismo laboratorio con metodologías diferentes, obteniéndose el mismo resultado. Los 225 individuos fueron correctamente identificados por la presente invención, utilizando los parámetros entregados por defecto por el programa GeneClass2 (Ensayo de reasignación y Método Bayesiano de Rannala & Mountain), el 100% de los individuos fueron asignados correctamente a especie. Las frecuencias alélicas para cada especie por locus, obtenidas del análisis de los 225 individuos antes descritos, se muestra en la Tabla 1 1. Tabla 11. Polimorfismo y frecuencias alélicas para los 10 SNPs del panel por especie

Especie p: Polimorfismo de tamaño presente en marcador PAPM.

No amplificación del marcador PAPM (L1) en M. trossulus.

(*): Determinados durante el desarrollo y validación del método multi-tocus (Quintrel et al, 2021 )

El mismo resultado exitoso de identificación de la especie se obtuvo reasignando 815 individuos que fueron genotipados en los 10 SNP del panel.

EJEMPLO 4: Identificación de híbridos de primera y segunda generación de especies del género Mytilus. Las distintas especies del género Mytilus pueden hibñdar cuando coexisten, generando zonas híbridas naturales. La hibridación también puede ocurrir por el ingreso de una especie invasora al ecosistema. Como ejemplo de lo anterior, en Chile ocurren ambas situaciones. En el Golfo de Arauco está presente la especie invasora M. galloprovincialis, y en la zona del Estrecho de Magallanes se ha descrito una zona híbrida natural entre M. chilensis y M. platensis. Por lo anterior, un método de identificación de especies dentro del género Mytilus debe tener la capacidad de identificar híbridos para responder a las distintas situaciones que se pueden dar entre las especies de este género.

Se evaluó el desempeño del método multi-tocus basado en el panel de 10 SNPs (L1 + 9 SNPs) en comparación con el marcador mono-locus PAPM, para identificar híbridos de primera (F1 ) y segunda (F2) generación con híbridos sintéticos y biológicos.

El desempeño del método multi-tocus basado en el panel de 10 SNPs: L1 + 9 SNPs (L2 a L10) para identificar híbridos, se evaluó probando dos formas de obtener la identificación: i) Realizando la clasificación a través de un árbol de decisión.

¡i) Asignando individuos a especie usando el método bayesiano de Rannala y Mountain implementado en el programa GeneClass2 (Piry et al., 2004).

Estas dos formas de obtener la identificación de la especie requieren de una línea base de referencia, que estuvo compuesta por individuos puros e híbridos sintéticos de primera generación (F1 ). Además, se simularon híbridos sintéticos de segunda generación (F2) para incluirlos, junto con los F1 , en la evaluación del desempeño de los métodos mencionados para identificar híbridos. El detalle de estas etapas se describe a continuación:

Línea base de referencia: Para ambas formas de obtener la identificación de la especie usando el panel de 10 SNPs, se requiere crear una línea base de referencia. Ésta estuvo compuesta por individuos puros e híbridos sintéticos F1 .

El criterio utilizado para seleccionar material de referencia se detalla a continuación:

A. Individuos puros: Se usaron un total de 225 individuos, entre los que había ejemplares de las 5 especies en igual cantidad (n = 45 por especie). Éstos, habían sido obtenidos desde localidades alejadas de las zonas híbridas descritas (Tabla 12) y cumplían al menos uno de los siguientes criterios para ser considerados como material de referencia (#): La inclusión de la muestra en un paper publicado.

Que la muestra haya sido analizada por dos laboratorios independientes con la misma metodología, obteniéndose el mismo resultado.

Que la muestra haya sido analizada por un mismo laboratorio con metodologías diferentes, obteniéndose el mismo resultado.

(#) (Comunicación personal Dr. Med. Vet. Rainer Schubbert - Eurofins Genomics Ebersberg, Alemania)

Tabla 12. Número de individuos puros que componen la línea base de referencia

Especie N ² de individuos

M.chilensis (Mch) 45

M.edulis (Me) 45

M. galloprovincialis (Mg) 45

M. trossulus (Mt) 45

M. platensis (Mp) 45

Total 225

Estos individuos fueron genotipados con el panel de 10 SNPs en el laboratorio.

B Híbridos sintéticos: Debido a la imposibilidad de tener muestras biológicas de todos los híbridos posibles que el método debería identificar, se simularon híbridos sintéticos de primera (F1) y segunda (F2) generación, a través de “cruzas in-silico" entre especies.

Híbridos de primera generación F1 : Se simularon para las siguientes 6 cruzas:

• M. chilensis x M. galloprovincialis (Mch x Mg)

• M. chilensis x M. platensis (Mch x Mp)

• M. edulis x M. galloprovincialis (Me x Mg)

• M. edulis x M. trossulus (Me x Mt)

• M. galloprovincialis x M. platensis (Mg x Mp)

• M. galloprovincialis x M.trossulus (Mg x Mt)

Considerando que las especies M. trossulus y M. edulis han sido descritas exclusivamente en el hemisferio norte, en tanto las especies M. chilensis y M. platensis solo en el hemisferio sur, se excluyeron las cruzas que por geografía no ocurren (Mch x Me, Mch x Mt, Mp x Me y Mp x Mt).

Para la simulación de los híbridos sintéticos de las cruzas mencionadas, se comenzó estableciendo todos los gametos posibles para cada especie considerando el polimorfismo y las frecuencias alélicas en cada uno de los diez loci por especie (Tabla 1 1 ). A partir de los gametos generados por especie, se realizaron las cruzas (F1 ), obteniendo en cada una, todas las combinaciones de genotipos posibles considerando los 10 toe/ del panel. Estos genotipos de híbridos sintéticos se incluyeron en la línea base de referencia.

Híbridos de segunda generación F2: Se simularon para las siguientes 12 cruzas:

• F1 (/W. chilensis x M. platensis) x M. chilensis

• F1 (M. chilensis x M. platensis) x M. platensis

• F1 (/W. chilensis x M. galloprovincialis) x M. chilensis

- F1 (/W. chilensis x M. galloprovincialis) x M. galloprovincialis

• F1 (/W. edulis x M. galloprovincialis) x M. edulis

• F1 (/W. edulis x M. galloprovincialis) x M. galloprovincialis

• F1 (/W. edulis x M. trossulus) x M. edulis

• F1 (/W. edulis x M. trossulus) x M. trossulus

• F1 (M. galloprovincialis x M. platensis) x M. galloprovincialis

• F1 (M. galloprovincialis x M. platensis) x M. platensis

• F1 (/W. galloprovincialis x M. trossulus) x M. galloprovincialis

• F1 (/W. galloprovincialis x M. trossulus) x M. trossulus

Se realizó la identificación de especies a través del método mono -tocos PAPM (L1 ). A los individuos generados in-silico, se les asignó la especie en función del genotipo obtenido en el locus PAPM. Este marcador, aparte del SNP que permite distinguir entre M. chilensis y M. galloprovincialis, presenta un polimorfismo de tamaño (p) que diferencia las dos especies anteriores de M. edulis y M. platensis, sin embargo, no puede distinguir entre estas dos últimas (Ver Figura 4A). Para el análisis de datos, este polimorfismo de tamaño fue usado como un nuevo alelo. Adicionalmente, PAPM tampoco puede identificar M. trossulus. Un individuo se identificó como híbrido cuando su genotipo fue heterocigoto en este marcador (G/T).

Para asignar individuos mediante el método multi-tocus, se utilizaron las siguientes alternativas: i) Árbol de decisión (AD): se creó un árbol de decisión, usando la línea base de referencia descrita previamente y la función “ctree” (Simulación de MonteCarlo, con 1000k de iteraciones) implementada en el paquete para R party v1 .3.

¡i) Método bayesiano de Rannala y Mountain en programa GeneClass2: se usó el método bayesiano de Rannala y Mountain (1997) implementado en el programa GeneClass2 (Piry et al., 2004). Se utilizó la línea base de referencia descrita previamente. Se asignó a especie aquellos individuos con valores de probabilidad igual o superior al 95%. Cuando el valor de probabilidad fue inferior a 95%, se asignó como híbrido entre las dos especies que presentan los mayores niveles de probabilidad de membresía.

Finalmente, para comparar el desempeño entre el marcador PAPM y el método multi - locus basado en el panel de 10 SNPs con las dos metodologías (i y ¡i), se identificó la especie de los híbridos sintéticos de primera (F1 ) y de segunda (F2) generación.

La línea base de referencia estuvo formada por los individuos puros (n=225) descritos en la Tabla 12 y por los híbridos sintéticos de primera generación (F1 ) (n=204) (Tabla 13), totalizando 429 genotipos multi-tocus.

Cabe de señalar que la línea base de referencia corresponde a los genotipos de individuos analizados previamente y se conoce pertenecen a una determinada especie. Y se diferencia del "material de referencia", en que la línea base se refiere a los genotipos, mientras el material corresponde al individuo (y este puede ser solo uno por especie).

Híbridos de primera generación (F1 ): El número de genotipos únicos posibles para los 10 toe/ del panel, variaron entre 64 para las cruzas Mch x Mp y Me x Mt y 16 para las cruzas Mch x Mg y Mg x Mt (Tabla 3).

Tabla 13. Número de genotipos únicos generados de híbridos Fi por cruza

Cruza N° Genotipos únicos

Mch x Mg 16

Mch x Mp 64

Me x Mg 24

Me x Mt 64

Mg x Mp 20

Mg x Mt 16

Total 204 Híbridos de segunda generación (F ₂ ): El número total de genotipos únicos posibles para los 10 toe/ del panel, fueron de 17040 (Tabla 14).

Tabla 14. Número de genotipos únicos generados de híbridos F ₂ por cruza

Cruza N° Genotipos únicos

F ₂ : FI (/W. chilensis x M. galloprovincialis) x M. chilensis 2048

F ₂ : FI (/W. chilensis x M. galloprovincialis) x M. galloprovincialis 128

F ₂ : FI (/W. chilensis x M. platensis) x M. chilensis 512

F ₂ : FI (/W. chilensis x M. platensis) x M. platensis 128

F ₂ : FI (/W. edulis x M. galloprovincialis) x M. edulis 64

F ₂ : FI (/W. edulis x M. galloprovincialis) x M. galloprovincialis 16

F ₂ : FI (M. edulis x M. trossulus) x M. edulis 1024

F ₂ : FI (M. edulis x M. trossulus) x M. trossulus 4096

F ₂ : FI (/W. galloprovincialis x M. platensis) x M. galloprovincialis 64

F ₂ : FI (/W. galloprovincialis x M. platensis) x M. platensis 256

F ₂ : FI (/W. galloprovincialis x M. trossulus) x M. galloprovincialis 512

F ₂ : FI (/W. galloprovincialis x M. trossulus) x M. trossulus 8192

Total 17040 i) Árbol de decisión: El árbol de decisión creado por el programa utiliza solo tres marcadores: L1 , L3 y L5 para clasificar los individuos de la línea base de referencia en 1 1 grupos: las 5 especies puras y las 6 cruzas Fi posibles entre ellas (Figura 3).

Al comparar el desempeño, expresado en % de individuos correctamente identificados (Tabla 15), se aprecia que el marcador PAPM tiene un promedio de 16,7% de individuos correctamente identificados, tanto para híbridos Fi como F ₂ , mostrando el menor desempeño. El método multi-tocus, tanto con el árbol de decisión como con el método bayesiano de GeneClass2, muestra un 100% de individuos híbridos Fi correctamente asignados. El desempeño de estos métodos baja en los híbridos F ₂ a 47.9 y 75% respectivamente.

Cabe de señalar que el término “desempeño" se entiende como el % de individuos correctamente identificados de acuerdo a los otros métodos.

Tabla 15: Desempeño de los métodos de Identificación de especies identificando híbridos Fi y F ₂ . Híbridos Fi y F ₂ correctamente identificados por método [%]

Cruza Árbol de decisión GeneClass L1 a

^PAPM L1 , L3 y L5 L10

Fi Mch x Mg 100 100 100

Fi Mch x Mp 0 100 100

Fi: Me x Mg 0 100 100

Fi: Me x Mt 0 100 100

Fi: Mg x Mp 0 100 100

Fi: Mg x Mt 0 100 100

Promedio Fi 16.7 100 100

F ₂ Mch x Fi (Mch x Mg) 50 50 70,5

F ₂ Mg x Fi (Mch x Mg) 50 50 82,8

F ₂ Mch x Fi (Mch x Mp) 0 50 58,4

F ₂ Mp x Fi (Mch x Mp) 0 50 76,6

F ₂ Me x Fi (Me x Mg) 50 50 59,4

F ₂ Mg x Fi (Me x Mg) 50 50 100,0

F ₂ Me x Fi (Me x Mt) 0 25 85,9

F ₂ Mt x Fi (Me x Mt) 0 100 50,0

F ₂ Mg x Fi (Mg x Mp) 0 25 56,3

F ₂ Mp x Fi (Mg x Mp) 0 50 73,4

F ₂ Mg x Fi (Mg x Mt) 0 25 75,0

F ₂ Mt x Fi (Mg x Mt) 0 50 76,6

Promedio F ₂ 16,7 47,9 75,0

Promedio Global „ _c -, _ec _

, _{P v} 16,7 65,3 91,7

( Y rz) _ _ _

Mch: M. chilensis. Me: M. edulis. Mg: M. galloprovincialis. Mt: M. trossulus. Mp: M. platensis.

Independiente de la forma para identificar la especie, el método multi-tocus, tiene un mejor desempeño que el marcador PAPM asignando híbridos por sí solo. Las limitaciones de usar solo el marcador PAPM (L1) para la identificación de especímenes del género Mytilus radican en su incapacidad para identificar M. trossulus y a que, además, confunde M. platensis con M. edulis.

4.2 Determinación de híbridos biológicos

Para comparar el desempeño entre el marcador PAPM y el método multi -locus basado en el panel de 10 SNPs, se usaron 6 individuos que resultaron ser híbridos entre M. chilensis x M. platensis con un panel de 54 SNPs genotipados usando el método Sequenom ¡PLEXO Assay (Zbawicka et al., 2018) y 15 individuos que resultaron ser híbridos entre M. chilensis x M. galloprovincialis con un panel de 89 SNPs genotipados por GT-Seq (Tabla 16).

La identificación de la especie se realizó usando el método bayesiano de Rannala y Mountain en programa GeneClass2. Para el caso de híbridos M. chilensis x M. platensis, la línea base de referencia utilizada contenía 46 individuos, de los que 29 eran M. chilensis (PICL) y 17 M. platensis (BACL) y que cumplen con al menos uno de los criterios para ser considerados como material de referencia (#) (Comunicación personal Dr. Med. Vet. Rainer Schubbert - Eurofins Genomics Ebersberg, Alemania) mencionados previamente.

Tabla 16: Número de híbridos biológicos

M. chilensis x M. platensis

Localidades N ^e híbridos determinados con

Panel de 54 SNPs

FKGB (Islas Malvinas - Reino Unido) 1

BLCL (Bahía Laredo, Magallanes - Chile) 1

BICL (Bahía Inútil, Magallanes - Chile) 2

CMCL (Caleta María, Magallanes - Chile) 2

Total 6

M. chilensis x M. galloprovincialis N ^e híbridos determinados con

Panel de 89 SNPs

ILCL (llque, Reloncaví - Chile) 15

Total 15 En el caso de los híbridos M. chilensis x M. platensis, el método multi-tocus basado en el panel de 10 SNPs (L1 + 9 SNPs) es capaz de identificar correctamente el 67% de los híbridos, en tanto el marcador mono-locus PAPM no fue capaz de identificar ningún híbrido 0% (Tabla 17). En el caso de los híbridos M. chilensis x M. galloprovincialis el panel de 10 SNPs identificó correctamente el 60% de los híbridos.

Tabla 17: Asignación en híbridos biológicos usando el panel de 10 SNPs.

M. chilensis x M. Panel de 54 Método mono-locus PAPM Método multi-tocus 10 platensis SNPs (L1 - Patente previa) (*) SNPs (L1 + 9 SNPs)

Localidades N ^e híbridos Mch Mp Híbrido Mch Mp Híbrido

FKGB 1 1 0 0 0 0 1

BLCL 1 1 0 0 1 0 0

BICL 2 2 0 0 0 0 2

CMCL 2 2 0 0 1 0 1

Total 6

M. chilensis x M. Panel de 89 galloprovincialis SNPs

Localidad N ^e híbridos Mch Mg Híbrido NI Mch Mg Híbrido NI

ILCL 15 0 0 13 2 4 2 9 0

(*): Un individuo se consideró híbrido cuando su genotipo fue heterocigoto en este marcador, conteniendo un alelo característico de M. chilensis y otro de M. galloprovincialis o M. edulis.

El marcador mono-locus PAPM permite distinguir entre M. chilensis y M. galloprovincialis por el SNP descrito ( Jilberto et al., 2017), y además presenta un polimorfismo de tamaño que diferencia las dos especies anteriores de M. edulisy M. platensis, sin embargo, no puede distinguir entre estas dos últimas. NI: no identificado (no se obtuvo genotipo legible en el análisis de HRM-PAPM).

Conclusiones identificación de híbridos de primer y segunda generación

El método multi -locus basado en el panel de 10 SNPs (PAPM + 9SNPs) tiene un mejor desempeño identificando híbridos de primera y segunda generación, que el marcador PAPM por sí solo. Además, el método multi -locus basado en el panel de 10 SNPs permite identificar híbridos entre más especies que el marcador mono -locus PAPM. Por otra parte, el método multi-tocus basado en el panel de 10 SNPs permite identificar híbridos M. chilensis x M. platensis, que el marcador mono -locus PAPM no es capaz de identificar. Es importante señalalar que para asignar individuos a una especie con la aproximación multi-tocus (10 SNPs) se recomienda usar el método bayesiano de Rannala y Mountain (1997) implementado en el programa GeneClass2 (Piry et al., 2004). Finalmente, es preciso destacar que la aproximación multi-tocus para identificar especies es recomendada ya que permite identificar la especie aun cuando falle el genotipado de alguno de los SNPs del panel. LITERATURA

Jilberto, F., Araneda, C., & Larraín, M. A. (2017). High resolution melting analysis for identification of commercially-important Mytilus species. Food Chemistry, 229, 716- 720. https://doi.Org/10.1016/j.foodchem.2017.02.109 Piry, S., Alapetite, A., Cornuet, J. M., Paetkau, D., Baudouin, L., & Estoup, A. (2004).

GENECLASS2: A software for genetic assignment and first-generation migrant detection. Journal of Heredity, 95(6), 536-539. https://doi.org/10.1093/jhered/esh074

Piry, S., Alapetite, A., Cornuet, J. M., Paetkau, D., Baudouin, L., & Estoup, A. (2004). GENECLASS2: A software for genetic assignment and first-generation migrant detection. Journal of Heredity, 95(6), 536-539. https://doi.Org/10.1093/jhered/esh074