TECHNISCHES GEBIET

[001] Bereitgestellt wird ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls. Bereitgestellt wird auch die Verwendung eines Hydrogels zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls.

HINTERGRUND

[002] Bei der Analyse der Genomstruktur und der physikalischen Validierung von

Sequenzanordnungen sowie in diagnostischen Untersuchungen sind optisches Mapping und Faser- Fluoreszenz in situ Hybridisierung (fiber-FISH) gängige Verfahren. Diese Untersuchungen erlauben es, in großem Maßstab Informationen zu gewinnen, die Sequenzierungsergebnisse ergänzen. Des Weiteren können beim Sequenzieren nur kleine Segmente in einem Stück analysiert werden, die anschließend zu längeren Sequenzen zusammengesetzt werden müssen. Demgegenüber werden mit dem DNA-Mapping eine veränderte Anordnung von DNA- Abschnitten und die Anzahl an Kopien einer Sequenz direkt ersichtlich.

[003] Praktisch alle diese Techniken basieren auf der Immobilisierung und Linearisierung von DNA auf einer Oberfläche. Dabei müssen die DNA-Moleküle von ihrer entropiebegünstigten gewundenen Form in eine auseinandergezogene lineare Form überführt werden. Zu diesem Zweck wurden zahlreiche Verfahren entwickelt wie z.B. unter Einsatz von Nanokanälen, Fluidkraft oder elektrophoretischer Kraft in einer mikrofluidischen Vorrichtung, Fließen auf einer

mikrostrukturierten oder positiv geladenen Oberfläche oder DNA-Combing. Bei dieser Technik wird ein DNA-Molekül auf einer modifizierten, festen Glas- oder Polymeroberflächen gestreckt. Die Oberfläche ist mit positiv geladenen Silanen modifiziert, so dass Ankerstellen für die negativ geladene DNA vorhanden sind. Durch das Zusammenspiel einer erzwungenen Fluidströmung und der ionischen Bindung der DNA an die Oberfläche wird diese linearisiert und gestreckt.

[004] Bei allen Verfahren zum Strecken von DNA sind das Streckungsverhältnis und die

Gleichmäßigkeit der Streckung wesentlich für eine qualitativ hochwertige Einzelmolekülanalyse, insbesondere für Hochdurchsatz- oder Vergleichsuntersuchungen. Das DNA-Combing gilt bislang als eines der vielseitigsten, einfachsten, kostengünstigsten und effektivsten Verfahren zum Strecken und Immobilisieren von DNA-Molekülen.

ZUSAMMENFASSUNG

[005] Es werden ein Verfahren und eine Verwendung bereitgestellt, die ein schnelles,

kostengünstiges und zuverlässiges Strecken von Nukleinsäuremolekülen wie DNA, beispielsweise für DNA-Mapping und epigenetische Analysen ermöglicht. Ein hier bereitgestelltes Verfahren und eine hier bereitgestellte Verwendung erlauben typischerweise eine Streckung eines Nukleinsäure moleküls von mehr als etwa 50 KBp. Dies ist üblicherweise die Größengrenze beim DNA-Combing. In einem hier beschriebenen Verfahren und einer hier beschriebenen Verwendung wird ein Hydrogel eingesetzt, auf dessen Oberfläche eine Lösung angeordnet ist, die das zu streckende Nukleinsäure molekül enthält. Üblicherweise definiert die Lösung einen Tropfen. Die Erfinder haben festgestellt, dass bei einem hier bereitgestellten Verfahren und einer hier bereitgestellten Verwendung

vorteilhafterweise eine Fixierung des gestreckten Nukleinsäuremoleküls mittels des eingesetzten Hydrogels erfolgt. Werden mehrere Nukleinsäuremoleküle gestreckt, so liegen die einem hier bereitgestellten Verfahren und einer hier bereitgestellten Verwendung unterzogenen

Nukleinsäuremoleküle in der Regel homogen gestreckt vor.

[006] Vorteilhaft in Bezug auf die Streckung ist der Einsatz eines stimuliresponsiven Hydrogels, auch stimulus-responsives Hydrogel genannt, das unter der Einwirkung eines externen Stimulus bzw. Reizes in der Lage ist, seinen Quellgrad und/oder sein Volumen zu ändern und damit eine Quellung bzw. ein Kollabieren zu durchlaufen. Das stimuliresponsive Hydrogel ist in einigen

Ausführungsformen ein thermoresponsives Hydrogel.

[007] In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung wird

typischerweise keine elektrische Kraft eingesetzt, um ein Nukleinsäuremolekül zu strecken. Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung wird typischerweise so durchgeführt, dass die einzige Flüssigkeit, mit der das eingesetzte Hydrogel in Kontakt steht, eine das

Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung ist. Das eingesetzte Hydrogel steht anders ausgedrückt nicht in Kontakt zu einer sonstigen Flüssigkeit wie Wasser oder einer wässrigen Lösung.

[008] Gemäß einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Auf der Oberfläche des Hydrogels befindet sich eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA-Molekül sein. Zum Verfahren zählt es, das Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die Nukleinsäuremolekül-Lösung befindet, einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C oder einer Temperatur, die oberhalb der Raumtemperatur hegt, auszusetzen. Die gewählte Temperatur kann auch zwischen Raumtemperatur und 95 °C liegen.

[009] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, eine das Nukleinsäuremolekül enthal tende wässrige Lösung auf die Oberfläche des Hydrogels aufbringen. Das Hydrogel wird dann einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C, inklusive zwischen Raumtemperatur und 95 °C ausgesetzt.

[010] Das im Verfahren eingesetzte Hydrogel enthält Wasser, das in der Regel eine zumindest gewisse Quellung des Hydrogels bewirkt. Dieses Wasser lässt sich durch Verdunstung und/oder Verdampfung dem Hydrogel entziehen. Eine solche Verdunstung bzw. Verdampfung wird ausgelöst, indem das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C, inklusive zwischen

Raumtemperatur und 95°C, ausgesetzt wird. Der zu Grunde hegende Vorgang kann auch als eine Trocknung des Hydrogels aufgefasst werden.

[011] Im hier offenbarten Verfahren wird das Hydrogel für einen Zeitraum einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C ausgesetzt, der lange genug eine Verdunstung bzw. Verdampfung erlaubt, dass eine Streckung des Nukleinsäuremoleküls detektierbar ist. Der zu wählende Zeitraum hängt dabei unter anderem von der gewählten Temperatur, den Dimensionen des Hydrogels und der Menge an eingesetzter Nukleinsäurelösung ab.

[012] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die wässrige Lösung befindet, die das Nukleinsäuremolekül enthält, einer Temperatur von etwa 30 bis 90 °C auszusetzen. In einigen Ausführungsformen hegt die Temperatur, der das Hydrogel ausgesetzt wird, im Bereich von etwa 35 bis 80 °C, beispielsweise im Bereich von etwa 40 bis 70 °C.

[013] Ein hier verwendetes Hydrogel hat in einigen Ausführungsformen Poren.

[014] In einigen Ausführungsformen enthält das Hydrogel ein Polymer, das Polyvinylmethylether ist. In einigen Ausführungsformen enthält das Hydrogel ein Polymer, das Poly(ethylenglycol) (PEG) ist.

[015] In einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt ist das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel. Ein stimuliresponsives Hydrogel hat einen Quellgrad und/oder ein Volumen, der bzw. das durch einen Reiz veränderbar, also z.B. verringerbar ist.

[016] In Ausführungsformen des Verfahrens, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, kann es zum Verfahren zählen, das stimuliresponsive Hydrogel einem Reiz auszusetzen, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst. In einigen Ausführungs formen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel verwendet wird, zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel gleichzeitig dem besagten Reiz und einer Temperatur von

Raumtemperatur bis 95 °C auszusetzen.

[017] In einigen Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel verwendet wird, zählt es zum Verfahren, während das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin dem besagten Reiz, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst, ausgesetzt wird, das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C, inklusive zwischen Raumtemperatur und 95 °C, auszusetzen.

[018] Wie bereits erwähnt, ist in einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel. Zum Verfahren kann es in solchen

Ausführungsformen zählen, eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufzubringen. Das stimuliresponsive Hydrogel ist in der Lage, seinen Quellgrad und/oder sein Volumen als Reaktion auf einen Reiz zu ändern. Ein entsprechender Reiz kann beispielsweise die Ionenstärke oder die Temperatur sein. Auch Licht oder der pH-Wert können ein solcher Reiz sein. Zum Verfahren zählt es weiterhin, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, einem Reiz aussetzen, der ein Verringern des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst. Zum Verfahren kann es auch zählen, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, dem besagten Stimulus weiterhin auszusetzen und das stimuliresponsive Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C zu trocknen. [019] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül zu detektieren. Dabei kann der Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls erfasst werden. In einigen Ausführungsformen kann die Streckung des Nukleinsäuremoleküls überwacht werden. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C so lange getrocknet werden, bis ein ausreichender Streckungsgrad detektiert wird. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise durch eine Farbmarkierung, wie eine

Fluoreszenzmarkierung detektiert werden.

[020] Wird als Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt, so kann in entsprechenden Ausführungsformen das Hydrogel dem Stimulus so lange ausgesetzt werden und das stimuli- responsive Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C so lange getrocknet werden, bis eine ausreichende Streckung detektiert wird.

[021] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Hydrogel, das dem Stimulus weiterhin ausgesetzt wird, so lange durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C zu trocknen, bis die aufgebrachte Fösung makroskopisch zumindest im Wesentlichen nicht mehr auf der Oberfläche des Hydrogels erkennbar ist. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel weiterhin durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C getrocknet werden. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C so lange getrocknet werden, bis keine

nennenswerte Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr feststellbar ist. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C so lange getrocknet werden, bis keine Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr detektierbar ist.

[022] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Fösung auf der Oberfläche des Hydrogels, z.B. des stimuliresponsiven Hydrogels, keinerlei Fluss unterzogen. Beispielsweise werden typischerweise in einem Hydrogel keine Kanäle oder ähnlichen mikrofluiden Elemente vorgesehen. In einigen Ausführungsformen kann ein Hydrogel mit einer ebenen Oberfläche eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen kann ein Hydrogel mit einer unebenen, z.B. welligen oder rauen, Oberfläche eingesetzt werden.

[023] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, die sich auf der Oberfläche des Hydrogels befindende, das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Fösung in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels zu belassen. In einigen Ausführungs formen zählt es zum Verfahren, während das Hydrogel einer Temperatur im Bereich von Raumtempe ratur bis 95 °C ausgesetzt wird, die das Nukleinsäuremolekül enthaltende Fösung in im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels zu belassen. In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, während das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C ausgesetzt wird, die das Nukleinsäuremolekül enthaltende Fösung in statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels zu belassen. In einigen Ausführungsformen wird die auf der Oberfläche des Hydrogels befindliche, das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Fösung in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen, bis makroskopisch zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des Hydrogels sichtbar ist.

[024] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen. In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen, bis bei in Augenscheinnahme, also makroskopisch, zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des Hydrogels sichtbar ist. In einigen

Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen, bis makroskopisch zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des Hydrogels sichtbar ist.

[025] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül in einem Tropfen einer wässrigen Lösung auf die Oberfläche des Hydrogels, beispielsweise des

stimuliresponsiven Hydrogels, aufzubringen.

[026] Das Hydrogel, auf dem sich die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, kann jede beliebige Oberflächenstruktur haben. Das Hydrogel hat in einigen

Ausführungsformen eine zumindest im Wesentlichen planare Oberfläche. In einigen

Ausführungsformen hat das Hydrogel eine vollständig planare Oberfläche.

[027] In einigen Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel verwendet wird, definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in kollabierter Form nach Aussetzen gegenüber dem Reiz eine planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in gequollener Form, z.B. Gelform, vor Aussetzen gegenüber dem Reiz eine planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in geschrumpfter Form eine im Wesentlichen planare Oberfläche. In einigen

Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in gequollener Form eine im Wesentlichen planare Oberfläche.

[028] In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat angeordnet, z.B. auf einem Glassubstrat. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat fixiert. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat durch kovalente Bindung fixiert.

[029] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein Hydrogel, z.B. ein

stimuliresponsives Hydrogel herzustellen, bevor auf dessen Oberfläche eine wässrige Lösung aufgebracht wird, die das Nukleinsäuremolekül enthält. Es kann hierzu jedes bekannte Verfahren eingesetzt werden, um ein entsprechendes Hydrogel zu erhalten.

[030] In einigen Ausführungsformen enthält ein eingesetztes stimuliresponsives Hydrogel ein stimuliresponsives Polymer, also ein Polymer, das in der Lage ist, seinen Quellgrad und/oder sein Volumen als Reaktion auf einen Reiz zu ändern. In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive Hydrogel aus einem stimuliresponsiven Polymer. In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive Hydrogel im Wesentlichen aus einem stimuliresponsiven Polymer.

[031] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein stimuliresponsives Hydrogel auf einem Substrat herzustellen. Das Substrat kann dabei funktionelle Gruppen enthalten, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden werden kann. In einigen Ausführungsformen enthält ein derartiges Substrat funktionelle Gruppen, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden wird. Ein solches entstehendes Polymer kann ein Polymer sein, das im hier eingesetzten Hydrogel enthalten ist. Ein solches entstehendes Polymer kann in einigen Ausführungsformen ein

stimuliresponsives Polymer sein, das in einem stimuliresponsiven Hydrogel enthalten ist oder das das entsprechende stimuliresponsive Hydrogel definiert.

[032] Wie bereits vorangehend angegeben, kann das stimuliresponsive Hydrogel ein

thermoresponsives Hydrogel sein. In einigen Ausführungsformen, in denen das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, hat das Hydrogel eine VPTT (Volumen-Phasenübergangs- Temperatur) im Bereich von 20 bis 95 °C.

[033] In einigen Ausführungsformen, in denen das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die das

Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, einer Temperatur auszusetzen, die bei der VPTT des Hydrogels oder darüber hegt. In einigen Ausführungsformen, in denen das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, für eine Dauer von 10 Minuten bis 5 Stunden bei einer Temperatur bei oder oberhalb der VPTT des

Hydrogels zu halten.

[034] In typischen Ausführungsformen wird das Verfahren ohne Zufuhr einer externen Flüssigkeit, insbesondere ohne Zufuhr einer wässrigen Lösung oder von Wasser durchgeführt. In typischen Ausführungsformen wird das Hydrogel während des Verfahrens zumindest im Wesentlichen mit keinem Protein, beispielsweise mit keinem Enzym in Kontakt gebracht. In typischen Ausführungs formen wird das Hydrogel während des Verfahrens mit keinem Protein in Kontakt gebracht.

[035] Ausführungsformen des folgenden zweiten Aspekts können auch Ausführungsformen des ersten Aspekts darstellen.

[036] Gemäß einem zweiten Aspekt wird ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA-Molekül sein. Zum Verfahren zählt es, eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufzubringen. Das Hydrogel hat eine Volumen-Phasenübergangs- Temperatur (engl volume phase transition temperature, VPTT), die im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 95 °C, inklusive einem Bereich von etwa 20 bis 80 °C hegt. Dabei hat das Hydrogel in der Regel unter dem gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, eine VPTT, die im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 95 °C hegt. In einigen Ausführungsformen liegt die VPTT im Bereich von etwa 20 bis 80 °C. Zum Verfahren zählt es weiterhin, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, einer Temperatur aussetzen, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt.

[037] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren des Weiteren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, solange bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des

stimuliresponsiven Hydrogels erkennbar ist.

[038] Die gewählte Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, kann während des Verfahrens konstant gehalten werden. Die Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, kann während des Verfahrens auch variieren. Die Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels, der dieses zunächst ausgesetzt wird, kann unabhängig von der Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gewählt werden, bei der dieses gehalten wird, bis zumindest im Wesentlichen keine aufgebrachte Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels nachweisbar ist.

[039] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels keinerlei Fluss unterzogen.

Beispielsweise werden in einigen Ausführungsformen in einem Hydrogel keine Kanäle oder ähnlichen mikrofluiden Elemente vorgesehen. In einigen Ausführungsformen wird ein Hydrogel mit einer planaren Oberfläche eingesetzt.

[040] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels belassen, bis zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels nachweisbar ist.

[041] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül in einem Tropfen einer wässrigen Lösung auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels aufzubringen.

[042] In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest unterhalb der VPTT eine planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest unterhalb der VPTT eine im Wesentlichen planare Oberfläche.

[043] In einigen Ausführungsformen ist das stimuliresponsive Hydrogel auf einem festen Substrat angeordnet, z.B. auf einem Glassubstrat. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat fixiert. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat durch kovalente Bindung fixiert.

[044] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein stimuliresponsives Hydrogel herzustellen, bevor auf dessen Oberfläche eine wässrige Lösung aufgebracht wird, die das

Nukleinsäuremolekül enthält. Es kann hierzu jedes bekannte Verfahren eingesetzt werden, um ein stimuliresponsives Hydrogel zu erhalten.

[045] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein stimuliresponsives Hydrogel auf einem Substrat herzustellen. Das Substrat kann dabei funktionelle Gruppen enthalten, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden werden kann. In einigen Ausführungsformen enthält ein derartiges Substrat funktionelle Gruppen, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden wird.

[046] In einigen Ausführungsformen zählt es weiterhin zum Verfahren, nachdem die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des

stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, das stimuliresponsive Hydrogel trocknen zu lassen.

[047] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, aufgebracht worden ist, einer Temperatur von etwa 30 bis 90 °C auszusetzen. In einigen Ausführungsformen hegt die Temperatur, der das stimuliresponsive Hydrogel ausgesetzt wird, im Bereich von etwa 35 bis 80 °C,

beispielsweise im Bereich von etwa 40 bis 70 °C.

[048] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, aufgebracht worden ist, für eine Dauer von etwa 10 Minuten bis etwa 5 Stunden bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten.

[049] In einigen Ausführungsformen enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein LCST-Polymer, also ein Polymer mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur (engl lower critical solution temperature, abgekürzt LCST). In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive

Hydrogel aus einem LCST-Polymer. In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive Hydrogel im Wesentlichen aus einem LCST-Polymer.

[050] In einigen Ausführungsformen ist das LCST-Polymer ein Homopolymer oder ein Copolymer.

[051] In einigen Ausführungsformen, in denen das stimuliresponsive Hydrogel ein LCST-Polymer enthält, hat das LCST-Polymer bei dem gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, in Wasser eine LCST im Bereich von etwa 20 bis 100 °C. In einigen Ausführungsformen hat das LCST- Polymer bei dem gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, in Wasser eine LCST im Bereich von etwa 30 bis 90 °C.

[052] In einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das Poly(N-isopropylacrylamid (PNIPAAm) oder

Poly(N,N-diethylacrylamid) (PDEAAm) ist. In einigen Ausführungsformen enthält das

stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das Poly(N-isopropylmethylmethacrylamid) (PNIPMAAm) oder Poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylat] (pDMAEMA) ist. In einigen Ausführungsformen enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das Hydroxypropylcellulose oder Poly(N- vinly caprolactam) (PVCL) ist. In einigen Ausführungsformen enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das ein PEG-Methacrylat (PEGMA) ist. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das eine Kombination von zwei oder mehreren von Poly(N-isopropylacrylamid (PNIPAAm), Poly(N,N-diethylacrylamid) (PDEAAm), Poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylat] (pDMAEMA), Hydroxypropylcellulose, Poly(N-vinlycaprolactam) (PVCL), Polyvinylmethylether, Poly(ethylenglycol) (PEG) und/oder einem PEG-Methacrylat (PEGMA) ist. [053] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein markiertes Nukleinsäuremolekül auf das stimuliresponsive Hydrogel aufzubringen. Das markierte Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Dabei kann es sich beispielsweise um eine kovalente Markierung oder um eine Modifikation des Nukleinsäurerückgrats handeln. Es kann auch ein Interkalationsfarbstoff eingesetzt werden.

[054] In typischen Ausführungsformen wird das Verfahren ohne Zufuhr einer externen Flüssigkeit, insbesondere ohne Zufuhr einer wässrigen Lösung oder von Wasser durchgeführt. In typischen Ausführungsformen wird das Hydrogel während des Verfahrens zumindest im Wesentlichen mit keinem Protein, beispielsweise mit keinem Enzym in Kontakt gebracht. In typischen Ausführungs formen wird das Hydrogel während des Verfahrens mit keinem Protein in Kontakt gebracht.

[055] Gemäß einem dritten Aspekt wird die Verwendung eines Hydrogels zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA- Molekül sein. Das Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich eine Lösung des Nukleinsäuremoleküls befindet, wird einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis 95 °C ausgesetzt.

[056] In einigen Ausführungsformen der Verwendung gemäß dem dritten Aspekt wird das

Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die wässrige Lösung befindet, die das Nukleinsäuremolekül enthält, einer Temperatur von etwa 30 bis 90 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen liegt die Temperatur, der das Hydrogel ausgesetzt wird, im Bereich von etwa 35 bis 80 °C, beispielsweise im Bereich von etwa 40 bis 70 °C.

[057] In einigen Ausführungsformen der Verwendung des dritten Aspekts ist das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel. In derartigen Ausführungsformen ist typischerweise durch Aussetzen gegenüber einem Reiz eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslösbar. Der Quellgrad und/oder das Volumen des stimuliresponsiven Hydrogels ist also durch einen Reiz verringerbar. Typischerweise ist weiterhing eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 100 °C möglich.

[058] In Ausführungsformen der Verwendung, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, wird das Hydrogel einem Reiz ausgesetzt, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst. In einigen Ausführungsformen wird eine wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufgebracht. Das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, wird diesem Reiz ausgesetzt und bei einer Temperatur zwischen

Raumtemperatur und 95 °C getrocknet.

[059] Für Ausführungsformen der Verwendung nach dem dritten Aspekt wird auf das Verfahren nach dem ersten Aspekt und nach dem zweiten Aspekt verwiesen. So wird in einigen

Ausführungsformen die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels keinerlei Fluss wie z.B. mikrofluiden Kräften ausgesetzt. Ebenso wird beispielsweise in einigen Ausführungsformen die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremole kül enthält, nach dem Aufbringen auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf ebendieser Oberfläche belassen. In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, nach dem Aufbringen auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf dieser Oberfläche belassen, bis makroskopisch zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist. In typischen Ausführungsformen erfolgt keine Zufuhr einer externen Flüssigkeit, insbesondere keine Zufuhr einer wässrigen Lösung oder von Wasser. In typischen Ausführungsformen wird das Hydrogel auch zumindest im

Wesentlichen mit keinem Protein in Kontakt gebracht.

[060] Gemäß einem vierten Aspekt wird die Verwendung eines stimuliresponsiven Hydrogels zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA-Molekül sein. Das Hydrogel hat eine VPTT, die im Bereich von etwa 20 bis 80 °C hegt. Dabei hat das Hydrogel in der Regel beim gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, eine VPTT, die im Bereich von etwa 20 bis 80 °C hegt. In der Verwendung wird eine wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufgebracht. Das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, wird bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gehalten, so dass eine Streckung des Nukleinsäuremoleküls erfolgt. In einigen Ausführungsformen wird das stimuliresponsive Hydrogel solange bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gehalten, bis die aufgebrachte Lösung augenscheinlich zumindest im Wesentlichen nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels makroskopisch erkennbar ist.

[061] In einigen Ausführungsformen wird das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das

Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, einer ersten Temperatur ausgesetzt, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, bevor es bei einer zweiten Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gehalten wird, bis die aufgebrachte Lösung mit bloßem Auge zumindest im Wesentlichen nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels optisch erkennbar ist. Die erste Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels, der dieses zunächst ausgesetzt wird, kann in solchen Ausführungsformen unabhängig von der zweiten Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gewählt werden, bei der dieses gehalten wird, bis zumindest im Wesentlichen keine aufgebrachte Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels

makroskopisch sichtbar ist.

[062] Die gewählte Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, bei der es gehalten wird, kann konstant gehalten werden. Die Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, bei der das Hydrogel gehalten wird, kann während des Verfahrens auch variieren.

[063] Für Ausführungsformen der Verwendung nach dem vierten Aspekt wird auf das Verfahren nach dem zweiten Aspekt und die Verwendung nach dem dritten Aspekt verwiesen. So wird in einigen Ausführungsformen die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels keinerlei Fluss wie z.B. mikrofluiden Kräften ausgesetzt. Ebenso wird beispielsweise in einigen Ausführungsformen die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, nach dem Aufbringen auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf ebendieser Oberfläche belassen. Auch ist in einigen Ausführungsformen das stimuliresponsive Hydrogel ein thermoresponsives Hydrogel.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

[064] Fig. 1 zeigt eine theoretische Überlegung zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls nach dem hier offenbarten Verfahren. Gezeigt ist ein auf ein Hydrogel (1) aufgetragener Tropfen

Nukleinsäurelösung (4). Da das Hydrogel (1) in der Regel eine größere Oberfläche besitzt als der Tropfen mit Nukleinsäurelösung (4), dürfte in der Summe die Verdampfung über das Hydrogel höher sein als über den Tropfen der Lösung. Gleichzeitig dürfte der Tropfen als Flüssigkeitsreservoir dienen. Bei einer Abnahme des Gesamtvolumens durch Evaporation, insbesondere bei Erwärmen, dürfte somit Flüssigkeit von der Nukleinsäurelösung (4) in das Hydrogel (1) strömen. Dadurch tritt das Nukleinsäuremolekül in das Hydrogel ein und wird dabei gestreckt, ein Vorgang, der tatsächlich beobachtet wird.

[065] Fig. 2 zeigt schematisch eine Herstellung eines stimuliresponsives Hydrogels und die Verwendung desselben zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls nach einer Ausführungsform des hier offenbarten Verfahrens. Eine Stammlösung mit einem oder mehreren Monomeren für ein stimuliresponsives Hydrogel sowie typischerweise ein Vernetzer sowie beispielsweise ein Initiator, z.B. ein Photoinitiator, werden zwischen einem Substrat wie einem Glassubstrat (3) und einem Deckgläschen, z.B. einem runden Deckgläschen (2) bereitgestellt. Das Substrat (3) kann mit einem Silan modifiziert sein, das mit einem Monomer verbunden ist oder verbunden werden kann. Durch UV-Bestrahlung wird die Polymerisation gestartet und es wird ein stimuliresponsives Hydrogel (1) gebildet. Das Deckgläschen (2) wird entfernt und eine Lösung (4) aufgebracht, die das

Nukleinsäuremolekül enthält. Durch Erwärmen, beispielsweise auf eine Temperatur im Bereich von etwa 35 bis 75 °C, wird ein stimuliresponsives Schrumpfen des Hydrogels bewirkt, wobei ein Strecken des Nukleinsäuremoleküls im Hydrogel (1) erfolgt.

[066] Fig. 3A und Fig. 3B zeigen eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA- Strangs nach Strecken durch Erwärmen in einem Polyacrylamidgel (Durchmesser 10 mm). Eine Färbung der l-Phagen-DNA erfolgte mit dem Interkalationsfarbstoff YOYO-1.

[067] Fig. 4A und Fig. 4B zeigen eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA- Strangs nach Strecken durch Erwärmen in einem Polymethacrylsäuregel (Durchmesser 10 mm). Eine Färbung der l-Phagen-DNA erfolgte mit dem Interkalationsfarbstoff YOYO-1.

[068] Fig. 5A und Fig. 5B zeigen eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA- Strangs nach Strecken durch Erwärmen in einem Poly-NIPMAAm-Hydrogel (Durchmesser 10 mm). Eine Färbung der l-Phagen-DNA erfolgte mit dem InterkalationsfarbstoffYOYO-1.

[069] Fig. 6 zeigt eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA-Strangs nach Strecken durch Trocknung oberhalb der VPTT in einem Poly-NIPAAm-Hydrogel (Durchmesser 10 mm). Eine Markierung der Stränge erfolgte mit AdoYnTAMRA und einer DNA-Methyltransferase. Überschüssiges Fluorophor wurde mittels Agarose Plug Purification (APP) entfernt. Weiterhin erfolgte eine Interkalationsfärbung der l-Phagen-DNA mit YOYO-1. Fig. 6A zeigt beide Färbungen, während Fig. 6B nur die gelbe Färbung des TAMRA-Fluorophors und Fig. 6C nur die Cyan-Färbung des YOYO-1 zeigen.

[070] Fig. 7 zeigt mit den Abbildungsteilen 7A, 7B und 7C drei Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahmen von T7-Phagen-DNA-Strängen, die in Hydrogelen mit einem Durchmesser von 22 mm gestreckt wurden. Die Markierung der Stränge erfolgte wie für Fig. 6 angegeben mit AdoYnTamra und YOYO-1. Fig. 7D, 7E und 7F zeigen die gleichen Gele wie Fig. 7A, 7B und 7C, wobei nur die Signale der Cyan-Färbung durch YOYO-1 wiedergegeben sind.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

[071] Soweit nicht anders angegeben, haben die folgenden Begriffe und Ausdrücke, wenn sie in diesem Dokument, inklusive Beschreibung und Patentansprüchen, verwendet werden, die im

Folgenden angegebenen Bedeutungen.

[072] Der Ausdruck„bestehend aus“, wie in diesem Dokument verwendet, bedeutet einschließend und begrenzt auf das, was auf den Begriff„bestehend aus“ folgt. Der Begriff„bestehend aus“, gibt somit an, dass aufgeführte Elemente erforderlich oder notwendig sind und dass keine weiteren Elemente vorhanden sein dürfen. Der Begriff„im Wesentlichen bestehend aus“ wird dahingehend verstanden, dass er bedeutet, dass jedwede Elemente, die nach dem Ausdruck definiert sind, umfasst sind und dass weitere Elemente, beispielsweise in einer Probe oder einer Zusammensetzung zugegen sein können, die die Aktivität oder Wirkung, die für die betreffenden Elemente in diesem Dokument angegeben sind, nicht verändern, also sie nicht beeinträchtigen und nicht zu ihr beitragen. Anders gesagt gibt der Ausdruck„im Wesentlichen bestehend aus“ an, dass die definierten Elemente notwendig oder erforderlich sind, dass aber weitere Elemente optional sind und zugegen sein können oder nicht, je nachdem, ob sie für die Wirkung oder Wirksamkeit der definierten Elemente von Belang sind oder nicht.

[073] Das Wort„etwa“ bezieht sich, wenn hier verwendet, auf einen Wert, der für einen bestimmten Wert, wie von einem Durchschnittsfachmann bestimmt, innerhalb eines akzeptablen Fehlerbereichs hegt. Dies wird teilweise davon abhängig sein, wie der jeweilige Wert ermittelt oder gemessen worden ist, d.h. von den Einschränkungen des Messsystems.„Etwa“ kann beispielsweise innerhalb einer Standardabweichung von 1 oder mehr bedeuten, je nach Gebrauch im jeweiligen Gebiet. Der Begriff„etwa“ wird auch verwendet um anzugeben, dass der jeweilige Betrag oder Wert der bezeichnete Wert sein kann oder ein anderer Wert, der näherungsweise gleich ist. Der Begriff soll ausdrücken, dass ähnliche Werte gleichwertige Ergebnisse oder Wirkungen, wie in diesem Dokument offenbart, begünstigen. In diesem Zusammenhang kann„etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 10 % über und/oder unter einem bestimmten Wert beziehen. In einigen Ausführungsformen bezieht „etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 5 % über und/oder unter einem bestimmten Wert, wie etwa 2 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einigen Ausführungsformen bezieht„etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 1 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einigen

Ausführungsformen bezieht„etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 0,5 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einer Ausführungsform bezieht sich„etwa“ auf einen Bereich von bis zu 0,1 % über und/oder unter einem bestimmten Wert.

[074] Die Begriffe„oben“ und„unten“ beziehen sich auf eine Ausrichtung eines hier offenbarten Hydrogels als Ganzes wie es typischerweise bei seiner Herstellung auf einer Oberfläche eines Substrats, wie z.B. einer im Wesentlichen planaren Oberfläche eines Substrats vorliegt. Die

Ausrichtung des Hydrogels wird dabei typischerweise dadurch festgelegt, dass das entstehende Polymer sich in einer flüssigen Phase befindet. Das Substrat befindet sich daher, relativ zum entstehenden Hydrogel gesehen, in Richtung der Gravitation. Das entstehende Hydrogel hat in der Richtung der Gravitation eine bestimmte Dicke und erstreckt sich in einer Ebene, die zur Gravitation im Wesentlichen senkrecht ausgerichtet ist.

[075] Der Konjunktionalausdruck„und/oder“ zwischen mehreren Elementen, wenn hier verwendet, wird als sowohl individuelle als auch kombinierte Optionen umfassend verstanden. Sind beispiels weise zwei Elemente durch„und/oder“ verknüpft, betrifft eine erste Option den Einsatz des ersten Elements ohne das zweite Element. Eine zweite Option betrifft den Einsatz des zweiten Elements ohne das erste Element. Eine dritte Option betrifft den Einsatz des ersten und des zweiten Elements zusammen. Es wird verstanden, dass jede beliebige dieser Optionen unter die Bedeutung des Ausdrucks fällt und somit die Bedingungen des Begriffs„und/oder“, wie in diesem Dokument verwendet, erfüllt.

[076] Singularformen wie„eine“,„ein“,„der“,„die“ oder„das“ schließen die Pluralform ein, wenn sie in diesem Dokument verwendet werden. So bezeichnet beispielsweise eine Bezugnahme auf „eine Zelle“ sowohl eine individuelle Zelle als auch eine Mehrzahl an Zellen. In einigen Fällen wird explizit der Ausdruck„ein oder mehrere“ verwendet, um im jeweiligen Fall darauf hinzuweisen, dass die Singularform die Pluralform mit umfasst. Derartige explizite Hinweise schränken die allgemeine Bedeutung der Singularform nicht ein. Falls nicht anders angegeben, werden die Begriffe„zumindest“, „mindestens“ und„wenigstens“, wenn sie eine Abfolge von Elementen vorangehen, dahingehend verstanden, dass sie sich auf jedes dieser Elemente beziehen. Die Begriffe„zumindest ein“, „mindestens ein(e)“,„wenigstens einer“ oder„wenigstens eine(r) von“ schließen beispielsweise ein, zwei, drei, vier oder mehr Elemente ein.

[077] Der Begriff„Nukleinsäure“, wenn hier verwendet, bezieht sich auf jedwedes Nuklein säuremolekül in jedweder möglichen Konfiguration, wie z.B. einsträngig, doppelsträngig oder eine Kombination davon. Zu Nukleinsäuren zählen beispielsweise DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Analoga der DNA oder RNA, die mit Nukleotidanaloga oder mit Hilfe der Nukleinsäurechemie erzeugt werden können, LNA-Moleküle (englisch locked nucleic acid), Peptid-Nukleinsäure- moleküle (PNA) und Tecto-RNA-Moleküle (z.B. Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076- 4077). Ein PNA-Molekül ist ein Nukleinsäuremolekül, bei dem das Rückgrat ein Pseudopeptid anstelle eines Zuckers ist. Dementsprechend weist PNA im Allgemeinen ein ladungsneutrales Rückgrat auf, im Gegensatz zu beispielsweise DNA oder RNA. PNA ist dennoch in der Lage, zumindest komplementäre und im Wesentlichen komplementäre Nukleinsäurestränge zu hybridisieren, wie z.B. DNA oder RNA (zu der PNA als strukturelle Nachbildung gilt). Ein LNA-Molekül weist ein modifi ziertes RNA-Grundgerüst mit einer Methylenbrücke zwischen C4' und 02' auf, die den Furanosering in einer N-Typ-Konfiguration fixiert und dem betreffenden Molekül eine höhere Duplexstabilität und Nukleaseunempfindlichkeit verleiht. Anders als ein PNA-Molekül hat ein LNA-Molekül ein geladenes Rückgrat. DNA oder RNA kann genomischen oder synthetischen Ursprungs sein und kann ein- oder zweisträngig sein. Eine solche Nukleinsäure kann z.B. mRNA, cRNA, synthetische RNA, genomische DNA, cDNA, synthetische DNA, ein Copolymer aus DNA und RNA oder ein Oligonukleotid sein. Eine entsprechende Nukleinsäure kann darüber hinaus nicht-natürliche Nukleotidanaloga enthalten und/oder mit einem Affinitäts-Tag oder einer Markierung verbunden sein.

[078] Es sind viele Nukleotidanaloga bekannt und jedes kann grundsätzlich im hier offenbarten Verfahren eingesetzt werden. Ein Nukleotidanalogon ist ein Nukleotid, das eine Modifikation beispielsweise an dem Basen-, Zucker- oder Phosphatanteil enthält. Als veranschaulichendes Beispiel ist von einer Substitution von 2'-OH-Resten der siRNA durch 2Έ-, 2'O-Me oder 2'H-Reste bekannt, dass sie die /«-v/vo-Stabilität der betreffenden RNA verbessern. Zu Modifikationen am Basenteil gehören natürliche und synthetische Modifikationen von A, C, G und T/U, verschiedene Purin- oder Pyrimidinbasen wie Uracil-5-yl, Hypoxanthin-9-yl und 2-Aminoadenin-9-yl sowie Nicht-Purin- oder Nicht-Pyrimidin-Nukleotidbasen. Andere Nukleotidanaloga dienen als Universalbasen. Zu den Universalbasen zählen 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol. Universalbasen sind in der Lage, mit jeder anderen Base ein Basenpaar zu bilden. Basenmodifikationen können oft mit z.B. einer

Zuckermodifikation wie z.B. 2'-0-Methoxyethyl kombiniert werden, um z.B. einzigartige

Eigenschaften wie erhöhte Duplexstabilität zu erzielen.

[079] Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung basieren auf dem Einsatz eines Hydrogels. Dabei erfolgt das Strecken eines Nukleinsäuremoleküls auf bzw. in dem Hydrogel. Es ist somit keine besondere geometrische Oberflächenstruktur vonnöten, vielmehr kann das eingesetzte Hydrogel herstellungsbedingt von planarer Oberfläche sein. Insbesondere ist das

Strecken nicht auf die Gegenwart einer Vertiefung wie eines Kanals angewiesen. Das Strecken erfolgt in einigen Ausführungsformen ohne die Gegenwart einer Vertiefung wie eines Kanals.

[080] Das Hydrogel kann dennoch, wie bereits eingangs erwähnt, jede beliebige Oberflächentopologie haben. So sind in einigen Ausführungsformen eine oder mehrere Vertiefungen wie beispielsweise eine Furche, eine flächige, inklusive einer planaren, Absenkung oder auch eine oder mehrere Erhebungen vorhanden. Eine Erhebung kann beispielsweise die Form einer Stufe, einer Wulst oder einer flächigen, inklusive einer planaren, Anhebung sein. Eine Vertiefung und eine Erhebung können von beliebiger geometrischer Form sein. Eine Vertiefung auf der Oberfläche des Hydrogels steht dabei während des hier offenbarten Verfahrens und der hier offenbarten Verwendung allenfalls mit der Lösung des Nukleinsäuremoleküls in fluider Verbindung oder wird von dieser benetzt oder ausgefüllt. Eine Vertiefung auf der Oberfläche des Hydrogels steht in der Regel nicht mit einer weiteren Flüssigkeit in fluider Verbindung.

[081] In der Regel wird ein einziges Hydrogel für die Streckung eines bestimmten

Nukleinsäuremoleküls eingesetzt. Dabei können mehrere verschiedene Nukleinsäuremoleküle parallel auf mehreren Hydrogelen gestreckt werden. Es können auch mehrere Nukleinsäuremoleküle, inklusive verschiedener Nukleinsäuremoleküle und gleicher Nukleinsäuremoleküle auf einem einzigen Hydrogel gestreckt werden.

[082] Als Hydrogel ist jedes beliebige Hydrogel geeignet, beispielsweise ein Hydrogel, das Polyacrylat oder ein Derivat davon wie z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) enthält. Als geeignetes Derivat kann beispielsweise auch 2-Hydroxypropylmethacrylat (HPMA) gewählt werden. Ein geeignetes Hydrogel kann auch Polyacrylamid oder ein Derivat davon enthalten. Es kann sich beispielsweise um ein mit Bisacrylamid quervemetztes Polyacrylamid handeln. Ein geeignetes Hydrogel kann als weiteres Beispiel Polyvinylalkohol enthalten.

[083] Ein geeignetes Hydrogel kann auch ein Polysaccharid oder Poly(ethylenglycol) enthalten. Methoxyl-poly(ethylenglycol)monoacrylat ist ein illustratives weiteres Beispiel eines geeigneten Polymers. Zahlreiche für Hydrogele geeignete Monomere sind kommerziell erhältlich und das entsprechende Protokoll zur Herstellung des Hydrogels verfügbar.

[084] In einigen Ausführungsformen eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung wird ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt. Dementsprechend erfolgt in solchen Ausführungsformen das Strecken eines Nukleinsäuremoleküls auf bzw. in dem stimuliresponsiven Hydrogel.

[085] Ein stimuliresponsives Hydrogel zeigt Änderungen seiner Eigenschaften in Reaktion auf einen oder mehrere äußere Einflüsse wie Temperatur, pH-Wert, Licht, eine Ionenänderung, ein magnetisches oder elektrisches Feld oder eine Änderung des Redoxpotenzials. Ein hier beschriebenes stimuliresponsives Hydrogel kann beispielsweise ein thermoresponsives Hydrogel sein. Ein stimuliresponsives Hydrogel enthält in der Regel ein Polymer, das in Reaktion auf einen äußeren Reiz kollabiert.

[086] Ein thermoresponsives Polymer hat eine obere und/oder eine untere kritische

Lösungstemperatur. Der typische Fall ist eine untere kritische Lösungstemperatur. Ist ein Polymer oberhalb einer bestimmten Temperatur in Wasser löslich und unterhalb davon unlöslich, so hat es eine obere kritische Lösungstemperatur. Ist ein Polymer unterhalb einer bestimmten Temperatur in Wasser löslich und oberhalb davon unlöslich, so hat es eine untere kritische Lösungstemperatur (lower critical solution temperature, LCST). Bei Temperaturen unterhalb der LCST ist ein solches Polymer durch die Bildung von Wasserstoffbrücken mit Wasser löslich. Wenn die Temperatur die LCST erreicht, wird die hydrophobe Wechselwirkung dominant, wodurch die Menge an

strukturiertem Wasser, das die Polymerkette umgibt, verringert und die Entropie des Lösungsmittels maximiert wird. Das am meisten untersuchte Polymer dieser Klasse von Polymeren ist

Poly(NIPAM), das eine LCST nahe der menschlichen Körpertemperatur hat. Verwandte Polymere wie Poly(N,N-diethylacrylamid), Poly(dimethylaminoethylmethacrylat) und Poly(N-(L)-(l- hydroxymethyl)propylmethacrylamid), mit LCSTs im Bereich von 30-50 °C, wurden ebenfalls untersucht. Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid)-Copol ymere, bekannt unter dem Handelsnamen Pluronic®, sind eine weitere Art von Polymer, das umfassend in der

kontrollierten Wirkstoffabgabe untersucht wurde.

[087] Ein Hydrogel auf Polymerbasis ist ein quervemetztes hydrophiles Polymer. Zahlreiche Quervemetzer sind bekannt, oft eingesetzt werden Ethylenglycol-diacrylat (EGDA) oder PEG- diacrylat (PEGDA). Ein häufig eingesetzter Quervemetzer ist das bereits im Vorangehenden genannte /V,/V‘-methylenbis(acrylamid) (MBA). Ein Hydrogel definiert ein dreidimensionales hydrophiles Polymemetzwerke aus einem oder mehreren chemisch und/oder physikalisch vernetzten Polymeren. Ein Hydrogel auf Polymerbasis kann Wasser aufnehmen oder abgeben. Nach Absorption von Wasser kann ein Hydrogel auf ein Mehrfaches seines Gewichts quellen.

[088] Bei einem Hydrogel, das ein quervemetztes thermoresponsives Polymer enthält, verläuft die Quellung mit zunehmender Temperatur nicht kontinuierlich, da das zu Grunde hegende Polymer unterhalb seiner LCST hydratisiert ist, s.o.. Unterhalb einer entsprechenden Temperatur quillt ein solches thermoresponsives Hydrogel, ab einer entsprechenden Temperatur kollabiert es. Die Temperatur, bei der diese Änderung des Quellgrades eintritt, wird die Volumen-Phasenübergangs- Temperatur (engl volume phase transition temperature, VPTT) genannt.

[089] In typischen Ausführungsformen eines stimuliresponsiven Hydrogels findet eine entsprechende Trennung von der Lösung und ein Kollabieren, oder umgekehrt eine Aufnahme von Lösung und ein Quellen durch einen äußeren Reiz statt.

[090] Ein zuvor genanntes thermoresponsives Hydrogel ist ein illustratives Beispiel eines stimuliresponsiven Hydrogels. Bei einem thermoresponsiven Hydrogel finden ein Kollabieren und eine Verfestigung ab oder bis zu einer bestimmten Temperatur statt. Ein solches Hydrogel kann also einen temperaturinduzierten reversiblen Völumenphasenübergang durchlaufen. Dementsprechend kann eine Änderung der lokalen Temperatur zu einer Quellung oder einem Kollabieren des Hydrogels führen, was beispielsweise bei der geregelten Freisetzung von Substanzen genutzt werden kann. Thermoresponsive Hydrogele basieren typischerweise auf einem oder mehreren Polymeren, die eine LCST aufweisen, d.h. die Gele kollabieren mit steigender Temperatur. Bei einem solchen Hydrogel ist die thermische Gelierung in der Regel auf die physikalische Vernetzung der hydrophoben Domänen bei Temperaturen oberhalb der LCST zurückzuführen. Unterhalb der unteren kritische Lösungstemperatur ist das Polymer, das das Hydrogel charakterisiert, löslich. Oberhalb der LCST wird das Polymer zunehmend hydrophob und unlöslich.

[091] Neben einem thermoresponsiven Hydrogel existieren weitere Beispiele eines stimulirespon- siven Hydrogels. Das oben gesagte hinsichtlich des Volumen-Phasenübergangs gilt dementsprechend für den äußeren Reiz, auf den ein stimuliresponsives Hydrogel reagiert. Ein stimuliresponsives Hydrogel kann beispielsweise beim Überschreiten oder Unterschreiten eines bestimmten pH-Wertes, einer Konzentration einer bestimmten chemischen Verbindung, dem Über- oder Unterschreiten einer bestimmten Wellenlänge oder Intensität von Licht oder dem Über- oder Unterschreiten einer bestimmten Stärke eines elektrischen oder magnetischen Felds quellen bzw. kollabieren.

[092] Ein geeignetes stimuliresponsives Hydrogel kann beispielsweise ein Graft-Polymer aus einem LCST-Polymer und einem weiteren Polymer wie Hyaluronsäure oder Chitosan sein. Ein Copolymer aus z.B. NiPAAm und Propyl acryl säure (PAA) kann ebenso eingesetzt werden. Ein geeignetes Hydrogel kann beispielsweise auch ein Diblock-Polymer zweier verschiedener

Monomereinheiten eines bekannten LCST-Polymers sein wie z.B. ein PEG-PCL-Copolymer. Ein geeignetes Hydrogel kann auch ein Triblock-Polymer dreier Monomereinheiten eines bekannten LCST-Polymers sein. Ein geeignetes Polymer kann auch eine modifizierte Cellulose sein, wobei es sich um eine Cellulose handeln kann, deren Hydroxygruppen mit Alkylresten, insbesondere Ci-, C2- oder C3-Alkylresten oder Hydroxyalkylresten, z.B. Ci- bis C5- Hydroxyalkylresten substituiert ist. Substitution der Hydroxylgruppen an Cellulose durch mehrere hydrophobe Einheiten wie Methyl oder Hydroxypropylgruppen macht die ursprünglich wassserlösliche Cellulose wasserunlöslich. Methylcellulose geliert beispielweise in Wasser bei 60-80 °C. Auch ein Graft-Polymer aus einer alkylierten Cellulose mit A-isopropylacrylamid (NiPAAm) ist ein geeignetes Hydrogel.

[093] Ein geeignetes stimuliresponsives Polymer ist auch Poly(A-acryloylsarcosin-methylester) (PNASME), ein thermoresponsives N-Ester-substituiertes Polyacrylamid.

[094] In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem hier offenbarten Verfahren, das Hydrogel durch Polymerisation herzustellen. Das Hydrogel kann in einigen Ausführungsformen durch Polymerisation auf einer festen Auflage hergestellt werden.

[095] Ein Hydrogel lässt sich unabhängig von seinem Quellgrad und von seinem Volumen trocknen, wobei dem Hydrogel Wasser entzogen wird. In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung wird dem Hydrogel durch Erwärmen Wasser entzogen. In einigen Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, wird dem Hydrogel durch Erwärmen Wasser entzogen, nachdem durch einen externen Reiz eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels bewirkt wurde. Die gewählte Temperatur kann dabei frei bestimmt werden. In Fällen, in denen ein thermoresponsives Hydrogel verwendet wird, hegt die gewählte Temperatur weiterhin bei oder oberhalb der VPTT. Im Übrigen wird der Fachmann die Temperaturstabilität des zu streckenden Nukleinsäuremoleküls berücksichtigen.

[096] In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur oberhalb der

Raumtemperatur ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird dem Hydrogel durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C Wasser entzogen, inklusive bei einer Temperatur zwischen etwa 40 °C und etwa 80 °C. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur zwischen etwa 45 °C und etwa 75 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel etwa 50 °C oder etwa 60 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur von etwa 70 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur von etwa 37 °C oder bei etwa 42 °C ausgesetzt. In einigen

Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur von etwa 40 °C ausgesetzt. [097] Als Wärmequelle kann jede beliebige Energiequelle eingesetzt werden. Typischerweise wird das Hydrogel als Ganzes einer erhöhten Temperatur ausgesetzt, beispielsweise einer Temperatur oberhalb von 28 °C oder einer Temperatur oberhalb von 32 °C. In typischen Ausführungsformen wird in diesem Zusammenhang keine partielle Erwärmung nur ausgewählter Bereiche des Hydrogels vorgenommen.

[098] Das Hydrogel wird in der Regel einer erhöhten Temperatur ausgesetzt bzw. getrocknet, bis eine Streckung oder ein gewünschtes Ausmaß an Streckung des Nukleinsäuremoleküls nachweisbar ist. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel dann beispielsweise durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und etwa 85 °C so lange getrocknet werden, bis keine Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr detektierbar ist.

[099] In Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, kann das Hydrogel in einer ersten Stufe dem Reiz ausgesetzt werden, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels bewirkt. In einer zweiten Stufe kann das Hydrogel, das dem Stimulus weiterhin ausgesetzt wird, einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C ausgesetzt werden. In einigen Ausführungsformen kann das stimuliresponsive Hydrogel dem Reiz ausgesetzt werden, während es bereits einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C ausgesetzt ist. In einigen Ausführungsformen kann das stimuliresponsive Hydrogel gleichzeitig dem Reiz und einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C ausgesetzt werden.

[100] In einigen Ausführungsformen hegt die Temperatur, der das Hydrogel, inklusive ein stimuliresponsives Hydrogel, ausgesetzt wird, im Bereich zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt von Wasser.

[101] In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C getrocknet, inklusive bei einer Temperatur zwischen etwa 40 °C und etwa 80 °C. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei einer Temperatur zwischen etwa 45 °C und etwa 75 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei etwa 50 °C oder bei etwa 60 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei etwa 70 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei einer Temperatur von etwa 37 °C oder bei etwa 42 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen ist das Einwirken des Stimulus optional, sobald makroskopisch im Wesentlichen keine Nukleinsäure enthaltende Lösung mehr auf dem Hydrogel erkennbar ist. Das Hydrogel kann dann weiterhin durch Halten bei einer Temperatur zwischen beispielsweise etwa 30 °C und etwa 95 °C getrocknet werden. Es kann eine Temperatur im gleichen Bereich oder bei einem gleichen Wert gewählt werden wie während der Phase, in der das Hydrogel dem Stimulus ausgesetzt wird. Dabei kann die Temperatur unabhängig von der vorangehenden Phase gewählt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel dann beispielsweise durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und etwa 85 °C so lange getrocknet werden, bis keine Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr detektierbar ist. [102] Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung können grundsätzlich bei jedem gewünschten Druck durchgeführt werden, solange die eingesetzte Nukleinsäure und das verwendete Hydrogel dem hier offenbarten Verfahren bzw. der Verwendung zugänglich sind. Wird ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt, so kann eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels in einigen Ausführungsformen bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa auslösbar sein. In einigen Ausführungsformen kann eine Verringerung des Quellgrads und/ oder des Volumens eines stimuliresponsiven Hydrogels unter atmosphärischem Druck auslösbar sein.

[103] In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel unter Umgebungsluftdruck einer

Temperatur oberhalb der Raumtemperatur ausgesetzt. Das Hydrogel wird in einigen Ausführungs formen der Temperatur von Raumtemperatur bis etwa 95°C unter Umgebungsluftdruck ausgesetzt. Dabei kann es sich um einen Luftdruck beim atmosphärischen Druck oder im Bereich von +20 bis -60 % des atmosphärischen Drucks in Pa handeln, inklusive im Bereich von ±10 % des atmosphärischen Drucks. Der atmosphärische Druck ist der mittlere Luftdruck der Atmosphäre auf Meereshöhe, der normgemäß 101.325 Pa beträgt. Auf der Höhe des Toten Meeres beträgt der Luftdruck im Mittel 1070 hPa. Bei diesem Druck kann das hier offenbarte Verfahren problemlos durchgeführt werden. Auf Höhe des Gipfels des Mt. Everest beträgt der Luftdruck im Mittel 325 hPa, ein Druck, bei dem das hier offenbarte Verfahren ebenfalls gut durchführbar ist. In einigen Ausführungsformen wird zumindest ein Teil des hier offenbarten Verfahrens bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird das gesamte hier offenbarte Verfahren bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt.

[104] Zumindest ein Schritt eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten

Verwendung wird in einigen Ausführungsformen bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. Zumindest ein Schritt eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung wird in einigen Ausführungsformen unter Umgebungsluftdruck durchgeführt. Jeder Schritt, der innerhalb eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung durchgeführt wird, wird in einigen Ausführungsformen bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird jeder Schritt, der innerhalb eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung durchgeführt wird, unter

Umgebungsluftdruck durchgeführt.

[105] Wie bereits zuvor erläutert, kann in Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, das stimuliresponsive Hydrogel eine VPTT haben und das Hydrogels einer Temperatur oberhalb der VPTT ausgesetzt werden. In einigen Ausführungsformen wird das

Hydrogels einer Temperatur oberhalb der VPTT ausgesetzt, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist. In einigen Ausführungsformen wird der Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird der Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, bei atmosphärischem Druck durchgeführt.

[106] In Ausführungsformen, in denen das Hydrogel, z.B. das stimuliresponsive Hydrogel, trocknen gelassen wird, kann dieser Schritt bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, z.B. das stimuliresponsive Hydrogel, bei atmosphärischem Druck trocknen gelassen. In Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel trocknen gelassen wird, können auch sowohl ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, und ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin trocknen zu lassen, bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen wird ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im

Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, und ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin trocknen zu lassen, bei atmosphärischem Druck durchgeführt werden.

[107] Die Dicke des eingesetzten Hydrogels kann der Fachmann je nach der gewünschten

Anwendung wählen. Das Hydrogel kann in einigen Ausführungsformen eine Dicke im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 pm haben, beispielsweise eine Dicke im Bereich von etwa 20 bis etwa 50 pm. Illustrative Werte für eine geeignete Dicke sind beispielsweise 25 pm oder 38 pm.

[108] In der Ebene senkrecht zur Dicke kann das Hydrogel jede beliebige Form haben. Geeignete Formen sind beispielsweise die Kreisform, die Form eines Quadrats oder Rechtecks oder ein sonstiges Vieleck. Auch die Dimensionen des Hydrogels in der Ebene senkrecht zur Dicke, die in einigen Ausführungsformen als Durchmesser aufgefasst werden kann, kann der Fachmann je nach der gewünschten Anwendung wählen. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel in der Ebene senkrecht zur Dicke beispielsweise Dimensionen im Bereich von etwa 2 mm bis etwa 100 mm haben, inklusive z.B. etwa 5 mm bis etwa 50 mm. Illustrative Werte für eine geeignete maximale Ausdehnung in der Ebene senkrecht zur Dicke sind beispielsweise 10 mm oder 22 mm.

[109] Auch die Menge an Nukleinsäure, die zum Strecken eingesetzt wird, hängt im Wesentlichen von der beabsichtigten Anwendung sowie von der verwendeten Analytik ab. So kann beispielsweise bei der Verwendung des Interkalationsfluoreszenzfarbstoffs YOYO-1® (l,l'-(4,4,8,8-Tetramethyl- 4,8-diazaundecamethylen)bis[4-[(3-methylbenzo-l,3-oxazol-2-y l)methyliden]-l,4- dihydrochino- linium]-tetraiodid) ein Tropfen mit einer Konzentration von etwa 15 bis 100 pg/pl Nukleinsäure, inklusive einer Konzentration von etwa 25 bis 60 pg/pl Nukleinsäure auf ein kreisrundes Hydrogel von 10 mm Durchmesser und 38 pm Dicke problemlos aufgetragen und gestreckt werden.

[110] Das zu streckende Nukleinsäuremolekül hegt in wässriger Lösung vor. In einigen

Ausführungsformen wird das zu streckende Nukleinsäuremolekül in wässriger Lösung bereitgestellt. Die wässrige Lösung enthält in typischen Ausführungsformen ein Reduktionsmittel wie ein Thiol, beispielsweise Dithiothreitol oder 2-Mercaptoethanol. Die wässrige Lösung enthält in typischen Ausführungsformen ein anorganisches Salz im Bereich von etwa 1 bis 500 mM. Beispielsweise kann ein Kalium- und oder Magnesiumsalz vorhanden sein. Die wässrige Lösung enthält in typischen Ausführungsformen eine oder mehrere Pufferverbindungen. Zahlreiche Pufferverbindungen sind dem Fachmann bekannt und können in der wässrigen Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, vorhanden sein. Beispiele für geeignete Puffer sind unter anderem Lösungen von Phosphatsalzen, Carbonat, Succinat, Carbonat, Citrat, Acetat, Formiat, Barbiturat, Oxalat, Laktat, Phthalat, Maleat, Cacodylat, Borat, N-(2-Acetamido)-2-Aminoethansulfonat (auch ACES genannt), N- (2)Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (auch HEPES genannt), 4-(2-Hydroxyethyl)-l- piperazinpropansulfonsäure (auch HEPPS genannt), Piperazin- l,4-bis(2-ethansulfonsäure) (auch PIPES genannt), (2-[Tris(hydroxymethyl)-methylamino]-l-ethansulfonsäure (auch TES genannt), 2- Cyclohexylamino-ethansulfonsäure (auch CHES genannt) und N-(2-acetamido)-iminodiacetat (auch ADA genannt). Jedes Gegenion kann in diesen Salzen verwendet werden, als illustrative Beispiele mögen Ammonium, Natrium und Kalium dienen. Weitere Beispiele für geeignete Puffer sind Triethanolamin, Diethanolamin, Ethylamin, Triethylamin, Glycin, Glycylglycin, Histidin, Tris- (Hydroxymethyl)aminomethan (auch TRIS genannt), Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris(hydroxy- methyl)methan (auch BIS-TRIS genannt) und N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-glycin (auch TRICINE genannt), um nur einige zu nennen.

[111] In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung, die das zu streckende

Nukleinsäuremolekül enthält, in Form eines Tropfens auf das Hydrogel aufgebracht. In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung, die das zu streckende Nukleinsäuremolekül enthält, in Form eines Mikrotropfens auf das Hydrogel aufgebracht

[112] Ein in einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung eingesetztes Nukleinsäuremolekül hegt typischerweise in gereinigter oder zumindest angereicherter Form vor. Es handelt sich um ein zellfreies Nukleinsäuremolekül. Neben dem zu streckenden Nukleinsäure molekül sind in der dieses enthaltenden Lösung in einigen Ausführungsformen im Wesentlichen keine sonstigen Nukleinsäuremoleküle vorhanden. Neben dem zu streckenden Nukleinsäuremolekül sind in der dieses enthaltenden Lösung in einigen Ausführungsformen im Wesentlichen keine Nukleinsäuremoleküle von signifikant anderem Molekulargewicht vorhanden. Neben dem zu streckenden Nukleinsäuremolekül sind in der dieses enthaltenden Lösung in einigen

Ausführungsformen keine Primer vorhanden. Das eingesetzte Nukleinsäuremolekül ist

typischerweise in Lösung frei beweglich. Das eingesetzte Nukleinsäuremolekül ist typischerweise nicht an einer Oberfläche verankert.

[113] Wie bereits eingangs angegeben, zählt es in einigen Ausführungsformen zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül zu detektieren. So kann der Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls erfasst werden. Dabei kann die Streckung des Nukleinsäuremoleküls in einigen Ausführungsformen überwacht werden. Grundsätzlich kann jedes Detektionsverfahren eingesetzt werden, mit dem sich der Streckungszustand eines Nukleinsäuremoleküls beurteilen lässt. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Detektion des Streckungszustands eines Nukleinsäuremoleküls mit Hilfe einer Visualisie rungstechnik. Eine entsprechende Detektion kann beispielsweise mit Hilfe einer Mikroskopietechnik erfolgen. Als illustratives Beispiel kann eine Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen zählt es zum hier offenbarten Verfahren und zur hier offenbarten Verwendung, nachdem das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C ausgesetzt worden ist, das Nukleinsäuremolekül zu detektieren. In einigen Ausführungsformen kann es zum hier offenbarten Verfahren und zur hier offenbarten Verwendung zählen, nachdem das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C ausgesetzt worden ist und das Nukleinsäuremolekül detektiert worden ist, das Hydrogel erneut einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C auszusetzten.

[114] Ein ungestrecktes Nukleinsäuremolekül nimmt auf Grund thermischer Bewegung in einer wässrigen Umgebung die entropisch begünstigte Form eines lockeren Knäuels ein, insbesondere solange Elektrolyte in Form von Ionen vorhanden sind. In der Form eines lockeren Knäuels ist der Ausdehnungs- oder Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls in alle Richtungen im Wesentlichen gleichförmig. Bei mikroskopischer Detektion erscheint ein entsprechendes Nukleinsäuremolekül als von zumindest im Wesentlichen rundem, typischerweise kreisförmigem Querschnitt. Je nach gewählter Auflösung und Größe kann eine ungestrecktes Nukleinsäuremolekül auch punktförmig erscheinen. Eine Abweichung von der Form eines lockeren Knäuels bedeutet eine Streckung. Der Ausdehnungs- oder Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls ist nicht mehr in alle Richtungen gleich. Vielmehr erstreckt sich das Nukleinsäuremolekül in eine bestimmte Richtung oder entlang einer bestimmten Achse weitre als in andere Richtungen. Es kann je nach Dauer der Einwirkung einer gewählten Temperatur und der Höhe der gewählten Temperatur ein Streckungsgrad erreicht werden, der beliebig im Bereich zwischen der Form eines lockeren Knäuels und der Form eines linearen Fadens hegt. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur beispielsweise oberhalb der Raumtemperatur so lange getrocknet werden, bis ein gewünschter Streckungsgrad detektiert wird. Bekannte Verfahren zum Detektieren des

Streckungsgrads von übermolekularen Strukturen können in dieser Hinsicht eingesetzt werden. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise durch eine Farbmarkierung, wie eine

Fluoreszenzmarkierung detektiert werden.

[115] In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung wird

typischerweise keine Kapillare eingesetzt. In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung ist das eingesetzte Hydrogel in der Regel nicht in einer Kapillare angeordnet.

[116] Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, lässt sich ein hier offenbartes Verfahren sowie eine hier offenbarte Verwendung beschreibend veranschaulichen. So ist in Fig. 1 eine mögliche Erklärung skizziert, wie es möglich ist, dass eine Streckung eines Nukleinsäuremoleküls erfolgt. Durch Erwärmen und Trocknen könnte eine Strömung von der die Nukleinsäure enthaltenden Fösung, typischerweise in Form eines Tropfens, in das Hydrogel erfolgen. Das Kollabieren des Hydrogels nach Einwirken eines externen Reizes könnte zusätzlich die Bildung einer nanoporösen Struktur zur Folge haben. [117] Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung lassen sich in kosten günstiger und schneller Weise im optischen Nukleinsäure-Mapping, insbesondere im optischen DNA- Mapping einsetzen. Die zu streckende Nukleinsäure kann in diesem Fall genomische DNA sein.

BEISPIEL

[118] Nachfolgend wird zur Veranschaulichung beispielhaft beschrieben, wie sich ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung umsetzen lassen.

[119] Eingesetzes Wasser wurde entweder durch eine Kombination aus Millipore Elix 3 mit einem nachgeschalteten Milli-Q Academic System (Q = 0,055 pS cm ¹ ) oder durch ein membraPure Astacus ² System (s= 0,055 pS cm ¹ ) gereinigt.

[120] Für die Plasmareinigung wurde ein Zepto-System von Diener electronic verwendet.

[121] Für alle Fluoreszenzmikroskopie-Messungen wurde ein spinning disk-Konfokal- Fluoreszenzmikroskop VisiScope Confocal-CSUXl mit Nikon Ti und Andor EMCCD-Kamera verwendet. Aufnahmen wurden in der Regel bei 561 nm und bei 488 nm erstellt. Im 488 nm Kanal war das Bleichen der Fluorophore unkritisch, da genügend Substanz vorhanden war und lediglich die Form der Stränge erkennbar sein musste. Im Gegensatz dazu war das Bleichen der Markierungen im 561 nm-Kanal für die weitere Analyse sehr kritisch, da jedes einzelne Fluorophormolekül eine sequenzspezifische Position markierte. Daher wurde der Fokus während der Aufnahme manuell eingestellt. Der Grauwert des hellsten Punktes des Bildes wurde durch den durchschnittlichen Grauwert des Bildes dividiert. Die 100 Bilder mit dem höchsten Verhältnis wurden zu einem

Einzelbild gemittelt.

Herstellung von Hydrogelen

Reinigung der Glassubstrate

[122] Rechteckige Glassubstrate (Marienfeld, Hochpräzisions-Mikroskop-Abdeckgläser, 24x50 mm, Nr. 1,5H) wurden durch Ultraschall nacheinander in Wasser, Aceton und 2-Propanol für je 5 min gereinigt. Runde Deckgläschen (10 mm; 22 mm) wurden auf die gleiche Weise gereinigt und in 2- Propanol gelagert. Die Glassubstrate wurden für 1000 s bei 100 W und einem Ch-Druck von 0,44 mbar plasmagereinigt.

Silanisieren der Glassubstrate

[123] Die Glassubstrate wurden in einen Exsikkator ohne Trockenmittel gegeben. Eine

Verdampfungsschale mit 3-(Trimethoxysilyl)propylacrylat (100 pF) wurde den Substraten gegenübergestellt. Im Exsikkator wurde die Fösung 15 Minuten lang verdampft. Das Vakuum wurde für 2 h gehalten. Nachdem die Verdampfungsschale entfernt worden war, wurde der Exsikkator für 1 Std. evakuiert. Die Glassubstrate wurden lichtdicht unter Argon bei Umgebungsdruck gelagert.

Polymerisationslösung für Polymethacrylat-Hydrogele

[124] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer Methacrylsäure (2,56 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA; 50,2 mM, 1,96 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2-methylpropiophenon (49,9 mM, 1,94 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 22 mm) abgedeckt.

Polymerisationslösung für Polyacrylamid-Hydrogele

[125] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer Acrylamid (2,56 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer MBA (50,2 mM, 1,96 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2- methylpropiophenon (49,9 mM, 1,94 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 22 mm) abgedeckt.

Polymerisationslösung für PNIPAAm-Hydrogele

[126] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer NIPAAm (1,77 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer MBA (17,7 mM, 1,0 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2- methylpropiophenon (17,7 mM, 1,0 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (für 10 mm Deckgläser: 1,0 pL; 2,0 pL; 3,0ppL; für 22 mm: 14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 10 oder 22 mm) abgedeckt.

Polymerisationslösung für PNIPMAAm-Hydrogele

[127] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer NIPMAAm (A-isopro- pylmethylmethacrylamid, 2,56 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer MBA (50,2 mM, 1,96 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2-methylpropiophenon (49,9 mM, 1,94 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (22 mm Deckgläschen, 14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 22 mm) abgedeckt.

Polymerisation der Hydrogele

[128] Die radikalische Terpolymerisation wurde mit jeder Polymersisationslösung gestartet, indem die Proben 1 Stunde lang UV-Licht (l = 254 und 366 nm) ausgesetzt wurden. Es wurden vernetzte und an die Oberfläche gebundene Polymethacrylat-, Polyacrylamid-, PNIPAAm- und PNIPMAAm- Hydrogele erhalten. Das Deckglässchen wurde entfernt und das Hydrogel wurde für mindestens 16 Stunden in Wasser (50 mL) gelagert. Das Hydrogel wurde unter einem Argonstrom getrocknet.

[129] Als Volumen für Hydrogele mit einem Durchmesser von 10 mm wurden 3 pL gewählt. Dies entspricht einer Höhe der Stammlösung von 38 pm.

DNA -Präparation

[130] DNA wurde mittels einer DNA-Methyltransferase und AdoYnTAMRA Fluoreszenz-markiert. Weiterhin wurde als Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung ganzer DNA-Doppelstränge der Interkalationsfarbstoff Y OY O- 1 ® eingesetzt.

Modifikation von l Phagen-DNA mit AdoYnTAMRA undM. Taql

[131] l Phagen-DNA (50,0 ng pL ¹ ) wurde mit M.Taql (1,00 Äquiv. pro TCGA, 0,189 pM) und AdoYnTAMRA (10 mM) in lx NEB4-Puffer gemischt. Das Gemisch wurde für 1 Stunde bei 65 °C inkubiert. Überschüssiger Cofaktor wurde durch Agarose Plug Purification (APP) entfernt.

Modifikation von T7 Phagen-DNA mit AdoYnTAMRA durch M. Tagl oder M.BseCI

[132] T7 Phagen-DNA (50,0 ng pL ¹ ) wurde mit M.Taql (1,00 Äquiv. pro TCGA, 0,213 mM) oder M BseCI (20,0 Äquiv. pro ATCGAT, 0,115 mM) und AdoYnTAMRA (10 mM) in lx NEB4-Puffer bzw. lx BseCI-Puffer vermischt. Die M.Taql-haltige Mischung wurde bei 65 °C für 1 h inkubiert und die M.BseCI-haltige Mischung wurde bei 55 °C für 1 Stunde inkubiert. Überschüssiger Cofaktor wurde durch Agarose Plug Purification (APP) entfernt.

Thermische Behandlung von beladenen Hydrogelen

[133] Das Hydrogel wurde 5 Minuten lang bei 40 °C inkubiert. Ein Tropfen der DNA-haltigen Lösung (pNIPAAm-Gele: 10 pL und 5 pL, alle anderen Gele: 10 pl) wurde auf das Hydrogel pipettiert. Üblicherweise wurden 10 pl DNA-Lösung mit einer DNA-Konzentration von 50 pg pL ¹ eingesetzt. Das System wurde 1 Stunde lang bei 40 °C inkubiert.

Variation des Durchmessers des Hydrogels

[134] Nach theoretischen Überlegungen könnte der radiale Zug auf die DNA durch die

Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Hydrogel durch die Hydrogeloberfläche entstehen. Dies würde zur Überlegung führen, dass eine größere Oberfläche zu mehr verdunstetem Lösungsmittel pro Zeiteinheit und damit zu einer höheren Zugkraft führen könnte. Es könnten sich Auswirkungen auf das Streckverhältnis, die Lorm und die Ausrichtung der DNA-Moleküle ergeben. Um den Einfluss der Hydrogeloberfläche auf das Streckverhalten zu prüfen, wurde der Hydrogeldurchmesser von bisher 10 mm auf 22 mm erhöht. Dies entspricht einer Steigerung der Oberfläche um 384 %. Die übrigen Parameter blieben unverändert. Die Hydrogeldicke wurde bei 38 pm gehalten, indem das Hydrogelvolumen proportional zur Lläche erhöht wurde.

[135] Lig. 7A, 7B und 7C zeigen drei exemplarische Lluoreszenzmikroskopie-Bilder. In allen Lällen wurde ein sehr gutes Streckungsverhalten beobachtet. Alle Stränge erscheinen in Lorm von perfekt geraden Linien und innerhalb des gleichen Bildes haben alle Stränge die gleiche Ausrichtung. Die Markierungen befinden sich auf den Linien und sind dem entsprechenden Strang gut zuordenbar. Zwischen den Strängen liegen nur sehr wenige Signale von freien Lluorophoren.

[136] Der Inhalt von wissenschaftlichen Artikeln, Patenten und Patentanmeldungen sowie der Inhalt von allen anderen Dokumenten und elektronisch zugänglichen Daten, die hier erwähnt oder zitiert werden, wird hiermit durch Bezug in ihrer Gesamtheit im gleichen Maße aufgenommen, als wäre jede einzelne Veröffentlichung ausdrücklich und individuell als durch Bezug aufgenommen bezeichnet. Im Palle eines Widerspruchs gibt das vorliegende Dokument den Ausschlag. Der Anmel der behält sich das Recht vor, jedwedes, inklusive alles Material und Daten aus jedweden solchen Artikeln, Patenten und Patentanmeldungen oder anderen physischen und/oder elektronischen Dokumenten per Bezug in dieses Dokument aufzunehmen. [137] Die Nennung oder Diskussion eines zuvor veröffentlichten Dokuments in dieser Beschrei bung sollte nicht notwendigerweise als Anerkenntnis verstanden werden, dass ein solches Dokument zum Stand der Technik zählt oder Allgemeinwissen des Fachmanns darstellt.

[138] Das Verfahren und die Verwendung, die hier veranschaulichend beschrieben sind, können in geeigneter Weise ohne ein einzelnes Element oder Elemente, Beschränkung oder Beschränkungen ausgeführt und eingesetzt werden, die hier nicht explizit offenbart sind. Die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke sind ferner als beschreibende Begriffe und nicht als Einschränkung verwendet, und es besteht keine Absicht, beim Verwenden solcher Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon

auszuschließen. Es wird erkannt, dass verschiedene Abwandlungen im Umfang der beanspruchten Erfindung möglich sind. So sollte daher verstanden werden, dass der Fachmann auf Abwandlungen und Variationen der offenbarten Ausführungsformen zurückgreifen kann, obwohl die hier offenbarten Vorrichtungen und Verfahren für den Fachmann in ausreichendem Detail beschrieben und veran schaulicht sind, um sie anzuwenden, und dass solche Abwandlungen und Variationen als innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung befindlich anzusehen sind.

[139] Es sollte somit verstanden werden, dass ein Verfahren und eine Verwendung, die hier in ausreichend Detail beschrieben und anhand bestimmter spezifischer Ausführungsformen

veranschaulicht sind, so dass sie vom Fachmann ausgeführt werden können, nicht darauf beschränkt sein sollen; vielmehr werden Abwandlungen und Variationen der beschriebenen Ausführungsformen als im Umfang der Erfindung befindlich angesehen.

[140] Die Erfindung ist hier ausgedehnt und allgemein beschrieben worden. Jede der engeren Spezies und Subgenus-Gruppierungen, die unter die allgemeine Offenbarung fallen, bilden ebenfalls einen Teil des Verfahrens und der Verwendung. Das schließt die allgemeine Beschreibung des des Verfahrens und der Verwendung mit einer Bedingung oder einer negativen Beschränkung ein, die einen Gegenstand aus dem Genus ausschließen, unabhängig davon, ob der ausgeschlossene

Gegenstand hier explizit wiedergegeben ist.

[141] Weitere Ausführungsformen sind in den nachfolgenden Patentansprüchen wiedergegeben. Sind ferner Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Form von Markush-Gruppen angegeben, wird der Fachmann erkennen, dass die Erfindung auf diese Weise auch hinsichtlich jedes individuellen Mit glieds oder jeder individuellen Untergruppe von Mitgliedern von Markush-Gruppen beschrieben ist.

[142] Wie ein durchschnittlicher Fachmann im Fachgebiet an Hand der vorliegenden Offenbarung bereitwillig zu schätzen wissen wird, können andere Komponenten, Elemente oder Schritte, die zur Zeit existieren oder später entwickelt werden und die im Wesentlichen das gleiche Ergebnis erzielen wie die hier beschriebenen beispielhaften Ausführungsformen, gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingesetzt werden.