DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention se rapporte au domaine de l'observation et de la mesure in situ de données biophysiques en rapport à un ensemble de molécules au sein d'une cellule ou d'un animal vivant, comme par exemple des constantes de diffusion, des concentrations locales et des interactions moléculaires à courtes et longues distances.

Elle se rapporte en particulier à un système d'analyse moléculaire comprenant :

- un dispositif de microscopie confocale muni de moyens d'illumination agencés pour exciter les molécules, et

- un dispositif d'imageries corrélées de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées.

Elle se rapporte également à un procédé d'analyse moléculaire comprenant :

- une étape d'excitation des molécules, et

- une étape d'acquisition d'images corrélées de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE

Un système disposant d'une partie des ces propriétés est décrit dans la publication « Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells » (Spriet et al. ; Microscopy Research and Technique ; Vol. 70 ; Issue 2 ; pp. 85-94 ; 2007), qui enseigne la réalisation d'un système de mesures corrélées de spectre et de temps de vie de fluorescence.

Ce système, dit « SLIM », fonctionne de manière à combiner des mesures simultanées de spectre de fluorescence et de temps de vie de fluorescence dans chaque région d'une cellule étudiée. De la sorte, il rend possible l'utilisation d'informations de spectre d'émission de fluorescence et de temps de vie de fluorescence, acquises de manière simultanée, de façon à obtenir des informations complémentaires sur les molécules et leur environnement. Ces informations, prises individuellement, ne peuvent en effet quantifier de façon complète les caractéristiques des fluorophores considérés, du fait de leur dépendance à plusieurs paramètres (l'environnement moléculaire, les conditions expérimentales et la complexité d'interprétation).

Plus précisément, le système décrit dans cette publication propose des mesures simultanées de temps de vie sur au moins seize bandes spectrales, directement reliées à un microscope confocal par excitation à deux photons. Ces mesures peuvent être réalisées au moyen d'un détecteur à 32 anodes.

Dans la publication « SLIM: a new method for molecular imaging » (Ruck et al. ; Microscopy Research and Technique ; Vol. 70 ; Issue 5 ; pp. 485-492), l'imagerie corrélée de spectre et de temps de vie de fluorescence est utilisée pour l'analyse de cellules ADN, ARN, ou de marqueurs rhodamine 123 (marqueur des mitochondries). Pour cela, le système divulgué comporte un microscope à balayage laser, muni d'un spectrographe, d'un photomultiplicateur multianode à seize canaux et d'un compteur de photon multidimensionnel à corrélation temporelle. L'excitation des molécules est réalisée au moyen d'un laser titane saphir ou d'une diode laser.

Un tel système ne permet cependant d'obtenir qu'un nombre limité d'informations sur les interactions moléculaires dans le milieu étudié, dans la mesure où le nombre de données qu'il est susceptible d'acquérir est lui-même limité.

Cette limitation pose donc le problème de l'obtention d'un nombre plus important d'informations à partir d'un unique appareil.

Il est en effet connu d'utiliser d'autres systèmes de mesure pour obtenir d'autres informations sur les interactions moléculaires, comme par exemple les systèmes de microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM), de spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS) et de spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence (FCCS).

Des systèmes FLIM sont par exemple décrits dans les documents de brevet US 2007/0181 16 A1 et US 2007/197894 A1 . Une source lumineuse y génère un faisceau apte à exciter des molécules. La fluorescence émise en retour par ces molécules traverse un microscope confocal afin d'être détectée par un photomultiplicateur rapide (picoseconde) fonctionnant en régime de comptage de photons. Des systèmes FCS et FCCS sont, quant à eux, décrits par exemple dans le document de brevet FR 2 827 959. Dans chaque cas, un faisceau laser d'excitation est rendu convergeant par un objectif de microscope en un point de focalisation situé au niveau des particules que l'on souhaite analyser, ces particules étant en solution sur un substrat passif du point de vue optique. La lumière du faisceau laser focalisé est absorbée par les particules, puis réémise à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau laser pour être ensuite dirigée sur le détecteur via le dispositif de conjugaison optique.

Afin d'obtenir un nombre important d'informations sur des particules fluorescentes en solution, un corrélateur est relié au détecteur afin d'analyser les fluctuations temporelles de la lumière fluorescente émise par le volume d'analyse, de sorte à réaliser une détection par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Ces fluctuations temporelles sont directement reliées à la diffusion des fluophores au travers du volume d'analyse. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen - le temps de diffusion - des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d'analyse. Le corrélateur peut ainsi fournir des données d'autocorrélation, de corrélation croisée ou une combinaison de ces données.

Afin d'obtenir des informations issues de ces différents dispositifs avec un unique appareil, il se pose le problème du couplage de ceux-ci. Ce couplage s'avère d'autant plus intéressant que la combinaison de données SLIM et FCS permettrait d'aboutir à de nouvelles informations sur les interactions moléculaires, qui n'étaient jusqu'alors jamais accessibles.

Dans l'état de la technique, ce problème est résolu d'un point de vue structurel par l'adjonction de ces dispositifs à un unique microscope confocal, par l'intermédiaire d'un dispositif de couplage.

Or, les dispositifs SLIM, FLIM, FCS et FCCS sont prévus pour une même position d'adaptation du microscope, ce qui nécessite de retirer l'un de ces dispositifs pour le remplacer par un autre et/ou de changer une pièce dans le dispositif de couplage (par exemple un cube filtre pour passer de FLIM à FCS). Dans ces conditions, les analyses de dynamique et d'interactions moléculaires ne peuvent être réalisées que de manière séquentielle, dispositif par dispositif, ce qui limite la combinaison et la corrélation de ces différentes données, notamment par la création de modèles fonctionnels intégrant ces données. Cet inconvénient est d'autant plus significatif lors d'études nécessitant une vision à la fois dynamique et topologique des phénomènes étudiés.

Par ailleurs, la question du couplage de ces dispositifs rejoint celle du couplage des données issues de ceux-ci, afin d'obtenir, d'une part, des nouvelles données complémentaires et, d'autre part, des données déjà connues mais avec une plus grande précision.

OBJET DE L'INVENTION

Un but de l'invention est donc de permettre, avec un unique système, la combinaison et la corrélation de données issus d'un dispositif d'imageries corrélées de spectre et de temps de vie de fluorescence (SLIM) et d'un dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS).

Ce problème est résolu selon l'invention par un système d'analyse moléculaire tel que décrit précédemment, comprenant en outre :

- un dispositif de spectroscopie par corrélation de la fluorescence émise par les molécules excitées, apte à commuter avec le dispositif d'imageries corrélées de sorte à réaliser de manière simultanée des mesures d'imageries corrélées et de spectroscopie, et

- un dispositif de contrôle agencé de sorte que les données issues du dispositif d'imageries corrélées participent à l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation.

Grâce à la combinaison d'un système d'analyse moléculaire de l'art antérieur avec ces dispositifs de spectroscopie par corrélation de fluorescence et de contrôle, il est possible de réaliser simultanément des mesures SLIM et FCS et, ensuite, d'exploiter ces données qui ont été acquises sur la même base temporelle. En particulier, le dispositif de contrôle permet d'ajuster les données FCS, par exemple en intégrant les données SLIM au modèle de représentation de FCS. Ainsi constitué, le système selon l'invention permet donc l'obtention de mesure plus précises. En outre, la conception modulaire de ce système présente l'avantage de faciliter sa fabrication et sa maintenance, notamment dans le cas du remplacement d'un module défectueux par un nouveau module.

En vue de disposer d'informations complémentaires avec cet unique système, le dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence est de préférence muni d'au moins deux canaux de spectroscopie agencés de sorte à réaliser un dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence et un dispositif de spectroscopie par corrélation croisée de fluorescence. En effet, ce type de mesure permet d'accéder à d'autres paramètres concernant les particules à analyser.

Dans ce dernier cas, selon un mode de réalisation particulier, les canaux de spectroscopie comportent des fibres optiques, ce qui permet un guidage optimal de la lumière qui doit être dirige vers les dispositifs considérés.

De préférence, le dispositif d'imageries corrélées (de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées) est combiné à un dispositif d'imagerie de temps de vie de fluorescence sous microscope. Ce nouveau dispositif (FLIM), permet une mesure de données sur une seule bande spectrale, mais avec une résolution plus élevée, ce qui permet donc d'obtenir certaines informations temporelles préalablement choisies de manière plus précise.

De préférence, la commutation entre les dispositifs de spectroscopie par corrélation et d'imageries corrélées est réalisée au moyen d'un coupleur. Ce moyen de couplage peut se présenter par exemple sous la forme d'un commutateur à plusieurs positions, chaque position fournissant plusieurs flux lumineux, dans différentes proportions, en direction des dispositifs d'imagerie et de spectroscopie compris dans le système. On rend ainsi possible à tout instant le choix des dispositifs dont on souhaite qu'il procède à une analyse de molécules. Dans ce dernier cas, le coupleur est avantageusement muni d'une séparatrice sensible à la polarisation du faisceau issu du dispositif de microscopie confocale. De la sorte, il est possible de faire des mesures de types différents sur les différentes polarisations du faisceau d'entrée. En particulier, il est possible d'attaquer le spectrographe du module SLiM avec une polarisation optimale et d'utiliser le reste de la lumière pour d'autres mesures, optimisant alors l'efficacité globale de collection du système.

De préférence, le dispositif d'imageries corrélées (de spectre et de temps de vie de la fluorescence émise par les molécules excitées) est agencé pour recueillir des données spectrales et temporelles relatives aux interactions moléculaires. Ce dispositif permet ainsi de déterminer la présence ou non d'interactions moléculaires au sein de l'échantillon à analyser. En fonction du résultat de cette détermination, il est possible de déclencher des mesures adéquates, en fonction des informations que l'on souhaite en retirer, comme par exemple une mesure FCS, FCCS ou FLIM.

Selon un mode de réalisation particulier, l'ajustement des données issues du dispositif de spectroscopie par corrélation de fluorescence consiste à ajuster le modèle de représentation de l'émission par fluorescence des molécules.

Selon un mode de réalisation avantageux, le dispositif de microscopie confocale est muni de moyens d'illumination agencés pour émettre un faisceau lumineux d'excitation des molécules. Ces molécules excitées sont ainsi aptes à générer de la fluorescence en retour.

De préférence, tous les dispositifs du système selon l'invention sont motorisés et pilotés à distance, ce qui permet une meilleure manipulation par un utilisateur. L'invention concerne également un procédé d'analyse moléculaire tel que décrit précédemment, comprenant en outre :

- une étape de d'acquisition spectroscopique par corrélation de la fluorescence émise par les molécules excitées, simultanée à l'étape d'acquisition d'images corrélées, et

- une étape de contrôle des données recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées de sorte qu'elles participent à l'ajustement des données recueillies lors de ladite étape d'acquisition spectroscopique.

Ce procédé présente les mêmes avantages que le système d'analyse moléculaire selon l'invention, à savoir la possibilité d'obtenir des données complémentaires de manière simultanée, en vue de les combiner/corréler pour en déduire ensuite des informations complémentaires et/ou plus précises sur la dynamique et les interactions moléculaires.

De préférence, l'étape d'acquisition spectroscopique s'opère sur au moins deux canaux de spectroscopie agencés de sorte à permettre une corrélation de fluorescence et une corrélation croisée de fluorescence, ce qui permet d'accéder à d'autres paramètres concernant les particules à analyser. Aux fins de conditionner la mesure par les dispositifs du système autres que le dispositif SLIM à la présence d'interactions, les données recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées (SLIM) sont préférentiellement traitées de manière à déterminer la présence éventuelle d'interactions moléculaires.

En l'absence d'interactions moléculaires, il peut être prévu que les données recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique soient traitées par corrélation croisée de manière à déterminer le niveau d'indépendance des molécules.

En présence d'interactions moléculaires, il peut être prévu que les données recueillies lors de l'étape d'acquisition d'images corrélées soient traitées de manière à déterminer les proportions de molécules en interaction et la distance entre les molécules en interaction.

Dans ce dernier cas, l'ajustement des données recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique est réalisée à partir des proportions de molécules en interaction et de la distance entre les molécules en interaction préalablement déterminées.

Toujours en présence d'interactions moléculaires, il peut être enfin prévu que les données recueillies lors de l'étape d'acquisition spectroscopique soient traitées de manière à déterminer les concentrations de donneurs et d'accepteurs d'une interaction, ainsi que la constante de diffusion commune aux donneurs et accepteurs d'une interaction.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'exemples non limitatifs de réalisation, accompagnée de figures représentant respectivement :

- la figure 1 , un schéma d'ensemble d'un système d'analyse moléculaire selon un mode de réalisation particulier de l'invention,

- la figure 2, un schéma d'un microscope confocal intégré au système d'analyse moléculaire selon l'invention,

- la figure 3, un schéma d'un coupleur intégré au système selon l'invention,

- la figure 4, un schéma d'un dispositif combinant des mesures FCS et FCCS, intégré au système selon l'invention, - la figure 5, un schéma de dispositifs de mesure SLIM et FLIM, intégrés au système selon l'invention, et

- la figure 6, un diagramme illustrant un procédé d'analyse moléculaire selon un mode de réalisation particulier de l'invention.

Pour une meilleure lisibilité, sur ces figures, des références numériques identiques se rapportent à des éléments techniques similaires.

EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS

Le système selon l'invention vise à analyser un échantillon dans un milieu. Cet échantillon peut être un milieu liquide, gazeux, ou un objet biologique contenant des particules à analyser. Les particules à analyser peuvent être des molécules ou des assemblages moléculaires, comme par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles.

On a représenté sur la figure 1 un système d'analyse moléculaire 1 selon un mode de réalisation particulier de l'invention, intégrant de manière modulaire :

- un dispositif de microscopie confocale 2,

- un dispositif de couplage 3,

- un dispositif de spectrosopie par corrélation de fluorescence FCS 5 (qui peut éventuellement être remplacé par un dispositif combinant autocorrélation et corrélation croisée de fluorescence 6, tel que décrit en référence à la figure 4),

- un dispositif de microscopie par imageries corrélées de temps de vie de fluorescence et de spectre d'émission de fluorescence 7,

- un dispositif de microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence FLIM 8, et

- un dispositif de contrôle 9.

Un exemple de microscope confocal est décrit à la figure 2. Il comprend en outre des moyens d'illumination 20, de séparation dichroïque 21 , de focalisation 22, de support 23 et de filtrage spatial 24.

Les moyens d'illumination 20 génèrent un faisceau lumineux d'excitation collimaté 25. Ces moyens sont constitués d'une source laser puisée, par exemple une source laser impulsionnelle femtoseconde infrarouge (type Titane-Saphir accordable). Le faisceau lumineux d'excitation 25 est dirigé vers les moyens de séparation dichroïque 21 , avantageusement constitués d'une filtre dichroïque de type coupe-bande, disposé à 45° du faisceau incident d'excitation 25. Il peut également être utile d'adjoindre des moyens de balayage (non représentés), par exemple un scanner.

Les moyens de focalisation 22 sont constitués d'un objectif de microscope, par exemple un objectif apochromatique présentant un grandissement de 40x et une ouverture numérique de 1 ,2.

Les moyens de support 23 sont constitués d'un substrat de verre, par exemple une lamelle de microscope. Ils supportent l'échantillon 2, avantageusement enfermé dans une boîte étanche dont les parois sont résistantes à l'eau.

Le faisceau lumineux d'excitation 25 ainsi focalisé interagit avec des particules en solution dans l'échantillon disposé sur les moyens de support 23, selon un phénomène de fluorescence. Chaque particule excitée va émettre par fluorescence une réponse lumineuse à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau d'excitation 25. Une partie de cette réponse lumineuse est alors collectée par les moyens de focalisation 22 de sorte à former un faisceau lumineux de réponse 26.

Ce faisceau lumineux de réponse 26 est envoyé en direction du dispositif de couplage 3 au travers des moyens respectivement de focalisation 22, de séparation dichroïque 21 de filtrage spatial 24 (au moyen d'un trou confocal), et éventuellement de balayage (non représentés).

Afin de réaliser la détection du faisceau de réponse 26, les moyens de filtrage spatial 24 comprennent un ensemble de lentilles permettant de conjuguer le plan focal des moyens de focalisation 22 avec le plan du capteur de chacun des moyens de détection compris dans chacun des dispositifs SLIM, FLIM, FCS et FCCS. Ces moyens de filtrage spatial 24 comprennent également une ouverture de dimension réglable, disposée suivant l'axe du faisceau lumineux 26. Elle est conjuguée optiquement avec le point de focalisation des moyens de focalisation 22. Elle permet de sélectionner un volume de détection autour de ce point de focalisation.

Un exemple de coupleur 3 est décrit à la figure 3. Il comprend en outre une bride de fixation 30, un premier doublet achromatique 31 , un premier commutateur à trois positions 32, 33 et 34, un second commutateur à deux positions 36 et 37 et enfin, un second doublet achromatique 35.

La bride de fixation 30 est disposée à la sortie du microscope 2.

Le premier doublet achromatique 31 est monté sur platine à flexion XY et glissière pour positionnement XYZ. Sa focale et son diamètre peuvent être respectivement égaux à 125 mm et 12,7 mm. Il est disposé de sorte à collimater le faisceau (divergent) issu du trou confocal (des moyens de filtrage spatial 24) et adapter l'ouverture entre le microscope 2 et le spectrographe du module SLIM 7 (ou le capteur du module FCS/FCCS 6).

Un commutateur manuel reçoit le faisceau collimaté. Le but est de diriger à chaque position des proportions différentes du faisceau pour les diriger séparément, d'une part, vers le module FCS/FCCS 6 et, d'autre part, vers les modules SLIM 7 et FLIM 8. Pour cela, il est apte à travailler selon trois positions 32, 33 et 34 :

- la première position 32 du commutateur est vide, si bien que 0% du flux est dirigé vers le module FCS/FCCS et 100% vers les modules FLIM et SLIM,

- la seconde position 33 du commutateur comporte un miroir plan, incliné à 45° par rapport à l'axe optique du microscope 2, de dimensions 15 mm par 15 mm, si bien que 100% du flux est dirigé à 90° vers le module FCS/FCCS et 0% vers les modules SLIM et FLIM, et

- la troisième position 34 du commutateur comporte un cube séparateur (éventuellement polarisant), de dimensions 10 mm par 10 mm, si bien que 50% du flux est dirigé à 90° vers le module FCS/FCCS (polarisation horizontale) et 50% vers les modules SLIM et FLIM (polarisation verticale). De la sorte, il peut être déterminé si 0%, 50% ou 100% du flux est dirigé vers le module FCS/FCCS, le reste étant dirigé vers les modules FLIM et SLIM. L'homme du métier notera ici qu'il est possible de réaliser des commutateurs avec un nombre différent de positions sans pour autant sortir du cadre de l'invention.

Le faisceau dirigé vers les modules SLIM 7 et FLIM 8 traverse d'abord le second commutateur manuel. Le but est de diriger à chaque position deux proportions différentes du faisceau pour les diriger séparément, d'une part, vers le module SLIM 7 et, d'autre part, vers le module FLIM 8. Pour cela, il est apte à travailler selon deux positions 36 et 37 :

- la première position 36 du commutateur est vide, si bien que 0% du flux est dirigé vers le module FLIM et 100% vers le module SLIM,

- la seconde position 37 du commutateur comporte un miroir plan, incliné à 45° par rapport à l'axe optique du microscope 2, de dimensions 15 mm par 15 mm, si bien que 100% du flux est dirigé à 90° vers le module FLIM et 0% vers les modules SLIM.

Le faisceau dirigé vers le module SLIM 7 traverse ensuite le second doublet achromatique 35, monté sur platine à flexion XY et glissière pour positionnement XYZ. Sa focale et son diamètre peuvent être respectivement égaux à 24 mm et 1 1 ,5 mm. Il est disposé de sorte à focaliser le faisceau (collimaté) provenant du premier doublet 31 sur l'orifice d'entrée du spectrographe du module SLIM 7. Ce faisceau pénètre ensuite le module 6.

Grâce au premier doublet 31 (qui collimaté le faisceau 26 issu du trou confocal) et au second doublet 35 (qui refocalise le signal sur l'orifice d'entrée du spectrographe du module 7), le coupleur 3 sert ainsi à adapter l'ouverture des faisceaux sortant du microscope confocal 2 (via le trou confocal) à celle du dispositif de mesure utilisé pour les mesures de SLiM.

Un exemple de dispositif de spectroscopie par autocorrélation et corrélation croisée de fluorescence (FCS/FCCS) 6 est décrit à la figure 4. Il comprend en outre une séparatrice 60, deux fibres optiques 62 et 65, deux moyens d'injection 61 et 64 de la lumière dans ces fibres, et deux détecteurs rapides 63 et 66.

La séparatrice 60 sépare le faisceau issu du coupleur 3 entre deux sous-faisceaux d'égale intensité, séparés d'un angle égal à 90°. Selon une autre variante de mise en œuvre, cette séparatrice peut être remplacé par un élément séparateur dichroïque, éventuellement sensible à la polarisation. Selon cette variante, des mesures pourront être réalisées en fonction de la longueur d'onde ou permettront de réaliser des mesures d'anisotropie de fluorescence.

Les deux canaux de spectroscopie, vers lesquels sont dirigés les deux sous- faisceaux, sont structurellement identiques. Aussi, seul le premier canal sera décrit ci-après. Ce premier canal comporte une lentille 61 pour l'injection du sous- faisceau dans la fibre optique 62, cette dernière étant agencée de sorte à diriger la lumière vers un détecteur rapide APD 62. Le second canal comprend les mêmes éléments, notés 64, 65 et 66.

Les flux mesurés par les deux détecteurs rapides 63 et 66 sont ensuite transmis sous forme de signal électrique au dispositif de contrôle 9.

L'homme du métier notera que pour réaliser un module FCS 5, apte à réaliser seulement de l'autocorrélation et pas de corrélation croisée de fluorescence, il lui suffit d'adapter le module 6 en supprimant le miroir dichroïque 60 et un canal de spectroscopie, de sorte qu'il ne reste qu'un seul canal spectroscopique, muni des éléments 61 , 62 et 63 (ou 64, 65 et 66).

Des exemples d'un dispositif de microscopie par imageries corrélées de temps de vie de fluorescence et de spectre d'émission de fluorescence (SLIM) 7 et d'un dispositif de microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM) 8 sont décrit plus particulièrement à la figure 5.

Le module SLIM 7 comporte un orifice d'entrée 70 (un diaphragme ajustable, par exemple entre 0,5 mm et 7 mm), ainsi qu'un miroir plan, de dimensions 25 mm par 25 mm, afin de renvoyer le faisceau vers le réseau 72 du spectrographe.

Le réseau 72 est un réseau holographique concave, de dimensions 52 mm par 52 mm, de pas 372 traits/mm, de focale 166 mm, disposé sur une monture cinématique (de type trait-point-plan) réglable en rotation afin de permettre d'orienter les traits. Ainsi, les seuls éléments optiques du module 7 sont le miroir 71 et le réseau 72, ce qui limite les pertes de photons.

Un détecteur 73 est enfin disposé de sorte à collecter au moins une partie du flux lumineux diffracté sur le réseau 72. Il s'agit d'un détecteur multicanaux rapide (de l'ordre de 200 picosecondes de FWHM), par exemple un photomultiplicateur multianodes (16 anodes de dimensions 0,8 mm par 16 mm), disposé sur une monture cinématique (de type trait-point-plan) ajustable en rotation.

Le module FLIM 6 comporte un filtre passe bande interchangeable et un détecteur 80, par exemple un photomultiplicateur rapide (inférieur à 50 picosecondes de FWHM).

Ce système rend ainsi le couplage vers trois dispositifs de détection indépendants (les modules 6, 7 et 8), dans des proportions de flux lumineux qui peuvent être réglables. La mesure simultanée par plusieurs dispositifs de détection indépendants est donc rendue possible par ce système selon l'invention.

Enfin, on a représenté sur la figure 6 un diagramme illustrant un procédé d'analyse moléculaire selon un mode de réalisation particulier de l'invention. Dans cette figure, les carrés représentent des étapes de mesure ou d'analyse, les losanges des étapes de détermination, les octogones des données, les flèches en traits pleins la succession des étapes et les flèches en pointillés l'utilisation de données pour la mise en œuvre d'étapes.

Ce procédé vise la mise en œuvre et l'exécution d'un système d'analyse moléculaire selon l'invention, comprenant en particulier des modules de détection SLIM et FCS/FCCS. Il peut également être complété par des mesures FLIM (à une seule bande spectrale), dans le but d'obtenir des informations issues du SLIM (à plusieurs bandes spectrales) avec une plus grande précision. Il s'agit en l'état des informations au niveau de la bande spectrale en commun entre les mesures SLIM et FLIM. Parmi ces informations quantifiables, on note les interactions à courte distance, la diffusion, la concentration et l'appartenance à un même complexe.

Ce procédé vise en outre la corrélation des données issues des modules SLIM et FCS/FCCS. Pour cela, la stratégie de corrélation proposée s'appuie sur différents modes d'observation de la lumière afin de réaliser des modèles fonctionnels des événements biologiques étudiés. Pour y parvenir, les différentes mesures se font de façon simultanée sur la même région de l'objet.

Cette stratégie de corrélation se décompose de la façon suivante. Des mesures SLIM permettent de savoir si une interaction a lieu entre les deux molécules étudiées, y compris dans des milieux complexes. Si aucune interaction moléculaire n'est observée, une mesure FCCS permet de savoir si les deux molécules sont indépendantes ou si elles appartiennent à un même complexe. Si une interaction moléculaire est observée, on réalise des mesures de FCS à deux canaux (un canal pour le donneur de l'interaction, un canal pour l'accepteur). Dans ce cas, au moins une fraction des deux protéines a les mêmes constantes de diffusion. Cette information permet ensuite de réaliser un ajustement global par partie des données de FCS (afin de stabiliser les résultats), de déterminer le temps de diffusion des protéines en interaction, et de déterminer avec précision la distance mais également la concentration des molécules en interaction (le SLIM donne accès à la distance et la proportion des molécules, alors que la FCS donne accès aux concentrations de molécules marquées).

Plus précisément, en référence à la figure 6, on procède simultanément à des mesures SLIM (étape 100), FCS 1 (étape 102) et FCS 2 (étape 104). Ces étapes de mesure FCS 1 et FCS 2 représentent des mesures de FCS à un canal : FCS 1 pour le premier canal, FCS 2 pour le second. En l'espèce, les mesures FCS 1 et FCS 2 correspondront à des mesures respectivement sur le donneur et sur l'accepteur de l'interaction moléculaire, ce qui permettra de déterminer plusieurs données relatives à la nature de l'interaction moléculaire.

Par la suite, ces mesures à deux canaux pourront permettre des calculs de corrélation croisée (entre FCS 1 et FCS 2) ou des calculs d'autocorrélation distincts (une autocorrélation pour FCS 1 , une pour FCS 2). Ces étapes de mesures permettent de disposer de données SLIM (101 ), de données FCS 1 (103) et de données FCS 2 (105).

Par la suite, il est procédé à l'analyse des données SLIM (étape 106) qui viennent d'être mesurées. Le but de cette première analyse est de déterminer (étape 107) la présence éventuelle d'interactions moléculaires.

S'il est déterminé l'absence d'interactions lors de l'étape 107, on procède à l'analyse de données FCCS (étape 108), déterminées à partir des données FCS 1 (103) et FCS 2 (105) mesurées sur les deux canaux de FCS simultanément. Le but de cette analyse est de déterminer (étape 109) si les molécules (qui ont été jugées sans interaction à l'étape 107) sont ou non indépendantes. Dans la positive, il est considéré comme nouvelle donnée (1 10) le fait que les molécules sont membres du même complexe. Dans la négative, il est considéré comme nouvelle donnée (1 1 1 ) le fait qu'il n'y a pas de lien entre les molécules.

Après la détermination de l'étape 109, le procédé est terminé et il est conclu quant à l'absence d'interactions moléculaires et l'indépendance éventuelle des molécules.

S'il est déterminé la présence d'interactions lors de l'étape 107, on procède alors conjointement aux analyses des données SLIM (étape 1 12) et des données FCS 1 et FCS 2 (étape 1 13).

Une deuxième analyse des données SLIM de l'étape 1 12 permet d'aboutir à de nouvelles données parmi lesquelles le pourcentage de molécules en interaction (1 17) et la distance entre les molécules en interaction (1 18).

L'analyse des données FCS 1 et FCS 2 de l'étape 1 13 permet également d'aboutir à de nouvelles données parmi lesquelles la concentration 1 (1 14), la concentration 2 (1 15) et la constante de diffusion commune à FCS 1 et FCS 2 (1 16). Il convient ici de noter que la concentration 1 correspond à la concentration de la molécule étudiée au niveau du canal FCS 1 , donc la molécule considérée comme donneur de l'interaction, tandis que la concentration 2 correspond à celle de la molécule considérée comme accepteur de l'interaction.

A partir de ces données 1 14, 1 15 et 1 16, il est possible de construire un modèle de représentation de l'émission par fluorescence des molécules excitées.

Enfin, suite aux analyses conjointes des données SLIM (étape 1 12) et des données FCS 1 et FCS 2 (étape 1 13) et à la détermination des paramètres 1 14 à 1 18, il est procédé à l'ajustement (étape 1 19) des données 1 14 à 1 16 (issues de l'analyse des données de FCS 1 et FCS 2). Lors de cette étape 1 19, les données 1 17 et 1 18 sont utilisées afin d'ajuster les données 1 14 à 1 16, de sorte à améliorer leur précision et par la suite d'améliorer la précision du modèle de représentation de émission par fluorescence des molécules.

Après l'ajustement de l'étape 1 19, le procédé est terminé et il est conclu quant à la présence d'interactions moléculaires, quant au nombre de molécules libres et de molécules en interaction, éventuellement quant à la distance moyenne entre molécules, quant à l'intégration des molécules dans un complexe, ainsi que quant à certaines informations relatives à l'interaction.

Il est clair pour l'homme du métier que le nombre d'informations déterminées grâce au procédé selon l'invention, ainsi que la précision de ces informations, ne saurait résulter de la mesure sur un seul module (SLIM ou FCS) et de l'analyse des données mesurées sur ce module. En effet, d'une part, les différents modules mis en œuvre se combinent en vue de réaliser des mesures simultanées, dont il est possible d'extraire de nouvelles informations, du fait de la base temporelle communes à toutes ces mesures. D'autre part, l'analyse conjointe des données issues de tous ces modules permet d'en déduire de nouvelles informations et par ailleurs d'ajuster certaines données relative à l'interaction.

Le système et le procédé selon l'invention, décrits ci-dessus, permettent donc d'affiner la connaissance sur la dynamique et les interactions moléculaires, y compris en milieu biologique complexe, par l'obtention d'un plus grand nombre d'informations et l'amélioration de la précision de ces dernières.

Les modes de réalisation précédemment décrits de la présente invention sont donnés à titre d'exemples et ne sont nullement limitatifs. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention sans pour autant sortir du cadre du brevet.