Gebiet der Erfindung und Stand der Technik Transfektion ist das Einbringen von Nukleinsäuren wie beispielsweise Nukleotiden, Anti- sense-RNA, Ribozymen, oder insbesondere DNA in Form von Plasmiden. Chromosomen, oder Chromosomfragmenten zur Expression eines Gens in Zellen Der Begriff Trarisjer ist hierzu analog, wobei im allgemeinen Sprachgebrauch die Bezeichung Tnansfektion insbeson- dere für Gentransfer verwendet wird Neben dem Transfer von Nukleinsauren ist auch der gerichtete und effiziente Transfer weiterer Wirkstoffe, wie beispielsweise Proteine, Peptide.

Arznei-Wirkstoffe und andere molekulare Substanzen von großem Interesse. Der Trans- ferprozeß besitzt wesentliche Bedeutung sowohl für die biomedizinische Grundlagenfor- schung als auch für die pharmazeutisch-biotechnologische Industrie. Einige Proteine, darunter therapeutisch relevant. werden nur bei einer Herstellung in eukaryontischen Zellen korrekt prozessiert, da die Modifikationsmaschinerie, die ein Protein nach der Translation noch ver- ändert, in prokaryontischen Organismen zum großen Teil nicht vorhanden oder erheblich anders ausgestaltet ist. Andere Proteine dagegen werden vorteilhaft in prokaryontischen Wiltszellen produziert, da hier kostengünstig große Mengen des Proteins einfach herstellbar sind. Weiterhin ist die Transfektion und gezielte Expression bestimmter Gene ein bedeuten- des Werkzeug der Zell-und Molekularbiologie, um biologische Prozesse zu analvsieren und zu charakterisieren. Die Transfektion von Pflanzenzellen ist eine wichtige Methode für Pflan- zentechnologie bezüglich der Herstellung von Pflanzen mit neuen Eigenschaften und Inhalts- stoffen (transgene Pflanzen) oder herbizidresistenter Pflanzen. Schließlich werden im Rah- men von biomedizinischer Forschung auch regelmäl ? ig Zellen mit einzelsträngigen Nuklein- säuren (ssDNA oder ssRNA) oder mit Nukleinsäureanaloga (beispielsweise Peptide Nucleic Acids, PNAs) transfizieit, die intrazellulär als Effektoren, beispielsweise als spezifische Inhi- bitoren von Proteinsynthesen durch sogenannte Antisense-Techniken, wirksam werden. In all diesen Prozessen und Methoden ist die Transfektion zur spezifischen Einbringung einer rele- vanten Nukleinsauren ein wichtiger Verfahrensschritt In gleicher Weise sind auch Verfahren relevant, die direkt ein Protein oder Peptid in eine Zelle transportieren können, hier sind die wichtigsten Anwendungsfälle jeweils Therapeutika.

Beispielsweise können intrazelluläre Antikörper dazu venvendet werden, spezifisch Pathoge- ne in Zellen zu erkennen und zu inhibieren. Eine Methode hierfür ist die Elektroporation von Makromolekülen in die Zielzellen: diese Methode ist jedoch nur in vivo anwendbar und nur mit gennger Effizienz und relativ hohen Verlusten bezüglich der Zellen verbunden (vgl. E. J Verspohl, 1. Kaiserling-Buddemeier A Wienecke, Introducing specific antibodies into e- /<?cf/'o/?c/'/Meo/?///zcCC//.S-W7//5/eoo//b/-e/!/y:f/y/?c c/7ccc///wiCf/o, Cell. Bio- chem. Funct. Band 15, S. 1'7-134. 1997).

Zum Transfer von Nukleinsauren in Zellen sind nach dem Stand der Technik einige Metho- den bekannt. Dazu zählen-wie bei dem vorstehend genannten Verfahren zum Transfer von Proteinen-physikalische Verfahren wie die Elektroporation, bei der durch Anlegen eines elektrischen Feldes die Membran von Zellen perforiez und damit durchlässig für große Mai ;- romoleküle wird. Elektroporation ist jedoch bei sensitiven Zellen oft schwierig und oft mit nur geringer Uberlebensrate der Zellen verbunden. Im Falle von eukaryontischen Zellen wer- den nach dem Stand der Technik meist chemische Methoden verwendet, wie beispielsweise die Kopräzipitation von Calciumphosphat und DNA, oder die Bildung von höhermolekularen Komplexen, beispielsweise aus DEAE-(Diethylaminoethyl-) Dextran und DNA (vgl. Y. W.

Yang & J. C. Yan... Studies of DEAE-dextran-mediated gene transfer". Biotechnol. Appl. Biochem. 1997, Band 25. S 47-51) oder von Dendrimeren mit DNA (vgl. J. F. Kukowska- Latallo. A. U. Bielinska. J. Johnson. R. Spindler. D.A. Tomalia, & J. R. Baker lr.,,. Efficien ; transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendri- mers". Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, Band 93. S. 4897-4902). Grundprinzip dieser Transfektionsreagenzien ist zunächst eine Kompaktierung des langen und mechanisch steifen Nukleinsäurefadens. diese Kompaktierung ist in den meisten Fällen eine wichtige Vorausset- zung für die erfolgreiche Aufnahme der Nukleinsäuren in die Zellen. Gelegentlich wird dies auch durch ein Polykation erreicht wie beispielsweise reines oder modifiziertes Polylysin (vgl. hierzu beispielsweise Patent WO 98/06869).

Im medizinisch-phanmazeutischen Anwendungsbereich werden liposomenbasierte Systeme auf der Grundlage von kationischen Lipiden oft für Transfektionen bevorzugt ; sie besitzen den Vorteil hoher Effizienzen. Dabei erfolgt ein Einschluß der Nukleinsäuren in kationische Liposomen verschiedener Herkunft und Zusammensetzung (vgl. die kommerziellen Produkte PerFect der Fa. lnvitrogen. FuGene der Fa. Roche. Lipofectamine der Fa. Life Technologies, PolyFectin der Fa. Biontex, und LipoTaxi der Fa. Stratagene). Eine umfassende und aktuelle Übersicht dazu findet sich bei R. J. Lee & L. Huang,"Lipidic vector systems for gene trans- fer", Ci-it. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1997, Band 14, S. 173-206. Hierzu existieren auch eine große Zahl von internationalen Patenten, die sich hauptsächlich durch die verwendete Formulierung der Liposomen unterscheiden.

Allerdings besitzen die genannten Techniken und Reagenzien jeweils verschiedene individu- elle Nachteile. Zum einen sind die bestehenden Systeme (außer den liposomenbasierten Pro- dukten) eher ineffizient, mit Ausbeuten von nur wenigen Prozent der zu transfizierenden Zellen ; zum anderen sind gerade die effektiven (liposomenbasierten) Reagenzien zunehmend toxisch, insbesondere für empfindliche eukaryontische Zellen. Auch andere nachteilige Ei- genschaften sind beschrieben ; beispielsweise lösen sich bei der Transfektion von adhärenten eukaryontischen Zellen mit DEAE-Dextran die nur schwach angehefteten Zellen uner- wünschterweise von ihrem Untergrund, der Zellkulturschale. Auch Transfektionsagenzien. die nicht unmittelbar toxisch für Zellen sind, können Eigenschaften aufweisen, die die Zellen nach der Transfektion beeinflussen. Weiterhin sind die existierenden Agenzien der neuen Generation wie beispielsweise Dendrimere (Produkt SuperFect-Fa. Qiagen) zwar in be- stimmten Anwendungsfällen nur wenig toxisch, dafür jedoch aufwendig in der Herstellung und somit teuer. Schließlich erfordern viele der bisherigen Transfektionsprotokolle eine eroße Zahl von Manipulationen durch den Anwender und sind somit in ihrer Anwendung kompli- ziert und langwierig ; auch kann dies die Reproduzierbarkeit von Transfektionsversuchen ne- gativ beeinflussen. Die von Herstellern vorgegebenen Standardprotokolle für Transfektionen müssen für jeden Zelltyp individuell modifiziert und neu optimiert werden, um jeweils ma- ximale Ausbeuten zu erreichen. Die Agentien sind nur für den Transport von doppelsträngi- ger DNA. nur selten für einzelsträngige Nukleinsäuren, und praktisch nie für andere moleku- lare Substanzen wie beispielsweise Proteine oder Peptide geeignet. Und nicht zuletzt bestehen die üblichen Transfektionsreagenzien nur aus jeweils einer oder wenigen molekularen Spezies und sind daher wenig variabel in ihrer Anwendbarkeit.

Aufgabe der Erfindung ist es, die vorstehend genannten Nachteile nach dem Stand der Tech- nik zu beseitigen oder abzumildern. Dazu wird erfindungsgemäß ein Verfahren nach An- spruch 1 zum Transfer von Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga, und/oder Nuklein- säuren und/oder Nukleinsäureanaloga und/oder Aminosäuren enthaltenden Substanzen, in prokaryontische und/oder eukaryontische Zellen bereitgestellt, wobei -die zu transferierende Nukleinsäure oder das Nukleinsäureanalogon, oder die Nuklein- säuren oder Nukleinsäureanaloga oder Aminosäuren enthaltende Substanz mit einem prokaryontischen Nukleinsäure-bindenden Protein in Kontakt gebracht wird, um einen Komplex aus der Nukleinsäure, dem Nukleinsäureanalogon, oder der Nukleinsäuren o- der Nukleinsäureanaloga oder Aminosäuren enthaltenden Substanz und dem Nuklein- säure-bindenden Protein zu bilden. und -anschließend der Komplex aus Nukleinsäure, Nukleinsäureanalogon und/oder Nuklein- säuren oder Nukleinsäureanaloga oder Aminosäuren enthaltender Substanz und dem prokaryontischen Nukleinsäure-bindenden Protein mit den prokaryontischen oder eu- karyontischen Zielzellen in Kontakt gebracht wird, um einen Transfer des Komplexes in die Zellen zu erreichen.

Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteran- sprüchen und der Beschreibung.

Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transfer von Nukleinsäuren, Nuklein- säureanaloga und/oder von Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga oder Aminosäuren ent- haltenden Substanzen, insbesondere von Nukleinsäuren wie DNA in Form von Plasmiden, in prokaryontische oder eukaryontische Zellen.

Dabei wird ein prokalyontisches, Nukleinsäure-bindendes Protein unter geeigneten Inkubati- onsbedingungen an die zu transferierende Substanz kovalent angebunden oder zur nichtko- valenten Assoziation mit der zu transfizierenden Nukleinsäure gebracht, und dieser Komplex zu den Zielzellen gegeben. Die besondere Eigenschaft des prokaryontischen Nukleinsäure- bindenden Proteins zur Kondensation von DNA begünstigt dabei wesentlich den Transfer von DNA-basierten Wirkstoffen. Zur Steuerung der Aufnahme und zur Erhöhung der Effizienz kann das prokaryontische Nukleinsäure-bindende Protein weitere Ausgestaltungsmerkmale, beispielsweise in Form von zusätzlichen Fusionen, auíiveisen. Die Zellen internalisieren den Komplex aus Protein und Wirkstoff bzw. Protein und Nukleinsäure. Verschiedene Ausfüh- rungsformen sind schematisch in Figur 1 gezeigt.

Zum Transfer wird ein prokaryontisches, Nukleinsäure-bindendes Protein verwendet, vor- zugsweise aus einem thermostabilen Organismus, weiterhin bevorzugt aus einem hyperther- mophilen Organismus. Bei Verendung von Nukleinsäuren als zu transferierende Substanz bildet das Nukleinsaure-bindende Protein mit der Nukleinsaure einen reversiblen Komplex, das prokaryontische Protein kondensien und kompaktiert die Nukleinsåule. Dieser Kompiex ist dadurch auch vor unenvünschten Effekten, beispielsweise dem Abbau durch Nukleasen. geschützt. Solchermaßen kondensierte Nukleinsäuremoleküle können passiv oder aktiv über die Zellmembran von eukaryontischen Zellen oder die Zellwand von prokaryontischen Zellen nach entsprechender Inkubation in diese Zellen aufgenommen werden. Wird als Nukleinsaure dabei ein kodierendes Gen in Form einer entsprechenden DNA (beispielsweise als Plasmid) verwendet, dann kann das Gen anschließend von der Zielzelle exprimiert werden. Wird als zu transportierende molekulare Substanz dagegen ein Protein oder ein Peptid verwendet, dann ist eine Fusion des zu transferierenden Proteins oder Peptids mit dem Transferprotein auf gen- technischer Ebene günstig. Zur Erhöhung der Effizienz kann das nukleinsäurebindende Pro- tein mit Effektoren auf der Basis von Proteinen oder Peptiden verknüpft (fusioniert) werden. Weiterhin kann die Verwendung eines Proteins vorteilhaft sein, welches eine typische Signa- tur für Kerntranslokation in seiner Sequenz aufweist Weiterhin kann eine Umhüllung des Komplexes mit Lipiden, Polyethylenglykol, oder ande- ren Molekülen vorteilhaft bezüglich der Erhöhung der Effizienz und bezüglich der biologi- schen Eigenschaften des Komplexes sein.

Ein wichtiges Merkmal bei der Transfektion von Nukleinsäuren ist deren Kondensation. Die- se Moleküle besitzen üblicherweise in Lösung eine lange, unflexible Struktur, die nur wenig biegsam ist. Aufgrund der umfangreichen kodierenden Länge von Genen kann die DNA sehr lang sein und damit finir die Transfektion ungünstige physikalische Eigenschaften aufweisen. Kondensation ist in dieser Erfindung die Verminderung des ungünstigen Längen-zu- Durchmesser-Verhältnisses der DNA, durch Zusammenballung des DNA-Fadens oder auch eines zirkulären Plasmides zu einer kompakten Struktur. also auf ein kleines Volumen. Opti- male Kondensation zeichnet sich durch die Entstehung einer nahezu globulären Struktur aus. Kondensation von Nukleinsäuren setzt das Vorhandensein von Kondensationsagentien vor- aus. eine übliche Funktion dieser Kondensationsagentien ist dabei die Kompensation der ne- gativen Ladungen auf dem Polyphosphat-Rückgrat der DNA und anderer Nukleinsäuren.

Nach Maßgabe der Erfindung stammt das prokaryontische Nukleinsäure-bindende Protein vorteilharterweise aus einem hvpertheimophilen Organismus. also einem bei Temperaturen von über 75 °C existierenden Lebewesen. Der Vorteil von Proteinen aus diesen Organismen besteht unter anderem dann, daß sie aufgrund ihrer besonderen Stabilitätseigenschaften sehr einfach handhabbar sind und beispielsweise eine Kühlung der Agenzien bei der Aufreinigung und Lagerung nicht notxvendig ist Weiterhin lassen sich Proteine aus diesen Organismen ein- fach und in großer Ausbeute rekombinant in Esci1crichia coli herstellen und reinigen. Dabei kann die hohe Stabilität der Proteine gegen Denatunerung dazu genutzt werden, eine Reini- gung unter sehr stringenten Bedingungen durchzuführen und damit mögliche Kontaminatio- nen in den Präparationen, auch beispielsweise durch bakterielle Lipopolysaccharide (Endoto- xine), DNAsen. Proteinasen, RNAsen, u. a. auf ein Minimum unterhalb der Nachweisgrenze gängiger analytischer Methoden zu begrenzen. Hilfreich ist hier auch die Eigenschaft des in dieser Erfindung vorzugsweise verwendeten Proteins TmHU (Thermotoga maritima HU- Protein). spektroskopisch im Wellenlängenbereich von 260 bis 300 nm transparent zu sein : dadurch ist eine schnelle und empfindliche spekiroskopische Analytik von Verunreinigungen durch Nukleinsäuren oder andere Proteine einfach möglich. Bevorzugt für reproduzierbare und effiziente Transferraten von Nukleinsauren, Nukleinsäureanaloga und/oder Aminosäuren enthaltender Substanzen sind erfindungsgemäß reine Präparationen der Transferagenzien, da Kontaminationen, insbesondere von bakteriellen Endotoxinen. aber auch von Proteinasen, DNasen und RNasen. die Transferergebnisse verschlechtern können. Dies gilt insbesondere für sensitive Zellen beziehungsweise für Verfahren mit geringer Transfereffizienz.

Histone sind Proteine in eukaryontischen Zellkernen. die Nukleinsäuren vonviegend oder gänzlich unspezifisch binden und deren Zweck hauptsächlich in der Kompaktierung (Kon- densation) der DNA liegt, beispielsweise durch Ladungsneutralisation und hydrophobe Ef- fekte. vermittelt durch das Protein. Somit verringern sie den effektiven Raumanspruch der DNA innerhalb des Zellkerns. Histonähnliche Proteine erfüllen nach derzeitigem Kenntnis- stand eine analoge Aufgabe in den einfacher strukturierten (kernlosen) Prokaryontischen Or- ganismen. Beispielsweise ist das DNA-bindende Protein aus dem hyperthermophilen Orga- nismus Tltermotoga maritima (histonähnliches Protein) den aus Eukaryonten stammenden Histonen nicht nur in der Stabilität überlegen, sondem auch in der Handhabbarkeit und be- züglich der genngeren strukturellen Komplexität. So sind beispielsweise eukaryontische Histone Assoziate von bis zu acht verschiedenen Proteinuntereinheiten, die alle separat herge- stellt und in einem Komplex mit DNA assemblien werden müßten. dies ist in vitro kompli- ziert und aufwendig. In der vorliegenden Erfindung werden prokaryontische, histonähnlichc Proteine, bevorzugt das aus dem hyperthermophiien Organismus Thermotoga maritima stammende HU-Protein, verwendet Die von den Erfindern durchgeführten Versuche zeigen überraschend, daß dieses prokaryon- tische DNA-bindende. histonähnliche Protein HU aus dem hyperthermophilen Eubaktenum @ Thermoto-a maritime (Gattung Thermotogales). nachfolgend benannt TmHU, nicht nur Nukleinsäuren bindet, schützt und kondensiert, sondem darüber hinaus auch in der Lage ist, diese Nukleinsäuren außergewöhnlich effektiv in verschiedene Zelltypen zu transportieren. Dabei sind die Effizienzen einer nachfolgenden Genexpression signifikant höher als die ver- gleichbarer. etablierter Agenzien, ohne daß dabei Anzeichen von zellulärer Toxizität erkenn- bar sind. Das Transferprotokoll ist einfach und robust und erfordert einen sehr geringen zen- lichen Aunvand für die Durchführung des Transferts In gleicher Weise konnte gezeigt werden, daß auch Aminosäuren enthaltende Substanzen, beispielsweise Proteine oder Peptide, bevorzugt Proteine, die an TmHU fusioniert werden. vermittels der Aufnahmewirkung von TmHU in die Zielzellen aufgenommen werden.

Als vorteilhaft hat sich dabei weiter der Umstand erwiesen, daß sich das histonähnliche Pro- tein in sehr hoher Ausbeute rekombinant im Bakterium Eschericiiia coli herstellen und ein- fach sowie kostengunstig in spektroskopisch reiner Form isolieren läßt. Der hypeithermophile Ursprung erfordert beispielsweise keine Aufarbeitung und Lagerung des Proteins unter ge- kühlten Umgebungsbedingungen. Darüber hinaus geschieht der primäre Schritt der Reini- gung, die Trennung des HU-Proteins von der Masse der EscfiericS coli-Wirtsproteine, durch eine einfache Hitzefällung. bei der praktisch ausschließlich das thermostabile TmHU- Protein in Lösung bleibt.

Es konnte gezeigt werden, daß das TmHU-Protein hervorragende Eigenschaften bezüglich der Transfektion von Zellen aufweist. Das Protein kompaktiert (kondensiert) Nukleinsäuren zu einem stabilen Komplex. Dadurch ist ein ausgezeichneter Schutz vor Abbau der Nuklein- säuren durch Nukleasen gegeben. Die Komplexe werden effizient in Zellen aufgenommen.

Weiterhin können zusätzlich Peptide oder Proteindomänen an das TmHU-Protein gentech- nisch fusioniert werden, die den Komplexen veränderte Eigenschaften geben. So können mo- difizierte TmHU-Proteine eine Erhöhung der Aufnahmeeffizienz oder eine gerichtete Auf- nahme in die Zellen erlauben. Als Modifikationen kommen beispielsweise Peptide zur Bin- dung an zelluläre Oberflächenstrukturen in Frage, so ist bekannt, daß Peptide mit dem Se- quenzmotiv Arginin-Glycin-Aspartat (RGD) bevorzugt an häufig vorhandene Integnne vom Typ ot,. ß, oder o"ß, auf der Zelloberfläche binden. Von anderen Peptidmotiven ist be- kannt. daß sie durch ihre amphipathische strukturelle Natur eine Insertion in eukaryontische Zellmembranen bewirken und dadurch eine Aufnahme von Molekülen durch die Zellen be- werkstelligt werden kann. Schließlich kann die Erhöhung der Aufnahmeeffizienz und eine Spezifizierung von Zelltypen auch durch die Verwendung von Proteinen oder Proteindoma- nen erreicht werden, die als Effektoren an zelluläre Oberflächenrezeptoren binden. Ein Bei- spiel hierfür ist der Epidermal Growth Factor EGF. der an den (auf einigen Tumorzelltvpen überexprimiemen) EGF-Rezeptor hocn spezifisch binden kann. Dadurch kann die Aufnanme der TmHU/EGF-DNA-Komplexe spezifisch in solche Tumorzellen erfolgen. Aber auch nach der Aufnahme der Komplexe in Zellen können anhaftende Funktionsdomänen zur Steigerung der Effizienz beitragen. Hier sind als Beispiele Proteine zur Bewerkstelligung einer Endoso- men-Freisetzung, und Peptide zur gezielten Aufnahme in eukaryontische Zellkerne durch NLS-Sequenzen (NLS. nuclear localization signal) zu benennen.

Eine Ummantelung der Protein/Nukleins zur weiteren Abgrenzung von der Umgebung sowie gegebenenfalls zur Erhöhung der Transfektionseffizienz kann durch Um- hüllung mit einer Liposomen-Membran bewerkstelligt werden. Liposomen können nach dem Stand der Technik einfach hergestellt werden : dabei erfolgt ein passiver Einschluß der Prote- in/Nukleinsaure-Komplexe in die Liposomen. Diese Konstrukte haben den Vorteil vermin- delter Immunogenitåt bei einer in vivo-Anwendung in Organismen. Darüber hinaus kann durch die Verschmelzung der Liposomenhülle mit der Zellmembran eine Erhöhung der Zell- aufnahme erfolgen. Eine Ummantelung der Protein/Nukleinsaure-Komplexe kann auch durch die Verwendung anderer molekularer Substanzen erfolgen, beispielsweise durch Polyethy- lenglycol der Molekularmasse 2000 Da (PEG 2000). Nach dem Stand der Technik wurde bereits gezeigt, daß eine derartige PEGinylierung zu einer erheblichen Verminderung der Immunantwort bei in no-Anwendungen führt (vgl. beispielsweise die Zusammenfassung bei M. D. Scott & K. L. Muras,.. Cellular camouflage : fooling the immune system with poly- mers", Cuir-. Pilnrn1. Des. 1998. Band 4, S 423-438) Der Transfer von Nukleinsäuren, Nukleinsaureanaloga und/oder Aminosäuren enthaltender Substanzen in Zellen ist in den nachstehenden Beispielen jeweils beispielhaft am Transfer von kodierenden DNA-Sequenzen zur Transfektion eines Reportergenes, sowie am Transfer eines Proteins (GFP) in Zielzellen gezeigt. Als prokaryontisches Protein wird dabei das HU- Protein aus Thermotoga maritima verwendet, das sich als sehr gut geeignet für das beschrie- bene Verfahren erwiesen hat Das Protein besitzt zwei typische Signaturen für eine Kerntranslokation bei Transfer des Proteins in eukaryontische Zellen, vergleichbar mit der Translokationssequenz RPAATKKAGQAKKK nach Robins, Dilworth, Laskey, und Ding- wall, Cell 64, S. 615-623, 1991 ; damit ist eine Kerntranslokation des Proteins sowie der mit dem Protein assoziierten molekularen Substanzen (DNA, Proteine) mit einer Wahrscheinlich- keit von über 9*-3"/o gegeben (ermittelt mit dem nach dem Stand der Technik verwendeten Computerprogramm PSORT II). Diese Kemtranslokation ist besonders beim Transfer von DNA in Zellen von hoher Bedeutung für die große Effizienz des Verfahrens. Das nachfol- gende Beispiel 8 zeigt aber deutlich, daß das Protein nicht nur DNA in Zellen transferieren kann, sondern auch Proteine, die an TmHU angehängt sind. Damit besitzt das Protein auch die vorteilhafte Eigenschaft. eukaryontische Zellmembranen zu passieren. Durch das Anhän- gen von Rezeptorbindungsmodulen wie beispielsweise EGF (vgl. nachstehendes Beispiel 6) kann dabei auch eine gerichtete Aufnahme in Zellen erreicht werden.

Ein besonderer Vorteil des TrnHU-Proteins ist seine fehlende Toxizität in den nachstehend genannten Beispielen, sowie der Umstand, daß adhärente Zellen bei der Transfektion nicht von den Zellkulturgefäßen abgelöst werden. Diese Eigenschaften setzen das Protein von an- deren Transfektionsagentien wie Liposomen oder synthetischen Stoffen (Dendrimere) ab. Gleichfalls ist die Eigenschaft von TmHU, aus einem hyperthermophilen Organismus zu stammen, für die Anwendung des Systems von besonderem Vorteil. So ist die rekombinante Herstellung besonders einfach, und es kann eine hohe Reinheit der Proteinpräparation ge- währleistet werden. Die extrem hohe Thermostabilität des Proteins erlaubt lange und stabile Lagerung auch unter ansonsten ungünstigen Umweltbedingungen. Insbesondere aber ist es möglich, die Protein/Nukleinsäurekomplexe, die für die Transfektion notwendig sind. bei hohen Temperaturen zu generieren. Wird DNA mit dem TmHU-Protein in geeigneten Men- genverhältnissen vermischt und kurzzeitig für etwa 0. 5 bis 10 min auf hohe Temperaturen (um etwa 90 °C) gebracht, dann wird ein feines Präzipitat aus DNA und TmHU gebildet, das für besonders hohe Transfektionseffizienzen geeignet ist. Eine solche Möglichkeit steht nur zur Verfügung, wenn hvperthermophile Nukleinsaure-bindende Proteine eingesetzt werden Die Inkubation der Nukleinsäuren mit dem TmHU-Protein bei üblichen Raumtemperaturbe- dingungen kann dabei zwischen 0. 5 und 180 min betragen, wobei hier eine lnkubation von 60 min in der Regel ausreichend ist. Für den Transfer von Nukleinsäuren mit TmHU hat es sich als vorteilhaft enviesen, dem TmHU/DNA-Gemisch bei der Herstellung der Komplexe zusätzlich Calcium zuzusetzen, das die Komplexbildung beschleunigt. Die Inkubationszeit der bei Raumtemperatur oder bei hoher Temperatur gebildeten Präzipitate mit den Zielzellen kann je nach Zelltyp und Anwendungsfall zwischen 30 Sekunden und mehreren Tagen betra- gen. Besonders gut geeignet sind für die vorliegende Erfindung nukleinsäurebindende Proteine und davon abgeleitete Proteine aus thermophilen und insbesondere hyperthermophilen proka- ryontischen Organismen. Hier kommen aus dem Reich der Archaea insbesondere Vertreter der Crenarchaeota (hyperthermophile Archaebaktehen) in Frage, mit Vertretern der taxono- mischen Gruppen der Pyrodictiales, Sulfolobales, Thermoproteales, oder die unklassifizierten Crenarchaeota wie Aeropyrum, Caldococcus, Cenarchaeum, Igneococcus, Pyrolobus. Sul- fophobococcus, Themnodiscus, und Thermosphaera. Bei den Euryarchaeota sind insbesondere Proteine aus den taxonomischen Klassen der Thermococcales und der Thermoplasmales rele- vant. Aber auch thermophile und hyperthermophile Eubaktelien besitzen natürlicherweise nukleinsäurebindende Proteine, die im Rahmen einer erfindungsgemäßen Anwendung einge- setzt werden können, dazu gehören beispielsweise die Vertreter der taxonomischen Klassen der Thermosulfobakterien. die Aquificales, Themnotogales, oder die Gruppe der Ther- mus/Deinococcus-Baktenen.

Neben Proteinen aus hyperthetmophilen oder thermophilen Organismen können auch Protei- ne aus anderen prokaryontischen Organismen für eine erfolgreiche Transfektion eingesetzt werden, wie dies das nachstehende Beispiel 8 (unter Vervendung des Hou-Prote- aus E- scherichia coli) demonstriert. Hier erfolet die effiziente Bildung der zur Transfektion mit Nukleinsäuren notwendigen Komplexe mit dem prokaryontischen Protein vorzugsweise durch Zugabe geeigneter Mengen an Calcium zum Gemisch. auf einen Hitzeschritt zur Her- stellung der feinen Präzipitate muß hier verzichtet werden. Die Proteine können dabei aus mesophilen Organismen der Reiche Archaebaktenen oder Eubaktenen isoliert werden, oder Modifikationen dieser natürlichen Proteine sein. Als Vertreter der Archaebaktenen sind hier die taxonomischen Gruppen der Korarchaeota und der Euryarchaeota zu nennen, letztere mit den Familen der Archaeoglobales. Halobacteriales. Methanobacteriales, Methanococcales.

Methanomicrobiales. NIethanopyrales. Methanosarcinales. Thermococcales, und Ther- moplasmales. Zu den taxonomischen Gruppen der Eubakterien, die überwiegend nicht- thermophile oder nicht-hyperthermophile Organismen umfassen, gehören in diesem Zusam- menhang insbesondere die Aquificales. die Gruppe der Chlamydiales/Verrucomicrobia. die Gruppe der Coprothermobacter, die Cyanobacteria, die Gruppe der Cytophagales/Grüne Schwefelbakterien, die Gruppe der Fibrobacter/Acidobacteria, die Firmicutes. die Gruppe der Flexistipesk. die Fusobacteria, die Gruppe der Holophaga, die Gruppe der Nitrospira, die Planctomycetales. die Proteobacteria, die Spirochaetales, und die Gruppe der Synergistes.

Bei der Verwendung von prokaryontischen Organismen als Zielzellen für die beschriebene Transfertechnik kann die Bildung der feinen Präzipitate durch die kurzzeitige Erhitzung des TmHU/DNA-Gemisches für eine Steigerung der Transfektionseffizienz sorgen, sofern ein Protein aus einem thermophilen oder einem hypertherrnophilen Organismus verwendet wird. Neben einer Transfektion, die durch einfache Inkubation der TmHU/DNA-Komplexe mit den prokaryoniischen Zellen erfolgt, kann auch eine Elektroporation nach Stand der Technik mit Hilfe der TmHU/DNA-Komplexe erfolgreich sein. Die DNA wird dabei durch das TmHU geschützt und in seiner Struktur stabilisiert. In nachfoleendem Beispiel 1 konnte gezeigt wer- den. daß TmHU auch in hohen Konzentrationen für Eschcrichicr coli nicht toxisch ist. In a- naloger Weise kann auch ein Transfer von Proteinen oder anderen molekularen Substanzen in prokaryontische Zellen erfolgreich durchgeführt werden.

Gleichfalls schützt das TmHU-Protein in vivo Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau. Das rekombinant hergestellte Protein bindet in den Bakterienzellen an die dort vorhandenen Nuk- leinsäuren wie beispielsweise Plasmide. Auf dieser Basis läßt sich ein System herstellen, das unter wirtschaftlichen Bedingungen zur Produktion von großen Mengen von Nukleinsäuren in hoher Reinheit und ohne der Gefahr des enzvmatischen Abbaus durch Nukleasen eeeienet ist.

Ein besonders wichtiges Anwendungsgebiet für den Transfer von molekularen Substanzen in Zellen ist auch die Verwendung von Pflanzenzellen als Zielzellen. Diese Pflanzenzellen zeichnen sich durch eine stabile, kaum durchdringliche Zellwand aus, daher sind derzeit kaum Methoden bekannt, um molekulare Substanzen wie DNA oder Proteine in Pflanzenzellen zu transportieren. Die außerordentlich stabilen TmHU/DNA-Protein-Kompiexe können jedoch dazu geeignet sein, unter üblichen Verfahren nach dem Stand der Technik wie chemische Transfektion, Elektroporation, oder auch durch einfache Inkubation der TmHU/DNA- Komplexe einen Transfer in die Pflanzenzellen zu erreichen. Dabei spielen wiederum die im TmHU vorhandenen Kemtranslokationssequenzen eine wichtige Rolle bezüglich der erreich- baren hohen Effizienz des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens Die gentechnische Veränderung von Pflanzen kann beispielsweise durch die Züchtung ertrag- reicherer Sorten mit günstigeren Eigenschaften einen wesentlichen Beitrag zur Sicherung der Weltemährung leisten. In Westeuropa sind gut 20 % an Verlusten durch Krankheiten, Schäd- linge und Unkräuter zu verzeichnen. Eine wichtige Anwendung der Erfindung kann somit auch in der Transfektion von Pflanzenzellen liegen. Zur Transfektion von Pflanzenzellen sind jedoch bisher nur wenige, teilweise sehr aufwendige, unzureichende oder teure Verfahren des Gentransfers bekannt. Die populärste Methode ist dabei die Verwendung des am Wurzelhals Tumore verursachenden Bakteriums Agrobacterium tumefaciens, das die DNA in die Zellen einbringt. Das Bakterium befällt jedoch nur zweikeimblättnge Pflanzen, einkeimblättnge Pflanzen (darunter wichtige Getreidesorten) werden hingegen nicht transfiziert. Weitere, bis- her nur unzureichend wirksame und vor allem aufwendige Möglichkeiten zum Gentransfer sind Elektroporation und Mikroinjektion. Des weiteren wird die Methode des Partikelbe- schusses (*magic bullets') veTwendet, die oft erfolgreich, jedoch auch teuer ist. Die Verwen- dung des Komplexes aus TmHU und einer bestimmten molekularen Substanz kann diesen Transfektionsmethoden in Effizienz und Kosten erheblich überlegen sein. Dabei kommen vor allem auch Modifikationen des Proteins zum Einsatz, die beispielsweise die ansonsten un- durchlässige Zellwand von Pflanzenzellen durch an TmHU anfusionierte Enzyme lokal be- grenzt abbauen können und somit einen geeigneten, Aufnahmeweg für den TmHU/DNA- Komplex bereitstellen. Eine Anwendung dafür liegt vor allem auf dem Gebiet der Ertrags- steigerung durch die Entwicklung ertragreicherer bzw cmährungsphys) ologisch wertvollere ; Souten (Veränderung oder Steigerung des Gehaltes von lnhaltsstoffen wie Proteinen, Fettsäu- ren, Geschmacksstoffen oder Stärke), durch die Vermeidung von Schädlingsbefall (Einbrin- gen von Resistenzgenen, deren Genprodukt für den jeweiligen Schädling toxisch ist), durch die Vermeidung von Pflanzenkrankheiten sowie die Verhinderung von Unkrautwachstum (durch Herbizidresistenzeene) und das Einbringen von Fremd-DNA zur Produktion von Wirkstoffen in den Pflanzen. Dies kann durch eine erfindungsgemäße Anwendung des proka- ryontischen Nukleinsäure-bindenden Proteins erfolgen, mit dem Plasmid-DNA in Pflanzen eingebracht werden kann.

Als zu transportierende molekulare (therapeutische) Substanz bei medizinischer Anwendung kann beispielsweise DNA verwendet werden. die für intrazellulär oder extrazellulär wirkende Proteine codiert. Die therapeutische DNA kann dabei einzel-oder doppelsträngig in die Zelle eingefühlt werden. Ebenfalls wäre eine Kopplung sequenzspezifischer Oligonukleotide an die prokaryontischen Proteine denkbar, die durch Hybridisierung mit der therapeutischen ssDNA eine spezifische Komplexbildung mit dem prokaryontischen Protein vermitteln, dies würde die vorstehend beschriebene unspezifische Nukleinsäurebindung durch eine spezifische Bin- dung substituieren. Ein weiterer Ansatzpunkt für den Transfer von therapeutischen Wirkstof- fen wäre die Komplexbildung mit Ribozymen, die eine spezifische Erkennungssequenz für eine RNA besitzen. die mit pathologischen Zuständen assoziiert ist. Diese RNA wird durch die Bindung der Ribozyme katalvtisch gespalten und inaktiviert.

Eine Therapie kann alternativ zu Nukleinsäuren auch durch in die Zelle eingebrachte Proteine oder Peptide erfolgen. Beispielsweise könnte eine HIV-Therapie auf erfindungsgemäß einge- brachten trans-dominanten (modifizielten) Proteinen basieren, die dann mit nativen HIV- Proteinen in der Zelle konkmrieren und somit ihre Funktion inhibieren. Ebenfalls können Peptide oder synthetisch modifizielte Peptide die Wirkung bestimmter HIV-Proteine, bei- spielsweise der HIV-Protease. inhibieren. Außerdem können Proteine oder Peptide direkt an das prokaryontische Protein fusioniert werden, in der Weise, daß sich zwischen therapeutisch wirksamer Substanz und prokaryontischem Transportprotein eine Erkennungssequenz für HIV-Protease oder eine zelluläre Protease befindet, die das Protein oder Peptid intrazellulär (und ggf. wiederum spezifisch in infizierten Zellen) freisetzt. Dies würde die Festlegung der Spezifität einer (therapeutischen) Wirkung auf bestimmte Zelltvpen ermöglichen. wobei das verwendete prokaryontische Protein lediglich das Transponvehikel für die Passage in die Zellen darstellt Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Applikation von Anti-Tumor- Wirkstoffen bei malignen Erkrankungen. Dafur mussen die herzestellten Komplexe Bausteine enthalten, die den Transport des Wirkstoffes in Tumorgewebe gewährleisten. Je nach Art des Tumors geschieht dies beispielsweise durch in die Wirkstoff/Protein-Komplexe eingebaute Antikörper, die an Tumorantigene binden, die ausschließlich oder weitestgehend nur auf Tu- morzellen vorhanden sind. Solide Tumore benötigen eine ausreichende Blutversorgung und sekretieren deshalb Wachstumsfaktoren, die die Bildung neuer Blutgefäße im Tumorgewebe initiieren. Die Epithelzellen neu gebildeler Blutgefäße expnmieren verstärkt plasma- membrangebundene iniegnne. Diese Rezeptoren erkennen spezifisch die Sequenzabfolge RGD (Arginin-Glycin-Aspartat) und bewirken eine rezeptorvermittelte Endocytose RGD- haltiger Liganden. Diese Eigenschaft kann ebenfalls zur Adressierung von Tumorzellen und damit verbundenem epithelialen Gewebe genutzt werden, indem RGD-exponierende Peptide an die prokaryontischen Transponproteine anfusioniert werden, so daß eine Aufnahme der therapeutischen Substanz in das Tumorgewebe erfolgt. Andere Tumore zeigen eine signifi- kant erhöhte Präsentation des natürlichen EGF-Rezeptors auf der Zelloberfläche. In diesem Falle bietet es sich an. eine Spezifitat der Aufnahme der in der vorliegenden Erfindung be- schriebenen Komplexe durch Anfusionieren der EGF-Domäne an das prokaryontische Trans- poltprotein zu bewerkstelligen, wie dies in nachfolgendem Beispiel 6 beschrieben ist. Eine Kombination verschiedener Rezeptorbindungseigenschaften bewirkt neben einer verbesserten Gewebespezifitat eine Therapie, die gleichzeitig an mehreren Stellen den Tumors angreift und die Bildung wirkstoffresistenter Zellen verringen. Als Wirkstoffe können hier Nuklein- säuren. wie einzel-und doppelsträngige DNA oder RNA eingesetzt werden. Die darauf co- dierten Proteine können beispielsweise in der Zelle Apoptose auslösen, indem sie an den ent- sprechenden Stellen in den zellulären Signaltransduktionskaskaden eingreifen. Zu einer er- weiterten Tumorspezifität und somit höheren Sicherheit lassen sich zur Transkription Pro- motoren verwenden, die bevorzugt in Tumorzellen aktiv sind. In gleicher Weise können Pep- tide als zu transportierende molekulare Substanz eingesetzt werden, die eine Inhibition von Matnx-Metalloproteinasen bewirken. Insbesondere die Inhibition von MMP-2 und MMP-9 durch spezifische, kurze Peptidsequenzen kann hier eme effektive Wirkung zeigen Grundsätzlich läßt sich die hier beschriebene Erfindung auch zur Korrektur angeborener ge- netischer Defekte anwenden, wie beispielsweise ADA-Defizienz, Hämophilie, Duchenne- Muskeldvstrophie. und Cvstische Fibrose. Diese Erkrankungen sind monokausal, das heißt. sie lassen sich auf den Defekt eines einzelnen Gens zurückführen. Das Einbringen dieses Gens in korrekter Form ist damit in der Regel ausreichend, um die Krankheitssvmptome auf- zuheben oder zu vermindem. Für diese Anwendungen muß eine stabile Genexpression er- reicht werden, ennveder durch stabile episomale Vektoren oder eine Integration der therapeu- tischen DNA in zelluläre Chromosomen. Dafür können die übertragenen Nukleinsäuren Se- quenzen enthalten, die eine Intgration erleichtem. Beispielsweise kann einzelsträngige DNA verwendet werden, die an ihren Enden ITR-Seauenzen (Inverted Terminal Repeats) des Ade- noassoziierten Virus trägt die zur chromosomaien Integration beitragen. Außerdem können neben der therapeutischen DNA oder RNA Proteine mit in die Zelle transportiert werden, die eine Integration aktiv katalysieren. wie beispielsweise HIV-Integrase, oder Rep78 und Rep68 des Adenoassoziienen Virus.

Die Expression korrigierender Gene kann idealerweise unter Kontrolle der natürlichen Pro- motoren erfolgen, wodurch gleichzeitig eine angepaßte Regulation gewährleistet wird. Ein zelltypspezifisches Targeung des Komplexes aus DNA und nukleinsäurebindendem prokary- ontischen Protein ist daher in vielen Fällen nicht notwendig. Beispielsweise können bei Hä- mophilie-Patienten die fehlenden Faktoren der Blutgerinnungskaskade in Muskelgewebe pro- duziert werden, wobei die Faktoren mit einer geeigneten Signalsequenz fusioniert werden, so daß sie aus der Zelle sekretiem werden und an ihren Wirkungsort, die Blutbahn, gelangen.

Außer den in verschiedenen, vorstehend diskutierten Beispielen genannten Nukleinsäuren können auch Proteine oder Peptide transferiert werden, die Apoptose oder Nekrose auslösen. Geeignet sind beispielsweise katalytische Domänen bakterieller Toxine (beispielsweise Diphtheria-Toxin Cholera-Toxin, Botulinus-Toxin, und andere), die mit hoher Effizienz die Proteinbiosynthese der Zelle hemmen und dadurch Nekrose auslösen. Vorteilhaft kann sich dabei auswirken, daß nur wenige Moleküle nötig sind. um eine Zelle abzutöten. Ein weiterer therapeutischer Ansatz stellt der Transport der Thvmidinkinase von Herpes-Simplex-Virus in Tumorzellen dar Dieses Enzym phosphorylien Nukleotidbausteine und weist dabei eine ver- ringerte Substratspezifitat gegenüber den zellulären Kinasen auf, so daß auch künstliche Nukleotide, wie beispielsweise Ganciciovir, phosphoryliert werden. Phosphoryliertes Gan- ciclovir wird bei der DNA-Replikation in neusynthetisierte DNA-Stränge mit eingebaut und föhn zum Abbruch der Replikation, was wiederum die Zellteilung verhindert.

In vielen Fällen einer praktischen Anwendung ist eine effiziente Freisetzung der transportier- ten Substanzen innerhalb der Zelle not vendig, das heißt, die Substanz muß die endosomale Membran erfolgreich passieren. In den nachstehend genannten Beispielen ist diese Endoso- menfreisetzung nicht limitierend, da eine Genexpression oder der Transport eines Proteins (GFP als Markerprotein, vgl. Beispiel 7) in der Regel mit hoher Effizienz erfolgt. Sollte eine Limitierune durch Endosomeneinschluß der aufgenommenen Komplexe erfolgen, dann kann diese Funktion durch Hamoivsine. insbesondere thiolaktivierte Cvtolysine, Translokations- domänen bakterieller Toxine. oder bestimmte virale Proteine, wie beispielsweise das Adeno- virus-Pentonprotein. realisien werden, die in den zu transferierenden Komplex mit einge- bracht werden. Des weiteren kann diese Funktion auch von chemischen Substanzen, wie bei- spielsweise Polykationen oder Dendrimeren, übernommen werden, die an die Komplexe mit angebunden werden.

Oft ist es für Anwendungen isl vvo notwendig, die Immunogenität des aufgenommenen Komplexes so gering wie möglich zu halten. Die humorale Immunogenität des Komplexes selbst und die Erkennung und Eliminierung durch Makrophagen kann durch eine Maskierung mit Polyethylenglycol oder eine Umhüllung mit einer Lipiddoppelschicht erreicht werden, wie dies in nachfolgendem Beispiel 9 gezeigt ist. Polvethylenglycol kann beispielsweise che- misch so modifiziert werden. daß es kovalent an spezifische SH-Gruppen gebunden wird. Die Immunogenität des therapeutischen Wirkstoffes, das heißt, der direkt eingeführten Proteine oder der von therapeutischen Nukleinsäuren transkribierten und/oder translatierten Proteine, kann mit einer Fusion von 35 bis 40 GA- (Glycin-Alanin)-repetitiven Sequenzen reduziert werden. GA-reiche Sequenzen kommen natürlichernveise bei dem EBNAI-Protein des huma- nen Eppstein-Barr-Virus vor und schützen das virale Protein vor einem Abbau durch das zel- luläre Proteasom und einer Präsentation auf MHC-Klasse-I-Rezeptoren. Diese Schutzfunktion kann für die verschiedenen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Proteine und Peptide ausgeführt sein Neben Nukleinsäuren, Proteinen und Peptiden können für das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren zum Transfer von molekularen Substanzen in Zellen auch andere Molekülklassen verwendet werden. So können Peptiddenvate, Peptidantibiotika. Proteine mit modifizierten Seitenketten wie Fluoreszenzmarkierungen, Alkylierungen, Acetylierung. Pep- tid-oder Proteinkonjugate mit Kohlenhvdrat-, Nukleinsäure-oder Lipidanteilen und analogen Veränderungen in gleicher Weise in den Komplex mit eingebaut werden. Ebenfalls lassen sich außer den üblicherweise verwendeten kodierenden (doppelsträngigen) Plasmiden auch einzelsträngige DNA, einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, chromosomale DNA oder Chromosomenfragmente, Antisense-RNA. Ribozyme. katalytische RNA, Nukleotide, synthe- tische Nukleinsäuren wie beispielsweise Peptide Nucleic Acids (PNA), oder Hvbride hiervon mit dem prokarvontischen Transportprotein koppein, durch Interaktion mit der nukleinsäure- bindenden Stelle des Proteins oder auch auf chemischem Wege. Sie sind dann dazu geeignet, mit hoher Effizienz in vorgegebene Zellen aufgenommen zu werden. Als zu transportierende nicht-nukleinsäureartigen Substanzen kommen im Rahmen der erfindungsgemäßgen Anwen- dung insbesondere Proteine wie beispielsweise Antikörper, antikörperanaloge Substanzen, Proteindomänen, Glykoproteine, Enzyme. Peptide, Peptidhormone, pharmazeutische Wirk- stoffe auf Aminosäurebasis. Lipoproteine sowie Strukturproteine in Betracht.

Die Bindung der zu transportierenden Substanz an das prokaryontische Transportprotein kann unter dem Aspekt verschiedener physikalischer Wechselwirkungen betrachtet werden. So kann ein hydrophober Effekt bei der Komplexbildung dominieren. Es können aber auch ande- re lnteraktionsformen zur Ausbildung einer Bindung beitragen, wie beispielsweise ionische Wechselwirkungen. Ion-Dipol-Wechselwirkungen. Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Wasser- stoffbrückenbindungen, van der Waals-Kräfte, oder Dispersionskräfte. Schließlich kann ne- ben den genannten Beispielen für nichtkovalente Verbindungen auch eine kovalente Verbin- dung von zu transportierender Substanz und prokaryontischem Transportprotein bewirkt wer- den. Dabei wird entweder eine Fusion auf Genebene durchgeführt, oder es wird eine che- misch stabile Atombindung zwischen zwei Atomen der Interaktionspartner ausgebildet.

Zusammenfassend weist das erfindungsgemäße Transferverfahren folgende Vorteile gegen- über dem Stand der Technik auf : signifikant höhere Effizienz als die bestehenden Verfahren ; . keine oder nur minimale Toxizität: . keine oder nur geringe lmmunogenität bei in vivo-Anwendungen.

. kostengünstig in der Herstellung und in der Lagerung, . einfache und schnelle Anwendbarkeit.

. Transfer von Nukleinsäuren beliebigen chemischen Typs, 'Transfer von anderen, kovalent oder nichtkovalent gekoppelten Aminosäuren enthalten- den Substanzen wie Proteine oder Peptide.

. weitgehend keine Einschränkung bezüglich der Zielzellen (beispielsweise ist das Verfah- ren in gleicher Weise geeignet für eukaryontische tieiische Zellen. eukaryontische pflanz- liche Zellen und prokawontische Zellen), . Möglichkeit der variablen Zusammensetzung und der zusätzlichen Anheftung (Fusionie- rung) von Effektoren oder der Umhüllung und weitere Möglichkeiten zur Integration weiterer günstiger Eigenschaften für die Zellaufnahme.

Folgende Beispiele zeigen Anwendungen dieser Erfindung, sollen den Schutzumfang der Erfindung jedoch nicht einschränken.

In der Beschreibung und in den Beispielen wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen.

Figur 1 zeigt eine schematische Übersicht über mögliche Verwendungsverfahren der Erfin- dung beim Transport von Nukleinsäuren. Das TmHU-Protein (Y) vermittelt eine Kondensa- tion der linearen oder zirkulären Nukleinsäure. Der Protein/Nukleinsäure-Komplex wird dann von Zellen aufgenommen (linke Figur). Als weitere Ausgestaltung kann beispielsweise eine rezeptorvermittelte Aufnahme (mittlere Figur) oder eine Umhüllung des Prote- in/Nukleinsäure-Komplexes erfolgen (rechte Figur) Figur 2 zeigt eine SDS-PAGE zur Analytik der Reinigung von TmHU, das rekombinant in Escliericliia coli hergestellt wird. Bahn 1 zeigt den löslichen Anteil des Zellextrakts von E. coli. Bahn 2 zeigt den Überstand nach Hitzefallung. Bahn 3 zeigt den Molekularmassenstan- dard (Größe ist links in der Figur angegeben). Bahn 4 zeigt das Eluat nach Reinigung über eine Kationenaustauschersaule. Das Protein kann mit sehr hoher Reinheit durch einfache und wenige Reinigungsschritte gewonnen werden.

Figur 3 zeigt die spektroskopische Charakterisierung von nativem und gereinigtem TmHIo Das W-Absorptionsspektrum des Proteins (Konzentration 0. 5 mg/ml) zeigt keine Absorption bei 280 oder 260 nm. die auf Kontaminationen durch Fremdproteine oder Nukleinsäuren schließen lassen würden, die Präparation ist damit sehr rein. Das Protein weist keine Tvrosir- oder Tryptophanreste auf und ist daher spektroskopisch transparent im angegebenen UV- Bereich. Die drei Phenylalaninreste der Proteinuntereinheiten zeigen-wie zu erwarten-eine geringfügige Absorption bei 257 nm.

Figur 4 zeigt die Messung der TmHU-Bindung an DNA-Fragmente verschiedener Größe mit Hilfe von Oberflächen-Plasmon-Resonanz. (.), 56 bp dsDNA-Fragment. und (-), berech- nete Hill-Gleichung mit einem KD von 73 nM und einem Hill-Koeffizienten von 7. 6. (o), 23 bp dsDNA-Fragment, und berechnete Hill-Gleichung mit einem Kr von 73 nM und einem Hill-Koeffizienten von 1. 3. Die Bindung des Proteins an die DNA ist vergleichsweise stark und bei DNA-Fragmenten üblicher Größe ( » 23 bp) hoch kooperativ Figur 5 zeigt den Schutz einer Modell-DNA vor Abbau durch Nukleasen. Es wurden ver- schiedene Konzentrationen unterschiedlicher Kondensations-Agentien venvendet. Bahn 1, Grö#enstandard. Bahn 2-4* TmHU (0. 3, 3, und 15 5 ug). Bahn 5 - 7, Histone (0. 3, 3, und 30 ug), Bahn 8. Grö#enstandard: Bahn 9-11, CTAB (5, 10, und 100 µM): Bahn 12 - 14, Spermidin (10, 100, und 2000 µM). Unter den sehr stringenten Bedingungen wird unge- schützte DNA vollständig abgebaut. CTAB und Spermidin bieten dabei kaum Schutz vor diesem Abbau. Histone bieten etwas verbessenten Schutz, und TmHU bietet in diesem Ver- gleichsansatz den besten Schutz vor Abbau Figur 6 zeigt die Transfereffizienz von TmHU mit verschiedenen Zellinien im Vergleich zu Standardmethoden (DEAE-Dextran-tRANSFEKTION). lINKS, Transfektion von humanen 293T- Zellen mit TmHU: die Transfektionseffizienz beträgt hier Transfektionseffizienz betragt hier Mitte, Transfektion von murinen NIH3T3-Zellen mit TmHU die Transfektionseffizienz beträgt hier etwa 30 %.

Rechts, Transfektion von murinen NIH3T3-Zellen mit DEAE-Dextran; die Transfektionseffi- zienz beträgt hier bis zu 10 °, Figur 7 zeigt die Transfereffizienz von TmHU mit NIH 3T3-Zellen mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll. Es sind dabei zwei verschiedene Ausschnitte einer Zellkulturscha- lenvertiefung dargestellt; die mikroskopische Vergrößerung am Objektiv beträgt 20fach. Die Ausbeute an Transfektionsereignissen beträgt hier etwa 2500 positive Zellen pro llg an einge- setzter DNA.

Figur 8 zeigt Western-Blots zum Nachweis der Aufnahme des TmHU-EGF-Fusionsproteins in humane A431-Zellen. die als Tumormarker den EGF-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimieren. Linke Figur : Western-Blot der Proteine aus dem Zellysat nach Inkubation und Aufnahme des TmHU-EGF-Fusionsproteins. Bahn 1, Transfektion mit TmHU-EGF. Bahn 2, Transfektion mit TmHU-EGF/DNA-Komplex ; Bahn 3, Lysat von untransformierten A431- Zellen zur Kontrolle der Spezifitåt des Anti-EGF-Antikörpers; Bahn 4 TmHU-EGF-Fusions- protein (Standard); Bahn 5, Markierung des Molekularmassenstandards. Rechte Abbildung : Zeitlicher Verlauf des Verschwindens von TmHU-EGF aus dem Zelluberstand im Verlauf der Transfektion ; Nachweis durch \Vestemblot. Bahnen 1 bis 7 : Inkubation mit DNA bei der Transfektion. Bahnen A bis G : lnkubation ohne DNA bei der Transfektion. Bahn 1, TmHU- EGF-Vergleichsstandard; Bahn 2, 0 min. Bahn 3, 30 min; Bahn 4, 60 min; Bahn 5, 90 min, Bahn 6, 120 min Bahn 7* 7 h; Bahn A, 0 min ; Bahn B. 30 min ; Bahn C, 60 min; Bahn D, 90 min ; Bahn E, 120 min, Bahn F : 7 h. Es ist deutlich die Aufnahme des TmHU in die Zellen zu beobachten, wobei durch die Ausbildung der TmHU-DNA-Komplexe eine effizientere Auf- nahme bewirkt wird, als ohne diese Komplexbildung.

Figur 9 zeigt eine Durchlichtaufnahme (oben) und eine Aufnahme unter Fluoreszenzlichi- Bedingungen (unten) eines Ausschnitts aus einer transfizierten Kulturschale von NIH 3T3- Zellen. Die Zellen wurden für 5 Stunden im Medium inkubiert und anschließend mit PBS gewaschen. Die grün leuchtenden Zellen enthalten das TmHU-GFP-Fusionsprotein, das ver- mittels des TmHU-Aufnahmemechanismus in die Zellen aufgenommen wurde.

Figur 10 zeigt beispielhaft zwei Zellkulturen mit NIH 3T3-Zellen, die mit liposomenum- hüllten TmHU/DNA-Komplexen transfizielt wurden. Es sind in beiden Ansätzen eine große Zahl positiv transformiertenr Zelien zu verzeichnen, die das Reportergen exprimieren und da- durch eine Blaufärbung im Testansatz zeigen.

Beispiel 1 Klonierung, rekombinante Expression in Escherichia coli und Reinigung des Proteins HU von Thermotoga maritima Nach dem Stand der Technik ist die heterologe Expression einer klonierten DNA-Sequenz in einer prokaryontischen Wirtszelle bekannt. Durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Oligonukleotid-Pnmern TmHU-N (5'-GGG GGT CAT ATG AAC AAA AAA GAA CTG ATC GAC. AGG GTG G-3') und TmHU-C (5'-TTC CGG ATC CCT ATC ACT TGA CCT TCT CTT TGA GGG C-3') auf genomische DNA aus dem Organismus Thermotoga maritima kann ein 300 bp- Fragment amplifizien und mit Standardtechniken (siehe dazu Sambrook et al.,"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 1989. Co ! d Spnng Harbor Laboratory Press) in den proka- ryontischen Expressionsvektor pETI la (Fa. Novagen) einkloniert werden. Nach Transforma- tion des Plasmids in E. coli-Zellen des Stammes BL2I (DE3) (Fa. Stratagene) und Selektion auf ampicillinresistenten LB-Agarplatten wird eine Vorkultur von LB-Medium, das 100 g/ml Ampicillin enthält, mit einer einzelnen Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschuttelt. Diese Vorkultur wird im Verhältnis 1 : 100 in die Hauptkultur, bestehend aus dem gleichen Medientyp, verdünnt. Die Hauptkultur wird bei 37 °C im Schüttelschrank inkubiea, bis die Absorption der Bakteriensuspension bei einer Wellenlänge von 600 nm den Wert 1. 0 erreicht. Die Expression des Tliermotoga maritime HU-Gens (TmHU) wird an- schließend durch Zugabe von 1 mMt Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert Nach einer weiteren Wachstumszeit von 90 min werden die Zellen durch Zentnfugation (6000 g, 15 min, 4 °C) abgetrennt, in einem Resuspensionspuffer (50 mM Natliumphosphat. pH 7.5, 300 mM Natnumchlorid, 5 mM EDTA. 1 mM PMSF) aufgenommen und anschlie- ßend durch Hochdruckhomogenisierung aufgeschlossen. TmHU bleibt dabei vollständig im löslichen Überstand des Zellaufschlusses. Nach Zugabe von Benzonase (Fa. Merck) wird der Zellaufschluß für eine Stunde bei Raumtemperatur zur enzymatischen Beseitigung der stö- renden Nukleinsäuren (DNA und RNA) aus dem Wirtsorganismus inkubiert.

Nach Zentrifugation zur Trennung der löslichen von den unlöslichen Bestandteilen (50 000 g, 1 h, 4 °C) wird der Überstand für 20 min auf 80 °C erhitzt. Dabei wird der größte Teil der Wirtsproteine thermisch denaturiert und fällt nach Abkühlung als unlösliches Präzipitat aus Das thermostabile Protein TmHU liegt nach erneuter Zentrifugation bei 50 000 g in angerei- cherter und bereits nahezu reiner Form im Überstand vor (Fig. 2).

Im nachfolgenden letzten Reinigungsschritt wird der Überstand durch eine Kationen- austauschchromatographie über eine Säule vom Typ Poros HS (Fa Perseptive Biosystems) aufgereinigt. Unter den Bedingungen des Resuspensionspuffers bindet TmHU stark an die Kationentauschersäule. Nach Anlegen eines linearen Salzgradienten von 300 bis 2000 mM NaCl kann TmHU von den restlichen, noch verbliebenen Verunreinigungen chromato- graphisch separielt eluiert werden. Fig. 2 zeigt die Effizienz der einzelnen Reinigungsschritte mit Hilfe eines 18% igen SDS-Polyacrylamidgels. Durch das hier dargestellte Verfahren kann das unter Nativbedingungen als Dimer vorliegende TmHU in spektroskopisch reiner Form (> 95 % Reinheit; Fig. 3) mit einer Ausbeute von etwa 20 mg je Liter E. coli-Kultur (bei ein- fachem Anzuchtverfahren) gewonnen werden Beispiel 2 Nachweis der Nukleinsäure-bindenden Eigenschaften von TmHU Ein 56 bp-DNA-Fragment sowie ein 23 bp-Fragment werden über jeweils 2 Pnmer. von de- nen je einer biotinyliert ist. mit PCR-Technik amplifiziert und die entstehende doppelsträngi- ge DNA an Streptavidin-Chips immobilisiert. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR). bestimmt durch ein BlACore-Gerät (Fa. Amersham Pharmacia Biotech), kann die Bindung von TmHU an die jeweils immobilisierte DNA direkt gemessen werden (Fig. 4). Dabei wird TmHU in verschiedenen Konzentrationen in einem Puffer, der 50 mM Natriumphosphat. pH 7. 5 und 100 mM Natriumchlorid enthält, in die Flußzelle des DNA-Chips injiziert und das s SPR-Signal aufgezeichnet. Die Plateaus der Signale sind direkt proportional zur gebundenen Menge an TmHU. Eine Auftragung des SPR-Signals gegen die Konzentration des eingesetz- ten TmHU ergibt eine sigmoide Kurve gemäß der Hill-Gleichung (Fig. 4), die im Falle des 56 bp-Fragmentes charakteristisch für eine hoch kooperative Bindung ist. Der Ubergangsmitte'i- punkt der Kurven, das ist definitionsgemäß die Dissoziationskonstante Kp, liegt dabei in bei- den Fällen bei einer TmHU-Proteinkonzentration von 73 nN, 1, Beispiel 3 Schutz von Nukleinsäuren vor Abbau durch Nukleasen 1 ig einer zirkulåren Plasmid-DNA (pEGFP-NI. Fa. Clontech) in 120 1l Probenpuffer (20 mM HEPES, pH 7. . 100 mM NaCI, 5% Glycerol, 10 mM MgCI,) wird mit TmHU, hu- manen Histonen (Fa. Sigma). Cetyl-TIimethyl-Ammoniumbromid (CTAB, Fa. Amresco) oder Speamidin (Fa. Sigma) jeweils in drei verschiedenen Konzentrationen versetzt, für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, und anschließend mit 5 Einheiten (units) Benzonase (Fa. Merck) versetzt. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur werden die Proben auf Konzentrationen son 0 s °,/O SDS. 0 mM EDTA. gebracht. die Nukleinsäuren werden mit Phenol-Chloroform extrahiert und aus der wäßrigen Phase mittels Ethanoi gefällt. Anschlie- ßend wird nach Anfärben der DNA mit dem sensitiven Farbstoff SYBR Gold (Fa. Molecular Probes) auf einem 1 % igen Agarosegel der Schutz der Nukleinsäuren vor Nuklease-Abbau analysiert (Fig. 5). In diesem Beispiel wird der erhebliche Schutz der DNA durch TmHU vor dem Abbau durch Nukleasen deutlich. Die niedermolekularen Substanzen (CTAB und Sper- midin) bieten nur einen schlechten Schutz vor Nukleaseabbau ; dieser Schutz ist bei eukary- ontischen Histonen deutlich verbessert (Fig. 5). Jedoch erst bei Verwendung des prokaryonti- schen TmHU-Proteins wird unter ansonsten identischen Versuchsbedingungen ein deutlicher Schutz der Nukleinsäuren vor Nukleaseabau erreicht Ungeschützte DNA wird unter den Ver- suchsbedingungen vonständig abgebaut.

Der Schutz vor nukleaseinduziertem Abbau ist für die Optimierung von Transfereffizienzen wichtig, da im serumhaltigen Medium und teilweise auch in den Zielzellen die Nukleinsäuren einem Abbau durch Nukleasen ausgesetzt ist. Aus diesem Beispiel wird weiterhin deutlich. daß das prokaryontische Protein den eukaryontischen Histonen in dieser Hinsicht signifikant überlegen ist, vermutlich durch das Fehlen der für Eukaryonten charakteristischen repetitiven Strukturen in den Nukleohistonkomplexen, die eine Spaltung an den Verbindungsstellen be- günstigen können. Dieser Schutz vor Abbau ist ein sehr günstiges Ausgestaltungsmerkmal für das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren. Dazu kann dieser Schutz auch bei der Herstellung von Plasmiden izl vivo dazu eingesetzt werden, um eine verbesserte Herstel- lung beispielsweise in Bakterien zu erreichen.

Beispiel 4 Transfektion von eukarvontiscften Zelleri 300 u1 einer TmHU-Lösung (0. 5 mg/ml) und 6 gl Plasmid-DNA (24 ug pCMV-, kodiert für das Markerprotein ß-Galaktosidase) werden zusammen für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird diese Mischung in das Medium von halbkonfluenten murinen NIH3T3-oder humanen 293T-Zellen (60 mm-Zellkulturschale) gegeben. Die Schalen werden leicht geschwenkt und bei 37 °C und 5 % CO, für 2 Tage inkubiert : in dieser Zeit wird kein weiterer Medienwechsel durchgeführt. Dabei bildet sich ein Präzipitat aus Protein und Nuk- leinsäuren, das auf die adhärenten Zellen sedimentiert. Der Protein/Nukleinsäure-Komplex wird in dieser Zeit von den Zellen aufgenommen. Nach 48 h wird eine Anfärbung der trans- formierten Zellen mit einem Substrat für die-Galaktosidase, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß- D-galactopyranosid (X-Gal), durchgeführt und das Verhältnis der gefärbten (transfizierten) zu den nicht gefärbten (nicht transfizierten) Zellen bestimmt. Daraus errechnet sich die Trans- fektionseffizienz.

Dazu werden zusätzlich Kontrolltransfektionen durchgeführt, in denen entweder jeweils die Nukleinsäuren oder das TmHU im Transfektionsansatz fehlen (Negativkonrrollc). Als Ver- gleich zur Bestimmung der Effektivität wird parallel eine optimierte Transfektion mit DEAE- Dextran (Mammalian Transfection Kit. Fa. Stratagene) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (Positivkontrolle). Die Negativkontrollen zeigen-wie erwartet-jeweils keine gefärbten Zellen, also auch keine Transfektionen. Bei der Positivkontrolle (DEAE/Dextran- Transfektion) werden maximal 10 % der Zellen in der Kulturschale gefärbt (vgl. Fig. 6) ; dies liegt in der Größenordnung der aus der Literatur bekannten Effizienzen für dieses Verfahren.

Eine Transfektion der 293T-Zellen mittels DEAE-Dextran-Verfahren ist nicht erfolgreich, da die nur schwach angehefteten Zellen durch das Transfektionsverfahren abgelöst werden. Im Gegensatz dazu ist eine Transfektion mit TmHU bei beiden Zellinien problemlos möglich, eine Ablösung der 293T-Zellen wird nicht beobachtet. Bei den TmHU-basierten Transfektio- nen betragen die Transfektionseffizienzen jeweils 30 % (murine NIH3T3-Zellen) bzw. 50 % (humane 293T-Zellen). Es ist also eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienzen der Zellen gegenüber einem Standardsystem zu beobachten (vgl. Fig. 6). Diese Ausbeuten er- scheinen darüber hinaus durch Optimierungen noch weiter steigerbar. Bis zur Fixierung der Zellen (Abtötung) zur Anfarbung mit X-Gal war ein negativer Einfluß der TmHU- Transfektion auf das Überleben und das Wachstum der Zellen nicht zu beobachten ; das TmHU ist mithin nicht toxisch für die Zellen.

Beispiel 5 Alternatives Protokoll zur Transfektion von eukaryontischen Zellen 100 µl einer TmHU-Lösung (0. 5 mg/ml) in Phosphatpuffer, pH 7. 0, und 1 ul einer Plasmid- DNA-Lösung (4 ug pCMV-ß. kodierend für das Markerprotein ß-Galaktosidase), werden mit 10 1, 11 einer'0 mM CaCI,-Losung vermischt und für 40 min auf 95 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Inkubation für weitere 20 min wird die Mischung mit 350 u ! DMEM-Medium mit 10 % FBS versetzt und in die Vertiefung einer 12-well-Platte gegeben, in die 16 Stunden vorher 50 000 NIH 3T3-Zellen ausgesät wurden. Vor der Zugabe wird das Medium über den Zellen entfernt. Nach leichtem Schwenken wird die Schale für 12 h im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO ; inkubiert. Das Medium wird anschließend gegen jeweils 1 mi friches Vollmedium (DMEM mit 10 % FBS) ausgetauscht und die Zellen für weitere 36 h inkubielt. Es wird nun der im Beispiel 4 beschriebene Test auf ß-Galaktosidase-Expres- sion durchgeführt und die Zellen mit Hilfe eines gerasterten Okulars gezählt Typischenveise erhält man mit dieser Methode etwa 10 000 positive Zellen pro Well (Beispiele in Fig. 7).

Wird das beschriebene Protokoll ohne die Zugabe von TmHU zum Transfektionsansatz durchgeführt (Kontrolle auf Effizienz einer Standard-Calciumphosphat-Transfektion zum Vergleich), so erhält man ca. 10 Transfotmanden, also eine um einen Faktor 10'geringere Ausbeute. Die Ausbeute an Transfektionsereignissen ist im vorliegenden Beispiel mit ca.

2 500 positiven Zellen pro gg DNA etwa 5-bis 10mal höher als die einer DEAE-Dextran- Transfektion (etwa 300 bis 400 Transfektionsereignisse pro pg DNA).

Beispiel 6 Verwendung modifizierter Proteine am Beispiel von TmHU-EGF TmHU-EGF ist ein Fusionsprotein aus TmHU und dem humanen epidermalen Wachstums- faktor (EGF), der eine Aufnahme in EGF-Rezeptor tragende Zielzellen, wie beispielsweise die hier verwendeten humanen A431-Zellen (vgl. E. J. Meuillet et al.,"Sialidase gene trans- fection enhances epideamal growth factor receptor activity in an epidermoid carcinoma cell line, A431": Cancer Res. 1999. Band 59. S. 234-240), ermöglichen sollte. Das Fusionsprotein wird im Anschluß an eine Klonierung über Sacll-Schnittstellen in den in Beispiel 1 genannten pETI la-Expressionsvektor nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Standardverfahren herge- stellt. 100 µl TmHU-EGF (0. 5 mg/ml) werden mit 8 ug des pCMV-ß-Plasmids für I Stunde inkubiert und der entstehende Komplex aus TmHU-EGF/DNA gemäß den Angaben von Bei- spiel 4 in das Medium über halbkonfluente A431-Zellen gegeben. Als eine Kontrolle werden 100 pI TmHU-EGF ohne zusätzliche DNA auf identisch behandelte Zellen gegeben. In einer Negativkontrolle wird außerdem eine halbkonfluente Zellkulturschale vorbereitet, in die kein TmHU-EGF gegeben wird.

Die Zellen werden jeweils für 2 Stunden auf Eis inkubien, dann mit kaltem PBS-Puffer ge- waschen und anschließend bei 37 °C für 45 min inkubiert Das Medium über den Zellen wird entfernt und Trypsin/EDTA-Lösung zum Ablösen des bis dahin nicht internalisienen Kom- plexes sowie der adhärenten Zellen zugegeben. Der Tlypsinverdau wird durch Zugabe von FCS-haltigem Medium (FCS : Fötales Kälberserum) gestoppt und die resuspendierten Zellen dreimal mit kaltem PBS-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt werden die Zellen in 100 pI PBS-Puffer resuspendiert und anschließend mit 100 fut 4 % SDS und 2 mM PMSF versetzt, kräftig gemischt und sofort für 10 min auf 95 °C erhitzt. Die so hergestellten Zelly- sate werden auf ein 15 ioiges SDS-Polvacrvlamideel aufgetraeen und nach der Elektrophore- se mittels Westem-Blot analysiert (Erstantikörper : rabbit polyclonal anti-EGF. Fa. Santa Cruz. Zweitantikörper : goat anti-rabbit IgG. HRP-conjugate, Fa. BioRad). lm spezifischen Westem-Blot (Fig. 8. links) kann man in den Lysaten, die mit der TmHU- EGF-Chimäre inkubiert werden, das Protein als spezifische Bande nachweisen : bei Lvsaten ohne TmHU-EGF-Inkubation fehlt diese Bande. Damit ist gezeigt, daß das Protein TmHl- EGF in die A431-Zellen intemalisiert wird und diese Aufnahme mittels spezifischem Western Blot nachweisbar ist. Diese. Aufnahme ist unabhängig von der Anwesenheit von DNA im Experiment, jedoch ist die Aufnahme in Gegenwart von DNA effizienter ; dies wird durch ein zweites Experiment unterstützt. das analog zum vorstehend beschriebenen Transfektionsexpe- riment durchgeführt wird (vgl. Fig. 8, rechts). Hier wird die Aufnahme der TmHU-EGF- Chimären in die A431-Zielzellen durch die Abnahme der J-Menge im Medium über den Zellen detektiert. Auch hier zeigt sich. daß DNA-beladenes TmHU-EGF erheblich schneller aus dem Zellüberstand abgezogen wird, als im Kontrollexperiment ohne DNA.

Beispiel 7 Verwendung modifizierter Proteinc am Beispiel von TmHU-GFP TmHU-GFP ist ein Fusionsprotein aus TmHU und dem Green Fluorescent Protein der Tief- seequalle, 4equorea victoria, das die bemerkenswerte Eigenschaft aufweist, ohne Kofaktoren, also nur aufgrund seiner Tertiärstruktur, grün zu fluoreszieren. Fusionskonstrukte mit GFP behalten oftmals diese Fluoreszenz des nativen Proteins bei. In dem vorliegenden Beispiel ist das GFP C-terminal an das TmHU über einen Linker fusioniert. Die Fusion wurde auf DNA- Ebene durchgefuhrt. durch gentechnische Standardmethouen wurde dabei das GFP-Gen mit- samt einem Linker aus dem Vektor pEGFP-N ! der Firma Oontech ausgeschnitten und am R- Ende des TmHU-Gens eingefugt. Die Reinigung von TmHU-GFP erfolgt analog zu der des TmHU aus Beispiel 1, über einen Kationentauscher. Das Fusionsprotein kann löslich in hoher Ausbeute gereinigt werden.

TmHU-GFP besitzt, wie GFP selbst auch. eine grünliche Fluoreszenz. Ebenso bleibt die DNA-Bindung des Fusionsproteins erhalten, denn bei Zugabe von hochmolekularer DNA zur Proteinlösung und anschlie#ender Zentrifugation wird TmHU-GFP mit der DNA kopräzipi- tiert und zeigt grün leuchtende Komplexe. Es kann somit davon ausgegangen werden, daß beide Anteile des Fusionskonstrukts funktionell erhalten sind. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, daß das System leicht auf genetischer Ebene modifizierbar ist und die Struktur von TmHU ein stabiles Gerüst zur Erschaffune weiterer Varianten in Form von Fusionskonstruk- ten darstellt Mit der vorliegenden Variante TmHU-GFP lassen sich nun Aufnahmestudien in eukaryonti- sche Zellen in vii-o durchführen. also ohne eine Fixierung der Zellen. Dazu wird eine 2 cm- Kulturschale mit NIH 3T3-Zellen mit PBS-Puffer gespült und dann 50 1ll TmHU-GFP- Lösung (0. 1 mgiml) in PBS-Puffer zugegeben. Nach kurzem Schwenken werden die Schalen für 5 Stunden bei 37 °C und mit 5 % CO, inkubiert und anschließend nach dreimaligem Spü- len mit PBS mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera Fotos der GFP-Fluoreszenz aufgenommen. Man erkennt in Fig. 9 deutlich die Umrisse der Zellen in der Fluoreszenz (unten) und im Vergleich mit einer Phasenkontrastaufnahme (oben) desselben Ausschnitts Diese Befunde deuten daraufhin, daß das Fusionskonstrukt mit großer Effizienz in die Zellen aufgenommen wird und dabei nicht in einzelnen Vesikeln wie beispielsweise Lysosomen konzentriert und angereichert wird, sondern daß das Fusionsprotein im gesamten Cytosol vorliegt.

Aus der Literatur ist bekannt, daß diese Eigenschaft der Zellaufnahme nicht durch das GFP verursacht ist : sie muß also durch den TmHU-Teil des Fusionskonstruktes vermittelt worden sein.

Das Beispiel verdeutlicht damit, daß prokaryontische histonähniiche Proteine wie TmHU mit hoher Effizienz in Zellen aufgenommen werden und dabei nicht in den Lysosome angerei- chert werden, sondern sich im Cytosol verteilen. Diese Aufnahmeeigenschaft kann die hohe Gentransfereffizienz von TmHU erklären. Dabei tragen sowohl die effiziente Aufnahme in Zellen als auch das potentielle Freisetzen aus Endosomen und anderen zellulären Komparti- menten zur hohen Transfektionseffizienz bei. Das Beispiel verdeutlicht zudem. daß auch an TmHU angehangte oder fusionierte Proteine (beispielsweise auch therapeutisch relevante Proteine) mit hoher Effizienz durch TmHU in eukaryontische Zellen eingeschleust werden können. TmHU wirkt hier als Transportvehikel zum Durchqueren der Zellmembran für das Fusionsprotein Beispiel 8 Transfektion mit HU aus Escherichia coli (EcoHU) 100 gl einer EcoHU-Lösung (HU-Protein aus Escherichia coli), 0. 5 mg/ml, werden mit 1 gl Plasmid-Lösung (4 mgiml, kodierend für ß-Galactosidase) vermischt und für 40 min auf 95 °C erhitzt, dann für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wird in 350 u) DMEM und 10 % FBS mit 1 % PS aufgeschlämmt und anschließend auf NIH 3T3-Zellen gegeben (50 000 Zellen in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte). Nach 2 Tagen wird die Zellkultur auf Expression von ß-Galaktosidase untersucht. Unter diesen Bedingungen zeigen 104 Zellen ß-Galaktosidase-Expression. Dies ist eine erheblich geringere Ausbeute als im Falle der analoçen Verwendung von TmHU (etwa 600 positiv transformierte Zellen). Das Beispiel zeigt, daß eine Transfektion unter den in der vorliegenden Erfindung gemachten Be- dingungen im Prinzip auch mit histonähnlichen Proteinen anderer Bakterien, in diesem Fall eines mesophilen Bakteriums, möglich ist.

Beispiel 9 Verpackuy des TmHU-DNA-Komplexes in Liposomen und Transfektion mit diesen Liposo- men-TmHU-DNA-Komplexem Eine der neueren Methoden zum Gentransfer in eukaryontische Zellen besteht in der Verpa- ckung der DNA in kationische Lipidvesikel, die dann mit der Zellmembran fusionieren und die DNA auf diese Art in die Zelle einbringen. Dabei kommt es allerdings zu geringeren Ausbeuten, als nach der effizienten Aufnahme in die Zellen zunächst zu erwarten wäre, denn oftmals werden diese Lipidvesikel in den Endosomen angereichert und es kommt nicht zu einer Überführung der DNA in das Cytoplasma und nachfolgend zum Transport in den Zell- kern. In diesem Beispiel wird untersucht, inwiefern sich liposomenvermittelte und TmHU- vermittelte Transfektionen synergistisch kombinieren lassen.

Zunächst wurde eine Transfektion mit dem Reagenz Tfx-50 (Fa. Promega) nach Hersteller- angaben durchgeführt. Dabei war ein Ladungsverhältnis von positiven Ladungen (Lipid) zu negativen Ladungen (DNA) von 2 : 1 am effizientesten (Optimierung nach Herstellerangaben).

Es wurden mit der Methode 80 % der konfluent ausgesäten NIH 3T3-Zellen transfiziert mit 1 ig Plasmid-DNA (pCMV-ß), 3 gl Tfx-50-Reagenz und 200 pI DMEM. Nach einstündiger Inkubation wird 1 ml Vollmedium (DMEM mit 10 % FBS) zugesetzt. Es wurden hier im Schnitt 3 300 positive (transformierte) Zellen pro ig DNA erhalten. Diese Transfektionseffi- zienz liegt in der gleichen Größenordnung wie die optimierte TmHU-Transfektion (vgl. Bei- spiel 5).

Im nächsten Schritt wird die Transfektion unter Zusatz von verschiedenen Mengen TmHU bei variierender Lipidmenge durchgefühnt. Dabei werden die höchsten Transfektionsergebnis- se durch eine einstündige Inkubation von) ug DNA mit 12. 5 pI TmHU-Lösung (0. 5 mg/ml) und einem Ladungsverhältnis von 4 1 (bezüglich Lipid : DNA) erreicht (4. 5 pI Lipidsuspensi- on, ! 2. 5 ul TmHLl-Lösung. und 1 µg DNA auf 200 pI der Transfektionslösung). Die Anzahl der positiven Zellen pro tg eingesetzter DNA steigt dabei auf durchschnittlich 16 000 trans- formierte Zellen. Die Ausbeute einer kombinierten TmHU-Lipofektion ist damit etwa fünf- bis sechsmal höher als die optimierten Protokolle der Lipofektion, sowie der TmHU- Transfektion alleine. Zwei Beispiele für auf diese Art transformierte Zellen sind in Fig. 10 gezeigt.

Obwohl nicht auszuschließen ist. daß in diesem Experiment auch TmHU-vermittelte Trans- fektion und Lipofektion parallel zueinander stattfinden, kann in jedem Falle ein deutlicher synergistischer Effekt verzeichnet werden, denn die Effizienz ist erheblich höher als die Summe der jeweiligen Einzelbeiträge (zumal sowohl vom Standpunkt der Lipofektion als auch vom Standpunkt der TmHU-Transfektion im angegebenen Experiment unter jeweils suboptimalen Bedingungen gearbeitet wird). Die wahrscheinlichste Erklärung für die hohe Effizienz ist daher die. daß die entstehenden TmHU-DNA-Komplexe zumindest teilweise in die entstehenden Liposomen des Lipofektionsagens eingeschlossen werden. Diese Umhüllung der TmHU-DNA-Komplexe mit einer Liposomenmembran zeigt auch eine deutlich erhöhte Effizienz gegenüber Standardmethoden wie DEAE-Dextran-Transfektion.