Technische Anwendungsgebiete Die Verarbeitung von Biopolymeren mit Hilfe von chemischer und enzymati- scher Reagenzien erfordert häufig eine Vielzahl von Schritten unter unter- schiedlichen Bedingungen in der Biotechnologie. Dabei wird eine steigende Schrittzahl, Variationsvielfalt, Parallelität und Integration unter zunehmend programmierbarer Reaktionsführung benötigt. Solche Biopolymer Verarbei- tungsvorgänge schließen Synthese, Amplifikation, Trennung, Selektion, Modifi- kation, Schneiden und Zusammenfügen, Labelling, Detektion, Sortierung, Na- noassembly und Reaktionssteuerung ein. Vor allem in"Lab-on-a-chip"An- wendungen wird eine komplette automatisierte und autark ablaufende Proben- verarbeitung angestrebt. Die Erfindung trägt zu diesem breiten technischen Anwendungsgebiet bei, in dem rechnergesteuert und parallel in kleinsten Vo- lumina Biopolymere zwischen einer Vielzahl von unterschiedlichen Reak- tionslösungen übertragen werden.

Stand der Technik Viele biotechnologische Prozesse basieren auf der Kombination von mehreren Reaktionsschritten, die oft auf sehr unterschiedliche und nicht-kompatible Re-

aktionsbedingungen angewiesen sind. Die Arbeit mit Restriktionsenzymen, Li- gasen und Polymerasen sind charakteristische Beispiele hierfür, die den Wech- sel von Reaktionspuffern erfordert. In anderen Fällen ist es nötig, prinzipiell kompatible Teilschritte in einer bestimmten Reihenfolge abzuarbeiten. Die Re- aktionsbedingungen für Biopolymere zu ändern ist aufwendig und erfordert spezifische Trennungs-und Aufkonzentrierungsschritte, z. B. das Entsalzen von Nukleinsäuren. Es bildet eine signifikante technische Barriere zur Integration, wenn Proben nicht immobilisiert und identisch verarbeitet werden sollen. Un- abhängig davon, ob diese Transferschritte automatisch oder manuell ausge- führt werden, erhöhen sie sowohl die benötigte Zeit als auch das Kontamina- tionsrisiko und verursachen materiell Verluste an Proben.

Hoch parallele Probenführung und Laborautomatisierung im Bereich der Bio- technologie zeigen zwei unterschiedliche Ansätze : offene Chiptechnologie <BR> <BR> (DNA Chips, Antikörper Chips usw. ) und geschlossene Mikrofluidiksysteme (Lab-on-a-Chip). Erfolgreiche bisherige Ansätze, Reaktionssysteme in Mikro- strukturen oberhalb von 1000 Proben zu implementieren basieren auf der Mi- niaturisierung von offenen Reaktionskammern (also der ersten Kategorie). Im wesentlichen seriell arbeitende Pipettierroboter sind dann notwendig, um Pro- ben von einer Kammer in die nächste zu bringen, und begrenzen den Pro- bendurchsatz, wenn Molekültransferschritte benötigt werden. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn Biomoleküle in Lösung von einer Reaktionsbedingung in eine andere gewechselt werden müssen, z. B. um Reaktionen unter einer an- deren Pufferbedingung zu führen. Elektroelution und Elektroentsalzung sind gängige aber aufwendige Methoden, um größere Probenmengen zwischen Re- aktionsschritten aufzuarbeiten. Sie werden zwischen sich ruhenden Flüssig- keiten verwendet.

Unterschiedliche Reaktionsbedingungen können mit Hilfe einer laminaren Flusstechnik in unmittelbare Nähe in geschlossene Mikrosysteme gebracht werden. Hierbei werden zwei oder mehr Flüsse parallel oder antiparallel ne- beneinander in einer Reaktionskammer geführt. Die niedrige Reynoldszahl und

die kleinen Diffusionskoeffizienten (im Vergleich zu Kontaktzeiten) führen zu einer vernachlässigbaren Vermischung der beiden Lösungen an der Grenz- fläche. Eine solche Technik ist bereits früher vorgeschlagen worden. Biomole- küle können dann (z. B. auf magnetischen Beads) von einer Lösung in die nächste transferiert werden. Dieser Transfer ist aber relativ schwer zu inte- grieren und zu kontrollieren ; eine parallele individuelle Reaktionsführung mit Magneten ist aufwendig.

Die Kombination von Mikroreaktorsystemen mit elektrischen Feldern be- schränkt sich in der Regel auf solche Anordnungen, die Felder in Längsrichtung des Flusses erzeugen und so lediglich den elektrophoretischen Effekt zur Teil- chentrennung ausnutzen oder dem Teilchentransport dienen. Bei den ange- legten Feldern kann es sich um gepulste oder harmonisch modulierte Felder handeln, die tatsächlich fähig sind, Elektrolyse in bestimmten Parametergren- zen (Konzentration, Stromdichte, Potentialunterschiede) zu vermeiden. Eine Anpassung an die Teilchensorten dagegen ist kaum möglich. Die Verwendung von geschützten Elektroden durch Gele oder Polymere verhindert die starre Anlagerung von Ionen und die Redox-Umsetzung der zu transportierenden Teilchen. Die zur Zeit meist verwendeten statischen Biochips lassen immer nur wenige Prozessschritte pro Chip zu. Das macht eine weitere Integration von Prozessen sehr schwierig.

Aufgabe Eine Vielzahl von individuell programmierbaren Reaktionsschritten in parallelen Biopolymerproben sollen unter verschiedenen Reaktionsbedingungen in kleinen Volumina durchgeführt werden. Dies soll ohne aufwändige Trenn-oder Pipet- tierschritte oder mechanische oder hydrodynamische Schaltung geschehen, die eine Integration für hoch parallelen Probendurchsatz verhindern.

Lösung Zur Lösung dieser Aufgabe wird mit der Erfindung ein Verfahren nach An- spruch 1 vorgeschlagen ; einzelne Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Mit der Erfindung wird demzufolge ein Verfahren zum Überführen eines in ei- ner ersten Strömung befindlichen Moleküls, Molekülkomplexes oder Mikropar- tikeels in eine benachbart zur ersten Strömung fließende und diese zumindest bereichsweise entlang einer Grenzschicht kontaktierende zweite Strömung be- schrieben, wobei die mindestens zwei laminaren Strömungen unterschiedliche chemische Zusammensetzungen aufweisen, die insbesondere zueinander in- kompatible Reaktionsmittel (z. B. Katalysatoren, Puffer) enthalten, um Reaktio- nen an dem zu überführenden Molekül, Molekülkomplex oder Mikropartikeln hervorzurufen, wobei zusätzlich vorgesehen ist, - dass die chemischen Zusammensetzungen in den beiden Strömungen trotz der Kontaktflächen durch die laminaren Strömungen aufrecht er- halten bleiben und - dass zumindest im Kontaktbereich der Grenzschicht der mindestens zwei Strömungen zur Überführung des Moleküls, Molekülkomplexes oder Mikropartikels ein elektrisches Feld angelegt wird, dass im wesentlichen quer zur Flussrichtung bzw. zu den Flussrichtungen der mindestens zwei Strömungen gerichtet ist.

Mit der Erfindung wird also vorgeschlagen, (Bio-) Moleküle bzw. (Bio-) Molekül- komplexe durch elektrische Felder induziert von einem ersten strömenden Me- dium, mit dem das Molekül eine (bio-) chemische Reaktion eingehen kann, in ein zweites strömendes Medium, mit dem das Molekül ebenfalls (bio-) che- misch reagieren kann, zu überführen. Der Transfer des Reaktants in Form des (Bio-) Moleküls bzw.-komplexes erfolgt also im Fluss.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, über das Anlegen von elektrischen Feldern, die im wesentlichen quer zum Fluss gerichtet sind, selek- tiv Moleküle, Molekülkomplexe oder Partikel in den Strömungen anzusprechen.

Die Besonderheit der Erfindung besteht gerade in diesem selektiven Anspre- chen, was durch die Parameter des elektrischen Feldes erfolgt. Insbesondere haben sich inhomogene elektrische Felder für den Quertransport als vorteilhaft herausgestellt. Vorzugsweise wird durch den erfindungsgemäßen Quertrans- port das Dipolmoment eines Moleküls, eines Molekülskomplexes oder eines Partikels ausgenutzt, das insbesondere in einem inhomogenen elektrischen Feld diesem folgt.

Die Art der Anlegung der elektrischen Felder ist nach der Erfindung der Art gewählt, dass die strömenden Medien keinerlei elektrochemischen Reaktionen ausgesetzt sind.

Grundzüge der Lösungswege 1. Unterschiedliche mischbare Lösungen werden unter parallelen oder anti- parallelen laminaren Flussbedingungen in direktem Kontakt über einer gewissen Strecke geführt, ohne sich insgesamt zu vermischen. Dies kann u. a. in geschlossenen Mikroreaktoren in Kanälen geschehen. Unter den verwendeten Flussgeschwindigkeiten (<< 1 m/s) und Dimensionen (Kanäle mit Breiten und Tiefen auf der Skala von lum-10mm) sind hydrodynamische Turbulenzen nicht vorhanden und thermische Konvek- tion vernachlässigbar. In der Abwesenheit von elektrischen Feldern findet der Austausch von Molekülen zwischen benachbarten Flüssen lediglich ü- ber Diffusion statt. Die Diffusion verursacht eine Mischung der Flüssig- keiten nur innerhalb einer Grenzschicht (Mischungsschicht). Die Breite der Mischungsschicht steigt mit der Kontaktlänge und hängt von der Fließgeschwindigkeit ab. Typische Diffusionskoeffizienten von Biomolekü- len z. B. sind im Bereich 10-11 m2/s.

2. Da sich parallele/anti-parallele laminare Flüsse nicht durchmischen kön- nen sehr unterschiedliche Reaktionsbedingungen in unmittelbare räum- liche Nähe gebracht werden. Das ist von besonderem Interesse, wenn sich Komponenten der einzelnen Lösungen gegenseitig durch Inhibition oder ungewollte Reaktion stören oder verbrauchen würden. Statt die ein- zelnen nicht-kompatiblen Reaktionsschritte räumlich getrennt und nach- einander ablaufen zu lassen, wird nur das Biomolekül von Interesse quer zur Strömungsrichtung der Flüsse von einer Reaktionslösung in eine an- dere transportiert. Dadurch entfallen zusätzliche Zwischenschritte, wie Entsalzung oder Reinigung.

3. Durch den direkten Kontakt der unterschiedlichen Lösungen können gela- dene Moleküle ohne Hinderung durch eine Barriere mittels eines elektri- schen Feldes von einer Lösung zur nächsten transferiert werden. Es wer- den Elektroden in einer quer zur Flussrichtung verlaufenden Aufeinan- derfolge in den Kanal so eingebracht, dass diese die Flussverhältnisse nicht stören. Die Elektrodenabstände bewegen sich zwischen lum und 100, um je nach Kanalbreite und Aufgabe. Wenn der induzierte Transport- weg länger als die Breite der Mischungsschicht ist, können Moleküle von einer Reaktionsbedingung, d. h. Reaktionslösung zur anderen (und wenn gewünscht zurück) geführt werden. Die Moleküle können die Biomoleküle selbst sein oder sonstige Reagenzien (siehe Abb. 1).

4. Die Elektroden werden individuell und gepulst mit Digitalspannungen oder mittels Analogspannungen so angesprochen, dass ein Teilchentransport aufgrund von Elektrophorese oder Elektromigration quer zur Flussrichtung einsetzt. Durch die Verwendung von Digitalspannungen, bei denen Puls- dauer und Tastverhältnis einstellbar sind, können elektrolytische Erschei- nungen vor allem im Hochsalzbereich durch Unterlaufen der Elektroden- kinetiken vermieden werden. Die bekannte Verwendung von geschützten Elektroden durch Gele oder Polymere verhindert die starre Anlagerung von Ionen und die Redox-Umsetzung der zu transportierenden Teilchen.

5. Die individuelle Ansteuerung der Elektroden ermöglicht es ferner, die e- lektrischen Parameter an die zu bewegenden Teilchensorten anzupassen, so dass benachbarte Teilchensorten weniger stark oder gar nicht be- einflusst werden.

6. Die Lösungen werden so zusammengesetzt, dass die Beweglichkeit der Ionen und der Dissoziationsgrad der Hilfsstoffe (Leitsalz, Puffer) die Be- wegung der eigentlichen Teilchen durch Abschirmeffekte an den Elektro- den oder Vermischungen der Puffer bzw. Reaktionslösungen vor allem an den Grenzflächen nur wenig beeinflussen.

7. Durch die Einführung einer Trennwand mit kurzen Verbindungskanälen in regelmäßigen Abständen können nach kurzen Transferperioden unter konstanten Flussbedingungen Zeit für Mischvorgänge und Reaktionen in den getrennten Lösungen gelassen werden, ohne dass sich die beiden Lö- sungen in dieser Zeit vermischen (siehe Abb. 2).

Verbesserungen und Vorteile gegenüber Stand der Technik Die Nutzung der benachbarten laminaren Flusstechnik erlaubt ein hohes Maß an Integration und verhindert Kontamination. Der von Elektroden gesteuerte Transfer von Biomolekülen zwischen Lösung ist schnell und reversibel und kann sogar eine Aufkonzentrierung der Proben mit minimalen Verluste bewir- ken.

Die Verwendung der digitalen Felder ermöglicht die individuelle Ansteuerung einer Vielzahl von Elektroden, so dass die Teilchen spezifisch angesprochen werden können und störende Effekte wie elektrolytische Erscheinungen ver- mieden werden können. Durch die Verwendung kleiner rechteckiger Elektroden mit kleinen Abständen zueinander können sehr hohe Feldstärken realisiert werden. Die Felder können inhomogen ausgestaltet werden, so dass Teilchen

mit stärkerem Dipol-als lonencharakter ebenfalls effektiv beeinflusst werden können.

Durch den Einsatz laminarer Flüsse lassen sich Reaktionen mit stark unter- schiedlichem Reaktionsmilieu in räumlicher Nähe kombinieren. Es kommt nicht zur Inhibition oder ungewollten Reaktion zwischen Reaktionsbestandteilen ver- schiedener Prozessschritte. Keine zusätzliche Reinigungsschritte zum Entfer- nen von nicht benötigten oder störenden Reaktionsbestandteilen, Nebenpro- dukten oder Abbauprodukten werden benötigt. Damit wird u. a. die Reaktions- zeit verringert. Außerdem reduziert sich die Gefahr von Kontaminationen durch teilweise manuelle Arbeitsschritte. Es muss nicht zwischen verschiedenen Re- aktionsumgebungen gewechselt werden. Damit entfallen Probleme, die z. B. durch einen Wechsel der Oberflächenbeschaffenheit (Adsorption) verursacht werden. Es ist keine aufwändige Technik (Ventile, Schalter, Temperaturgra- dienten) nötig.

Anwendungsbeispiel der Erfindung Chemische Amplifikation von Nukleinsäuren : Eine Standardmethode zur Amplifikation von DNA stellt die Polymerase-Ket- tenreaktion (PCR) dar. Sie basiert auf der abwechselnden Denaturierung von Template-DNA, anschließender Hybridisierung spezifischer Primer und deren Elongation. Die klassische Denaturierung erfolgt thermisch, kann aber auch chemisch ausgelöst werde. Zur chemischen Denaturierung kann eine pH- Änderung genutzt werden (50-lOOmM NaOH), aber auch Stoffe wie Harnstoff (8,3M) oder Formamid (50%). Handelt es sich bei den laminaren Flüssen aus Abb. 1 um eine Enzymlösung und eine Denaturierungslösung kann mit Hilfe der Elektroden DNA abwechselnd in die Enzym/Amplifikations-und Denaturie- rungslösung transportiert werden. Damit ist die Voraussetzung zur Amplifia- tion erfüllt. Ein Übergang von der Enzym/Amplifikationslösung zur Denaturie- rungslösung und zurück entspricht dabei einem klassischen PCR-Zyklus.

Alternativen sind 1. Moleküldiagnostik : Die klinische Diagnostik pathogener Organismen besteht in der Regel aus mehreren Reaktionsschritten, deren Reaktionsbedingungen nicht miteinander vereinbar sind. Die wichtigsten Schritte sind der Aufschluss der Zellen und die Extraktion und Detektion der Nukleinsäure. In der Regel ist es möglich, Zellen durch die Zugabe von Lysispuffer aufzuschließen, um genomische oder Plas- mid-DNA freizusetzen. Nach dem Aufschluss müssen überflüssige Zellbe- standteile, wie Zellwandstücke oder Proteine, entfernt werden. Diese DNA- Präparation kann durch angrenzende laminare Flüsse gelöst werden, wenn die Zellen in Zell-Lysis-Puffer in einem Kanal und ein Transportpuffer im Nachbar- kanal angelegt werden. Die DNA wird erfindungsgemäß unter Ausnutzung e- lektrischer Felder, die quer zur Strömungsrichtung gerichtet sind, aus dem Zell-Lysis-Puffer in einen Transportpuffer überführt werden und direkt für weiter Manipulationen, wie Restriktion, oder für eine Detektion, z. B. mittels Hybridisierung, eingesetzt werden.

2. Restriktion/Ligation : Ein Problem bei dem Mehrfach-Restriktionsverdau von DNA sind die zum Teil stark abweichenden Pufferbedingungen der einzelnen Restriktionsenzyme. Die- ses Problem kann durch angrenzende laminare Flüsse gelöst werden, wenn die verschiedenen Puffer mit den entsprechenden Enzymen nebeneinander laufen und nur die DNA überführt wird. Die geschnittene DNA kann in einem weiteren Kanal mit der geeigneten Enzym/Reaktionslösung mit einer Zielsequenz ligiert werden.

3. DNA Synthese : Die Synthese von Nukleinsäuren besteht aus der wiederholten Abfolge mehrer Arbeitsschritte. Es kommt zur Elongation eines Start-Nukleosides durch die Kopplung 5'chemisch geschützter Nukleoside. Anschließend wird die Schutz- gruppe entfernt und das nächste Nukleosid gekoppelt. Am Ende der Synthese wird das Produkt chemisch oxidiert. Die einzelnen Schritte lassen sich durch die Anordnung der entsprechenden laminaren Flüsse und den erfindungsge- mäßen elektroden-induzierten Transport des wachsenden Syntheseproduktes lösen.

In der Zeichnung, auf die bereits oben Bezug genommen wurde, ist darge- stellt : Abb. 1 Ein mikrostrukturiertes Kanalsystem mit unvermitteltem Kontakt der laminaren Flüsse. Die weißen Pfeile zeigen die Richtung der lamina- ren Flüsse (1) an. (2) markiert die Kontaktstelle dieser Flüsse. Die dunklen Rechtecke (3) stehen für Elektroden-Arrays, mit denen Komponenten aus einem Fluss in einen anderen überführt werden können. Das Verfahren ist nicht auf zwei parallele Kanäle beschränkt (links) sondern funktioniert auch mit 3 oder mehr Flüssen (rechts).

Abb. 2 Ein mikrostrukturiertes Kanalsystem mit Vermittlungskanal (4). Die Beschriftung ist analog zu Abb. 1. Auch hier ist das Verfahren nicht auf zwei Kanäle beschränkt.