PROCEDIMIENTO

La presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de células madre mesenquimales equinas y a un sistema para l l evar a cabo ta l procedimiento. En particular, la invención proporciona un procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino, así como un sistema de tipo kit para la realización de dicho procedim iento. Así, la invención encuentra su aplicación en el campo veterinario, en especial para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades del caballo, por ejemplo las derivadas de problemas del aparato locomotor, ayudando a la regeneración tisular de ligamentos, articulaciones, tendones, por ejemplo, así como en la cicatrización de heridas, tratamiento de úlceras corneales, laminitis, etc.

Las células madre son células indiferenciadas capaces de dividirse de manera indefinida y de diferenciarse en cualquier tipo de tejido. En particular las células madre mesenquimales son células madre adultas, esto es proceden de un individuo nacido, que son capaces de diferenciarse a tejidos tales como cartílago, tendón, hueso, piel, músculo, etc. , siendo úti les, por tanto, en la medicina veterinaria para la regeneración y reparación de tejidos lesionados.

En el estado actual de la técnica se han descrito procedimientos para la extracción de células madre a partir de médula ósea, un procedimiento invasivo y limitado por la edad del donante. Así, las características invasivas de este tipo de procedimientos para obtener células madre en las cantidades adecuadas y en el momento oportuno han llevado a nuevas investigaciones para la obtención de células madre a partir de adultos y de forma extra-embrionaria, por ejemplo de membranas fetales, líquido amniótico o cordón umbilical. Así, estos procedimientos claramente no invasivos permiten la recolección de células extra- embrionarias de forma segura, ética y sencilla (AriannaBarbaraLovati y col. , Vet. Res. Commun (201 1 ), 35: 103-1 21 , "Com parison of equine bone marrow-, umbilical cord matrix and amniotic fluid-derived progenitor cells").

En este sentido, Hoynowski y col. ("Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells", Biochem. Biophys. Res. Commun 2007, 362: 347-53) asilaron y caracterizaron una población de células madre procedentes de cordón umbilical equino. Este estudio, así como otros similares, pusieron de manifiesto la necesidad de establecer un protocolo de extracción de tejido no invasivo que permitiera obtener una fuente abundante de células y un bajo nivel de contaminación, en particular teniendo en cuenta que tanto el canal del parto como el entorno ambiental donde éste se produce presentan una condición no esté ri l . L a co n c l u s i ó n d e ta l es e st u d i o s es q u e l a co n ta m i n ac i ó n bacteriana/fúngica es uno de los principales problemas de este tipo de procedimientos, debido al ambiente no estéril donde se desarrollan y al posible contacto con material fecal y con el conducto del parto.

A este respecto, por ejemplo la WO2007/044418, "Cell culture media, kits and methods of use", se refiere a un medio de cultivo celular suplementado con albúmina y libre de productos xenogénicos, a un medio suplementado para el cultivo celular y a un kit para el cultivo de células no hematopoyéticas de origen mesodérmico para su aplicación en investigación y en terapias clínicas.

La WO2004/022078, "Pharmaceutical kits comprisingmesenchymalstemcells", describe un método para el tratam iento del daño de tej ido esqueletal que comprende la administración de una composición de células mesenquimales. La ES 201 031 01 6, "Células mesenquimales y mem brana com puesta para el tratam iento de lesiones osteocondrales", se refiere a una composición farmacéutica que comprende células madre mesenquimales alojadas en una membrana compuesta que presenta al menos dos capas con distinta estructura, siendo la capa inferior porosa y la capa superior compacta, preferiblemente de colágeno, así como al uso de dicha composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones osteocondrales.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino de forma sencilla sin necesidad de que la recogida del cordón umbilical sea realizada por personal cualificado, pero manteniendo las condiciones de esterilidad y funcionalidad del material recogido. Es igualmente objeto de la invención un sistema tipo kit para la llevar a cabo dicho procedimiento que mantenga la esterilidad desde el momento de la recogida del cordón umbilical y durante su transporte hasta el centro de mantenimiento.

De acuerdo con el primer objeto de la invención, el procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino incluye:

1 ) Cortar el cordón umbilical a aproximadamente unos 7 cm de la placenta y lavarlo bajo un chorro suave de agua para eliminar el grueso de materiales extraños adheridos al mismo;

2) La fracción de cordón extraída se introduce en una solución de lavado consistente en povidona yodada, por ejemplo Betadine®, en una solución de suero fisiológico estéril, manteniendo la fracción de cordón sumergida en dicha solución durante 30 minutos;

3) Tras el tiempo indicado anteriormente, la fracción de cordón se retira de la solución de lavado y se introduce en una solución de transporte consistente en anfotericina B , penicilina, estreptom icina y gentam icina en suero fisiológico estéril, manteniéndose a una temperatura de entre 5-8°C para su transporte al laboratorio;

4) La fracción de cordón se extrae entonces de la solución de transporte en ambiente estéril proporcionado por una campana de flujo lam inar y se real iza una revisión m acroscópica de su estado a tem peratura de laboratorio;

5) Siempre bajo campana de flujo laminar, la fracción de cordón se lava con suero fisiológico, se retira entonces el amnios mediante disección roma y técnica estéril y se desecha; opcionalmente antes de retirar el amnios, la fracción se lava con etanol

6) La fracción del cordón se abre longitudinalmente y se retira el tej ido endotelial mediante disección roma, desechándose. El resto detejido se corta a continuación en tiras de cómo máximo 1 cm de ancho, troceándose en fragmentos de 5 mm de longitud;

) Los fragmentos se sumergen sin comprimir en una solución de lavado en laboratorio consistente en anfotericina B, penicilina, estreptomicina y gentamicina en suero fisiológico y se mantienen bajo refrigeración a 2-8°C durante 2-4 horas;

) Se filtra la fracción sólida obtenida, desechándose el líquido, y se digiere en una solución de digestión consistente en colagenasa tipo I, penicilina, estreptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, incubándose a 37°C y 5% C0 ₂ durante 15-24 horas;

) Tras la incubación, se separan las fases, se desecha la fase sólida, se filtra la fase líquida (100 pm) y se añade una solución de medio de cultivo base consistente en suero bovino fetal, penicilina y estreptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, homogeneizando el sistema, y posteriormente se centrifuga 10 minutos a 450g;

0) Tras retirar el sobrenadante, el resultado de la centrifugación obtenido se siembra con una solución de medio de cultivo consistente en suero bovino fetal, anfotericina B, gentamicina, penicilina y estremptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina durante como máximo 96 horas o hasta una confluencia del 90%, a 37°C y 5% C0 ₂ ;

1 ) Una vez alcanzada la confluencia del 90% u observada la presencia de esferoides, se aspira el sobrenadante y se añade una solución de tripsina en suero fisiológico, con agitación suave, incubándose durante al menos 1 minuto a 37°C y 5% CO2, añadiéndose solución de medio de cultivo base y centrifugando durante 5 minutos a 300g, observándose la formación de un pellet, el sobrenadante se desecha;

2) Finalmente, los pellets se criogenizan en una solución de DMEN 4, 5 gl u c o s a + L-glutamina, suero bovino fetal, DMSO, penicilina y estreptomicina a -80°C, manteniéndose a esta temperatura durante al menos 24 horas, para su posterior criomantenimiento a -196°C hasta su uso. En una realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de lavado del paso 2) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril povidona yodada al 10% a una concentración de entre el 0,10% y el 20,00%, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.

En una realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de transporte del paso 3) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril anfotericina B 0,1 pg/ml - 8 pg/ml, penicilina 100-500 U.l./ml, estreptomicina 100 pg/ml - 500 pg/ml y gentamicina 30 pg/ml - 300 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.

En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de lavado en laboratorio del paso 7) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril anfotericina B 0,1 pg/ml - 8 Mg/ml, penicilina 100-500 U.l./ml, estreptomicina 100 pg/ml - 500 pg/ml y gentamicina 30 pg/ml - 300 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.

En una realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de digestión del paso 8) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, colagenasa tipo I 0,50 mg/ml - 2,00 mg/ml, penicilina 100 U.l./ml - 200 U.l./ml y estreptomicina 100 pg/ml - 200 pg/ml, manteniéndose a una temperatura entre - 15 y -22°C hasta su uso.

En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de medio de cultivo base del paso 9) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina suero bovino fetal 7,5% - 12,5%, penicilina 75 U.l./ml - 125 U.l./ml y estreptomicina 75 pg/ml - 125 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.

En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de medio de cultivo del paso 10)se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L- glutamina suero bovino fetal 7,5% - 12,5%, anfotericina B 0,10 pg/ml - 5 pg/ml, gentamicina 10 pg/ml - 300 Mg/ml, penicilina 75 U.l./m - 225 U.l./ml y estreptomicina 75 pg/ml - 225 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso. En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de tripsina de la etapa 1 1 ) se prepara disolviendo tripsina en suero fisiológico al 15 - 25%, manteniéndose a una temperatura entre -15 y -22°C hasta su uso.

En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de criopreservación de la etapa 12) consiste en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina 40 mi - 80 mi, suero bovino fetal 30 mi - 50 mi, DMSO 5 mi - 15 mi, penicilina 7.500 U. l. - 12.500 U. l. y estreptom icina 7,5 mg - 12,5 mg, manteniéndose a una temperatura entre 2 y 5°C hasta su uso.

Es igualmente objeto de la invención un sistema tipo kit para llevar a cabo dicho procedimiento que mantenga las condiciones de limpieza y de temperatura adecuadas desde el momento de la recogida del cordón umbilical y durante su transporte hasta el centro de mantenimiento.

Así, la invención proporciona un sistema tipo kit que incluye, en una caja isotérmica capaz de mantener temperaturas de entre 2-8°C durante al menos 48 horas, un paño de campo estéril (A), al menos un par de guantes de exploración (B), preferentem ente en una bolsa de autocierre, un par de tijeras (C), preferentemente en una bolsa de autocierre, un recipiente de recogida de muestras estéril (D) conteniendo la solución de lavado del paso 2), un recipiente de recogida de muestras estéril (E) conteniendo la solución de transporte del paso 3), preferentemente en una bolsa de autocierre, al menos un acumulador de frío (F) para 72 horas, al menos un separador isotérm ico (G) y a l m enos u n empapador (H). Opcionalmente, el sistema tipo kit incluye instrucciones de uso, hojas de datos del animal, pegatina con los datos y dirección de envío, rollo de cinta adhesiva para sellar la caja y un indicador de temperatura.

En una realización preferente del sistema tipo kit de la invención, la caja isotérmica que incluye los elementos antes citados está fabricada con poliuretano inyectado de alta densidad y revestido con papel de estraza con tratam iento antihumedad de polietileno. A continuación se explica la invención en base a un ejemplo de realización, que es meramente ilustrativo y en ningún caso limitativo del alcance de la misma.

Ejemplo

A la recepción del sistema tipo kit, se sacan los recipientes de recogida de muestras que contienen la solución de lavado (D) y la solución de transporte (E) de las bolsas de autocierre, preferentemente homologadas para transporte. Ambos recipientes de recogida de muestras se mantendrán a una temperatura entre +2 y +8°C, por ejemplo en un refrigerador doméstico.

Los acumuladores de frío (F) deben mantenerse entre -15 y -22°C, por ejemplo en un congelador doméstico, hasta su uso. El resto de los elementos, se guardarán en el interior de la caja a temperatura ambiente y alejada de fuentes de calor y/o de luz.

Cuando se produzca el parto, se coloca, en el lugar más aséptico posible, enfermería o sala de curas si existiese, pero nunca en el interior del box, una mesita portátil. Tras ponerse el operario los guantes de exploración (B), coloca sobre la mesita anterior el paño de campo estéril (A). Se recoge el cordón umbilical directamente con las manos enguantadas. Tras cortar el cordón con las tijeras (C), a unos 7 centímetros de la placenta, se lava con abundante agua a chorro suave, con el fin de limpiar el grueso de las pajas adheridas al mismo. Se sumerge durante 30 minutos el cordón en el recipiente de recogida de muestras estéril que contiene la solución de lavado (D), colocándose su correspondiente tapa. El operario se quita los guantes de exploración (B), desechándolos. El operario se pone un nuevo par de guantes de exploración (B) saca el cordón del interior del recipiente que contiene la solución de lavado (D) y lo introduce en el correspondiente a la solución de transporte (E). Se desecha la solución de lavado. El recipiente (E) se introduce en una bolsa junto a uno de los empapadores (H) y ésta se cierra. Se sacan los acumuladores de frío (F) del congelador y se colocan en la caja. Para evitar congelaciones no deseadas, se colocan los separadores isotérmicos (G) pegados a los acumuladores de frío. Se deposita en el hueco resultante el recipiente que contiene el cordón ya preparado (E), colocando, en el hueco restante, las tijeras (C), el recipiente vacío que contenía la solución de lavado (D) y la hoja de datos previamente rellenada. Se activa el indicador de temperatura y se introduce en la caja junto al resto de los componentes. Se cierra la caja y se sella con cinta adhesiva, pegando en su exterior la pegatina con los datos y dirección de envío al laboratorio. Se transporta al laboratorio en el plazo de 36 horas.

A la recepción del sistema tipo kit, se revisa éste y su contenido, comprobando el buen estado de todos los componentes, confirmándose el mantenimiento de la cadena de frío mediante el análisis del indicador de temperatura. Entonces, se retira el recipiente de muestras que contiene la fracción de cordón umbilical y se introduce en una campana de flujo laminar, donde se saca el cordón mediante técnica estéril realizando una revisión macroscópica de su estado. Una vez superado el control de calidad y siempre en el interior de la campana de flujo lam inar, se rocía la muestra con etanol al 70% durante un tiem po de 2 a 3 minutos, lavándose posteriormente con suero fisiológico, entonces se retira el amnios mediante disección roma y técnica estéril de todo el cordón, el amnios se desecha. Se abre longitudinalmente el cordón con unas tijeras y se retira el tejido endotelial mediante disección roma, desechándose el endotelio. Posteriormente, se corta longitudinalmente el cordón con unas tijeras en tiras de 1 centímetro de anchura como máximo, troceando dichas tiras en fragmentos de 5 milímetros.

Se introducen los fragmentos sin comprimir en tubos tipo Falcon de 50 mi hasta llegar al nivel 30 y se añade solución de lavado en laboratorio hasta llenar el tubo tipo Falcon (nivel 50), de forma que todos los fragmentos estén sumergidos en dicha solución. Los tubos se mantienen en una nevera a una temperatura entre +2 y +8°C de 2 a 4 horas. A partir de este punto, el tej ido se considera estéril, pudiendo estar en contacto sólo con elementos estériles. Una vez transcurrido este tiempo, se pasa el contenido de cada tubo, a través de un embudo Büchner de filtrado, desechando la fracción líquida y reservando la sólida. Se vierte la fracción sólida obtenida en tubos tipo Falcon de 50 mi hasta llegar al nivel 30, rellenando cada tubo con solución de digestión hasta el nivel 40. Se sellan los tubos y se introducen en una incubadora a 37°C y 5% de CO2 durante 3 a 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de digestión, el contenido de todos los tubos se vierte, a través de un sistema de filtrado, en una única cubeta, consiguiendo una separación de las fases sólidas y líquidas. La fase sólida se desecha. La fase líquida se pasa por un filtro de 100 mieras, desechando los filtros. Se llenan los tubos tipo Falcon de 50 necesarios, hasta el nivel 1 5, con la fase líquida, añadiendo 30 m i d e so l u ci ó n d e m ed i o d e cu l t ivo base a cad a u n o , homogeneizando ambas fases, entonces se centrifuga durante 10 minutos a 450g. Se retira el sobrenadante por aspiración, desechándolo.

Se siembra el líquido obtenido en recipientes de cultivo. Cada recipiente se suplementa con solución de medio de cultivo y se introducen en una incubadora a una temperatura controlada de 37°C y con un porcentaje de CO2 del 5%.

A partir de este momento, cada recipiente de cultivo se considera un elemento independiente y se deja reposar en la incubadora, hasta alcanzar la confluencia deseada. Entonces se retira por aspiración el sobrenadante, desechándolo. Se añaden 5 mi de solución de tripsina, agitando suavemente. Se introduce durante almenos un minuto en la incubadora a 37°C y 5% de CO2. Una vez retirado de la incubadora, se añaden 7 mi de solución de medio de cultivo base. Se aspira introduciendo el aspirado en un tubo tipo Falcon, que entonces se centrifuga durante 5 minutos a 300g, formando las células un pellet en el fondo del tubo. Se aspira el sobrenadante, desechándolo.

Se deposita cada pellet obtenido en un criotubo de 2 mi, al que se añaden 2 mi de solución de criopreservacion. Se repetirá esta operación con el resto de los pellets, manteniéndose en una caja especial de congelación y etiquetándose. Esta caja se introducirá en un congelador a -80°C, donde se mantendrá durante al menos 24 horas, para posteriormente introducirse inmediatamente en un contenedor de nitrógeno líquido a -196°C, donde se mantendrá hasta su uso.