MIOCARDIO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos específicos de regeneración celular, tisular y de órganos, especialmente el corazón, tras sufrir los pacientes una patología cardiaca, preferentemente un infarto agudo de miocardio. Dichos métodos están basados en el uso de plasma aislado del seno coronario y, preferentemente de pacientes que han sufrido dicho infarto agudo de miocardio.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los infartos agudos de miocardio (IAM) son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Son producidos por un riego sanguíneo insuficiente del corazón producido por una oclusión u obstrucción en los vasos sanguíneos coronarios. La isquemia o suministro deficiente de oxígeno que resulta de tal obstrucción produce la angina de pecho, que si se recanaliza precozmente no produce muerte del tejido cardíaco, mientras que si se mantiene esta anoxia se produce la lesión del corazón y finalmente la necrosis, es decir, el infarto. El IAM afecta a la función del corazón y, particularmente, a su electrofisiología dando como resultado la fibrilación ventricular o la taquicardia, que pueden provocar una mayor isquemia y un infarto más extenso y conllevar finalmente una muerte súbita cardiaca.

La isquemia que acompaña al IAM tiene como consecuencia la necrosis cardiaca de la zona infartada del corazón. El propio organismo, para reparar dicha necrosis cardiaca, comienza un proceso de remodelación vascular que incluye procesos de angiogénesis, liberando al torrente circulatorio gran cantidad de factores inductores de proliferación y quimioatrayentes que estimulan la migración de las células madre residentes en el corazón hacia la zona dañada y, además, estimula su multiplicación y diferenciación en músculo cardiaco y microvasculatura coronaria. Dicho procedimiento angiogénico es llevado a cabo principalmente por inductores de proliferación como: el factor inducible por hipoxia (HIF-1), el factor estimulante de granulocitos (G-CSF) (Engelmann MG et a 2006, J Am Coll Cardiol. Oct 17;48(8):1712-21., Lapidot T et al, Blood. 2005 Sep 15;106 (6):1901-10. May 12), el factor de crecimiento placentario (P1GF) y sus receptores (Khurana 2005, Circulación 111 : 2828-2836), diferentes miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y sus receptores (van Laake 2006, circulación, 114:2288 - 2297 de ALK; Bobik 2006, Biol 26 del florero de Arterioscler Thromb: 1712-1720; Bertolino 2005, tórax suplementa 128: 585-590), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), y factores de crecimiento angiogénicos, tales como el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), el factor derivado del estroma (SDF-1), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), (Hiasa K et al 2004 Circulation 109: 2454-2461 ; Dar A et al, 2006, Exp Hematol. Aug; 34(8):967-75), además de citoquinas y metaloproteinasas de matriz, que han sido también descritas como potentes factores angiogénicos (Nyberg F, 1990. FEBS Lett. 1990 Jul 2;267(l):75-7).

Las investigaciones de nuevas terapias en pacientes con infarto agudo de miocardio tratan de alcanzar la regeneración intrínseca de los cardiomiocitos para reparar los daños producidos por el infarto, así como en identificar los diferentes factores de crecimiento también implicados en dicha regeneración como una posible solución para la regeneración del corazón tras un IAM. En este sentido, uno de los tratamientos más utilizados, hasta la fecha, en el estado de la técnica, para reparar los daños producidos por el IAM es el transplante de cardiomiocitos o de células progenitoras, ya sean pluripotentes o multipotentes, es decir, aquellas células con capacidad intrínseca de diferenciarse a cardiomiocito y que son capaces de anclarse, implantarse (engraftment) ó fusionarse con el tejido preexistente sin ocasionar cambios en el control eléctrico del corazón, o arritmias ventriculares. Los principales problemas que presenta este tipo de tratamiento es que no se ha conseguido estandarizar un método específico para el transplante de dichos cardiomiocitos o células progenitoras ya que en los diferentes estudios existentes en el estado de la técnica, tanto el modo, como el número y como la capacidad de implantación de dichas células es muy heterogénea (Leone AM et al. From bone marrow to the arterial wall: the ongoing tale of endothelial progenitor cells. Eur Heart J. 2009 Apr; 30(8):890-9).

Además, existen estudios que demuestran que la implantación de células progenitoras, que pueden dar lugar a cardiomiocitos, por vía periférica, hace que la mayoría de dichas células no sean viables, o acaben acumulándose en el bazo o en órganos reservónos, como los pulmones, e incluso cuando dichas células han sido implantadas directamente en el músculo cardiaco tampoco se ha llegado a una normalización o estandarización en cuanto al número de células que deben implantarse, el vehículo en el que están inmersas para realizar la implantación de las mismas o incluso el lugar del implante o el momento después de sufrir el IAM (M. Hristov et al. Intracoronary infusión of autologous bone marrow cells and left ventricular function after acute myocardial infarction: a meta-analysis. J. Cell. Mol. Med. Vol 10, No 3, 2006 pp; Abdel-Latif A, et al., Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis. Arch Intern Med. 2007 May 28;167(10):989-97; Yousef M et al., The BALANCE Study: clinical benefit and long-term outcome after intracoronary autologous bone marrow cell transplantation in patients with acute myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology2009; 53(24):2262-9). Otros ensayos llevados a cabo también con células progenitoras procedentes de muestras de sangre periférica extraída de pacientes que han sufrido un IAM y que poseen el marcador CXCR4, que le permite el anclaje al tejido, tampoco han mostrado mejorías en los pacientes (Tendera M, et al. Intracoronary infusión of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+ cells and non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary Infusión of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction (REGENT) Trial. European Heart Journal. 2009; 30(11):1313-21).

Otra de las terapias utilizadas actualmente en el estado de la técnica para la regeneración de los daños producidos en los pacientes post-IAM es el tratamiento combinado de factores estimulantes de la proliferación junto con células progenitoras. En este sentido, en el ensayo clínico MAGIC trial se administró a los pacientes el factor de proliferación G-CSF junto con células derivadas de la médula ósea aisladas de muestras de sangre periférica obtenida de dichos pacientes. Los resultados pusieron de manifiesto que a pesar de la mejora de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, es decir, de la capacidad de eyeccionar sangre al torrente sanguíneo, que presentaban los pacientes tratados con dicha terapia, se observó que se producía una seria restenosis del stent implantado. Es decir, las células implantadas recubrían al stent obstruyendo e impidiendo el flujo sanguíneo, por lo que dicha terapia tampoco es aconsejable para el tratamiento de pacientes que han sufrido un IAM (Kang HJ et al., Effects of intracoronary infusión of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarctiomthe MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 2004; 363(9411):751-6).

Por lo tanto, hasta la fecha, no se ha encontrado un tratamiento estandarizado capaz de inducir la regeneración del miocardio dañado tras un IAM, ya sea mediante transplante directo de células progenitoras o mediante la implantación de factores inductores de proliferación o crecimiento. Existen estudios clínicos que demuestran que el tratamiento con el factor de proliferación G-CSF, puede mejorar la regeneración del miocardio de dichos pacientes, pero aún no se ha obtenido un tratamiento estandarizado para los mismos (Ellis SG, et al. Granulocyte colony stimulating factor in patients with large acute myocardial infarction: results of a pilot dose-escalation randomized trial. American Heart Journal.2006; 152(6): 1051 e9-14; Takano H, et al. , Feasibility and safety of granulocyte colony-stimulating factor treatment in patients with acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology. 2007; 122(l):41-7; Zohlnhofer D, et al., Stem cell mobilization by granulocyte colony- stimulating factor in patients with acute myocardial infarction: a randomized controlled trial. Jama. 2006; 295(9):1003-10).

En este sentido, todos los estudios, realizados hasta la actualidad, en el estado de la técnica para averiguar cuales eran los factores de crecimiento capaces de inducir la regeneración del corazón tras un IAM, se han basado en análisis de muestras de sangre periférica de pacientes con IAM. Hasta el momento, no se conoce cuales son los factores de crecimiento específicos o una combinación de los mismos, presentes en dichas muestras de sangre periférica que son capaces de inducir y estimular la migración de las células madre residentes en el corazón hacia la zona dañada y, además, estimular su multiplicación y diferenciación en músculo cardiaco y microvasculatura coronaria. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

Para solventar el problema existente en el estado de la técnica en cuanto a cuáles son los factores de crecimiento implicados en la estimulación de la supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos dañados, así como los métodos alternativos a los conocidos en el estado de la técnica, capaces de inducir una mayor estimulación y capacidad de supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos dañados tras una patología, preferentemente cardiaca, la presente invención describe el uso del plasma aislado del seno coronario (SC), preferentemente de p aciente s que han p adecido una enferme dad cardiac a, más específicamente, un IAM, como medicamento.

Además, la presente invención también describe el uso de dicho plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que han sufrido una patología cardiaca, para la obtención de factores de crecimiento y/o para la elaboración de una composición farmacéutica destinada a la estimulación de la supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos, específicamente del corazón. Como se describe a lo largo de la presente invención, el plasma aislado del seno coronario de pacientes que han padecido una enfermedad cardiaca y más específicamente un IAM posee una mayor capacidad de quimioatracción de células importantes para la regeneración celular y de órganos, en general, que el plasma aislado de muestras de sangre periférica de pacientes que también han padecido una enfermedad cardiaca, y más específicamente un IAM.

La presente invención también demuestra que las células dañadas tras sufrir una patología cardiaca, como por ejemplo un IAM, liberan a dicho SC gran cantidad de factores de crecimiento y factores quimiotácticos, implicados en la reparación y proliferación de células progenitoras, como por ejemplo, las células progenitoras derivadas de médula ósea (HSC), las células progenitoras endoteliales (EPC) o las células progenitoras mesenquimales (MSC), entre otras.

También la presente invención describe un método in vitro para estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos, caracterizado por la aplicación de plasma aislado del seno coronario de pacientes que han sufrido una patología cardiaca, preferentemente un IAM, en dichos órganos.

Tanto el plasma aislado del seno coronario preferentemente de pacientes que han padecido una patología cardiaca, como los métodos descritos en la presente invención, son capaces de inducir una mayor regeneración de los órganos, particularmente del corazón tras el daño sufrido, sin presentar problemas de histocompatibilidad como sucede en el caso de los transplantes de células cardiacas. Además, los métodos basados en el transplante de células además de presentar la desventaja mencionada previamente, son muy caros, tanto desde el punto de vista económico, como en el uso de recursos materiales y humanos. Si en lugar de realizar transplantes celulares en pacientes que han sufrido un IAM o cualquier otra patología cardiaca, se utilizan factores de crecimiento, el proceso seria rápido, barato y asequible a la mayoría de enfermos que lo necesitan.

A efectos de la presente invención, el término seno coronario se refiere a un conducto venoso ubicado en la pared posterior del corazón que recibe toda la sangre venosa de éste y la traslada a la aurícula derecha. A los efectos de la presente invención el término factor de crecimiento se refiere a un conjunto de sustancias, la mayoría de naturaleza proteica, que, junto con las hormonas y los neurotransmisores, desempeñan una importante función en la comunicación intercelular. Su función principal es estimular la proliferación celular mediante la regulación del ciclo celular iniciando la mitosis, además de mantener la supervivencia celular, estimular la migración celular y la diferenciación celular. Dichos factores de crecimiento son transportados por el suero y producidos por gran número de células. Entre los factores de crecimiento incluidos en la presente invención destacan: factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), proteínas morfogénicas del hueso (BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y relacionados (TGF-alfa), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF), factor estimulante de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina (EPO), y trombopoyetina (TPO), entre otros.

A los efectos de la presente invención el término factor quimiotáctico o quimioatrayente hace referencia a sustancias capaces de atraer, preferentemente, a células. Dicho concepto se refiere especialmente a aquellos factores liberados como resultado de un daño tisular, invasión o actividad inmunológica, capaces de atraer a leucocitos, macrófagos, células progenitoras u otras células, al sitio del daño o en el que se está produciendo una infección. Entre los factores quimiotácticos o quimioatrayentes incluidos en la presente invención destacan: distintos tipos de interferones (α, β, δ, κ, γ, ε, etc), interleucinas, VEGF, SDF-1, TSP-1, IGF-1, BMP (péptidos natriuréticos), secretagogos de la hormona del crecimiento (GH): Ghrelina, TGF- beta y metaloproteinasas de matriz, entre otros.

A efectos de la presente invención, el término vehículo hace referencia a la sustancia o medio, preferentemente líquido, junto con el cuál se deben administrar las células progenitoras aisladas de sangre periférica de pacientes que presenten una enfermedad cardiaca o cualquier otro tipo de patología en la que sea necesaria la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de algún órgano o tejido, como por ejemplo, enfermedades que se den lugar a la producción de fístulas cutáneas, enfermedad de Chron, enfermedades en las que sea necesario la regeneración de células endoteliales, o de tejido óseo, o de tejido dérmico, etc. En la presente invención, el término vehículo hace referencia al plasma aislado del seno coronario de pacientes que padecen enfermedad cardiaca y más preferentemente, enfermos que han sufrido un IAM. El plasma de la invención utilizado como vehículo puede además comprender otras sustancias terapéuticamente y/o farmacéuticamente aceptables, conocidas en el estado de la técnica y que obviamente sean compatibles con dichas células progenitoras. A efectos de la presente invención el término célula progenitora se refiere a aquella célula capaz de generar uno o más tipos de células diferenciadas y que además posee la capacidad de autorrenovación. Las células progenitoras pueden seleccionarse de entre cualquiera del grupo que comprende: HSC, EPC, MSC, células derivadas de médulas ósea (BMDC), células endoteliales derivadas de cordón umbilical (HUVEC), células madre embrionarias (ESC), células madre embrionarias KDR+ (Kinase inserí domain receptor también denominado VEGFR2: receptor 2 del factor VEGF) y células pluripotentes inducidas (iPS), entre otras.

A los efectos de la presente invención el término sustancias o excipientes farmacéuticamente aceptables se refiere excipientes que no producen ningún efecto tóxico cuando son administrados a animales, incluyendo los seres humanos. Dichos excipientes pueden seleccionarse de entre cualquiera de la lista o una combinación de los mismos: aglutinantes, rellenadores, disgregantes, lubricantes, recubridores, edulcorantes, saborizantes y colorantes, entre otros. A los efectos de la presente invención el término cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado, es decir, es la cantidad mínima efectiva, por encima de la cuál una composición, fármaco o principio activo, inicia su efecto terapéutico. A los efectos de la presente invención el término enfermedad cardiaca se refiere a la presencia de afectación miocárdica de cualquier etiología. Entre las enfermedades cardiacas referidas en la presente invención se encuentran la cardiopatía isquémica (IAM), la cardiopatía hipertensiva, valvulopatías (enfermedades relacionadas con las válvulas del corazón), cardiopatías familiares, miocarditis, enfermedad miocárdica infiltrativa, miocardiopatía dilatada, entre otras y cualquiera de sus combinaciones. Descripción de las figuras

Figura 1. Fotografías obtenidas mediante citometría de flujo (Dako cytomation, Dako, USA) en las que se muestran las células progenitoras endoteliales circulantes que expresan los marcadores CD133+ y KDR+, obtenidas de muestras de plasma periférico de pacientes con enfermedad cardiaca y que han sido cultivadas durante 5 días (A) y 7 días (B) en medio de cultivo Endothelial Basal Médium EBM-2 (Cambrex, Lonza, Switzerland) suplementado con factores de crecimiento. Las células progenitoras endoteliales circulantes se han incubado en presencia de los anticuerpos monoclonales CD133 unido a ficoeritrina (CD-133-PE) (clon AC133, Milteny Alemania) y KDR unido a aloficocianini (KDR-APC) (clon 89106 R&D, USA). En el eje X se muestran las células que expresan el marcador CD133 expresado como unidades de emisión de fluorescencia al estar unidas al anticuerpo CD133-PE. En el eje Y se muestran las células que expresan el marcador KDR expresado como unidades de emisión de fluorescencia al estar unidas al anticuerpo KDR-APC.

Figura 2. Fotografías obtenidas con microscopio invertido de fluorescencia de células marcadas con calceína AM que han pasado a través de la membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA) en presencia del factor quimiotáctico VEGF (a) o del plasma de un paciente que ha sufrido infarto agudo de miocardio con más de 7 días post-infarto (b) o del factor quimiotáctico SDF-1 (c) o del plasma del seno coronario de un paciente con 1 día post-infarto (d). Las imágenes han sido tomadas empleando un microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U y se tomaron imágenes con la cámara Nikon modelo DS5MC.

Figura 3. Ensayo de migración. La gráfica muestra el incremento en el número de células mononucleares (eje Y) procedentes del plasma obtenido de muestras de sangre periférica (PP) y sangre del seno coronario (PSC) de pacientes con IAM que han pasado a través de la membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA) en presencia de los diferentes factores quimiotácticos utilizados en el ensayo (eje X) respecto al control positivo (10% se suero bovino fetal, FBS). En la gráfica se muestran la media ± desviación estándar de las células del seno coronario (barras negras) vs sangre periférica (barras blancas). TSP-1 : trombospondina- 1, VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial, SDF-1 : factor derivado de estroma 1, PP: plasma periférico procedente de pacientes con IAM diluido a una concentración del 10% en medio de cultivo EBM-2, PSC: plasma del seno coronario procedente de pacientes con IAM diluido a un concentración del 10%> en medio de cultivo EBM-2. (Lonza Cambrex, Switherland). La significación estadística se expresa como p<0,05 del PSC respecto al resto de quimioatrayentes.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han encontrado que el plasma obtenido del seno coronario posee factores, diferentes a los conocidos hasta ahora en el estado de la técnica, capaces de inducir la proliferación y la quimiotáxis, de las células madre presentes en el miocardio, favoreciendo así la regeneración de dicho órgano, pudiendo por tanto ser utilizado en procedimientos de regeneración cardiaca en aquéllos enfermos que han sufrido un evento cardiaco, como por ejemplo, un IAM.

Así, la presente invención, divulga el uso de plasma aislado del seno coronario de pacientes que padecen enfermedad cardiaca como medicamento. Preferentemente, dicho plasma puede ser aislado del seno coronario de pacientes que padecen enfermedad cardiaca. Además, este objeto hace referencia al plasma aislado del seno coronario, particularmente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, para ser usado como medicamento.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere al uso de plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, para la obtención de una composición farmacéutica destinada a estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos, como por ejemplo, tejido endotelial, óseo, dérmico, etc.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere al uso del plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, para la obtención de factores de crecimiento y/o quimiotácticos destinados a la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos. Entre los factores de crecimiento y/o quimiotácticos presentes en dicho plasma destacan, el HGF, IGF-1. TGF-beta, TGF-alfa, BMPs, PDGF, VEGF, IGF-1, Interferon-gamma, interleucinas, secretagogo de la hormona del crecimiento Ghrelin, FGF, KGF, EGF, NGF, G-CSF, GM-CSF, EPO, TPO, SDF-1 y TSP-1, entre otros y cualquiera de sus combinaciones.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere al uso del plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, como vehículo para la administración de células progenitoras destinadas a la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos. En este sentido, las células progenitoras se aislan preferentemente de sangre periférica, preferentemente del propio paciente que padece una enfermedad cardiaca o bien de cualquier paciente que padece una enfermedad en la que sea necesaria la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejido dañado, como por ejemplo, la enfermedad de Chron, enfermedades que se desarrollan con la aparición de fístulas cutáneas, entre otras. Además, las células progenitoras aisladas de dicha sangre periférica se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR+, y/o iPS o combinaciones de las mismas. En una realización preferida de la presente invención, los pacientes a los que se les extraen las muestras de sangre del seno coronario para obtener el plasma, son pacientes que han sufrido un lAM.

En otra realización preferida de la invención, el órgano preferido capaz de regenerarse y/o repararse tras una lesión es el corazón.

En otra realización preferida de la invención, los tejidos preferidos capaces de regenerarse y/o repararse tras una lesión son preferentemente el tejido óseo, el tejido dérmico y el tejido epitelial.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a una composición que comprende plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, siendo preferentemente dicha enfermedad cardiaca, IAM. En una realización preferida, la composición descrita en la presente invención es una composición farmacéutica. En una realización más preferida, la composición de la invención, además comprende excipientes farmacéuticamente aceptables. En otra realización aún más preferida, la composición, además comprende células progenitoras, que se seleccionan de entre cualquiera de la lista: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR+ y/o iPS o combinaciones de las mismas.

La composición descrita en la presente invención, puede ser usada para la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de tejidos y/o órganos, siendo el órgano preferido el corazón. Otra realización preferida de la invención consistiría en una composición para conservación de órganos extraídos que comprenda plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, preferentemente IAM. Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método in vitro para estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos extraídos extra-corpóreamente caracterizado por la aplicación del plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, preferentemente IAM, o una composición que comprenda dicho plasma, a dichos órganos mencionados.

En una realización preferida, el método in vitro descrito en la presente invención se caracteriza por que el órgano es preferentemente el corazón.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, preferentemente IAM, para ser usado en la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere al plasma descrito en la presente invención para ser usado como vehículo para la administración de células progenitoras destinadas a la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método de tratamiento de pacientes aquejados de enfermedades que necesitan para su tratamiento la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones descritas en la presente invención. A efectos de la presente invención, las enfermedades que necesitan para su tratamiento la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de las comprendidas en la lista: enfermedad de Chron, enfermedades que se desarrollan con la aparición de fístulas cutáneas, enfermedades en las que es necesario la regeneración del tejido endotelial, y/o del tejido óseo y/o del tejido dérmico, entre otras. Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un método de tratamiento de pacientes aquejados de enfermedad cardiaca que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones descritas en la presente invención. En una realización preferida, el método de tratamiento descrito en la presente invención se caracteriza por que la enfermedad cardiaca es IAM.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar la invención y no pretenden limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1. Obtención y procesamiento de las muestras sangre de pacientes con IAM.

Se han tomado muestras de sangre tanto periférica como del seno coronario de pacientes con IAM (n=8), previo consentimiento informado durante la intervención quirúrgica no invasiva a la que fueron sometidos. Dichas muestras de sangre fueron procesadas por separado, aislando en ambas muestras de sangre, periférica y del seno coronario, por un lado el plasma, utilizando para ello ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y, por otro lado, las células progenitoras endoteliales, utilizando heparina (BD vacutainer, USA) como anticoagulante.

Para la obtención del plasma, las muestras de sangre periférica y de sangre del seno coronario se centrifugaron, inmediatamente a su extracción, a 3000 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4°C. Posteriormente se realizó una segunda centrifugación para la eliminación de los posibles restos plaquetarios residuales que quedasen en dicha muestra de plasma. Las condiciones de la segunda centrifugación fueron 10000 rpm a una temperatura de 4 ^o C durante 10 minutos. Las muestras de plasma obtenidas se almacenaron a una temperatura de -80°C hasta el momento de realizar los ensayos de migración.

Para la obtención de las células progenitoras endoteliales de las muestras de sangre periférica y del seno coronario de los pacientes con IAM, dichas muestras de sangre fueron sometidas a un proceso de centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll (Sigma-Aldrich, USA) a 800g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares obtenidas de la primera centrifugación se lavaron con buffer fosfato (PBS) al 1% de suero bovino fetal (FBS, Cambrex, Lonza, Switzerland). Posteriormente, se sembraron en placas de cultivo recubiertas con fibronectina según el método descrito por Hill y colaboradores (Hill JM et al 2003, N Engl J Med 348: 593-600) y se mantuvieron durante 7 días en medio de cultivo específico para el crecimiento de células endoteliales el Endothelial Basal Médium EBM-2 (Cambrex, Lonza, Switzerland) suplementado con diferentes factores de crecimiento para potenciar el crecimiento de las células progenitoras circulantes periféricas. Mediante ensayos de citometría, usando el marcado primitivo CD133+ que está asociado a regeneración celular, se comprobó que el tiempo óptimo de cultivo para obtener las células progenitoras endoteliales fueron 7 días (Figura 1). Por tanto, durante dichos 7 días, las células se mantuvieron en cultivo para obtener las células progenitoras endoteliales.

Entre los factores de crecimiento adicionados al medio de cultivo EBM-2 se encuentran el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el factor de crecimiento endotelial (EGF) y el factor de crecimiento insulínico (IGF). Además, se añadió al medio EBM-2: glucagón, anfotericina D, penicilina-estreptomicina y 20% de FBS (Cambrex, Lonza, Switzerland). El cultivo se llevó a cabo en cámaras de cultivo a una temperatura de 37 °C y en una atmósfera húmeda al 5% de CO ₂ . Esté método de cultivo permite en una primera fase de cultivo de 48 horas de incubación, descartar las células circulantes maduras como son células endoteliales adultas y los monocitos, que se adhieren a la placa de cultivo recubierta por fibronectina. En una segunda fase de cultivo se siembran las células no adheridas en el medio de cultivo especificado con anterioridad, permaneciendo 7 días en incubación, recambiando el medio cada 3 días. De esta manera, las posibles contaminaciones con células no adherentes que preexisten en la fase mononucleada de la sangre, como linfocitos, contaminaciones con eritrocitos, etc. son descartadas, y se favorece el crecimiento de las células progenitoras endoteliales circulantes (Figura 1).

Transcurrido dicho tiempo las células fueron tripsinizadas en una solución de Tripsina-EDTA lx (Sigma-Aldrich, USA) durante 3 minutos en la cámara de cultivo a una temperatura de 37°C y en atmósfera húmeda al 5% de CO ₂ . A continuación, las células se recogieron y se resuspendieron en una solución de medio de cultivo EBM-2 al 10% de FBS y se centrifugaron. El pellet celular formado por células progenitoras circulantes CD133+ se resuspendió en lml de medio de cultivo EBM suplementado con 10%> de FBS y que además contenía 5μΜ de calceina AM (Invitrogen, España), manteniéndose posteriormente en cultivo durante 12 horas en cámara de cultivo a una temperatura de 37°C, en atmósfera húmeda con un 5% CO ₂ . La calceina AM es un marcador de viabilidad celular, que permite la identificación de las células vivas al dar lugar a una tinción verde fluorescente en las células que lo incorporan en su metabolismo, lo cual solo puede suceder cuando las células están vivas. Mediante dicho procedimiento de viabilidad celular se puso de manifiesto a través del empleo del microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U, junto con la cámara Nikon modelo DS5MC, que el 100% de las células cultivadas se encontraban teñidas con calceína AM (Invitrogen, España) (Figura 2). Las fotografías mostradas en la Figura 2 son la representación de las células que han pasado a través de la membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA), la cual impide que la fluorescencia de ambos extremos de la membrana se sume, por lo tanto solo se cuantificarán las células que pasan a través de dicha membrana, en presencia de los quimioatrayentes VEGF (Figura 2a), SDF-1 (Figura 2c), plasma de un paciente con IAM con más de 7 días post-infarto (Figura 2b) o plasma del seno coronario de un paciente con 1 día post-infarto (Figura 2d).

Posteriormente las células fueron lavadas y resuspendidas en medio EBM-2 al 0,1 % de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich, España) para llevar a cabo los ensayos de migración.

Ejemplo 2. Ensayos de migración celular. Para la realización de los ensayos de migración celular se sembraron 100.000 células, cultivadas según se ha explicado en el Ejemplo 1, en la parte superior de una cámara de cultivo modificada de Boyden con membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA) de 8 μιη de diámetro en medio de cultivo EBM-2 al 0,1 % de BSA. El tamaño de las células que son investigadas determina el tamaño del poro de la membrana, y esto es esencial para elegir un diámetro que permita una transmigración activa. En este sentido se ha seleccionado un diámetro de 8 μιη para permitir el paso a través del mismo de las células progenitoras endoteliales presentes en las muestras de plasma de sangre periférica y de seno coronario de los pacientes con IAM descritos en la presente invención. En la parte inferior de la cámara de Boyden se sembraron las diferentes sustancias quimiotácticos que se testaron en el presente ensayo a las concentraciones previamente descritas para las mismas en el estado de la técnica. Las sustancias quimioatrayentes testadas fueron: solución de FBS diluido al 10%> en medio de cultivo EBM-2 (control positivo), trombospondina-1 (TSP-1, RD USA) a una concentración de 200ng/ml (Maier KG 2009, Am J Surg. Nov; 198(5):664-9); factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a una concentración de 50ng/ml (Yu JX 2009 J Vasc Surg. Sep; 50(3):608-l 6); factor derivado de células estromales-1 (SDF-1) a una concentración de lOOng/ml (Yu JX 2009 J Vasc Surg. Sep; 50(3):608-16), solución diluida en medio de cultivo EBM-2 al 10%> de plasma procedente del seno coronario de pacientes con IAM y solución diluida en medio de cultivo EBM-2 al 10% de sangre periférica de pacientes con IAM. Las células se mantuvieron en cultivo en presencia de los diferentes factores quimioatrayentes mencionados, así como del plasma obtenido de las muestras de sangre periférica y del seno coronario de pacientes que han padecido un IAM, en la cámara de Boyden durante 24 horas a una temperatura de 37°C y en atmósfera húmeda al 5% de CO ₂ . Transcurrido dicho tiempo se realizaron las lecturas en un fluorímetro de placa modelo FLX800 BT (Izasa, España) (480- 530nm) para averiguar la capacidad de migración de dichas células aisladas en presencia de cada una de las sustancias testadas. Para la cuantificación del número total de células por pocilio se utilizó una recta de calibración con rangos que variaron de 150.000 células a 1000 células marcadas con calceína- AM en medio EBM-2. Los resultados se expresaron como el incremento del número de células que pasan a través de la membrana de fluoroblock relativizados con respecto al control positivo del estudio (10% de FBS). Como puede observarse en la Figura 3 el plasma proveniente de las muestras de sangre extraídas del seno coronario de pacientes con IAM posee una mayor capacidad quimioatrayente tanto de células mononucleares periféricas, como, más aún, de células del seno coronario, más incluso que los factores SDF-1 y VEGF, ampliamente conocidos en el estado de la técnica como unos de los principales y mayores quimiotrayentes presentes en el plasma (Zaruba MM et al, 2010, Expert Opin Biol Ther. Mar; 10 (3):321-35). Sin embargo y, como se muestra en la Figura 3, el plasma proveniente del seno coronario (PSC) de pacientes que han padecido IAM presenta una mayor capacidad de quimioatracción tanto para las células endoteliales progenitoras obtenidas de la sangre periférica, como, más aún, para las células endoteliales progenitoras obtenidas de la sangre del seno coronario de los pacientes que han sufrido un IAM. Por lo tanto la presente invención pone de manifiesto que el seno coronario en un nicho importante para la búsqueda de nuevas dianas terapeúticas para el "homing" celular de células progenitoras, es decir, para la capacidad que presentan las células progenitoras para migrar desde reservónos alejados de las zona afectada o dañada del paciente, hacia las zonas isquémicas, infartadas o dañadas y para la quimiatracción celular.

Ejemplo 3. Análisis de la presencia de los factores quimioatrayentes VEGF, SDF-1, HGF y TSP-1 en muestras de sangre del seno coronario de pacientes con IAM.

Para el análisis de la concentración de los factores quimiotácticos se extrajeron, en tubos con EDTA, muestras de sangre procedentes del seno coronario de los pacientes que habían sufrido un IAM (Ver Ejemplo 1), para posteriormente proceder al aislamiento del plasma de dichas muestras. Dicha sangre se almacenó rápidamente en hielo a 4 ^o C para su procesamiento. El procesamiento de las muestras para el posterior análisis de la presencia de los factores quimiotácticos: VEGF, SDF-1, HGF y TSP-1 fue realizado en un tiempo inferior a 30 minutos debido al proceso de endocitosis plaquetario de ciertos componentes sanguíneos, como es el caso de la citoquina VEGF. Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a lOOOg a una temperatura de 4°C. Se recogió la fase plasmática que fue nuevamente sometida a centrifugación durante 10 min. a 10000g a 4°C. El plasma obtenido se almacenó a una temperatura de -80°C hasta su posterior análisis.

El análisis de la concentración de los factores quimiotácticos, mencionados previamente, en el plasma aislado de muestras de sangre extraídas del seno coronario de pacientes que habían sufrido un IAM, se realizó mediante kits comerciales de ELISA, para cada uno de los factores quimiotácticos analizados (VEGF, SDF-1, HGF y TSP-1) y siguiendo las instrucciones del fabricante (R&D systems, Minneapolis MN).

En la tabla 1 se muestra la concentración (pg/mL) de los quimiotácticos mencionados previamente, en las muestras de sangre del seno coronario de pacientes, entre los día 1-8 tras sufrir un IAM. Como se puede observar en dicha Tabla 1 no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la concentración de dichos quimioatrayentes respecto a los días transcurridos desde el evento coronario, IAM. Por lo tanto, de dichos resultados se deduce que la capacidad quimiotrayente, mostrada en la presente invención, que presenta el plasma/suero del seno coronario de pacientes post-AMI, no es consecuencia de los principales marcadores reconocidos por su capacidad quimioatrayente: VEGF, SDF-1, HGF o TSP-1 ; sino que es debida a la existencia en dicho plasma/suero de la presencia de otras moléculas que poseen dicha capacidad quimioatrayente, para la regeneración de la zona infartada del miocardio.

Tabla 1. Concentración de marcadores quimiotácticos en muestras de plasma aislado de sangre del seno coronario de pacientes con IAM.

Días VEGF SDF-1 HGF TSP-1 post-infarto (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL)

Paciente 1 5 - 1281 820 208

Paciente 2 1 28 1889 8000 -

Paciente 3 2 19 1643 4687 167

Paciente 4 7 7 2488 11939 83

Paciente 5 6 7 2359 5955 -

Paciente 6 8 7 3069 32015 1240

Paciente 7 1 7 1920 32773 317

Paciente 8 6 51 3686 10045 662