防治 岛 抵抗和糖尿 ¾的 u试剂

&术领域

水 n H τ ' I · 1勿 术领域： 更 .休地， 木发 涉及 i½ ½ 岛 ¾抵抗和糖尿 的 h法 和试剂. . 术

糖尿^ i 1-.¾分为 I Ή糖尿 和 2 ^.尿^ i两种类 H 1 糖尿^ ί 由丁 -ΰ A免疫系 统紊乱， 引 腺 + 岛 p细胞' :2损， ί¾Ι½岛 分泌不 2 糖尿 m糖尿^的 i-.

' ^形式， 90%以 I ·. i½糖尿 丄 ¹ 、 h\丁.2 ";'! 尿 - ， 其特点 岛 刺激的靶 ^织 11 ',现 岛¾抵杭症状， 即 (¾岛 相对不 /1-： |卜:常^况下 , 岛 p细胞分泌的^岛¾ 丁11'11.糖 水 τ·的动态下衡起 作 .> 岛 ¾汕过促进肌肉 \和脂 nh 葡^!糖的吸收,

M 11 ·]抑制 I Π W¾ I.织的掂 ' I ·:來降低 I ίι I.糖水 Τ· ffn /i； i岛 抵杭 况下， 11 ·:常浓 &的 岛 不能込-到预期的降糖 ¾ W， 机休不得不产 ' I ·:更多的 0^岛 来补 ^ , 从 π,]维持 ιίι I.糖浓 )'λ ·. 当 P细胞分泌的^岛 不能 种补 吋， 就^引 表现 糖 « {J m J II I.糖 常， 继 rfn引发 岛 p细胞 m亡， ki终发展成：)、 j 2 >['>糖尿 ,, 可见， 岛¾抵抗 2 糖尿 ^的发 .发展' I'.fc J'至 . ϋ的作 tt

岛 抗 ' -J肥胙及 的 'ι.ϋ式密 w相 .)'、■， ίά ·种涉及多个 tA'器 rv的代谢疾 ， 发^机制目 fji/jd不 : ΐ个^楚.， 的研究汄为， 血液 ^环' I'的激 细胞 w子、 來';訂'脂 tij I. \的 I ^酸和 i ^糖' 能源物质 岛 祗抗密 w相 例 ， 脂 .«/； \. (屮脂质的过 枳 ¾, 能诱 4脂^细胞木 对^岛 抑制的脂解作 fflt^抵抗， 这将^ ί ijg ^j I. ^籽放 ! h更多 u& wh酸和 id油进入 ιίιι液 iifi环， 继 m诱 肌肉和 J! Γ t'j 岛 抵抗 .,

2 糖尿 的动物懊' I ¹ , 发突: ili 肥 Jl' i '的纯 子小 ί Cob/ob†U db/db) 被公〔人. ^ίΕϊϊ价伹， 它们^ llUi 2-8 表现 ^！^岛 .症， ιίιι.糖和 细胞功能 下降 、类 2 糖尿 m†y似的症状..

/I·:分子水 ， ^岛 迎过^岛 佶 通路 ίί使 ' I〈物功能.. ^岛 佶 通路由 '1、 复 ^ 粮：介的 络^成,. 概 ίί·起来， 岛^ ¾ 到^岛 ¾休/ Ϊ, 激发 ' 休^氨 酸激 te¾忭, 使 磷酸化 岛 ' 休^物 (Insulin receptor substrate, 1RS)> 激 ίΛ·的 TRS I 通过 ΡΠΚ/Akt 通路发押 代 i射调拧作 W., 冃 研究表 I ^岛 抵抗可能迎过以 下） L种机 抑制 岛 iK iff 通路： ① Ifi白水 T的下 ¾ , 包 W 进通路屮 ^ ^白质的降 , 抑制 : τ^ ϊ翻 ί予.. 例如 报 IH .不 · SRTEBP- lc能抑制 1RS-2的转; r ， y*-i¾ IRS-2 ί&白水 下¾., ② 15白质的翻译 修饰， 抑制 ; Vitt,. 例 i/lltt 岛 和 IRS能 PKC - S6K I . ERK. J K及 ΙΚΚβ 激 ¾磷酸化 ^氨酸残某， 抑制 岛 4的 ½ 4., 促进 ^岛 ίπ ^迎路抑制 ¾的« *込， a^ ^ PTPIB, PT ,的^酸 «

PTEN. SHTP ④佶' '）迎路' I ¹ 的 白和其抑制 ί&白的 例如炎忭细胞 W子 1L-6 等能上调细胞因子信号通路的抑制子 (Suppressor of cytokine signaling, SOCS)的蚩白表 达， SOCS能结合到胰岛素受体抑制信号转 。

阿尔茨海默病 (AD)是老年痴呆病中最常见的一种， 是一种以记忆能力减退、 认知功 能障碍、 行为异常为特征的慢性进行性神经退行性疾病 ， 其发病率随年龄增大而增加。

AD 的主要病理特征是大脑内出现以沉积的 Λβ 为中心的淀粉样斑块 （amyloid plaque),或称老年斑 （senile plaque)和由高度磷酸化的微管相关蛋白 tau蚩白形成的神经 丝缠结 （neurofibrillary tangle)。 Αβ是细胞一种正常的代谢产物， 能在其受体帮助下透过 血脑屏障。 健康人血液和脑脊液中的 Αβ浓度处于一种平衡状态。 大量证据支持 Αβ是 AD 的主要致病因子。 目前被广泛接受的淀粉样蚩白级联假说 （Amyloid cascade hypothesis)认为， Αβ在 AD的发生、 发展中起着主 作用， 脑中 Αβ的生成和清除的失 衡， 使得 Αβ在脑中积累， 进而 致神经元和其突触功能的损伤， 最终造成认知的损害。

目前认为 Αβ主要由脑中的神经元产生。 Αβ由 ΑΡΡ经过 β-分泌酶和 γ-分泌酶酶解形 成。 由于 γ-分泌酶的切割位点不同， 主要产生两种形式： Αβ40和 Αβ42。 Αβ42的聚集能 力较强因而毒性也较大。 ΑΡΡ 和 γ-分泌酶分布都相对广泛， 在很多组织中都有表达。 β- 分泌酶最初认为只在脑中的神经元高表达， 但近来有研究显示， β-分泌酶也表达在神经 胶质细胞和其它外周的细胞， 例如脂肪细胞和肝细胞， 这提示外周组织也可能产生 Αβ。

研究表明， 在外周组织能检测到 Αβ。 Joachim等最先报道在 AD病人的血管、皮肤、 皮下组织和肠等非神经组织检测到 Αβ沉积， 在一部分正常的老年个体中也能在非神经 组织检测到 Αβ的沉积。 Lee等报道在正常人皮下脂肪和内脏脂肪中都能 检测到 Αβ的沉 积。 另外， 包涵体肌炎的病灶处也能检测到 Λβ。 这些沉积的 Αβ， 可能是由脑中产生， 再经过循环系统运送到外周， 也有可能是由外周的细胞产生的。 但目前的研究都只检测 到外周 Αβ， 而它们有什么功能还不淸楚， 血浆中的 Αβ浓度本身也并不适合作为 AD的 生物标记 ( Liu, J K , et al., J Alzheimers Dis. 2010;20(4): 1233-42. ) 。

除 Αβ外目前还发现多种淀粉样蛋白 (Amyloid protein) , 其在各种器官和组织 的异常沉积会造成系列病变。 截至 2010年， 已知的淀粉样蛋白有 27种， 其中公 认为与糖尿病有密切关系的是胰岛淀粉样多肽 (IAPP)， IAPP是胰岛 β细胞分泌的 一种止常产物， 含 37个氨基酸， 但与 Αβ在序列和剪切机制上大为不同。 尸体病 理解剖检验发现， 90%的 2型糖尿病患者胰岛中有 ΙΑΡΡ沉积，伴 β细胞数量减少， 且胰岛淀粉样变性程度与糖尿病的病变程度一 致， 说明 ΙΑΡΡ 与 2型糖尿病发病 相关。 人源 ΙΑΡΡ可诱 β细胞凋亡， 且二者呈剂量相关性。 转入人源 ΙΑΡΡ基因的纯 合子肥胖小鼠在卨糖、 卨脂饮食、 生长激素或糖皮质激素处理后胰岛内很快出现 大量 ΙΑΡΡ变性沉积， β细胞凋亡水平大于复制水平， 数量下降， 最终发展为 2型 糖尿病。 这些证据表明， ΙΛΡΡ在胰岛中变性沉积， 导致 β细胞凋亡， 数量减少是 2型糖尿病致病机制之一。但没有在先证据显� �， 同为淀粉样蛋白的 Αβ在胰岛素 的靶组织如肝脏等能诱导 2型糖尿病的另一特征胰岛素抵抗， 或者 Αβ在 2型糖 尿病的发病中具有与 ΙΑΡΡ类似的功能。

流行病学的研究显示， 糖尿病患者相对于正常人有高约两倍的摧患 AD的风险。 虽 然其机理目前仍不清楚， 有人认为糖尿病能影响 Αβ的代谢。例如 Ho等报道在 AD模型 小鼠中用高脂诱 胰岛素抵抗能显著增加 Αβ40和 Λβ42的生成， 同时脑中老年斑的沉 积加剧， 学习记忆能力的损害也恶化。 Cao等报道在 AD模型小鼠中用糖水诱 胰岛素 抵抗， 脑中老年斑的沉积也加剧， 主要是由于脑中沉积的 Αβ42增高了约 2倍， 水迷宫 实验结果也显示了学习记忆能力的损害恶化。 但是 Takeda等的研究表明， AD模型小鼠 与 2型糖尿病模型小鼠杂交的后代， 显示学习记忆能力的损害发生加剧， 脑中 Αβ的总 量没有变化， 而是显示脑血管出现炎性并伴随淀粉样血管病 变。

综上， 尽管现有技术中对于糖尿病或胰岛素抵抗与 AD的关系有过研究， 然而还没 有明确的、 可信的结论， 在机理也不明确。 因此， 本领域还需要进一步地研究 Αβ与糖 尿病或胰岛素抵抗的相关性， 并找到有用的、 适于药物幵发的靶点。 发明内容

本发明的目的在于提倂防治胰岛素抵抗和糖尿 病的方法和式剂。

在本发明的第一方面， 提供抑制 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信号通路激活， 抑制 JAK2/STAT3-SOCS-1 信号通路蚩白表达或活性， 或抑制淀粉样蚩白 β的表达或活性的 抑制剂的用途， 用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药 物。

在另一优选例中， 所述的 JAK2/STAT3- SOCS- 1 信号通路蛋白包括： JAK2 蚩白，

STAT3蛋白或 SOCS-1蚩白。

在另一优选例中，所述的 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活是： 淀粉样蚩白 β(Αβ) ^致的 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路激活。

在另一优选例中， 所述的淀粉样萤白 β(Αβ)包括： 全长的淀粉样蚩白 β, 或其蚩白片 段。 更佳地， 所述的蛋白片段选自： Αβ40、 Αβ42、 Αβ25-35等。

在另一优选例中， 所述的抑制剂包括 (但不限于)：

特异性干扰 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路蚩白表达的干扰分子 (如小干扰 RNA分 子或反义核苷酸)； 或

特异性与 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路蚩白结合的结合分子 (如抗体或配体)； 或 抑制 JAK2的 AG490; 或

特异性干扰淀粉样蛋白 β或其前体蚩白表达的干扰分子 (如小干扰 RNA分子或反义 核苷酸)； 或

特异性与淀粉样蛋白 β结合的纺仓分子 (如抗体或配体)； 或

β-分泌酶抑制剂、 y-分泌酶抑制剂和调节剂或抗淀粉样蚩白聚集� ��。 在另一优选例中，所述的干扰分子是 siRNA,其序列选自 SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 7的一种或多种。

在另一优选例中， 所述的干扰分子具有以下结构：

Seq X— Seq

其中， Seq 的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 36所示； Seq _{S ij} 为与 Seq ^互补的序列；

X为位于 Seq _J ^和 Seq _ii 之间的间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq _Eft 和 Seq _{S fi} 不互补。

在另一优选例中， 所述的干扰分子是腺病毒表达载体。

在另一优选例中， 所述的干扰分子可形成以下结构：

Seq正向一^ s

' ' X

Seq反向

其中，

Seq ^r^ Seq _Sia 和 X的定义如上述，

II 表示在 Seq 和 Seq _{S ia} 之间形成的氢键。

在另一优选例中， 所述的结合分子是抗淀粉样蛋白 β的抗体。

在另一优选例中，所述的抗淀粉样蚩白 β的抗体包括 (但不限于)： 3F5 BA27 BC05

1H3 , 6C8 solanezumab (Eli Lilly and Company), Bapineuzumab (JANSSEN Alzheimer Immunotherapy Research & Development , LLC; Elan Pharmaceuticals, Inc., Wyeth) , MABT5102A (Genentech, Inc.) , Ponezumab (Pfizer, Inc.), Intravenous Immunoglobulin (Baxter Healthcare) 最近己经发现，人免疫球蚩白（Ig)包含结合 Αβ的抗体 (Weksler et al., 2005), 静脉注射 Ig有助于促进 Αβ的清除。

在本发明的另一方面， 提供抑制 JAK2/STAT3- SOCS-1 信 通路激活或抑制 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路蚩白表达或活性的抑制剂，其是 siRNA,其序列选自 SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO 36

在本发明的另一方面， 提供一种筛选防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病 的潜在物质的 方法， 所述方法包括：

(1)将候选物质与含有淀粉样蛋白 β和 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路的体系接触；

(2)筛选出抑制淀粉样蚩白 β对 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路或通路蛋白的激活的 物质， 所述物质是防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的 潜在物质。

在另一优选例中， 步骤 （1) 包括： 向含有淀粉样蛋白 β和 JAK2/STAT3-SOCS- 1信 号通路的体系中添加候选物质； 和

步骤 (2)包括： 检测 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信号通路或通路蛋白的变化， 并与对照组 比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、 含有淀粉样蚩白 β 和 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系； 若候选物质在统计学上 (如显著抑制 20%以上， 较佳的 50°/。以上； 更佳的 80%以上) 抑制淀粉样蚩白 β对 JAK2/STAT3-SOCS- 1信 通路或通路蚩白的激活， 则该候选物质 是防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质 。

在另一优选例中， 所述的含有淀粉样蚩白 β和 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信号通路的体 系选自： 细胞体系（或细胞培养物体系）、 亚细胞体系、 溶液体系、 动物体系或组织体系。

在另一优选例中， 所述的含有淀粉样蚩白 β和 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信号通路的体 系是： 细胞内包含淀粉样蚩白 β和 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路的体系； 或以淀粉样 蛋白 β处理包含 JAK2/STAT3- SOCS-1信^通路的细胞后获得的体系。

在另一优选例中， 所述的含有淀粉样蚩白 β和 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信 通路的体 系是胰岛素的靶器官的细胞如肝细胞、 肌肉细胞或脂肪细胞。

在另一优选例中， 所述的方法还包括： 对获得的潜在物质迸行进一步的细胞实验和 / 或动物试验， 以从候选物质中进一步选择和确定对于防治或 缓解胰岛素抵抗或糖尿病有 用的物质。

在另一优选例中， 所述的候选物质选自 (但不限于)： 针对 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信号 通路或信号通路中的蛋白设计的干扰分子、 核酸抑制物、 结合分子 (如抗体或配体)、 小 分子化合物。

在本发明的另一方面， 提供淀粉样蚩白 β (包括： 全长的淀粉样蚩白 β, 或其蚩白片 段。 更佳地， 所述的蚩白片段选自： Αβ40、 Αβ42、 Λβ25-35等） 用作检测胰岛素抵抗或 糖尿病的血液 (包括： 血浆或血淸)标志物的用途。

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别淀 粉样蚩白 β (较佳地识别血液 (包括： 血 浆或血淸)中的淀粉样蛋白 β)的试剂的用途， 用于制备检测胰岛素抵抗或糖尿病的试剂 或试剂盒。

在另一优选例中， 所述的特异性识别淀粉样蚩白 β的试剂选自：

特异性结合淀粉样蚩白 β的结合分子 (如抗体或配体)；

特异性扩增淀粉样蚩白 β或其前体蚩白的编码基因或切割前体蚩白的� ��白酶的编码 基因的引物； 或

特异性识别淀粉样蚩白 β或其前体蚩白的编码基因或切割前体蚩白的� ��白酶的编码 基因的探针。

在另一优选例中， 所述的特异性结合淀粉样蚩白 β的结合分子是抗体， 选自： 3F5， 1H3 , 6C8 , 10C1 1 , 7B 10 , BA27或 BC05。

在本发明的另一方面， 提供一种检测血液 (包括： 血浆或血清)中胰岛素抵抗或糖尿 病的试剂盒， 所述的试剂盒中含有： 特异性识别淀粉样蛋白 β的试剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附阁说明

1、 Αβ诱 肝原代细胞和 Η4ΙΙΕ细胞胰岛素抵抗。

a, b, c， 小鼠肝原代细胞给予 Αβ25-35 (a, b)和 Αβ42 (c)处理后对胰岛素信号通路 的影响，给予的剂量和时间见图。免疫印迹法 分析了小鼠肝原代细胞 InsR， Akt和 GSK-3p 的磷酸化。其中，（a)为细胞用指定剂量的 Αβ25- 35孵育 60h，（b)为细胞用 10 μΜ Αβ25-35 孵育指定的时间， （c)为细胞用 10 μΜ Αβ42孵育 60 h; 之后给予或不给予 100 nM胰岛 素刺激 20 min。

d, 大鼠肝癌细胞株 H4IIE中糖质新生情况。 细胞用指定剂量的 Λβ25- 35孵育 60h, 然后用 50nM胰岛素再处理 3h。数据以平均值和标准差表示， **Ρ<0.01, *** < 0.001ο 图 2、 Αβ诱^ HepG2细胞胰岛素抵抗。

a, b， HepG2细胞给予 Αβ25-35处理后对胰岛素信号通路的影响， 给予的剂量和时 间见图。 免疫印迹法分析了 HepG2细胞 InsR， Akt和 GSK-30的磷酸化。 其中， （a)为用 指定剂量的 Αβ25-35孵育 60h， （b)为 10 μΜΑβ25-35孵育指定时间； 之后给予或不给予 100 nM 胰岛素处理 20min。

图 3、 高血糖病人血浆中 Αβ水平显著升高。

ELISA检测正常血糖和高血糖人群的血浆中 Αβ40/42水平。 正常血糖 η = 26; 高血 糖 η = 35, 数据以平均值和标准误表示。

4、 APP/PS1小鼠一些基本表型正常。

a, 雄性 APP/PS1小鼠 (n = 9)和同窝野生型 (WT)小鼠 (n = 8) 10-19周（w)的体重。 b, c, d, 12周和 16周的摄食 (b)、 体脂含量 (c)、 瘦体重含量 (d)。

e, f， 20周龄雄性八？？/1^1小鼠 (n = 4)和同窝野生型 (WT)小鼠 (n = 6)血脂中重要的 主要脂质指标 (e；)， 谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平 (f)。 数据以平均值和标准差表示。

5、 APP/PS1小鼠显示随年龄加重的糖耐量受损和胰� �素抵抗症状。

a，b,10周或 18周雄性 APP/PS1小鼠 (每一年龄 n= 14- 16)和同窝野生型 (WT)小鼠 (每 一年龄 η= Π-19)的葡萄糖耐受试验 Pgkg—

c, d, 13周或 19周雄性 APP/PS1小鼠 (每一年龄 n= 16)和同窝野生型 (WT)小鼠 (每 一年龄 n = 17-20)的葡萄糖耐受试验 (0.75 U kg ¹ )^

e, f, 葡萄糖耐受试验 GTT(e)和胰岛素耐受试验 ITT(f)的曲线下面积 (AUC)。

g, 饥饿和喂食状态下 APP/PS1小鼠 （《 = 6, 4)和 WT同窝小鼠 （《 = 6， 6)血浆胰岛 素水平。

数据以平均值和标准差表示， * <0.05， **P<0.01, *** < 0.001c

6、 APP/PS1小鼠肝脏和肌肉胰岛素刺激后的信兮激� �受损。

a， 20周的 APP/PS1 小鼠和同窝野生型 (WT)小鼠的肝中胰岛素刺激的 InsR和 Akt 的磷酸化。 b， （a)中 InsR和 Akt的磷酸化水平的定量。 c， 20周的 APP/PS1小鼠和同窝 野生型 (WT)小鼠的肌肉中胰岛素刺激的 Akt的磷酸化。 d， （c)中 Akt的磷酸化水平的定 量。 数据以平均值和标准差表示， ** < 0.01。

图 7、 肝脏、 肌肉和脂肪中重要炎性因子及其下游基因表达 变化。

a, b, c， 20周的 APP/PS1小鼠 (n = 4)和野生型 (WT)对照 (n = 4)的肝 (a)， 肌肉（b)和 白色脂肪组织 (WAT)中炎性因子和相关基因表达的定量 PCR分析。数据以平均值和标准 差表示， 与对照组相比， * < 0.05。

8、 APP/PS1小鼠肝脏中 SOCS-1蛋¾表达上调。

a, 20周的 APP/PS1小鼠 (n = 3)和野生型 (WT)对照 (n = 3)的肝 SOCS- 1、 SOCS-3蚩 白表达的免疫印迹分析。 b, a中 SOCS-l、 SOCS-3蛋白表达的定量分析。 数据以平均值 和标准差表示， **P<0.01。

图 9、 Αβ在肝原代细胞中上调 SOCS-1的 mRNA和蚩白水平。

3，1), ₍ ;,(1,定量？0 (3)和免疫印迹(1)，（；，（1)分析小鼠肝原代� ��胞中 SOCS- 1和 SOCS-3 的表达。 细胞以 ΙΟ μΜ Αβ25-35处理指定的时间 (a， b), 以指定剂量的 Αβ25-35 (c)或 10 μΜ Αβ42 (d) 处理 60 h。 数据以平均值和标准差表示， *尸<0.05， **Ρ<0.0\ _α

m 10、 Αβ通过上调 SOCS-1诱 肝细胞产生胰岛素抵抗。

a, 两种不同的 siRNA对原代肝细胞中 SOCS-1表达的抑制。 b, 在指定的 siRNA存 在下， 给予 Αβ25-35(10 μΜ)或不给于 Αβ25-35处理 60 h的原代肝细胞中 InsR和 Akt的 磷酸化水平， 其中， SOCS-1 RNAi 1的用量是 40 nM; SOCS-1 RNAi 2的用量是 40 nM。 c，（b)中 InsR和 Akt的磷酸化水平的定量，其中， SOCS- 1 RNAi 1的用量是 40 nM;SOCS-l RNAi 2的用量是 40 nM。 数据以平均值和标准差表示， *尸<0.05。

1 Αβ能诱 STAT3和 JAK2的磷酸化激活。

a， b， c, 小鼠原代肝细胞以指定剂量的 Αβ25- 35 处理 36 h(a)， 10μΜΑβ25-35处 理指定时间 (b)或 10 μΜ Αβ42 处理 36 h(c), 磷酸化 STATl (Tyr701) 磷酸化 STAT3 (Tyr705)和磷酸化 JAK2(Tyrl007/1008)的蛋白水平的免疫印迹分析。 d， 20周的 APP/PS1 小鼠和野生型对照小鼠肝中 STAT3和 JAK2的酪氨酸残基磷酸化水平。 e， （d)中 STAT3 和 JAK2的酪氨酸残基磷酸化水平的定量分析。

图 12、 Αβ(10 μΜ)诱^ SOCS-1上调依赖于 STAT3和 JAK2。

a, b, c， 通过 RNAi下调 STAT3或 JAK2(a, c)或 AG490 (b)抑制 JAK2阻止由 Αβ 介^的 SOCS-1蚩白水平的上升。 其中， STAT3 RNAi 1的用量是 40nM; STAT3 RNAi 2的用量是 40 nM; AG490的用量是】0 μΜ; JAK2 RNAi 1的用量是 40 nM; JAK2 RNAi 2的用量是 40 nM。

图 13、 Αβ诱^的胰岛素抵抗依赖于 STAT3和 JAK2。

a, c, e, 在 Λβ(10 μΜ)诱^的胰岛素抵抗状态下， 通过 RNAi (a, e)下调 STAT3或 JAK2或通过 AG490(c)抑制 JAK2使得 InsR和 Akt的磷酸化水平降低得到了显著回复； 其中， STAT3 RNAi 1的用量是 40 nM; STAT3 RNAi 2的用量是 40 nM; AG490的用量 是 ΙΟ μΜ; JAK2 RNAi 1的用量是 40 nM; JAK2 RNAi 2的用量是 40 nM。 b, d, f， (a, c， e)中磷酸化的 InsR和 Akt水平的定量分析， 数据以平均值和标准差表示， *P < 0.05。

14、 Α β的抗体 1H3、 6C8的降糖作用， 以抗体 IgG作为对照。

15、 6C8抗体注射 9个月后 (每周注射一次)， 检测饥饿 4小时的小鼠血糖 (A)、 胰 岛素 (B)水平以及 HOMA-IR, 显示 APP/PS1小鼠的血糖显著下降更为显著。

16、 注射 Α β的抗体 1Η3(Α、 Β)和 6C8(C、 D)， 能显著降低 APP/PS1小鼠肝脏中 的 STAT3和 JAK2活性和 SOCS-1的表达。 B、 D图分别是 A、 C图的灰度统计结果。

图 17、 下调 JAK2蛍白水平能显著降低 JAK2的磷酸化水平， STAT3的磷酸化水平 也显著下调， SOCS-1的蛋白表达也显著下降。 B图是 A图的灰度统计结果。

18、 葡萄糖耐受实验显示 (A和 B)， 注射了 JAK2 siRNA的腺病毒的 APP/PS1小 鼠糖耐量有显示提高。 胰岛素耐受实验显示 (C和 D)， 注射了 JAK2 siRNA的腺病毒的 APP/PS1小鼠胰岛素明显改善。胰岛素刺激后，� �射了 JAK2 siRNA的腺病毒的 APP/PS 1 小鼠肝脏组织 InsR和 Akt磷酸化水平显著高于注射对照病毒的 APP/PS1小鼠 (E和 F)。 具体实施方式

本发明人经过广泛的研究， 首次 i正实了胰岛素抵抗或糖尿病患者外周血中淀� �样蚩 白或蚩白片段含量显著上升，为胰岛素抵抗和 2型糖尿病的诊断提供了新的途径。并且， 本发明还首次揭示了淀粉样蚩白 β (Λβ) 能诱 外周组织产生胰岛素抵抗， 其是通过激 活 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路 （即诱 JAK2/STAT3依赖的 SOCS-1上调)而实现的。 因此， 可以以 JAK2/STAT3-SOCS-1通路或其通路蚩白作为筛选药物� ��靶点， 研究防治 或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。 检测胰岛素抵抗或糖尿病的试剂或试剂盒

基于本发明人的上述新发现， 可以将 Αβ或其蚩白片段 (包括 Αβ40、 Αβ42、 Αβ25-35 等)作为诊断胰岛素抵抗或糖尿病的标志物： （0 进行胰岛素抵抗或糖尿病的分型、 鉴别 诊断、和 /或易感性分析；（ii) 评估相关人群的胰岛素抵抗或糖尿病治疗药物 、药物疗效、 预后，以及选择合适的治疗方法；（iii) 早期评估相关人群胰岛素抵抗或糖尿病患病风 险， 早期监测早期防治。 比如， 可分离出由 Αβ 在血液 (血浆或血清)含量升高而 致胰岛素 抵抗或糖尿病的人群， 从而可进行更有针对性地治疗。

因此， 本发明提供了 Αβ (包括其前体蚩白或蚩白片段)或其编码基因的� ��途， 用于制 备诊断 (或检测)胰岛素抵抗或糖尿病的试剂或试剂盒� ��

可采用各种本领域已知的技术来检测 Αβ (包括其前体蛋白或蚩白片段)的存在与否以 及表达、 沉积情况， 这些技术均包含在本发明中。 例如可用己有的技术如 ELISA 法、 Western印迹法、 Southern印迹法、 DNA序列分析、 PCR等， 这些方法可结合使用。 本发明还提供了用于在分析物 (血液)中检测 Αβ (包括其前体蚩白或蚩白片段)的存在 与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基 因水平的检测时，可以采用特异性扩增 Αβ (包 括其前体蚩白或蚩白片段)基因的引物； 或特异性识别 Αβ基因的探针来确定 Αβ基因的 存在与否； 当进行蚩白水平的检测时， 可以采用特异性结合 Αβ蚩白的结合分子 (如抗体 或配体)来确定 Αβ蛋白的表达情况。

作为本发明的优选方式， 所述的试剂是抗体 (单抗或多抗)，其可特异性结合 Αβ或其 蚩白片段。 利用特异性结合 Αβ蚩白的抗体来检测分析物中 Αβ蚩白表达情况的方法是本 领域人员熟知的技术。 例如， 采用所述的抗体， 可通过 ELISA方法检测到血液中 Αβ或其 蛋白片段的存在情况。 ELISA技术是本领域技术人员所熟知的。

针对 Αβ基因的特异性引物或探针的设计是本领域� �员熟知的技术， 例如， 制备一种探 针， 其可与 Αβ基因上特定位点发生特异性结合， 而不与 Αβ基因以外的其它基因特异性结 合， 且所述探针带有可检测信号。 或制备一对引物， 其可特异性扩增出 Αβ基因。

本发明还提供了用于在分析物中检测 Αβ基因的存在与否以及表达情况的试剂盒， 该 试剂盒包括： 特异性结合 Αβ蚩白的抗体或配体； 特异性扩增 Αβ基因的引物或特异性识 别 Αβ基因的探针。

此外， 所述的试剂盒中还可包括川于抗原抗体反应、 杂交、 显色、 提取 DNA、 PCR 等所需的其它各种试剂， 包括但不限于： 显色液、 酶标液、 包被液、 洗涤液、 抽提液、 扩增液、 杂交液、 酶、 对照液等。

此外， 所述的试剂盒中还可包括使用说明书和 /或蛋白、 核酸序列分析软件等。 信号通路及相关蚩白

如本发明所用， 所述的 "（信号)通路" 是指由一系列蚩白或基因发生相互制约或相 互作用而形成的信号系统， 其一般会 ^致一些细胞事件的发生。 所述的 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路包括 (但不限于）： JA 2基因 (和 /或其编码的蚩白）、 STAT3 基因 (和 /或其编码的蚩白）、 SOCS- 1 (和 /或其编码的蚩白）。

所述的 JAK2基因的核苷酸序列例如如 GenBank登录兮 NM_004972所示； 其蚩白 氨基酸序列例如如 GenBank登录号 NP— 004963所示。

所述的 STAT3基因的核苷酸序列例如如 GenBank登录号 NM— 139276， NM_213662， NM— 003150所示； 其蚩白氨基酸序列例如如 GenBank登录号 NP— 644805， NP 998827 , NP— 003 141所示。

所述的 SOCS- 1基因的核苷酸序列例如如 GenBank登录号 NM_003745所示； 其蚩 白氨基酸序列例如如 GenBank登录号 NP 003736所示。

SOCS蚩白家族包括 8个成员： CIS和 SOCS-1— SOCS-7。细胞内 SOCS蛋白表达通 常较低，但在受细胞因子刺激时能明显上调。 SOCS蛋白与胰岛素信号的关系以 SOCS- 1 和 SOCS-3的研究最多。 SOCS- 1敲除小鼠血糖很低，其胚胎成纤维细胞分化� �脂肪细胞 的曾 力增 虽 (Kawazoe， Y.， et al. , Signal transducer and activator of transcription (ST AT)- induced STAT inhibitor 1 (SSI-l)/suppressor of cytokine signaling 1 (SOCSl) inhibits insulin signal transduction pathway through modulating insulin receptor substrate 1 (IRS-1) phosphorylation. J Exp Med, 2001. 1 3(2): p. 263-9), 提示胰岛素信号在这种 SOCS-1敲除细胞中的增强。通过腺病毒，直接在 小鼠肝脏中过表达 SOCS-1或 SOCS-3 , 都能诱 明显的胰岛素抵抗。 SOCS-1和 SOCS-3在 2型糖尿病的模型小鼠 ί όΑΛ小鼠的 肝脏中也是高表达的。 这些研究结果提示， SOCS 蚩白在某些因素 致的胰岛素抵抗中 发挥了重要作用。

当用于作为筛选的靶标时或人为建立筛选系统 时， 以上的蚩白或编码基因可以是天 然存在的， 比如其可被纯化和分离自哺乳动物； 也可以是重组制备的， 比如可以根据常 规的基因重组技术来生产重组的蚩白。 此外， 任何不影响这些蚩白的生物活性的变化形 式都是可用的， 如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。 用途及筛选方法

本发明人研究显示， Αβ能在小鼠肝原代细胞中上调胰岛素通路的� �制蚩白 S0CS-1 , 并且 APP/PS1小鼠肝脏中 SOCS-1表达也升高。 在小鼠肝原代细胞中下调 SOCS- 1蚩 β 表达能缓解 Αβ对胰岛素信号通路的抑制。 Αβ还能在肝原代细胞中激活 JAK2/STAT3 , 并且 APP/PS1小鼠肝脏中 JAK2/STAT3活性也更高。通过 RNAi或抑制剂在小鼠肝原代 细胞中下调或抑制 JAK2/STAT3 ,能缓解 Αβ对 SOCS-1的上调及对胰岛素信号通路转^ 的抑制。

基于本发明人的新发现，对 Αβ与 JAK2/STAT3-SOCS-1通路的研究有着多方面的用 途， 所述的用途包括 (但不限于)： 筛选抑制 Αβ对该信号通路的激活的物质， 该物质可 用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药 物。

因此， 本发明提供了筛选防治或缓解胰岛素抵抗或糖 尿病的潜在物质的方法， 将候 选物质与含有 Αβ 和 JAK2/STAT3-SOCS-1 信号通路的体系接触； 筛选出抑制 Αβ 对 JAK2/STAT3-SOCS-1 信号通路或通路蚩白的激活的物质， 所述物质是防治或缓解胰岛 素抵抗或糖尿病的潜在物质。

如本文所用， 所述的 "抑制"是指具有统计学意义的 "抑制" 。 即： 显著地 "抑制" 。 如与对照组的蚩白活性、 蚩白表达、 蛋白相互作用相比， 显著 "抑制" 、 20%以上， 较 佳的 50%以上； 更佳的 80%以上。

所述的含有 Αβ和 JAK2/STAT3-SOCS- 1 通路的体系选自： 细胞体系（或细胞培养物 体系）、 亚细胞体系、 溶液体系、 动物体系或组织体系。 可以是： 细胞内包含 Αβ 和 JAK2/STAT3-SOCS-1信^通路的体系； 或以 Αβ处理包含 JAK2/STAT3- SOCS-1信号通 路的细胞后获得的体系。 例如， 所述的含有 JAK2/STAT3-SOCS-1通路的体系是肝细胞。

作为本发明的优选方式， 所述的方法还包括： 对获得的潜在物质进行进一步的细胞 实验和 /或动物试验， 以从候选物质中进一步选择和确定对于防治或 缓解胰岛素抵抗或 糖尿病有用的物质。

当进行筛选时， 可以采用本领域熟知的各种技术来确定蚩白或 其编码基因的变化情 况以及相互作用情况。

可以采用多种常规的技术来鉴定系统中基因的 转录或蚩白表达情况。 这些技术包括 但不限于： 寡核苷酸杂交技术 (如探针）， 多聚嗨链反应 (PCR)， 聚丙烯酖胺凝胶电泳， 免 疫印迹（如 Western印迹）等。

通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛 选厍， 以便于人们最终可以从中筛选 出能够对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病真 正有用的物质。

本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用 于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病 的潜在物质。所述物质是抑制 Λβ 致的 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路激活的物质， 或 是 JAK2/STAT3-SOCS- 1信兮通路或通路蚩白的抑制剂。

基于本发明人的上述新发现， 本发明提供了一种抑制 JAK2/STAT3-SOCS-1 信号通 路激活、 抑制 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蚩白表达或活性或抑制� ��粉样蚩白 β的表 达或活性的抑制剂的用途， 用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的组 合物。

如本文所用， 所述的抑制 JAK2/STAT3-SOCS- 1 信号通路激活、 抑制 JAK2/STAT3-SOCS-1 信号通路蛋白表达或活性或抑制淀粉样蚩白 β的表达或活性的抑 制剂包括了拮抗剂、 下调剂、 阻滞剂、 阻断剂等。

所述的抑制 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路激活、 抑制 JAK2/STAT3-SOCS-1信^通 路蚩白表达或活性或抑制淀粉样蛋白 β的表达或活性的抑制剂是指任何可降低 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白的活性、降低 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路基因或 蚩 白的稳定性、 下调 JTAK2/STAT3-SOCS- 1 信号通路蚩 白 的表达、 减少 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蚩白有效作用时间、或� ��制 JAK2/STAT3- SOCS-1信号通 路基因的转录和翻译的物质， 这些物质均可用于本发明， 作为对于下调 JAK2/STAT3-SOCS-1 信号通路有用的物质， 从而可用于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿 病。 例如， 所述的抑制剂是： 特异性干扰 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达的干 扰分子； 或特异性与 JAK2/STAT3-SOCS- 1信号通路蚩白结合的结合分子； 或抑制 JAK2 的 AG490; 或特异性干扰淀粉样蚩白 β或其前体蚩白表达的干扰分子； 或特异性与淀粉 样蚩白 β结合的结合分子

作为本发明的一种优选方式， 所述的抑制剂是一种特异性抗淀粉样蛋白 β的抗体。 所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。 可用淀粉样蛋白 β免疫动物， 如家兔， 小

- I I - 鼠， 大鼠等来生产多克隆抗体； 多种佐剂可川于增强免疫反应， 包括但不限于弗氏佐剂 等。 与之相似的， 表达淀粉样蚩白 β或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动� ��来生 产抗体。 所述的抗体也可以是单克隆抗体， 此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备 (见 Kohler等人， Nature 256； 495, 1975 ; Kohler等人， Eur.J. Immunol. 6: 511 , 1976； Kohler等人， Eur.J. Immunol. 6： 292, 1976； Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N Y， 1981)。

作为本发明的一种优选方式， 所述的抑制剂是一种小干扰 RNA分子 （siRNA)。 如 本文所用， 所述的 "小干扰 RNA (small interfering RNA， siRNA)"是指一种短片段双链 RNA分子， 能够以同源互补序列的 mRNA为靶目标降解特定的 mRNA， 这个过程就是 RNA干扰 （RNA interference) 过程。

小干扰 RNA可以制备成双链核酸的形式， 它含有一个正义链和一个反义链， 这两 条链仅在杂交的条件下形成双链。 一个双链 RNA复合物可以由相互分离的正义链和反 义链来制备。 因此， 举例来讲， 互补的正义链和反义链是化学合成的， 其后可通过退火 杂交， 产生合成的双链 RNA复合物。

作为本发明的特别优选的方式， 提供了一种效果良好的小干扰 RNA分子， 所述的 小干扰 RNA分子具有良好的抑制 J AK2/ST AT3-SOCS- 1信号通路的效果。所述的小干扰 RNA分子是具有 SEQ ID NO. 2-7所示的核苷酸序列的小干扰 RNA分子。

此外， 小干扰 RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编 码正义链和反义链 的表达盒来制备。 当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时 ， 它们可以从生成的转 录物中断裂形成分离的正义链和反义链， 其后杂交生成双链小干扰 RNA。

所述的小干扰 RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内 ， 或还可采用本领 域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明还提供了一种制备防治或缓解胰岛素抵 抗或糖尿病的药物的方法， 所述方法 包括： 合成和 /或纯化前述筛选获得的对于防治或缓解胰岛� �抵抗或糖尿病有用的物质， 作 为用于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物 。

可将获得的对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿 病有用的物质配制于无毒的、 惰性的 和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH通常约为 5-8, 较佳地 pH约为 6-8, 尽管 pH 值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而 有所变化。 配制好的药物组合物可以 通过常规途径进行给药， 其中包括 (但并不限于)： 肌内、 静脉内、 或皮下给药。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件如 J.萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 科学出版社， 2002中所述的条件， 或 按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义 相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发明中。 文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I. 材料和方法

哺乳动物细胞株

HepG2: 人肝癌细胞； 购自 ATCC。

H4IIE: 大鼠肝癌细胞； 购自 ATCC。 人群样品收集与诊断评估 .

在获得了中国科学院上海生命科学研究院营养 科学研究所伦理道德委员会的批准 以及受试者知情同意的情况下进行试验。 正常血糖组和高血糖组空腹外周静脉血样品和 空腹血糖、血脂数据从上海市徐汇区中心医院 获得。 正常血糖组共 26人 (男性 17人， 女 性 9人， 平均年龄 58.6岁， SD = 5.5)。 高血糖患者共 35人 (男性 21人， 女性 14人， 平 均年龄 59.6岁， SD = 6.7)。 按照 WHO于 1999年颁发的标准， 空腹血糖受损的判定为： 空腹血糖浓度大于或等于 6.1 mmol/L并小于 7.0 mmol/L,并且对于测定 2小时餐后血糖 的情况， 血糖浓度必须小于 7.8 _mm ol/L;糖尿病的判定为： 空腹血糖浓度大于或等于 7.0 mmol/L或餐后 2小时血糖浓度大于或等于 1 1.1 mmol/L。 本发明中把空腹血糖受损和糖 尿病合并为高血糖组进行研究。 正常组血糖平均值为 5.3 mmol/L, SD = 0.5。 高血糖组 血糖平均值为 8.1 mmol/L, SD = 2.5。 小鼠品系和词养条件

APPswe/PSENdE9小鼠及其同窝野生型对照均购自南� ��大学模式动物研究所， 词养 于中 科学院营养科学研究所动物房。 所有小鼠均按照实验动物管理和使川委员会的 规 程进行饲养， 由斯莱克公司提供充足的水源和标准饲料。 主要试剂和试剂盒

Αβ25-35 _: Sigma公司， 货号 A4559;

Αβ42: Apeptide公司， 货号 AP3006;

AG490.- Sigma公司， 货号 T3434;

胶原酶： Sigma公司， 货兮 C0130;

胶原： Millipore公司， 货号 08-1 15 ;

酪氨酸磷酸酶抑制剂混合液： Sigma公司， 货号 P2850;

丝氨酸 /苏氨酸磷酸酶抑制剂混合液： Sigma公司， 货 P5726;

蛋白酶抑制剂混合液： Sigma公司， 货^ P8340; Amplex® Red Glucose^Glucose Oxidase Assay Kit: Invitrogen公司, 货 A22189; Lipofectamine 2000： Invitrogen公司， 货号 11668019;

注射用胰岛素： Lilly France S.A.S.公司， 商品名， 优泌林。 通用名， 重组人胰岛素 注射液。

胰岛素放射免疫分析盒； 北京北方生物技术硏究所；

Αβ40 ELlSAkit: Covance公司， 货 SIG-38950, 其中结合 Αβ40的一抗是 BA27;

Αβ42 ELlSAkit: Covance公司， 货号 SIG-38952, 其中结合 Αβ42的一抗是 BC05;

DMEM: Invitrogen公司， 货^■ 12100-046;

无糖 DMEM: Invitrogen公司， 货号 11966-025;

FBS: Invitrogen公司， 货号 16000-044;

Trizo Invitrogen公司， 货^ 15596-018;

核酸分析电泳用琼脂糖： Biowest公司；

反转录试剂盒 (M- MLV): Promega公司；

SYBR Green PCR mixture: AB1公司；

蚩白印迹化学发光试剂 SuperSignal West Pico: Pierce公司；

PVDF膜： Millipore公司。 抗体

抗体名称 来源 公 司 货 号 稀释比例

Tubulin 小鼠 T6074 J: 10000

Sigma

β-actin 小鼠 A5316 1:10000

Phospho-lnsulin Receptor β

(Tyrl 150/1151)

或称为 p-InsR-Tyrll50或 1151 兔 Cell signaling 3024 1.1000 (Tyr 1150/1151指第 1150或 1151位 Tvr

发生磷酸化）

Insulin Receptor β 兔 3025 1:1000

Phospho-Akt (Scr473)

或称为 p-Akt-Scr473 兔 9271 1:1000 (Scr473指第 473位 Scr发生磷酸化）

Phospho-Akt (Thr308)

或称为 p-Akt-Thr308 兔 9275 1:1000 (Thr308指第 308位 Thr发生磷酸化）

Phospho-GSK-3p (Scr9)

兔 9336 1:1000 或称为 p-GSK3p-Scr!

SOCS-1 兔 3950 1:1000 SOCS-3 兔 2923 1:1000

Phospho-Statl (Tyr701) 兔 9167 1:1000

Phospho-Stat3 (Tyr705) 兔 9135 1:1000

Phospho-Jak2 (Tyrl 007/1008) 兔 3776 1:1000

STAT3 兔 9132 1:1000

JA 2 兔 3773 1:1000

HRP-anti-mousc IgG 山羊 Jackson 115-035-146 1:10000

HRP-anti-rabbit IgG 山羊 ImmunoRcscarch 111-035-144 1:2000 实验仪器

微量移液器购自 Gilson公司， 超低温冰箱购自 Thermo Scientific Forma公司， PCR 仪、 垂直电泳槽、湿转转膜仪和配套电源购自 Bio- Rad公司， 冷冻离心机购自 Eppendorf 公司， 高速离心机购自 Beckman公司， 高速勾浆机购自 Qiagen公司， 精密天平及 pH计 购自 Mettler Toledo公司， 0.22μπι、 0.45μηι针头式过滤器购自 Millipore公司， ChemiDoc 化学发光成像系统购自 Wealtec公司， 酶联免疫检测仪购自 Molecular Device公司， X 光片及 X光片洗片机购自 Kodak公司。 FreeStyle血糖检测仪及血糖试纸，购自 TheraSense 公司， The minispec mq20型核磁共振仪 (NMR)购自 Bruker公司， HITACHI 7020全自动 生化分析仪购自 HITACHI公司， ABI 7900HT实时定量 PCR仪购自 Applied Biosystems 公司。 小鼠肝原代细胞分离与培养

10周龄的 C57BU6J雄鼠麻醉后打开腹腔， 从下腔静脉以 7ml/min的速率灌入 50ml 在 37°C预热的灌流液 PI (含有 4.8 mMKCl, 1.2 mM MgS0 ₄ > 1.2 mM KH ₂ P0 ₄ , 7.455 mM HEPES, 7 mg/ml NaCl, 2 mg/ml NaHC0 ₃ , 0.1 mM EGTA, 3.6 mg/ml葡萄糖）， 之后再 灌入 50mL 37'C预热的灌流液 P2(含有 4.8 mM KC1， 1.2 mM MgS0 ₄ , 1.2 mM KH ₂ P0 ₄ . 7.455 mM HEPES, 7 mg/ml NaCl， 2 mg/ml NaHC0 ₃ , 3.6 mg/ml葡萄糖， 1.372 mM CaCl ₂ ， 0.66 mg/ml胶原酶)进行消化。 消化好的肝脏置于预先放入 20 ml不含胶原酶的预冷灌流 液 P2的 10 cm培养皿中，剪碎后用移液管反复吹打并用 70 μηι孔径细胞筛网过滤至 50 ml 的离心管中。 4'C 50g离心 2分钟后重悬， 随即用不含胶原酶的预冷灌流液 P2洗 3遍， 再用 15 ml含有 20 U/ml的青霉素， 20 g/ml的链霉素， 10% FBS的 DMEM培液重悬。 台盼蓝染色确定细胞存活率并进行细胞计数后 用含有 10%FBS的 DMEM培液稀释， 按 照 5χΙ0 ⁵ 细胞每孔铺于用胶原包被过的 12孔板。过夜培养后，更换培养液用于后续试� ��。

HepG2、 H4IIE细胞培养

HepG2, H4UE细胞株培养于含 10%FBS、 100U/ml青霉素、 100 g/ml链霉素和 25 mM葡萄糖的 DMEM培养液中。细胞培养箱保持 37'C， 并含 5%二氧化碳。 细胞一般每 2-3天传代一次， 保持传代前的密度超过 80%。 细胞在使用前 16- 24小时接种到 12孔板 中。 的配制、 预处理

Αβ25-35的配制： 称取适量 Αβ25-35粉末， 溶于 PBS中至终浓度为 1 mM， 分装后储 存于 -80Ό冰箱备用。孵育： 参照文献方法 (Coraci , I S. , et al.， CD36 , a class B scavenger receptor, is expressed on microglia in Alzheimer's disease brains and can mediate production of reactive oxygen species in response to beta-amyloid fibrils. Am J Pathol, 2002. 160( 1 ): p. 101 -12), 将储存的 1 mM Αβ25-35在 37°C、 5%C0 ₂ 培养箱中孵育 2天后使用。

Αβ42的配制： 称取适量 Λβ42粉末， 溶于去离子水中至终浓度为 2 mM, 分装后储存 于- 8CTC冰箱备用。孵育： 参照文献方法 (Jana, M.， C.A. Palencia, and K. Pahan, Fibrillar amyloid-beta peptides activate microglia via TLR2: implications for Alzheimer's disease. J Immunol, 2008. 181 (10): p. 7254-62), 将储存的 2 mM Αβ42在 37'C、 5%C0 ₂ 培养箱中 孵育 5天后使用。 细胞处理和转染

铺好细胞的 12孔板， 过夜培养后， 换无血淸的含有 25 mM葡萄糖的 DMEM培液， 同时加入指定浓度的 Αβ25-35或 Αβ42。 AG490在加入 Αβ25-35后 24小时加入。 需要胰 岛素刺激的， 加入 100 ηΜ胰岛素刺激细胞 20分钟后收集细胞样品。

需要转染的细胞，细胞在转染前 16-24小时接种到 12孔板中。采用 Lipofectamine 2000 转染。 转染结束后 48小时加入 Αβ处理。

Western blot

细胞用 SDS- PAGE上样缓冲液 (50 mM Tris-Cl , pH 6.8 , 2%SDS , 10%甘油， 100 mM DTT)裂解， 100'C煮沸 10分钟变性。组织用加了蚩白酶抑制剂（10 _μ8 /ηι1 pepstatin, 5 μ _§ /ιη1 leupeptin, 20 μ /ιηΐ aprotinin, 1 mM PMSF和 50 nM trichostatin A)和磷酸酶抑制剂混合 物的 RIPA裂解液 (20 mM Tris, pH 7.5 , 100 mM KC1, 0.1% Nonidet P-40， 1 mM EDTA, 10%glycerol, 50 mM NaF , 10 mM sodium pyrophosphate)裂解后， 进行蚩白浓度测定， 相同量的蚩白（〜60 μ ₈ )加入适量 5Χ上样缓冲液 100Γ加热约 10分钟。 细胞或组织样品 离心后取上清上样于 9%或 12% SDS聚丙烯酰胺凝胶， 电泳， 湿转， PVDF膜用含 5% 脱脂奶粉的 TBST溶液封闭 1小时。 封闭结束后， 用 TBST室温、 中速在摇床上洗涤 3 次， 每次 5分钟， 随后加入配制在含 5%BSA的 TBST中的一抗， 室温孵育 3小时或者 4°C过夜。 一抗中一般加入 0.02〜0.05%的叠氮钠抑菌以便重复使用。 一抗结合完成后， 用 TBST室温、中速在摇床上洗漆 3次，每次 5分钟。加入配制在含 5%脱脂奶粉的 TBST 3

中的二抗 （1 : 1000〜 1 :5000), 室温孵育 1〜3小时， 再 ti TBST洗膜 3次。 加入蚩白印迹 化学发光试剂 SuperSignal West Pico反应 2〜5分钟， 用保鲜膜包好压片， 先依次以 5、 15、 30、 60秒曝光显影曝光在 Kodak X-Omat胶片上， 再根据结果调整曝光时间或者显 影时间。 葡萄糖输出实验

经过指定药物处理过的培养在 12孔板内的 H4IIE细胞， 用 PBS洗三遍， 每孔加入 400 μ1含有 20 mM乳酸钠， 2 mM丙酮酸钠的无糖 DMEM培养液， 需要胰岛素刺激的， 同时加入 50 nM胰岛素刺激。 3小时后收集培养液， 用 Amplex® Red Glucose lucose Oxidase Assay 试剂盒测定培养液中的葡萄糖水平， 同吋测定每孔细胞裂解后的蚩白浓 度作为内标。 人群血液样本的血浆分离和 AP40/42测定

外周静脉血， 加入 EDTA混匀抗凝。 血浆样品是将血液 4°C 2700g离心 10 min, 收 集上层血浆部分， 分装保存在 -80Ό冰箱。 血浆中的 Λβ40/42用 Covance公司的 ELISA 试剂盒按照说明书测定。

RNA抽提， 反转录

12孔板每孔细胞用 1 ml Trizol裂解， 组织约 100 mg用 lml Trizol裂解， 室温放置 5 分钟， 然后加入 0.2 ml的氯仿， 剧烈摇晃 15秒后， 室温静置 2-3分钟， 12 , OOOxg, 4 V离心 15分钟后， 取上淸至新的离心管中（约 0.45 ml), 再加入 0.5 ml的异丙醇混勾， 室温放置】 0分钟后， 12， OOOxg, 4Ό离心 10分钟， 沉淀用 1 ml 75%的酒精洗条后， 去 上淸， 晾干残留乙醇， 将沉淀溶干适量 DEPC水中， 检测纯度及浓度。 用 Takara公司的 RNase-free DNase I处理抽提得到的总 RNA, 以除去可能的 DNA污染， 然后按照 DNase I的说明书纯化经过消化的总 RNA, 再检测其纯度及浓度。 OD260/280 > 1.9即符合使用 标准。 取 2-4 μ 总 RNA, 按照 M-MLV reverse transcriptase (Promega) 反转录系统提供 的说明书进行反转录， 引物选用 random hexamer。 反转录得到 cDN A， Hi于后续的 PCR 检测。 实时定量 PCR

Real-time PCR用 384孔板， 以三复孔方式进行。 每孔含有 5 μΐ Power SYBR®Green PCR Master Mix (ABI)和 1 μΐ 模板 DNA (反转录获得的 cDNA根据基因的表达丰度稀释 10-60倍不等）， 正向和反向引物的浓度均为 0.5 μΜ， 用 ABI公司的 7900 system来实时 监测荧光。 PCR反应条件为 50'C 2 min, 95 °C 10 min,随后是 95 °C 15 s和 60 °C 1 min, 40个循环。 为了确定没有非特异性扩增， 每一 PCR产物都用熔解曲线进行分析， 同时 也进行琼脂糖电泳以确保产物的特异性。 同一块板检测 actin作为内参， 用于比较其它 基因的相对表达量。 各种基因的常规 PCR及 qRT- PCR引物见表 1实时定量 PCR部分。

表 1 基因 正向 反向 转基因小鼠基因型鉴定 PCR

GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG

APPs c

(SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9)

GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACC AATAGAGAACGGCAGGAGCA

PSENdE9

(SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11)

实时定量 PCR

TGTCCACCTTCCAGCAGATGT AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA

actin

(SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13)

CTGCGGCTTCTATTGGGGAC AAAAGGCAGTCGAAGGTCTCG

SOCS-1

(SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15)

ATGGTCACCCACAGCAAGTTT TCCAGTAGAATCCGCTCTCCT

SOCS-3

(SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17)

CGAAGACTACAGTTCTGCCATT GACGTTTCAGAGGTTCTCAGAG

IL-la

(SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)

GCAACTGTTCCTGAACTCAACT ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT

IL-Ιβ

(SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21)

TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC

IL-6

(SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23)

CCCTCACACTCAGATCATCTTCT GCTACGACGTGGGCTACAG

T F-a

(SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 25)

GTGCTACTGGGGCTCATTTGT GGAGTAAGAGGACACTTGCGAAT

IL-1R1

(SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 27)

CCTGAGACTCAAGCAGAAATGG AGAAGGAAGGTCGGCTTCAGT

IL-6Ra

(SEQ ID NO: 28) (SEQ ID NO: 29)

CCGTGTGGTTACATCTACCCT CGTGGTTCTGTTGATGACAGTG

GP-130

(SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 31) AACCAACAGGCAGGCTTTAGT CATGACGGATCGGGTCCTTC

IL-8R

(SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33)

CAATACCATTGACCTGCCGAT GAGCGACTCAAACTGCCCT

STAT3

(SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO. 35) 小鼠基因型鉴定

幼鼠年龄为 22-23天时断奶， 分笼， 进行基因型鉴定。 将剪刀用酒精灯烧烫， 迅速 剪取 5 mm左右小鼠尾巴尖端， 力 tl 200 μΐ 50 mM NaOH, 100°C加热 1小时， 充分振荡至 小鼠尾巴松散， 加 15μ1 l M Tris-HCl (pH8.0)， 振荡混匀， 离心使残渣沉淀， 得到基因组 DNA即可用于 PCR鉴定基因型。 使用的 PCR引物见表 1转基因小鼠基因型鉴定 PCR。 小鼠基本表型分析

所有实验对照组小鼠都是和 APPswe/PSENdE9转基因小鼠相同性别的同窝小鼠。� �� 鼠在 10- 19周龄每周测量体重。小鼠在 12周到 16周中，每两天测量一次小鼠的进食量， 得到每天摄食量的平均值。小鼠的体脂重量 （fat mass)和瘦体重 (lean mass)通过核磁共振 用 Minispec Mq7.5 Analyzer (Bruker, Germany)测出， 然后 1 本重标准化后得到体脂含量 和瘦体重含量值。 葡萄糖耐受实验 （GTT, glucose tolerance test)

葡萄糖耐受性实验前， 将小鼠饥饿 15小时， 检测空腹血糖后， 腹腔注射葡萄糖溶 液 （根据小鼠体重， 2 g/kg), 然后分别用血糖仪检测注射后 15、 30、 60和 120分钟小鼠 尾静脉血液中葡萄糖的浓度。 血糖用血糖仪 （FreeStyle, Alameda, California, USA)检

胰岛素耐受实验 (ITT, insulin tolerance test)

胰岛素耐受性实验， 实验前小鼠禁食 4小时， 检测空腹血糖后， 根据体重注射 0.75 U/kg 的人胰岛素注射液， 分别用血糖仪检测注射后 15 , 30, 60和 120分钟小鼠的血糖 水平。 小鼠血浆胰岛素水平、 血脂含量和 AP40/42的检测

小鼠眼眶取血。 检测空腹胰岛素水平须将小鼠饥饿 16 h。 血浆样品是将血液 4°C

2700g离心 10 min, 收集上层血浆部分， 保存在 -8CTC冰箱。 血浆胰岛素水平用北京北方 生物制品研究所的放射性免疫试剂盒， 根据说明书进行检测。 甘油三酯、 总胆固醇、 高 密度脂蚩白胆 1ST醇和低密度脂蚩白胆固醇的血浆水平是用 HITACHI 7020全自动生化分 析仪测定。 血浆中的 Αβ40/42用 Covance公司的 EL1SA试剂盒按照说明说测定。 小鼠肝脏、 肌肉中胰岛素敏感性的检测

20周龄的小鼠饥饿 16小时后称重， 麻醉后打幵腹腔， 先取一片肝和一侧大腿上肌 肉 块， 迅速冻入液氮作为未处理的对照。随后按照体 重从门静脉注射 2 U/kg的人胰岛 素注射液， 5分钟后取余下肝脏， 10 min后取另一侧大腿上肌肉。 取下的组织立即冻入 液氮， 组织采集完毕后将样品转移至 -80 °C冰箱。 后续进行蚩白抽提和 western blot实验 检测胰岛素信 通路关键蚩白的激活水平。 数据分析和统计

统计学分析采用 GraphPad 5.0软件，除特别标注夕卜，所有定量数据均以 平均值 (Mean) ± 标准偏差 (SD)表示。 两组间差异的显著性分析采用非成对 Student's t-test。 多因素比 较用 Two-Way ANOVA进行差异的显著性分析。 P < 0.05代表具有统计学意义的显著性 差异， 尸< 0.01代表差异极显著。

II. 实施例

实施例 1、 Ap诱 肝细胞产生胰岛素抵抗

由于外周血液循环中的 Αβ主要是由肝脏吸收和代谢 (Ghiso, J.， et al. , Systemic catabolism of Alzheimer's Abeta40 and Abeta42. J Biol Chem, 2004. 279(44): p.

45897-908), 本发明人选用肝细胞检测 Αβ对胰岛素信号通路的影响。

先使用 Αβ25-35片段处理肝细胞， 这个片段是全长 Αβ42的毒性核心 (Pike, C.J. , et al.， Structure-activity analyses of beta-amyloid peptides contributions of the beta 25-35 region to aggregation and neurotoxicity. J Neurochem , 1995 64(1): p. 253-65)。 Western blot 实验显示， Αβ25-35能抑制小鼠肝原代细胞受胰岛素刺激后 的胰岛素信号通路并具有剂 量和时间效应， 表现为 Insulin receptor (InsR)、 Akt、 Glycogen synthase kinase 3p(GSK3p) 的磷酸化水平的下降 (图 l a和 lb)。

本发明人同时也使用了全长的 Αβ42处理小鼠肝原代细胞， 发现 Αβ42也能抑制胰 岛素对胰岛素信号通路的激活， Western blot实验显示 InsR、 Akt、 GSK3p的磷酸化水平 也下降了（图 lc) . 胰岛素的重要功能之一是抑制肝细胞的糖质新 生。 在大鼠肝癌细胞株 H4IIE中， 胰岛素能将对照组的糖质新生降低约 60%。 但在加入 Αβ的实验组， 随着加 入 Αβ25-35浓度的升高， 胰岛素对糖质新生的抑制作用也逐渐降低 (阁 I d) ,

本发明人在人肝癌细胞株 HepG2中也得到了类似的结果。 Western blot实验显示 Αβ25-35能抑制 HepG2细胞受胰岛素刺激后的胰岛素信号通路并� ��剂量效应和时间效 应， 表现为胰岛素受体 (InsR)、 Akt、 GSK3P的磷酸化水平的下降（阁 2a和 2b)。 以上数据表明， Αβ能在培养的肝细胞中诱 胰岛素抵抗。 实施例 2、 高血糖病人血浆中 ΑΡ水平显著升高

Αβ能诱 体外培养的细胞胰岛素抵抗， 而体内胰岛素抵抗又能 致高血糖血症， 于是本发明人检测了血糖正常的人群以及高血 糖人群 (包括临床确诊空腹血糖受损病人 和糖尿病病人)血浆中的 Ap 7]平。 ELISA结果显示， 高血糖人群血浆中 Αβ40/42水平均 显著高于血糖正常的人群 (图 3)。

此结果提示， 血浆中 Αβ40/42升高与高血糖血症相关， 而胰岛素抵抗又是高血糖血 症的重要诱因， 提示血浆中 Αβ40/42升高与胰岛素抵抗相关。 实施例 3、 过表达 Αβ的 APPswe/PSENdE9(APP/PSl)小鼠显示胰岛素抵抗的症状 1、 APP/PS1小鼠血浆中 Αβ显著升高

如前述实施例所述， 在细胞水平 Αβ能在肝细胞中诱^胰岛素抵抗并且高血糖病� �� 血浆 Αβ水平提高， 这些发现促使本发明人进一歩在动物水平研究 Αβ能否诱 胰岛素 抵抗。

本发明人选取了 AD的模型小鼠 APP/PS 1作为研究对象。 APP/PS1小鼠是常用的双 转基因 AD小鼠模型。 它是由朊蚩白启动子启动表达含瑞典突变 （ΚΜ594/5Ν)的小鼠 /人 嵌合淀粉样蚩白前体蛋白 ΑΡΡ和缺失外显子 9的剪切 ΑΡΡ的 γ-分泌酶 PS1 (PSENdE9) 两个质粒共同注射入小鼠受精卵而建立的 (Jankowsky, J L , et al. , Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng， 2001. 17(6): p. 157-65)。 文献报道在 6个月大的这种小鼠的脑中能观察到少量的淀� �样沉淀， 同时脑中 也能检测到微量的聚集状的 Αβ40和 Αβ42，而其认知能力没有受到损害 (Savonenko, A , et al. , Neurobiol Dis, 2005. 18(3): p. 602-17)。 在小于 6个月的小鼠脑中并没有检测到泶 集状的 Αβ40和 Ap42(Garcia-Alloza, M. , et al. , Neurobiol Dis, 2006 24(3): p. 516-24； Jankowsky , J L.， et al. , Hum Mol Genet, 2004. 13(2): p. 159-70), 而 20周龄转基因小 鼠血液中的 Αβ已经显著增加了 (Burgess, B丄.， et al. , Elevated plasma triglyceride levels precede amyloid deposition in Alzheimer ' s disease mouse models with abundant A beta in plasma. Neurobiol Dis, 2006. 24(1): p. 1 14-27)。本发明人通过 ELISA实验也检测到 Αβ40 和 Αβ42在 20周龄的 APP/PS1小鼠血浆中与同窝对照小鼠比显著增加 (表 2)。 已有研究 指出， 2-3月大的 APP/PS1转基因小鼠血浆中 Αβ即有显著增加 (Takeda, S.， et al.， Biochem Biophys Res Commun, 2009. 385(2): p. 193-7)。 Ap40(pg/ml) N.D. 263.6 ± 42.9

Ap42(pg/ml) N D. 136.8 ± 37.1

2、 APP/PS1小鼠一些基本表型正常

本发明人观察了 APP/PS 1小鼠 10-20 Ml龄的一些基本表型，发现 APP/PS 1小鼠和同 窝对照小鼠相比， 10-19周的体重 (图 4a), 12周和 16周的摄食 (ffl 4b)、体脂含量 (阁 4c) 瘦体重含量 (|¾ 4d)， 20周龄血脂中重要的主要脂质指标 (图 4e)都没有显著差异。 由于外 周的 Αβ主要是由肝脏吸收和代谢 (Ghiso, J , et al. , Systemic catabolism of Alzheimer's Abeta40 and Abeta42. J Biol Chem, 2004. 279(44): p. 45897-908), 本发明人同时也检测了 20周龄小鼠肝功能的重要指标谷丙转氨酶和天� ��氨酸转氨酶 (图 4f 发现也没有显著变 化， 提示外周 Αβ的显著升高对肝脏功能没有造成明显损伤� �

以上结果显示， APP/PS1小鼠在 10-20周龄时的一些基本表型是正常的。

3、 APP/PS1小鼠显示随年龄增长而加重的糖耐量受� �和胰岛素抵抗症状

本发明人检测了 APP/PS 1小鼠和同窝野生型小鼠的糖耐量和胰岛素敏� �性的变化。 葡萄糖耐受实验显示， APP/PS1小鼠糖耐量在 10周时有轻微受损， 到 18周时显示更加 严重的糖耐量受损， 表明有随年齡增加而糖耐量损伤加重的表型 (图 5a, 5b, 5e) o 胰岛 素耐受实验显示， APP/PS1 小鼠胰岛素敏感性的损害更显著， 表现为 13 周龄时胰岛素 耐受已有显著损伤， 到 19周时损伤更加显著 (阁 5c, 5d, 5f) o 20周时测定 APP/PS1小 鼠和同窝对照小鼠饥饿和喂食状态下的胰岛素 水平发现， APP/PS 1的胰岛素水平均显著 高于同窝对照小鼠， 显示由于胰岛素抵抗引起的胰岛素代偿性分泌 升高 (图 5g)。

以上结果显示， APP/PS1小鼠随年龄增长呈现糖耐量受损和胰岛� �抵抗加重的趋势。

4、 肌肉的胰岛素抵抗情况

为了确认 APP/PS1小鼠肝脏和肌肉中是否出现胰岛素抵抗� �本发明人在小鼠肝脏和 肌肉中检测了胰岛素诱 的下游信^通路的激活。 结果显示， 胰岛素刺激后， APP/PS 1 小鼠肝脏组织的 InsR和 Akt的磷酸化水平要显著低于同窝对照小鼠 (图 6a, 6b), 表明在 APP/PS1小鼠肝脏组织中胰岛素下游的信号转 受损。 相一致的是， 在肌肉组织中也观 察到了与肝脏组织类似的现象。 胰岛素刺激后， APP/PS1小鼠肌肉的 Akt磷酸化水平也 显著低于同窝对照小鼠 (图 6c, 6d)， 显示肌肉中胰岛素信号转^也受到抑制。

以上结果显示， APP/PSI小鼠肝脏和肌肉中确实存在着胰岛素抵� �现象。

5、 A β的抗体的降糖作用 本发明人对 3 个月大的雄性 APP/PS1 小鼠使用 Αβ的抗体 3F5(购自 Yes Biotech Laboratories Ltd， 效价 1： 50- 1： 500)进行腹腔注射治疗， 给药量为每次 10 mg/kg。 每周注 射一次， 对照的雄性 APP/PS 1小鼠注射同剂量 IgG。

注射 3个月后，检测饥饿 4小时的小鼠血糖显示， APP/PS1小鼠的血糖从 152.3 _mg /dl 降低到 127mg/dl， 说明 Αβ的抗体 3F5治疗有显著的降糖效果。

本发明人对 3个月大的雄性 APP/PSI 小鼠使用 Αβ的抗体 1H3 (购自 Yes Biotech Laboratories Ltd, 效价 1:50-1:500), 6C8 (购自 Yes Biotech Laboratories Ltd, 效价 1:50-1:500)进行腹腔注射治疗， 给药量为每次 10 mg/kg。 每 J注射一次， 对照的雄性 APP/PS1小鼠注射同剂量 I _g G。

1H3和 6C8抗体注射 3个月后， 检测饥饿 4小时的小鼠血糖显示， APP/PS1小鼠的 血糖显著下降 (如图 14所示)， 说明 Αβ的抗体 1H3, 6C8治疗有显著的降糖效果。

6C8抗体注射 9个月后， 检测饥饿 4小时的小鼠血糖和胰岛素水平显示， APP/PS1 小鼠的血糖显著下降更为显著 (阁 15A), 并且小鼠的血浆胰岛素也显著下降 (图 15Β)。根 据小鼠空腹血糖和空腹胰岛素计算出的稳态模 型的胰岛素抵抗指数 (homeostasi s model assessment-estimated insulin resistance, HOMA-IR)也显示 A β的抗体 6C8治疗能显著提 高 APP/PS1小鼠的胰岛素敏感性 (阁 15C)。 实施例 4、 Αβ通过上调 SOCS-1诱 胰岛素抵抗

1、 Αβ能上调小鼠肝脏和肝原代细胞中的 SOCS-1表达水平

本发明人的研究发现，ΑΡΡ/PSl小鼠显示出随� �年龄增加而严重的胰岛素抵抗现象， 但 致这种现象的机制还不太清楚。由于炎性反应 在 Αβ诱 的神经损伤中起重要作用， 并且炎性反应同样也是胰岛素抵抗的一个重耍 诱因， 因此本发明人猜想 Αβ是否可能通 过激活外周组织的炎性反应来诱 胰岛素抵抗的。 本发明人通过定量 PCR 检测了 APP/PS1小鼠及其同窝对照组小鼠胰岛素的靶器� � ——肝脏、 肌肉和脂肪组织的一些重 要炎性因子以及介 其信号通路的下游因子的基因表达情况。 本发明人发现， APP/PS 小鼠肝脏和肌肉中 S0CS-1和 S0CS-3, 肝脏中 GP130, 脂肪中 IL-Ια, IL-8基因表达显 著升高。其余的炎性因子和其下游蚩白表达没 有明显变化 (图 7a, 7b, 7c),说明在 APP/PS 小鼠的胰岛素靶器官中没有明显的炎性反应。

SOCS蚩白最初被发现是细胞因子信号通路的抑� �因子，本发明人重点研究了 S0CS 蚩白在胰岛素信号通路中的作用。 Western blot实验显示，与同窝对照小鼠相比， APP/PS1 小鼠肝脏中的 SOCS-1蚩白表达显著上调了， 而 SOCS-3蚩白表达没有变化 (图 8a， 8b)。

以上结果提示， S0CS-1参与 APP/PS1小鼠的胰岛素抵抗形成。 为了验证 S0CS-1蛋白表达的上调是否是由 Αβ S接诱^的，本发明人用 Αβ处理小 鼠肝原代细胞。 定量 PCR结果显示 Αβ25-35能上调 SOCS-1基因转录并具有时间效应， 而 SOCS-3基因表达没有变化 (图 9a)。 Western blot也显示， Αβ25-35能上调 SOCS-1蚩 白表达水平， 并且存在剂量效应和时间效应， 而 SOCS-3的蚩白表达水平则不受影响 (图 9b , 9c)。 全长的 Αβ42同样也能上调 SOCS- 1蛋白表达， 并且也不影响 SOCS-3的蚩白 水平（阁 9d) _u

以上结果显示， Αβ能直接上调 SOCS- 1基因转录和蚩白表达。 实施例 5、 Αβ通过上调 SOCS-1诱^肝细胞产生胰岛素抵抗

本发明人进一步检测了 Αβ诱 的胰岛素抵抗是否依赖于 SOCS-1 的上调。 通过两 条不同的 RNAi序列（见表 3 , SOCS- 1 siRNA- l和 SOCS- I siRNA-2)来下调 SOCS- 1以后 ( 10a) , Αβ25-35对肝原代细胞受胰岛素刺激后的胰岛素 信号通路的抑制作用都得到缓 解， 表现为 InsR、 Akt磷酸化水平的显著回复 (图 10b , 10c)。

表 3

以上结果显示， Αβ主要通过上调 SOCS-1诱 ^肝细胞产生胰岛素抵抗。

JAK2/STAT3信号通路介 了 Αβ诱 的 SOCS-1上调和胰岛素抵抗

Αβ能诱 STAT3和 JAK2的磷酸化激活

己知 SOCS蚩白在静息状态的细胞中通常表达较低， 在受细胞因子刺激后， 主要通 过激活 JAK/STAT 信号通路诱 SOCS 基因转录 (Ronn, S.G. , N. Billestrup, and T.

Mandrup-Poulsen, Diabetes and suppressors of cytokine signaling proteins. Diabetes, 2007.

56(2): p. 541-8) ₀ 而 Αβ又能在神经细胞中激活 STAT3和 JAK2/Tyk2(Wan， J.， et al. ,

Tyk2/STAT3 signaling mediates beta-amyloid-induced neuronal cell death: implications in

Alzheimer's disease. J Neurosci , 2010. 30(20)： p. 6873-8 ·, Chiba, T.， et al. , Amyloid-beta causes memory impairment by disturbing the JAK2/STAT3 axis in hippocampal neurons.

Mol Psychiatry, 2009. 14(2): p. 206-22), 因此本发明人检测了 Αβ是否能在肝原代细胞中 激活 STAT3和 JAK2。 Western blot实验显示， Λβ25- 35能以剂量依赖地诱 STAT3酪 氨酸残基磷酸化， 而 STAT1的酪氨酸残基磷酸化水平则不受 Αβ25-35调控， 说明 Αβ能 特异性地激活 STAT3。 Αβ处理后， 〗ΛΚ2的酪氨酸残基磷酸化变化呈现和 STAT3类似 的趋势 (图 l la)。 进一步的研究显示， Αβ25-35诱 STAT3和 JAK2的酪氨酸残基磷酸 化具有良好的时间效应，随着诱 时间的延长 STAT3和 JAK2的酪氨酸残基磷酸化水平 总体上逐渐升高 (图 l lb)。 全长的 Αβ42同样也能诱 STAT3和 JAK2的酪氨酸残基磷 酸化 (图 l lc)o 同时， 本发明人还检测发现 APP/PS1小鼠肝脏组织的 STAT3和 JAK2酪 氨酸残基磷酸化水平要显著高于同窝对照小鼠 (阁 l i d, l ie), 说明 APP/PS 1小鼠肝脏中 的 STAT3和 JAK2处于相对高活性状态， 并且该状态也很可能是由 Αβ诱 产生的。

以上结果表明， Αβ 能在肝原代细胞诱^ STAT3 和 JAK2 的磷酸化激活， 而且

APP/PS1小鼠肝脏中的 STAT3和 JAK2活性也较高。

本发明人对 3个月大的雄性 APP/PS1小鼠使川 Α β的抗体 1H3 (购自 Yes Biotech Laboratories Ltd , 效价 1 :50-1 :500) , 6C8 (购自 Yes Biotech Laboratories Ltd , 效价 1 :50-1 :500)进行腹腔注射治疗， 给药量为每次 10 mg/lcg。 每周注射一次， 对照的雄性 APP/PS1小鼠注射同剂量 IgG。

分别注射 1H3 3个月后， 注射 6C8 9个月后检测 APP/PS1小鼠肝脏中的 STAT3和 JAK2活性和 S0CS-1 的表达， 发现注射 Α β的抗体能显著降低 APP/PS1小鼠肝脏中的 STAT3和 JAK2活性和 S0CS-1的表达， 如阁 16所示。 实施例 6、 Αβ诱 的 SOCS-1上调依赖于 STAT3和 JAK2

基于 JAK/STAT信号通路对于 S0CS表达的重要调控作用， 本发明人检测了 Αβ对 S0CS-1的上调是否是由 STAT3和 ΜΚ2所介 的。 本发明人设计了 2条针对 STAT3 的不同 siRNA序列 (见表 3. STAT3 siRNA-1和 STAT3 siRNA-2)，发现当 STAT3下调时， Αβ对于 SOCS- 1的上调作用被抑制 (图 12a)。 用抑制剂 AG490抑制 JAK2或通过两条不 同的 RNAi序列（见表 3 , JAK2 siRNA-1和 JAK2 siRNA-2)来下调 JAK2， Αβ对干 SOCS-1 的上调作用被抑制 (图 12b, 12c)。

以上结果显示， Αβ对 SOCS- 1的上调是依赖于 STAT3和 JAK2的。 实施例 7、 Αβ诱 的胰岛素抵抗依赖于 STAT3和 JAK2

最后，本发明人检测了 Αβ是否通过激活 JAK2/STAT3信^通路来诱^胰岛素抵抗。 当通过 RNAi降低 STAT3蛋白表达后，Αβ对胰岛素信 通路激活的抑制作用显著缓解， Αβ 致的 InsR和 Akt的磷酸化水平降低得到了显著 Μ复 (图 13a, 13b)。 类似地， 通过 抑制剂抑制 JAK2或通过 RNAi下调 JAK2, Αβ对胰岛素诱 的胰岛素信号通路激活的 抑制作用显著缓解，Αβ ^致的 InsR和 Akt的磷酸化水平降低也得到了显著回复 (阁 13c, 01063

13d, 13e, 13f)。

以上结果显示， STAT3和 JAK2介^了 Αβ诱^的胰岛素抵抗。

为了在体内验证 Αβ诱^的胰岛素抵抗依赖干 JAK2/STAT3/SOCS-1信号通路， 本 发 明人包装 了 特异性下调 JAK2 表达的 siRNA 腺病毒（针对序列为 5'-GCAAACCAGGAATGCTCA- 3', SEQ ID NO: 36)通过尾静脉注射使其在 APP/PS1小 鼠肝脏内过表达。结果，过表达 JAK2 siRNA的腺病毒能下调 JAK2的蚩白水平 (JAK2i)， STAT3的蚩白水平未受影响。 与预期一致， 下调 JAK2蚩白水平能显著降低 JAK2的磷 酸化水平， STAT3的磷酸化水平也显著下调， SOCS-1 的蚩白表达也显著下降了， 如图 17所示。 LacZi用于作为实验对照， 可沉默细菌的 LacZ基因。

JAK2 siRNA 腺病毒载体（Ad-JAK2i)构建方法具体如下： 腺病毒的构建按照

Invitrogen公司的 BLOCK-iT™ 腺病毒 RNAi表达系统的说明书构建。 简要步骤如下， 设 计了针对 JAK2编码序列 5'-GCAAACCAGGAATGCTCA-3'(SEQ ID NO: 36)的寡核苷酸：

GC-3' (SEQ ID NO: 38), 合成后退火， 插入到 U6-entry 载体 (Invitrogen)中。 随后与 pAd/BLOCK-iTT DEST质粒进行重组。 重组完成后得到的质粒用 Pac 1内切酶线性化后 转染 293A细胞进行第二次重组， 转染 】0天左右得到重组腺病毒。 腺病毒的纯化利用 CsCl梯度超速离心进行纯化。

LacZi siRNA腺病毒载体 (Ad- LacZi)构建方法具体如下： 用 Invitrogen的腺病毒试剂 盒提供的针对细菌 LacZ基因干扰片段的寡核苷酸， 退火， 插入到 U6- _en tiy载体中。 余 下步骤与 JAK2 siRNA腺病毒载体构建方法一致。

进一步本发明人研究了注射了 JAK2 siRNA的腺病毒的 ΛΡΡ/PSl小鼠的的糖耐量和 胰岛素敏感性的变化。 葡萄糖耐受实验显示， 注射了 JAK2 siRNA的腺病毒的 APP/PS 1 小鼠糖耐量有显示提高 （图 18A和 B)。 胰岛素耐受实验显示， 注射了 JAK2 siRNA的腺 病毒的 APP/PS1小鼠胰岛素明显改善（图 18C和 D)。为了确认 APP/PS 1小鼠肝脏胰岛素 抵抗的改善， 本发明人在注射了 JAK2 siRNA的腺病毒的 APP/PS 1小鼠肝脏中检测了胰 岛素诱 的下游信号通路的激活。 结果显示， 胰岛素刺激后， 注射了 JAK2 siRNA的腺 病毒的 APP/PS1小鼠肝脏组织的 InsR和 Akt的磷酸化水平要显著高于注射了对照病毒 的 APP/PS1小鼠（图 18E和 F)， 表明在 APP/PS1小鼠肝脏中下调 JAK2能调高 APP/PS1 小鼠的胰岛素敏感性。 提示 Αβ在体内的诱^胰岛素抵抗效应是由 JAK2信号通路介^ 的。 实施例 8、 筛选方法

细胞模型： 前面所述的小鼠原代肝细胞， 其中包含 JAK2/STAT3信号通路及其下游 的 SOCS-1 , 并以 ΙΟ μΜ Αβ42处理小鼠原代肝细胞 36 h。

测试组： 用候选物质处理的上述细胞模型；

对照组： 不用候选物质处理的上述细胞模型。

如果与对照组相比， 测试组中的 Αβ42对 JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的激活显 著下降 50%以上， 则说明该候选物质是潜在可防治或缓解胰岛素 抵抗或糖尿病的物质。

釆用上述方法， 将由 SEQ ID NO. 4- 7(依次为候选物质 1-4)， 以及 SEQ ID NO: 1的 siRNA (候选物质 5)作为候选物质， 处理所述细胞模型。 结果发现， 候选物质 1-4是潜在 可防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的物质； 而候选物质 5没有作用。 实施例 9. 检测试剂盒

一种检测胰岛素抵抗的试剂盒， 该试剂盒中含有：

容器 1 , 以及装于该容器中特异性结合 Αβ的抗体；

以及， 其它一些容器， 其中分别装有显色液、 酶标液、 包被液、 洗涤液。

以及， 说明检测方法的使用说明书。 讨论

本发明人先在细胞水平研究了 Αβ与胰岛素抵抗的相关性， 发现 Αβ能抑制小鼠肝 原代细胞受胰岛素刺激后的胰岛素信 通路， 降低胰岛素对肝细胞糖质新生的抑制作 用。 在人群样本中本发明人发现高血糖病人血浆中 的 Αβ显著升高， 由于胰岛素抵抗是 高血糖的重要诱因， 提示体内 Αβ与胰岛素抵抗相关。 血浆中过表达 Λβ的 APP/PS1小 鼠显示随年龄增长而加重的糖耐量受损和胰岛 素抵抗症状， APP/PS 1小鼠肝脏和肌肉中 胰岛素信号通路的激活受到抑制，表明 APP/PS 1小鼠肝脏和肌肉中确实存在着胰岛素抵 抗现象， 提示血浆中 Αβ 的过表达能直接诱 胰岛素抵抗。 最后本发明人研究发现 Αβ 通过激活 JAK2/STAT3信号通路上调 SOCS- 1而产生其诱 胰岛素抵抗的作用。 以上研 究说明， 外 l Αβ的异常升高能诱 胰岛素抵抗。

本发明人的实验选择的是小于或等于 20周龄的 APP/PS 1小鼠， 此时小鼠脑内淀粉 样沉淀很不明显， 小鼠的认知能力也没有受损， 显示此时产生的胰岛素抵抗不是由于老 年痴呆 致的， 并提示外周的胰岛素抵抗有可能由外周 Αβ的升高引起。 与广泛接受的 一些 2型糖尿病的小鼠模型相似， APP/PS 1在 10周左右开始表现出高胰岛素血症和高 血糖等人类 2型糖尿病的类似症状， 是一种潜在的新的 2型糖尿病动物模型。

AD病人脑中 Αβ的沉积是一个重要的病理特征， AD病人血浆中 Αβ的水平有研究 报道是显著升高了， 但也有报道没有显著变化。 造成这些研究结果不同的原因可能来自 实验设计， 例如测试对象的年龄、 疾病的严重程度不同等。 很多 AD病人外周 Αβ水平 没有显著变化也部分解释了只有小部分的 AD病人发展出空腹血糖受损和 2型糖尿病。 另一方面， 尽管有报道显示糖尿病患者血浆中抗 Αβ的抗体比起对照人群显著升髙， 提 示糖尿病人血桨中 Αβ有可能也升高了， 但糖尿病人血浆中 Αβ水平是否有变化还未见 报道。 本发明人的研究发现在高血糖人群 (包括空腹血糖受损和糖尿病)血浆中 Αβ 的显 著升高， 提示血浆中的 Αβ水平可能成为胰岛素抵抗和 2型糖尿病的一个潜在生物标志 物。

本发明人的研究发现 Αβ通过激活 JAK7STAT继而上调 SOCS-l。 SOCS蚩白最初被 发现是细胞因子信兮通路的抑制子， 细胞因子通过激活 JAK/STAT信号通路上调 SOCS 蚩白， SOCS蚩白结合到 JAK蚩白， 抑制信号通路的转 形成一个负反馈通路， 从而调 控细胞因子产生的生物效应。 后续研究发现 SOCS蛋白也能抑制胰岛素信号通路， 有些 细胞因子诱 的胰岛素抵抗需要 SOCS 蚩白参与。 虽然 Αβ 也能诱 胶质细胞表达 ΤΝΡ-α等细胞因子，但是本发明人并没有在 APP/PS 1小鼠外周组织中检测到 IL-Ιβ, IL-6, TNF-ct等炎性因子的表达升高， 而且细胞因子诱 的 SOCS基因转录往往比较宽泛， 一 种细胞因子能诱 多个 SOCS基因表达 (Fasshauer, M. , et al.， Insulin resistance-inducing cytokines differentially regulate SOCS mRNA expression via growth factor- and Jak/Stat-signaling pathways in 3T3-L1 adipocytes. J Endocrinol, 2004. 181(】）： p. 129-38)。 本发明人的研究发现， Αβ处理肝原代细胞时， 只有 SOCS- 1的转录被激活。这些结果都 提示 Αβ不是通过上调一些炎性因子诱 S0CS-1表达的。 另一方面， Αβ有较强的促氧 化应激能力， 例如. Αβ 能诱 人和小鼠小胶质细胞和巨噬细胞产生活性氧分 子 (reactive oxygen species, R0S)。 ROS又能激活 JAK/STAT信号通路。这些结果提示 Αβ有可能是 通过产生 ROS继而激活 JAK/STAT/SOCS信号通路的。 本发明人还发现 Αβ在肝原代细 胞能激活 ERK (数据未列出），而 ERK能磷酸化 STAT3的丝氨酸残基调控 STAT3的活性， 这些细胞内信号的整合有可能决定了 Αβ上调 S0CS-1的特异性。

胰岛素抵抗发生发展过程非常复杂， 不同因素引起的胰岛素抵抗虽然最终都可能^ 致糖尿病， 但针对糖尿病诱因不同应采取不同的治疗方法 ， 因此阐明胰岛素抵抗的机理 对于 2型糖尿病的治疗具有指 ^性意义。 本发明人在小鼠体外和体内的研究结果都显示 外周 Αβ能通过激活 JAK2/STAT3/SOCS- 1信号通路诱 胰岛素抵抗。 这些结果加深了 对胰岛素抵抗和 2型糖尿病致病机理的理解， 提示外周 Αβ水平有可成为胰岛素抵抗和 2型糖尿病的一个生物标记物。 降低 Αβ的生成、 下调外周 Αβ、 抑制 Αβ激活的信号通 路等都有可能成为治疗胰岛素抵抗和 2型糖尿病的重要策略。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定 的范围。