Esta invenção se refere a formas farmacêuticas para veiculação do benznidazol para o tratamento de doenças causadas por parasitos da família dos tripanosomatídeos, demais parasitas intracelulares, infecções microbianas e no tratamento de tumores, especialmente leucemias. Tais formas farmacêuticas incluem sistemas autoemulsionáveis micro e nanométricos, nanoemulsões, nanopartículas lipídicas sólidas, nanopartícula lipídica líquida, nanopartícula lipídica semi-sólida, nanoesferas e nanocápsulas poliméricas para tratamentos realizados pelas vias oral, parenteral e vias externa (tópica, retal, vaginal, ocular, auricular) contendo a substância benznidazol (N-benzil- 2 nitro- 1 imidazol acetamida) e todos os seus derivados nitroimidazólicos. Fundamentos da Invenção

A Tripanossomíase Americana ou doença de Chagas, descoberta em 1909 por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas (Chagas, 1909), é uma zoonose causada pelo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, pertencente à ordem Kinetoplastida e à família Tripanosomatidae. O Benzonidazol (Bz) é um fármaco nitro-heterocíclico (N-benzil- 2 nitro- 1 imidazol acetamida) sendo o único fármaco utilizado atualmente no Brasil para o tratamento da doença de Chagas. Apresenta atividade antiprotozoária, antibacteriana e recentemente, como foi também relatada sua atividade moduladora do crescimento de células leucêmicas (Calvo K.L et al, 2013). O grupo nitro da molécula do benzonidazol é reduzido pela ação da nitrorredutase, induzindo a formação de vários radicais livres intermediários e metabólitos nucleofílicos que interferem diretamente com a síntese de macromoléculas pelo T. cruzi, células tumorais, bacterianas, fúngicas e de outros protozoários. (Marr et al, 1991 e Do Campo et al, 1986)._0 tratamento com Benznidazol na fase aguda da doença de Chagas promove cura de aproximadamente 100% em crianças e cerca de 60% em adultos com infecção recente (De Andrade, A. L., 1996; Sosa Estani S., 2006). Na fase crónica da doença ocorrem danos irreversíveis no coração, esôfago e cólon. Atualmente não existe nenhum tratamento para a fase crónica da doença, pois o Benznidazol nem sempre é indicado. Esta diferença na atividade tripanomicida nas duas fases (aguda e crónica) da doença pode estar relacionada as propriedades farmacocinéticas do Benznidazol. No momento não existe nenhum tratamento satisfatório com 100% de cura parasitológica para todos os pacientes acometidos pela doença. O período de tratamento é longo, de 30-60 dias na fase aguda e de mais de 5 meses na fase crónica. O longo tempo de tratamento e os sérios efeitos colaterais associados ao uso do benznidazol reduzem a adesão dos pacientes ao tratamento e provocam, em muitos casos, a interrupção provisória do tratamento.

O benznidazol é um fármaco pouco solúvel em água, 0,4mg/ml (Kasim et al., 2004), o que dificulta sua veiculação em formas farmacêuticas líquidas, não havendo ainda nenhuma forma farmacêutica parenteral disponível comercialmente. O Benznidazol é disponibilizado somente na forma de comprimidos (Rochagan ^® ), que apresentam biodisponibilidade oral baixa e variada, além da dificuldade de administração a crianças, neonatos e idosos. Lamas et al, 2006, desenvolveram soluções alcoólicas contendo surfactantes como o PEG 400 que aumentaram a solubilidade aparente do benznidazol. Também foram desenvolvidas formas lipossomais multilamelares contendo benznidazol para administração parenteral que modificaram a biodistribuição deste fármaco em ratos (Morilla MJ et al, 2003). Em 2009 foi patenteado, no Brasil, um processo de obtenção de complexos do benznidazol com ciclodextrinas que promoveu uma maior solubilização do fármaco (PI0903451 0 A2). A complexação do benznidazol com rutênio também aumentou a solubilidade e a atividade do fármaco ( PI0704577-8 A2, J. Nogueira Silva J. et al 2008). Sendo assim, observa-se que a atividade desta molécula é dependente da solubilidade deste fármaco e que a utilização de formas farmacêuticas adequadas, que possibilitem o aumento de solubilidade do fármaco e a administração do benznidazol por diferentes vias de administração, e que tragam melhorias no perfil de biodisponibilidade são altamente desejáveis e não existem até o momento no mercado. O aumento da biodisponibilidade desta molécula poderá permitir que o fármaco possa atingir os alvos terapêuticos em concentrações ideais, com maior exposição do tecido afetado ao fármaco.

Assim neste documento técnico está relatado o desenvolvimento de novas composições farmacêuticas micro e nanoestruturadas pré-formadas, que podem ser administradas por qualquer via, e também de composições farmacêuticas de uso oral que se micro e nanoemulsionam em fluidos biológicos, principalmente no trato-gastrointestinal (TGI). As referidas composições farmacêuticas podem conter o benznidazol e qualquer um de seus derivado nitroimidazólicos obtidos pela modificação química da molécula original do benzonidazol. Essas composições farmacêuticas modificam o tempo de residência plasmático desses fármacos e também o perfil de farmacocinético e de biodisponibilidade, podendo melhorar a atividade farmacológica do fármaco encapsulado em seu uso como antiparasitário, antimicrobiano ou como antitumoral. Sumário da invenção

A presente invenção descreve os métodos de preparo de formas farmacêuticas poliméricas micro e nanométricas encapsulando o benznidazol para uso parenteral e de formas farmacêuticas de uso oral que se autoemulsionam em contato com fluidos biológicos, formando micro ou nanoemulsões. Incluem microcápsulas, microesferas, microemulsões, nanocápsulas, nanoesferas, nanoemulsões, nanopartículas lipídicas sólidas, semi-solidas e líquidas, nanocápsulas de núcleo lipídico e sistemas autoemulsionáveis, que formam micro e nanoemulsões. As formulações a serem patenteadas incluem formas farmacêuticas que possuem estrutura de glóbulos emulsionados revestidos ou não por polímeros contendo o Benznidazol e/ou um de derivados nitroimidazólicos. As composições farmacêuticas desenvolvidas melhoram o perfil de dissolução do benznidazol, controlam a liberação do fármaco e promovem aumento da biodisponibilidade plasmática, com consequentemente melhoria da atividade farmacológica.

Descrição das figuras

Figura 1- Imagem de sistemas autoemulsionantes para administração oral usando diferentes surfactantes, em várias proporções de fase oleosa/fase aquosa: 10:90 em A, 20:80 em B e 50:50 em C.

Figura 21 - Imagens de nanoemulsões com Tween 80 (A e B), Labrasol (C e D) e Cremophor EL (E e F) obtidas por Microscopia de Força Atómica: imagem de altura (coluna da esquerda) e imagem de fase (coluna da direita) obtidas em modo de contato intermitente. Varreduras de: (60 μηι x 60 μπι) em A e B; (10 μη x 10 μιη) em C e D , (1 μηι x 1 μηι ) em E e F . Z escala : 300 nm em A e B, 100 nm em C e D e 200 nm em E e F.

Figura 3 - Perfil comparativo da concentração plasmática-versws-tempo do benznidazol livre e na formulação nanoautoemulsionável. Figura 4 . Curvas de parasitemia determinada a partir da análise de esfregaços do sangue fresco de animais infectados com cepa Y do Trypanossoma cruzi e tratados com diferentes formulações de benznidazol.

Descrição detalhada da invenção Exemplo 1- Sistemas autoemulsionáveis

Os sistemas autoemulsionáveis de entrega de fármacos (SAEEFs) são definidos como misturas isotrópicas de óleos naturais ou sintéticos, solventes hidrofílicos, surfactantes e co- surfactantes, que quando adicionadas a água sob levíssima agitação, formam um sistema emulsionado estável. Os sistemas auto-emulsionantes aumentam a solubilidade aparente e em geral aumentam a biodisponibilidade oral do fármaco. Nesses casos a proporção do fármaco dissolvido no trato-gastro-intestinal é muitas vezes aumentada. Esta estratégia permite muitas vezes a diminuição das doses administradas, e o prolongamento do tempo de permanência do fármaco em concentrações eficazes no sangue.

Na presente invenção foram desenvolvidos sistemas micro e nano autoemulsionáveis contendo 10-90% de triglicerídeos adequados à administração oral (óleo de milho, óleo de canola, óleo de girassol, óleo de soja refinado, triglicérides de ácido cáprico e caprílico, triglicerídeos de cadeia média e miglyol), 10-90% de emulsionantes (Cremophor EL, Tween 20, Twenn 40, Tween 60, Tween 80, Tween 85, Labrasol®,), 0-50% de co-surfactante (Trancutol®, Lecitina de soja, Span, PEG 400, PEG 300), os quais foram adicionados ou não de algum solvente orgânico para solubilizar o benznidazol e/ou seu derivados.

As formulações FOI a F07, apresentadas na tabela I resultaram em boa compatibilidade entre os excipientes e o Benznidazol, o que permitiu a formação de autoemulsões. Segundo Ho e cols. (1996), a adição de co-surfactantes auxilia no desempenho dos surfactantes, reduzindo a tensão interfacial através do aumento da coesão no filme de tensoativos das emulsões.

De acordo com a figura 1, foi observado emulsificação espontânea nos sistemas dispersos imediatamente após o preparo, a partir da formulação contendo o Tween 20, Tween 80, PEG 400, Transcutol, Labrasol, Cremophor EL como surfactante. A mistura de óleo (Miglyol 810), surfactante e co-surfactante (lecitina de soja) foi adicionado em diferentes proporções em água pura, sendo em A 90% de água, B 80% de água e C 50% de água. Resultados semelhantes foram observados para as demais formulações desenvolvidas. Assim, pela análise visual de emulsificação espontânea das formulações preparadas a partir de um óleo específico (Miglyol 810), um co-surfactante (lecitina de soja) e testando sete surfactantes, pode-se concluir que todas as misturas, independentemente do surfactante utilizado, formaram um sistema emulsionado homogéneo com grnade facilidade e que estas emulsões se mantiveram estáveis por 24h.

Tabela I- Leitura do tamanho (nanômetros) dos glóbulos e índice de polidispersão das auto- emulsões com benznidazol em diferentes proporções de água. índice de

BZN Diluição em Tamanho (nm)

Formulação polidispersão ±

(mg/mL) água ± DP

DP

5 lOx 201,2 ± 4,3 0,203 ± 0,018

5 lOOx 302,9 ± 49,4 0,415 ± 0,271

Miglyol:Tween80: 5 200x 232,6 ± 2,1 0,206 ± 0,031

Lecitina (65:25:10) 3,3 lOx 212,8 ± 4,4 0,275 ± 0,050

3,3 lOOx 318,2 ± 101,4 0,419 ± 0,382

3,3 200x 224,7 ± 13,7 0,273 ± 0,122

Mygliol.Labrasol 80: 5 lOx 252,3 ± 197, 3 0,600 ± 0,402

Lecitina (65:25:10) 3,3 200x 1013,6 ± 779,3 1,702 ± 0,323

5 lOx 240,1 ± 2,9 0,099 ± 0,073

5 lOOx 184, 3 ± 17,0 1,702 ± 0,323

Miglyol : Cremophor80 5 200x 185,4 ± 1,6 0,146 ± 0,020

:Lecitina (65:25:10) 3,3 lOx 207,5 ± 6,4 0,711 ± 0,022

3,3 lOOx 334,3 ± 78,5 0,963 ± 0,300

3.3 200x 454,8 ± 294,8 0,965 ± 0,444

As três autoemulsões preparadas (tabela I), com concentrações de benznidazol de 3,3 e 5 mg/ml, apresentaram tamanho nanomê tricô dos glóbulos após sua dispersão em água gerando nanoemulsões. Nas nanoemulsões formadas a partir da formulação onde o surfactante empregado foi o Cremophor EL os glóbulos apresentaram tamanho inferior a 200 nm. As formulações preparadas a partir do Labrasol foram as mais monodispersas (IP < 0,3).

As nanoemulsões formadas após a diluição das formulações autoemulsionáveis em água ultrapura foram caracterizadas por Microscopia de Força Atómica (MFA). As nanoemulsões formadas foram depositadas em superfície de mica, desidratadas por fluxo de argônio e analisadas. Pelas análises microscópicas, pode-se observar que os glóbulos das nanoemulsões apresentaram formato esférico e as populações encontram-se homogeneamente distribuídas em relação ao tamanho dos glóbulos (monodispersas). Além disso, utilizando-se a técnica de microscópica de força atómica por contato intermitente foi possível observar imagens de altura de estruturas vesiculares, as quais estão de acordo com as características estruturais de uma nanoemulsão.

Avaliação in vivo

As concentrações de benznidazol foram determinadas no plasma de camundongos após administração oral do Benznidazol, tanto na forma convencional (Benznidazol livre) e em sistema nanoautoemulsionável (Miglyol 810, Tween 80 e lecitina). No gráfico da Figura 3, observa-se um aumento do tempo para que se atinja o pico máximo de concentração plasmática (2h) e um significativo (p < 0.05) aumento do tempo de residência plasmática do benznidazol sob a forma nanoautoemulsionada (área sob a curva). Com a administração do benznidazol na sua forma convencional (livre) ocorreu uma absorção rápida (30 min), porém com um rápido declínio da concentração plasmática (figura 3), o que resulta em baixo tempo de residência plasmática. Houve aumento significativo (p < 0.05) na área sob a curva (Concentração x tempo) do benznidazol na formulação desenvolvida (37 % da dose administrada) em relação a forma farmacêutica convencional (26%), como pode ser observado na figura 3.

EXEMPLO 2- Composições Farmacêuticas do Tipo Nanocápsulas Poliméricas biodegradáveis contendo Benznidazol

Uma alternativa potencialmente interessante para melhorar a eficácia do Benznidazol é o uso de nanopartículas poliméricas biodegradáveis. A utilização destes sistemas para a encapsulação de moléculas terapeuticamente ativas apresenta numerosas vantagens, tais como: proteção frente à degradação, diminuição dos efeitos tóxicos, liberação controlada do fármaco, aumento do tempo de meia via plasmático produzindo propriedades farmacocinéticos mais favoráveis, liberação mais prolongada e consequentemente maior conforto ao paciente (Dellacherie et al., 2001). As nanocápsulas poliméricas (NC) são nanopartículas poliméricas de tamanho inferior a um micrometro, do tipo reservatório, constituídos por um núcleo oleoso recoberto por uma camada polimérica biodegradável (Legrand et ah, 1999). Nas NC, o fármaco encontra-se predominantemente dissolvido ou disperso no núcleo oleoso, embora possa se adsorver na superfície das partículas. Na literatura científica não foi encontrado nenhuma nanopartícula polimérica carreando o benznidazol e nenhuma patente relacionado a este tipo de composição farmacêutica contendo o Benznidazol, similar à descrita como exemplo nesta invenção.

Fessi et al., 1989 descreveu um método para produção de nanocápsulas (US 5,049,322); baseada na deposição interfacial de um polímero pré-formado seguida do deslocamento do solvente, também denominado de nanoprecipitação. Este método consiste da mistura de uma fase orgânica, constituída por um solvente miscível com água, com uma fase aquosa contendo um surfactante hidrofílico, misturado em determinadas proporções. Para a preparação das nanocápsulas por nanoprecipitação são utilizados polímeros geralmente na faixa de 0,2 a 2% (m/m) como determinado anteriormente pela patente EP 1531800 A2. Surfactantes hidrofílicos e lipofílicos também são utilizados, usualmente de 0,2 a 2% (m/m) e os óleos empregados podem ser vegetais ou minerais. Para obtenção de nanocápsulas encapsulando o benznidazol, o método descrito anteriormente na patente EP 1531800 A2 foi modificado. Assim através do estudo de concentrações diferentes dos constituintes da formulação (óleo, polímero, o surfactante lipofílico e surfactante hidrofílico) foi desenvolvido novo método, que otimizado gerou a presente invenção como descrito neste exemplo, uma vez que nas proporções previamente descritas na patente EP 1531800 foi observada precipitação do benznidazol em 24-48 h após o preparo.

Para preparação de nanocápsulas contendo lmg/ml de benznidazol, pode-se utilizar de 6-15 mg/mL do polímero biodegradável, o PLA (poli-rac-ácido lático) (42000 a 75000Da) como exemplo, foram dissolvidos em 6 a 12 mL de uma solução de acetona contendo 0,1-10% de lecitina de soja (EpiKuron 170®), como exemplo,e 2,5-20 % m/v de triglicerídeo de cadeia média (Miglyol, 810N, ou outro triglicerídeo). Essa solução foi vertida em uma solução aquosa (12-24 mL) contendo 0,75-1,5% p/p de poloxamer 188 (Pluronic® F68) sob agitação magnética. A mistura resultante foi mantida sob agitação por mais 10-40 minutos para permitir a formação das nanocápsulas de benznidazol. Posteriormente, o excesso de solvente foi evaporado sob pressão reduzida em rotavapor (Heidolph Instruments, Alemanha) até um volume total de ImL. Na tabela 2 estão apresentados as diferentes proporções dos constituintes das NC contendo Img/mL de BZN e os volumes de solventes testados. As nove formulações preparadas apresentaram tamanho inferior a 300 nm, o que as classifica como nanocáspulas de núcleo oleoso. Diferentes constituintes foram utilizados e em todos os casos nanocápsulas foram obtidas, conforme descrito nas reinvidicações.

A eficiência de encapsulação, que mede a eficiência do processo de encapsulamento do fármaco no interior das nanocápsulas, foi determinada para estes métodos descritos nesta invenção. Dentre as diferentes formulações testadas, a formulação 9 (tabela III) apresentou mais estabilidade, menor precipitação do fármaco e uma melhor eficiência e porcentagem de encapsulação. A otimização desta metodologia proposta na presente invenção gerou formulações de nanocápsulas muito estáveis contendo Img/mL de benzonidazol encapsulado, sem que se obsserve formação de precipitados no período de estocagem e com altos teores de encapsulação (70%). Esta formulação, pelo seu reduzido tamanho, pode ser administrada por qualquer via, inclusive parenteral, particularmente pela via intravenosa.

Esta forma farmacêutica foi testada em animais e é bastante adequada à veiculação do benznidazol para as diferentes aplicações terapêuticas requeridas nesta invenção, podendo ser utilizada por diferentes vias de administração, como a via oral, parenteral, intravenosa, retal e tópica.

Tabela II- Tamanho médio e índice de polidispersão de NC de PLA contendo Img/mL de Benzonidazol.

Polímero Tamanho (nm) índice ^

Mygliol Epikuron Acetona Água Pluronic F68

PLA ± Polidispei

^L/imL) (mg/mL) (IBL) . (rniL) (mg/ml)

(mg/mL) DP (LP.) d

6 25 7,5 6 12 7,5 226,2 ± 0,2 0,158 ± C

6 50 15 6 12 7,5 172,8 ± 0,5 0,097 ± C

6 75 22,5 6 12 7,5 226,6 ± 3,2 0,015 ± C

6 100 30 6 12 7,5 199,3 ± 1,0 0,021 ± C

6 150 30 8 16 7.5 240,7 ± 5,6 0,180 ± C

6 200 35 10 20 7,5 235,9 ± 34,3 0,126 ± C

15 150 30 8 16 15 300,2 ± 8,9 0,277 ± 0

15 200 30 8 16 15 285,1 ± 10,6 0.290 ± C

15 200 30 12 24 15 236,6 ± 3,6 0,165 ± 0 A acetona é completamente removida após formação das nanocápsulas.

Tabela III- Eficiência de encapsulação, porcentagem de fármaco precipitado e teor de encapsulação de formulações de NC de PLA com lmg/fnl de Bz.

Bz

Formulação Rendimento do

precipitado (%) Encapsulação de NC PLA processo (%)

(%)

Formulação 5 49,54 13,02 56,96

Formulação 6 57,10 1,64 58,05

Formulação 9 67,60 4,31 70,66 Estudos in vivo

A atividade anti- Trypanosoma cruzi do benznidazol após sua inclusão nas nanocápsulas poliméricas biodegradáveis (Img/mL) foi avaliada em modelo experimental da Doença de Chagas em camundongos. Assim, os camundongos Swiss foram inoculados com 5000 parasitas da cepa y do Trypanossoma cruzi; após confirmar a infecção (4 dias após o inoculo) os animais (n=7) foram tratados durante 20 dias consecutivos com a formulação convencional de benznidazol (60mg/Kg) e com a suspensão coloidal das nanocápsulas de PLA contendo o Benznidazol (60 mg/kg). Foram realizadas análises diárias de sangue a fresco e contagem do parasita. Analisando a figura 4 podemos observar que o Benznidazol, livre e nanoencapsulado, aumentaram a sobrevida dos animais infectados quando comparado ao grupo não tratado (Figura 4). A formulação que desenvolvemos nesta invenção diminuiu drasticamente a parasitemia no sangue dos animais tratados com as nanocápsulas, logo no início do tratamento e manteve a parasitemia nula mesmo após o término do tratamento (Dia 20). Entretanto no grupo tratado com o Benznidazol na forma convencional, observou-se o retorno de parasitas no sangue dos animais após o fim do tratamento (dia 26), conforme pode ser observado na figura 4. Assim, o encapsulamento do Benznidazol em nanocápsulas poliméricas descritas nesta invenção melhorou a atividade do fármaco quando comparado com o fármaco na sua forma convencional.

Exemplo 3- Nanocápsulas poliméricas biodegradáveis recobertas com o polímero quitosana As nanocápsulas poliméricas biodegradáveis recobertas por quitosana (QUI) contendo benznidazol foram preparadas utilizando várias concentrações e proporções dos polímeros hidrofóbicos aniônicos, tipo (PLA, PCL, PHB, PLGA, PGA) e quitosana de vários pesos moleculares e graus de desacetilação foram testadas. Como exemplo, uma série de testes realizados com o polímero ácido poliláctico, pode ser observado na Tabela 4. Aumentando- se os volumes das fases foi observada redução do tamanho das nanocápsulas e do índice de polidispersão. A adição de lecitina na fase orgânica levou ao aumento significativo no tamanho das partículas (P < 0,05) e também do potencial zeta. Com o método descrito na presente invenção pode-se manipular as proporções, variar os constituintes das formulações e o volume dos solventes orgânico e aquoso para se controlar o tamanho das nanocápsulas.

Tabela IV: Microcápsulas e nanocápsulas de PLA revestidas com quitosana (QUI).

Epikuro

PLA QUI Acetona Agua Diâmetro Polidispersão de

n

(mg/mi) (mg/ml) (ml) (ml) (mm) tamanho

(mg/ml)

6 2 - 1 2 564,0±67,2 0,527±0,127

3 2 - 2 2 497,8±26,9 0,767±0,085

4 2 - 1 2 330,1±15,8 0,277±0,068

1 2 - 1 2 376,5±5,8 0,376±Q,036

2 1 - 1 2 380,1±26,7 0,82±0,068

2 2 - 2 4 287,2±2,6 0,116±0,080

2 2 - 3 6 , 255,5±2,3 0,075±0,007

2 2 - 4 8 248,1±0,6 0,009+0,040

2 2 7,5 4 8 1432,7±524,8 1,741±0,106

0 2 7.5 4 8 583,2±144,3 0,172±0,032

0 2 4 8 283,3±5,5 0,084±0,037

2,5 2,5 - 4 8 225,4±2,3 0,057±0,007 índice de polidispersão