Afin d'améliorer la production de leur souche, les industriels font appel à des séries de mutagenèse au hasard. Au cours de la première mutagenèse, le ou les mutants les plus producteurs sont retenus et sont soumis à une seconde mutagenèse etc... Au cours d'un processus pouvant prendre parfois plus d'une dizaine d'années les industriels obtiennent ainsi des souches hyper-productrices. Ces dernières sont souvent"poly-mutées"mais les gènes touchés ne sont pas connus.

Cette méthode traditionnelle d'amélioration de souches exposée ci-dessus est très longue et exige de nombreuses manipulations et tests. Elle aboutit à l'obtention de souches poly- mutées qui poussent mal, ont des exigences de milieu particulières, et pour lesquelles une longue phase d'optimisation de milieu est nécessaire.

Les manipulations réfléchies et ciblées de l'expression de certains gènes (il peut s'agir de sur-expression ou d'inactivation) dont il a été démontré, chez des espèces apparentées, qu'elles ont un effet sur la production d'antibiotique peut conduire beaucoup plus rapidement que les méthodes traditionnelles à l'obtention de souches d'intérêt industriel hyper- productrices d'antibiotique. De telles souches n'étant pas poly-mutées elles sont susceptibles d'avoir des caractéristiques de croissance proches de la souche sauvage et devraient demander une phase d'optimisation de milieu moins longue.

Il est connu de longue date que chez Streptomyces une carence en phosphate inorganique (Pi) induit le déclenchement de la biosynthèse d'antibiotique. Au cours de sa croissance, la bactérie consomme le Pi présent dans le milieu de culture jusqu'au moment où la concentration de ce dernier devient limitante. Cette faible concentration en Pi signale un futur état dé carence en Pi et la bactérie met alors en route l'expression de tout un ensemble de gènes qui permet son adaptation à cette limitation en Pi. L'ensemble de ces gènes, parmi

lesquels on peut citer des gènes codant des phosphatases de différentes molécules phosphorylées, des systèmes de transport du Pi à forte affinité, des systèmes de stockage/déstockage du Pi dans des polymères de Pi (dont le gène ppk) etc... constitue le régulon Pho. Ces différentes fonctions permettent de récupérer le Pi présent à une faible concentration dans le milieu ou présent dans différentes molécules biologiques et ainsi de différer ou de réduire l'ampleur de l'état de carence en Pi.

Chez Escherichia coli ou Bacillus subtilis, l'expression des gènes du régulon Pho est sous le contrôle d'un système à deux composants comprenant un activateur et une kinase sensorielle. En conditions de limitation en Pi, cette dernière s'auto-phosphoryle et transfère son phosphate au régulateur qui devient ainsi capable d'interagir avec des opérateurs (boîtes Pho) situés dans les régions promotrices des différents gènes du régulon Pho afin de stimuler leur transcription.

Une situation de limitation en Pi déclenche l'expression du régulon Pho, ensemble de gènes dont l'expression permet de retarder l'apparition d'un état de carence en Pi. Une situation de carence en Pi entraîne le déclenchement de processus adaptatifs différents de ceux induits par une limitation en Pi. Ce sont ces processus encore mal connus qui conduisent, chez Streptomyces, au déclenchement de la biosynthèse d'antibiotiques. Il est probable que cette production massive d'antibiotiques soit liée à une accumulation, dans la cellule, des précurseurs de biosynthèse d'antibiotique. Dans le cas des antibiotiques de type polyketides, ces précurseurs sont souvent des unités acétate, malonate ou butyrate résultant du catabolisme des acides gras ou de certains acides aminés. En état de carence en Pi la bactérie déclencherait des processus"d'autophagie"c'est à dire de catabolisme actif des ces constituants cellulaires afin de produire l'énergie dont la cellule à besoin via le cycle de Krebs. Cependant du fait de multiples carences, le cycle de Krebs tournerait au ralenti et il s'en suivrait une accumulation d'unités acétate, malonate ou butyrate dans la cellule. Cette accumulation pourrait être toxique pour cette dernière si elle n'induisait pas des voies de condensation/polymérisation de ces unités, condensation qui conduit à la synthèse du squelette carboné des antibiotiques de type polyketides.

La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs qu'il est possible de créer précocement une situation de carence en Pi en empêchant l'expression de l'ensemble des gènes (régulon Pho) qui permet une adaptation de la bactérie à une limitation en Pi afin de différer l'apparition de l'état de carence en Pi.

Pour ce faire, les Inventeurs ont isolé et interrompu les deux gènes phoR (kinase) et phot (régulateur) qui, chez Streptomyces lividans, constituent vraisemblablement le système

à deux composants responsable de l'activation de l'expression de l'ensemble des gènes du régulon Pho de Streptomyces. Les mutants phoR et phoP ainsi construits sont incapables d'induire l'expression des différents systèmes de récupération du Pi mentionnés ci-dessus ; ils sont donc précocement et sévèrement carencés en Pi et surproduisent de façon massive les antibiotiques.

L'invention a pour but de fournir un nouveau procédé visant à augmenter de façon très significative la production de métabolites ou d'enzymes par des souches de micro-organismes d'intérêt industriel (Actinomycétales ou autres), en levant la répression qu'exerce le phosphate sur la production d'antibiotique ou d'enzymes par des souches de micro-organismes d'intérêt industriel.

Avantageusement, le procédé de l'invention. est facilement transposable à toute souche industrielle dont la production d'enzymes, de métabolites ou tout autre produit à forte valeur commerciale est connue pour être réprimée par le phosphate inorganique (Pi).

L'invention a également pour but de fournir de nouvelles souches de micro-organismes d'intérêt industriel pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'antibiotiques, lesdites souches présentant l'avantage d'avoir des caractéristiques de croissance proches de la souche sauvage.

L'invention a également pour but de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques pour l'obtention de tells souches de micro-organismes.

La présente invention a pour objet l'utilisation de souches de micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, dont l'opéron phoR/phoP codant un système à deux composants, à savoir une kinase sensorielle codée par phoR, et un régulateur codé par phoP, responsable de l'activation du régulon Pho desdits micro-organismes comprenant un ensemble de gènes impliqués dans la réponse adaptative à une limitation en phosphate chez lesdits f micro-organismes, est inactivé, pour la mise en oeuvre d'un procédé de stimulation de la production de ces composés d'intérêt par lesdites souches transformées.

Par procédé de stimulation de la production de composés d'intérêt, tel que mentionné ci- dessus, on entend tout procédé selon lequel la production de ces composés est augmentée, notamment dans des proportions d'environ 20% à 50% ou plus, par rapport à la production de ces mêmes composés dans des souches identiques aux précédentes mais dont l'opéron phoRlphoP n'a pas été inactivé.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de micro- organismes dont la production de composés d'intérêts, notamment de métabolites secondaires, dépend de la concentration en phosphate inorganique à l'intérieur desdits micro-organismes,

la production desdits composés étant stimulée par une limitation de la concentration en phosphate inorganique.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de micro- organismes producteurs de composés d'intérêt choisis parmi les métabolites à activité antibiotique, anticancéreuse, immunosuppressive, antihelmintique, antifongique, herbicide, insecticide, ou de micro-organismes producteurs d'enzymes.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de souches de micro-organismes de l'ordre des Actinomycétales, notamment ceux producteurs de métabolites à activité antibiotique.

A ce titre, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de souches de Bacillus, de Cephalosporium, et de Penicillium producteurs de métabolites à activité antibiotique, et de souches d'Actinomycètes producteurs de métabolites à activité antibiotique choisies parmi les souches de Streptomyces, de Micromonospora, de Saccharopolyspora, de Streptoverticillium, de Nocardia, de Corynebacterium, d'Actinoplanes, d'Actinomadura, de Dactylosporangium, et de Mycobacterium.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de souches listées dans le tableau 1 ci-après dans le cadre de la stimulation de la production des antibiotiques également listés dans ce tableau I.

Avantageusement encore, les souches de micro-organismes utilisées dans le cadre de l'invention, sont des souches de micro-organismes producteurs d'enzymes.

La production d'enzymes telles que celle des protéases, cellulases, endoglucanases, . béta. -glucanases, hemicellulases, lipases, peroxidases, laccases,. alpha. -amylases, glucoamylases, chitinase, cutinases, agarase, ligninase, nucléase, pectinases, reductases, oxidases, phenoloxidases, ligninases, pullulanases, arabinosidases, mannanases, xyloglucanases, xylanases, pectin acetyl esterases, polygalacturonases, rhamnogalacturonases, galactanases, pectin lyases, pectin methylesterases, cellobiohydrolases, transglutaminases produites par différents genres bactériens tels qu'Erwinia, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, et par différentes espèces de Bacilles, de champignons, de levures ou d'Actinomycètales, sont susceptibles d'être produites en plus grande quantité par les micro- organismes modifiés selon l'invention, dans la mesure où la synthèse de ces enzymes est régulée par le phosphate inorganique.

Les souches de micro-organismes utilisées dans le cadre de la présente invention sont également choisies parmi celles transformées à l'aide de vecteurs contenant des séquences codant pour les composés d'intérêt susmentionnés.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de souches de micro-organismes dont l'opéron phoRlphoP,. ou la région promotrice de cet opéron, est modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, de telle sorte que ledit opéron ainsi modifié ne code plus pour la kinase sensorielle active, et/ou pour le régulateur (ou activateur) transcriptionnel des gènes du régulon Pho.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de souches de micro-organismes dont la région promotrice de l'opéron phoRlphoP, et/ou le gènephoR, et/ou le gène phoP, sont modifiés par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de souches de micro-organismes dont la région promotrice de l'opéron phoR/phoP, ou au moins le gène phoP, sont modifiés par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide.

L'invention concerne plus particulièrement encore l'utilisation susmentionnée, de souches de micro-organismes dont la région promotrice de l'opéron phoR/phoP, et/ou le gène phoR, et/ou le gène phoP, sont modifiés par insertion d'une cassette à l'intérieur de cette région promotrice, ou de ces gènes, avec délétion ou non de tout ou partie de cette région promotrice, ou de ces gènes.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de souches de micro-organismes telles que définies ci-dessus comprenant en lieu et place de leur région promotrice de l'opéron phoR/phoP, et/ou de leur gène phoR, et/ou de leur gène phoP, sauvages, une séquence nucléotidique correspondant : - à la région promotrice de l'opéron phoR/phoP, et/ou au gène phoR, et/ou au gène phoP, sauvages modifiés par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, t - ou à la région promotrice de l'opéron phoR/phoP, et/ou au gène phoR, et/ou au gène phoP, exogènes modifiés par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, et provenant d'une souche de micro-organisme autre que celle contenant initialement la région promotrice de l'opéron phoR/phoP, et/ou le gène phoR, et/ou le gène phoP, sauvages.

Avantageusement, dans le cas où les souches de micro-organismes susmentionnées contiennent une région promotrice de l'opéron phoRlphoP, et/ou un gène phoR, et/ou un gène phoP, exogènes modifiés, ceux-ci codent pour des protéines ayant un pourcentage d'identité avec les protéines sauvages correspondantes d'au moins environ 50%.

L'invention concerne également l'utilisation de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant un opéron phoRlphoP, ou la région promotrice de cet opéron, provenant de micro-organismes producteurs de composés d'intérêt, tels que ceux définis ci-dessus, ledit opéron phoR/phoP, ou sa région promotrice, étant modifiés par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, pour la transformation de souches de micro- organismes, en vue de l'obtention de souches de ces micro-organismes ne produisant plus de kinase sensorielle active, et/ou de régulateur transcriptionnel des gènes du régulon Pho, pour la mise en oeuvre d'un procédé de stimulation de la production de ces composés d'intérêt par lesdites souches de micro-organismes ainsi modifiées.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant : - une séquence nucléotidique. correspondant à la région promotrice de l'opéron phoR/phoP de Streptomyces délimitée par les nucléotides situés aux positions 420 à 630 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 représentée sur la figure 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée de la région promotrice susmentionnée et correspondant à une région promotrice de l'opéron phoR/phoP chez des micro-organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ladite région promotrice, ou sa séquence dérivée, étant modifiée par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - et/ou une séquence nucléotidique correspondant au gène phoR de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 632 à 1909 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gènephoR. et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoR susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phoR chez des micro- organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoR, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - et/ou une séquence nucléotidique correspondant au gène phoP de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 1917 à 2587 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gène phoP et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoP susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phot chez des micro-organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoP, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant : - une séquence nucléotidique correspondant à la région promotrice de l'opéron phoR/phoP de Streptomyces délimitée par les nucléotides situés aux positions 420 à 630 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée de la région promotrice susmentionnée et correspondant à une région promotrice de l'opéron phoR/phoP chez des micro-organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ladite région promotrice, ou sa séquence dérivée, étant modifiée par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - ou une séquence nucléotidique correspondant au gène phoP de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 1917 à 2587 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant. à une séquence nucléotidique dérivée du gène phot et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoP susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phoP chez des micro- organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoP, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - et, le cas échéant, une séquence nucléotidique correspondant au gène phoR de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 632 à 1909 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gène phoR et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoR susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phot chez des micro-organismes autres que Streptomycess, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gènephoR, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide.

L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques recombinantes comprenant : - la région promotrice de l'opéron phoR/phoP de Streptomyces lividans, ou une séquence dérivée, - et/ou le gène phot de Streptomyces lividans, ou une séquence dérivée, - et/ou le gène phot de Streptomyces lividans, ou une séquence dérivée, la région promotrice ou les gènes susmentionnés étant modifiés par insertion d'une séquence hétérogène au niveau d'un site de restriction endogène ou exogène déterminé dans la séquence du gène.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de séquences nucléotidiques recombinantes dans lesquelles la région promotrice ou les gènes phoR et phoP, sont modifiés par insertion au niveau d'un site de restriction déterminé de ladite séquence, d'une cassette contenant un marqueur, tel qu'un marqueur de résistance à un antibiotique, notamment l'apramycine.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, de séquences nucléotidiques recombinantes choisies parmi : - la séquence SEQ ID NO : 3 représentée sur la figure 2, comprenant l'interruption du gène phoR par insertion au niveau du site de restriction NcoI du gène, situé aux positions 1389 à 1394 de la séquence SEQ ID NO : 1, d'une cassette contenant un marqueur de résistance à l'apramycine, et délimitée par les acides aminés situés aux positions 1425 et 3626 de la séquence SEQ ID NO : 3, - la séquence SEQ ID NO : 4 représentée sur la figure 3, comprenant l'interruption du gène phot par insertion au niveau du site de restriction NotI du gènephoP, situé aux positions 2111 à 2118 de la séquence SEQ ID NO : 1, d'une cassette contenant un marqueur de résistance à l'apramycine, et délimitée par les acides aminés situés aux positions 2148 et 3920 de la séquence SEQ ID NO : 4, - la séquence SEQ ID NO : 5 représentée sur la figure 4, comprenant l'interruption des gènes phoR et phoP par insertion au niveau des sites de restriction NcoI et NotI susmentionnés, avec délétion du fragment NcoI l NotI, d'une cassette contenant un marqueur de résistance à l'apramycine, et délimitée par les acides aminés situés aux positions 1425 et 3626 de la séquence SEQ ID NO : 5.

L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante comprenant: : - une séquence nucléotidique correspondant à la région promotrice de l'opéron phoREphoP de Streptomyces délimitée par les nucléotides situés aux positions 420 à 630 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée de la région promotrice susmentionnée et correspondant à une région promotrice de l'opéron phoR/phoP chez des micro-organismes autres que Streptomyces, choisis parmi des souches de Cephalosporium et de Penicillium producteurs de métabolites à activité antibiotique, et des souches d'Actinomycètes producteurs de métabolites à activité antibiotique choisies parmi les souches de Micromonospora, de Saccharopolyspora, de Streptoverticillium, de Nocardia, de Corynebacterium, d'Actiszoplanes, d'Actinomadura, et de Dactylosporafagium, ladite région

promotrice, ou sa séquence dérivée, étant modifiée par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - et/ou une séquence nucléotidique correspondant au gène phot de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 632 à 1909 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gène phot et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phot susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phot chez des micro- organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoR, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - et/ou une séquence nucléotidique correspondant au gène phoP de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 1917 à 2587 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gène phoP et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoP susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène pump chez des micro-organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoP, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, L'invention a plus particulièrement pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, comprenant : - une séquence nucléotidique correspondant à la région promotrice de l'opéron. phoR/phoP de Streptomyces délimitée par les nucléotides situés aux positions 420 à 630 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée de la région promotrice susmentionnée et correspondant à une région promotrice de l'opéron phoR/phoP chez des micro-organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ladite région promotrice, ou sa séquence dérivée, étant modifiée par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - ou une séquence nucléotidique correspondant au gène phoP de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 1917 à 2587 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gène phot et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoP susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phoP chez des micro- organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoP, ou sa

séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - et, le cas échéant, une séquence nucléotidique correspondant au gène phoR de Streptomyces délimité par les nucléotides situés aux positions 632 à 1909 de la séquence SEQ ID NO : 1, ou correspondant à une séquence nucléotidique dérivée du gène phoR et codant pour une protéine ayant un pourcentage d'identité avec la protéine codée par le gène phoR susmentionné d'au moins environ 50%, ladite séquence dérivée correspondant à un gène phot chez des micro-organismes autres que Streptomyces, tels que mentionnés ci-dessus, ledit gène phoR, ou sa séquence dérivée, étant modifié par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide.

L'invention a plus particulièrement pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, comprenant : - la région promotrice de l'opéron phoR/phoP de Streptomyces lividans, ou une séquence dérivée, - et/ou le gène phot de Streptomyces lividans, ou une séquence dérivée, - et/ou le gène phoP de Streptomyces lividans, ou une séquence dérivée, la région promotrice ou les gènes susmentionnés étant modifiés par insertion d'une séquence hétérogène au niveau d'un site de restriction endogène ou exogène déterminé dans la séquence du gène.

L'invention concerne plus particulièrement toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, dans laquelle le promoteur ou les gènes phot et phoP, sont modifiés par insertion au niveau d'un site de restriction déterminé de ladite séquence, d'une cassette contenant un marqueur, tel qu'un marqueur de résistance à un antibiotique, notamment l'apramycine.

L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus, choisie parmi : - la séquence SEQ ID NO : 3, comprenant l'interruption du gène phoR par insertion au niveau du site de restriction NcoI du gène, situé aux positions 1389 à 1394 de la séquence SEQ ID NO : 1, d'une cassette contenant un marqueur de résistance à l'apramycine, et délimitée par les acides aminés situés aux positions 1425 et 3626 de la séquence SEQ ID NO : 3, - la séquence SEQ ID NO : 4, comprenant l'interruption du gène phoP par insertion au niveau du site de restriction NotI du gène phoP, situé aux positions 2111 à 2118 de la séquence SEQ ID NO : 1, d'une cassette contenant un marqueur de résistance à l'apramycine,

et délimitée par les acides aminés situés aux positions 2148 et 3920 de la séquence SEQ ID NO : 4, - la séquence SEQ ID NO : 5, comprenant l'interruption des gènes phot et hoP par insertion au niveau des sites de restriction NcoI et NotI susmentionnés, avec délétion du fragment NcoI l NotI, d'une cassette contenant un marqueur de résistance à l'apramycine, et délimitée par les acides aminés situés aux positions 1425 et 3626 de la séquence SEQ ID NO : 5.

L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment tout plasmide, le cas échéant à réplication thermosensible, contenant une séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus.

L'invention concerne également les souches de micro-organismes producteurs de métabolites ou d'enzymes, lesdits micro-organismes étant modifiés de manière à ce que l'opéron phoR/phoP codant un système à deux composants, à savoir une kinase sensorielle codée par phoR, et un régulateur codé par phoP, responsable de l'activation du régulon Pho comprenant un ensemble de gènes impliqués dans la biosynthèse des phosphates chez lesdits micro-organismes, est inactivé.

L'invention concerne plus particulièrement les souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, lesdites souches étant productrices de composés d'intérêt tels que définis ci-dessus.

L'invention a plus particulièrement pour objet les souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi des souches de Cephalosporium et de Penicillium producteurs de métabolites à activité antibiotique, et des souches d'Actinomycètes producteurs de métabolites à activité antibiotique choisies parmi les souches de Micromonospora, de Saccharopolyspora, de Streptoverticillium, de Nocardia, de Corynebacterium, d'Actinoplanes, d'Actinomadura, et de Dactylosporangium, telles que celles définies dans le tableau I.

L'invention concerne également les souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, lesdites souches étant productrices d'enzymes, et étant avantageusement choisies parmi les souches mentionnées ci-dessus.

L'invention a plus particulièrement pour objet les souches de micro-organismes susmentionnées, telles qu'obtenues par transformation desdits micro-organismes avec un vecteur défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation de souches de micro- organismes telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

- le cas échéant, le clonage de fopéron phoRlphoP, ou de la région promotrice de cet opéron, de la souche de micro-organisme que l'on souhaite modifier, et l'amplification d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant l'opéron phoRlphoP, ou sa région promotrice, à l'aide de deux amorces oligonucléotidiques choisies à partir de séquences connues situées dans cet opéron ou sa région promotrice, ou situées de part et d'autre de ce cet opéron ou de sa région promotrice, - modification de la séquence nucléotidique contenant cet opéron ou sa région promotrice, telle que celle obtenue lors de l'étape précédente, par addition et/ou substitution et/ou délétion d'au moins un nucléotide, - transformation de souches de micro-organismes à l'aide de vecteurs contenant la séquence nucléotidique recombinante obtenue lors de l'étape précédente, - sélection des souches de micro-organismes transformées ayant intégré dans leur génome la séquence nucléotidique recombinante susmentionnée en lieu et place de la séquence nucléotidique correspondant à l'opéron ou la région promotrice sauvages.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant l'opéron phoR/phoP, ou sa région promotrice, est modifiée par insertion d'une cassette comportant un marqueur, notamment un marqueur de résistance à un antibiotique, afin de sélectionner les souches modifiées obtenues.

La séquence recombinante ainsi obtenue, est ensuite clonée dans un vecteur approprié, notamment dans un plasmide capable de transfert interspécifique et capable ou non de se répliquer de façon thermosensible dans la souche du micro-organisme à modifier. Après transformation des souches avec le vecteur susmentionné, la sélection des souches modifiées se fait directement par observation de la présence ou non du marqueur porté par la cassette dans le génome des souches modifiées, après un passage ou non à haute température selon que le plasmide est à réplication thermosensible, ou n'est pas réplicatif.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant l'opéron phoR/phoP, ou sa région promotrice, est modifiée par addition ou délétion d'au moins un nucléotide. Dans ce cas, il est préférable d'utiliser un vecteur à réplication thermosensible, et, après passage à haute température, on repère les colonies ayant perdu le plasmide (colonies sensibles à l'antibiotique auquel le plasmide confère d'ordinaire la résistance) et qui surproduisent l'antibiotique sur un milieu approprié. Ces colonies pourront être repérées sur boîte de milieu de culture approprié en les faisant pousser en présence d'une souche sensible à l'antibiotique produit.

En variante, ce dernier procédé peut également être effectué en deux étapes. Dans un premier temps, la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus contenant l'opéron phoR/phoP, ou sa région promotrice, est modifiée par insertion d'une cassette susmentionnée conférant une résistance à un antibiotique, puis cette séquence modifiée par insertion est remplacée par une version délétée de cette séquence. Dans ce cas, on repère les colonies redevenues sensibles à l'antibiotique auquel la cassette confère d'ordinaire la résistance.

L'invention a également pour objet un procédé de stimulation de la production de métabolites, notamment de métabolites à activité antibiotique ou autre, ou d'enzymes, par des micro-organismes utilisés pour la production de ces composés, ledit procédé comprenant la mise en culture de souches de micro-organismes modifiés telles que définies ci-dessus, dans un milieu de culture approprié.

Avantageusement, le procédé susmentionné de l'invention. est caractérisé en ce que la culture est effectuée dans un milieu riche (à savoir un milieu contenant des acides aminés comme source de carbone et d'azote) avec une pression osmotique équivalente à celle conférée par 103 g/1 de saccharose et sans ajout de phosphate inorganique exogène.

Tableau 1 Liste des organismes producteurs d'antibiotiques I) Organismes producteurs d'aminocyclitols ORGANISME ANTIBIOTIQUE Bacillus (espèces variées) Aminocyclitols Micromonospora (espèces variées) Gentamycines Saccharopolyspora (espèces variées) Aminocyclitols Streptomyces albogriseolus Neomycines albus var. metamycinus Metamycine aquacanus N-methyl hygromycine B atrofaciens Hygromycines bikiniensis Streptomycine bluensis var. bluensis Bluensomycine canus Ribosyl paromamine catenulae Catenuline chrestomyceticus aminosidine crystallinus hygromycine A erythrochromogenes streptomycine var. narutoensis eùrocidicus A16316-C fradiae hybrimycines et neomycine fradiae var. italicus aminosidine galbus streptomycine griseus streptomycine griseoflavus MA 1267

hofuensis seldomycine complexe hygroscopicus hygromycinse hygroscopicus forma leucanicidine et hygrolidine glebosus glebomycine hygroscopicus var. limoneus validamycines hygroscopicus var. sâgamiensis spectinomycine kanamyceticus kanamycine A et B kasuqaensis kasugamycines kasugaspinus kasugamycins lavendulae neomycine lividus lividomycines mashuensis streptomycine microsporeus SF-767 netropsis LL-AM31 noboritoensis hygromycines olivaceus streptomycine olivoreticuli var. cellulophilus destomycine A poo/eM"'streptomycine rameus streptomycine ribosidificus SF733 rimofaciens destomycine A rimosus forma paromomycinus paromomycines, catenuline spectabilis spectinomycine tenebrarius tobramycine et apramycine Streptoverticilliumflavopersicus spectinomycine 11) Organismes producteurs d'Ansamycine ORGANISME ANTIBIOTIQUE Micromonospora (espèces variées) ansamycines Nocardia mediterranei rifamycine Streptomyces collinus ansatrienes, napthomycines diastochromogenes ansatrienes, napthomycines galbus subsp. griseosporeus napthomycine B hygroscopicus herbimycine hygroscopicus var. geldanus geldamycine var. nova nigellus 21-hydroxy-25-demethyl 25-methylthioproto- streptovaricine rishiriensis mycotrienes sp. E/784 actamycin and mycotriene sp. E88 mycotrienes spectabilis streptovaricines tolypophorous tolypomycine III) Organismes producteurs d'Anthracycline et de Quinone ORGANISME ANTIBIOTIQUE Streptomyces caespitosus mitomycines A, B, et C coélicolor actinorhodine

coeruleorubidicus daunomycine<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> cyaneus ditrisarubicine<BR> <BR> <BR> <BR> flavogriseus cyanocycline A galilaeus aclacinomycine A, auramycines, sulfurmycines lusitanus napthyridinomycine peuceticus daunomycine, adriamycine violochromoqenes arugomycine IV) Organismes producteurs de Beta Lactame ORGANISME ANTIBIOTIQUE Cephalosporium (espèces variées) beta-lactames Nocardia lactamadurans cephamycine C Penicillium (espèces variées) beta-lactames Streptomyces antibioticus acide clavulanique argenteolus asparenomycine A, MM 4550, MM 13902 cattleya thienamycine chartreusis SF 1623, cephamycine A and B cinnamonensis cephamycine A and B clavuligerus PA-32413-I, cephamycine C, A16886A, acide clavulanique, et autres clavames fimbriatus cephamycine A and B flavovirens MM 4550 et MM 13902 flavus MM 4550 et MM 13902 fulvoviridis MM 4550 et MM 13902 griseus cephamycine A et B halstedi cephamycine A et B heteromorphus C2081X, cephamycine A, B hygroscopicus deacetoxycephalosporine C lipmanii penicilline N, 7-methoxycephalosporine C, A16884, MM 4550, et MM 13902 olivaceus (MM 17880) epithienamycine F, MM 4550, et MM 13902 panayensis C2081X, cephamycine A, B pluracidomyceticus pluracidomycine A roche ! cephamycine A et B sioyaensis MM 4550 et MM 13902 sp. OA-6129 OA-6129A sp. KC-6643 carpetimycine A tokunomensis asparenomycine A viridochro7nogenes cephamycine A et B

wadayamensis WS-3442-D V) Organismes producteurs de Macrolide, Lincosamide, et Streptogramine ORGANISME ANTIBIOTIQUE Micromonospora rosaria rosaramicine Streptomyces albireticuli carbomycine albogriseolus mikonomycine albus albomycetine albus var coilmyceticus coleimycine ambofaciens spiramycine, foromacidine D antibioticus oleandomycine avermitilis avermectines bikiniensis chalcomycine bruneogriseus albocycline caelestis M188, celesticetine cinerochromogenes cineromycine B cirratus cirramycine deltae deltamycines djakartensis niddamycine erythreus erythromycines eurocidicus methymycine eurythermus angolamycine fasciculus amaromycine felleus argomycine et picromycine fimbriatus amaromycine flavochromogenes amaromycine, et shincomycines fradiae tylosine fungicidicus NA-181 fungicidicus var. espinomyceticus espinomycetines furdicidicus mydecamycine goshikiensis bandamycine griseofaciens PA133A et B <BR> <BR> griseoflavus acumycine<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> griseofuscus bundline griseolus griseomycine griseospiralis relomycine griseus borrelidine griseus ssp. sulphurus bafilomycines halstedi carbomycine, leucanicidine hygroscopicus tylosine hygroscopicus subsp aureolacrimonsus milbemycines kitastoensis leucomycine A. sub. 3, et josamycine lavendulae aldgamycine lincolnensis lincomycine loidensis vernamycine A et B macrosporeus carbomycine

maizeus ingramycine mycarofaciens acetyl-leukomycine, et espinomycine narbonensis josamycine et narbomycine narbonensis var. josamyceticus leucomycine A, josamycine olivochromogenes oleandomycine platensis platenomycine rimosus tylosine et neutramycine rochei lankacidine et borrelidine rochei var. volubilis T2636 roseochromogenes albocyline roseocitreus albocycline spinichromoenes var. suragaoensis kujimycines tendae carbomycine thermotolerans carbomycine venezuelae methymycines violaceoniger lankacidines, lankamycine VI) Espèces de Streptomyces producteurs d'antibiotiques variés a) Analogues d'aminoacides Streptomyces sp. Cycloserine b) Contenant des noyaux cyclopentanes Streptomyces coelicolor methylenomycine A erythrochromogenes sarkomycine violaceoruber methylenomycine A c) Containing de l'azote Streptomyces venezuelae chloramphenicol d) Polyènes Streptomyces griseus candicidine nodosus amphotericine B noursei nystatine e) Tétracyclines Streptomyces aureofaciens tetracycline, chlortetra- cycline, demethyltetra- cycline, et demethylchlortetra-cycline rimosus oxytetracycline VII) Organismes producteurs de Nucléosides ORGANISME ANTIBIOTIQUE Corynebacterium michiganese pv. rathayï, analogues de tunicamycine Nocardia candidus pyrazofurine Streptomyces antibioticus ara-A chartreusis tunicamycine

griseoflavusvar. streptoviridans thuringiensis griseolus sineingine VIII) Organismes producteurs de Peptides ORGANISME ANTIBIOTIQUE Actinoplanes missouriensis actaplanine teichomyceticus teicoplanine Bacillus (espèces variées) bacitracine, polymixine, et colistine Nocardia candidus A-35512 et avoparcine lurida ristocetine orientalis vancomycine Streptomyces antibioticus actinomycine aureus thiostreptone canus amphomycine eburosporeus LL-AM374 naranomacnlensls vancomycine pristinaespiralis pristinamycine roseosporus lipopeptides, tel A21978C toyocaensis A47934 virginiae A1030 IX) Organismes producteurs d'Antibiotiques ORGANISME ANTIBIOTIQUE Actinomadura (espèces variées) polyéthers variés Dactylosporangium (espèces variées) polyéthers variés Nocardia (espèces variées) polyéthers variés Streptomyces albus A204, A28695A et B, et salinomycine aureofaciens narasine cacaoi var. asoensis lysocelline chartreusis A23187 cinnamonensis monensine conglobatus ionpmycine eurocidicus var. asterocidicus laidlomycine flaveolus CP38936 gallinarius RP 30504 griseus grisorixine hygroscopicus A218, emericide, DE3936, A120A, A28695A et B, etheromycine, dianemycine lasaliensis lasalocide longwoodensis lysocelline mutabilis S-1173a ribosidificus lonomycine violaceoniger nigericine Streptoverticillium (espèces variées) polyéthers variés

L'invention sera davantage détaillée à l'aide des exemples ci-dessous.

Exemple 1 Inactivation du régulon Pho de Streptomyces lividans Comme cela a été précisé ci-dessus, une situation de limitation en Pi déclenche l'expression du régulon Pho, ensemble de gènes dont l'expression permet de retarder l'apparition d'un état de carence en Pi. Si cette réponse adaptative ne peut avoir lieu, il s'en suit une situation de carence en Pi. La carence en Pi entraîne le déclenchement de processus adaptatifs différents de ceux induits par une limitation en Pi et ce sont ces processus encore mal connus qui conduisent, chez Streptomyces, au déclenchement de la biosynthèse d'antibiotiques.

En interrompant les deux gènes'phot (kinase) et phoP (régulateur) qui, chez Streptomyces lividans, constituent vraisemblablement le système à deux composants responsable de l'activation de l'expression de l'ensemble des gènes du régulon Pho de Streptomyces, les Inventeurs ont créé précocement une situation de carence sévère en Pi.

Ces mutants surproduisent de façon massive les antibiotiques.

A) Principe de la méthode : Les Inventeurs ont isolé et interrompu les deux gènes phoR (kinase) et phot (régulateur) qui, chez Streptomyces lividans, constituent vraisemblablement le système à deux composants responsable de l'activation de l'expression de l'ensemble des gènes du régulon Pho de Streptomyces. Les mutants phoR et phoP construits sont incapables d'induire l'expression des différents systèmes de récupération du Pi mentionnés ci-dessus, ils sont donc précocement et sévèrement carencés en Pi et surproduisent de façon massive les antibiotiques sur tous les milieux testés. a) Caractérisation des gènes phoR/phoP : 1 In silico : Les systèmes à deux composants apparentés aux couples phoR (kinase) /phoP (régulateur) de Bacillus subtilis et phoR (kinase) /phoB (régulateur) d'Escherichia coli ont été recherché dans le génome entièrement séquencé de Streptomyces coelicolor (espèce très proche de S. lividans mais qui. est beaucoup plus facilement manipulable par les techniques classiques de biologie moléculaire que cette dernière) à l'aide du logiciel BLAST.

Plusieurs protéines putative de S. coelicolor se sont révélées avoir une homologie significative avec ces protéines. Des recherches de similarités de ces protéines de S. coelicolor ont ensuite été faites dans les génomes de B. subtilis et E. coli (système de BLAST retour) et ont révélées que seuls cinq couples kinase/régulateur de S. coelicolor présentaient une similarité significative avec les couples initiaux.

2 In vivo : Les gènes codant ces protéines ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN chromosomique de S. coelicolor et ont servi de sonde pour détecter par des techniques de "Northern blot"les transcripts correspondants. Des ARNs avaient été préparés en conditions d'abondance ou de limitation en Pi dans un contexte sauvage et mutant pour le gène ppk. En effet on savait que l'interruption du gèneppk conduisait à une limitation précoce en Pi et donc sans doute au déclenchement de l'expression du régulon Pho. Sur les cinq candidats un seul présentait le type de régulation attendue c'est à dire une augmentation de son niveau d'expression en condition de limitation en Pi. Cette augmentation était beaucoup plus importante dans un contexte muté pour ppk. Chez Streptomyces, ce couple a été appelé phoR (kinase)/phoP (régulateur). b) Clonage de l'opéron phoRIph Le protocole de clonage et d'interruption des gènes phoR et phoP décrit ci-dessous est applicable à toutes les souches de Streptomyces et à d'autres espèces bactériennes d'intérêt industriel.

1 Un fragment de S. lividans d'environ 3.2 kb contenant l'opéron phoR-phoP et 500bp en amont et en aval de ce dernier a été amplifié grâce à deux oligonucléotides convenablement choisis à partir de la séquence de la région équivalente de S. coelicolor.

2Une cassette conférant la résistance à l'apramycine a été cloné dans un site NotI situé au centre du gène phoP et amené à bord franc à l'aide du fragment Klenow de façon à l'interrompre. Une cassette excisable conférant la résistance à l'apramycine a été clonée dans le site NcoI situé au centre du gène thor et amené à bord franc à l'aide du fragment Klenow, de façon à interrompre ce dernier. Il est à noter que, pour des raisons scientifiques, nous avons utilisé pour interrompre phoR une cassette excisable car phot et phoP étant co- transcrits, l'interruption de phoR a un effet polaire sur l'expression de phoP.

3 Les fragments portant les gènes phoR et phoP interrompus ont été clonés dans pGM160 vecteur à réplication thermosensible. Ces vecteurs ont été introduits chez S. lividans et un remplacement des gènes phoR et phoP sauvages par leur copie interrompue a été réalisé par un protocole standard.

Compte tenu de la forte homologie de séquence détectée par Southern entre les gènes phoR/phoP de S. lividans et celui de diverses souches de Streptomyces productrices d'antibiotiques, il n'est pas nécessaire de re-cloner les gènes correspondants pour construire des mutants d'interruption chez ces espèces. En effet, les gènes phoR/phoP des différentes souches de Streptomyces sont suffisamment similaires à celui de S. lividans pour que la double recombinaison entre séquences homologues, nécessaire à la création du mutant par remplacement de gène, soit possible.

Nous avons montré qu'une souche de Streptomyces lividans chez laquelle les gènes phot et/ou phoP étaient interrompus produisait beaucoup plus d'antibiotique que la souche sauvage sur tous les milieux testés. Le gène phoP code l'activateur transcriptionnel du régulon Pho de Streptomyces et ce dernier requière une phosphorylation par phot pour remplir sa fonction activatriçe. Chez un mutant d'interruption des gènes phoR etlou phoP, l'induction des gènes nécessaires pour l'adaptation de la bactérie à une concentration limitante en Pi n'a pas lieu. Ce dernier est donc précocement et sévèrement carencé en Pi et il s'ensuit une induction massive de la production d'antibiotique.

B) Méthode expérimentale détaillée Clonage et interruption des gènes phot, PAzoR et de l'opéron phoR-zAhoP de Streptomyces lividans : - Un opéron codant un système à deux composants constitué d'une kinase sensorielle PhoR (427 AA) et un régulateur PhoP (224 AA) possédant 67% d'identité avec leurs homologues respectifs PhoR et PhoB d'E. coli a été trouvé dans le génome entièrement séquencé de Streptomyces coelicolor, espèce très voisine de S. lividan. s.

- deux sites uniques NcoI et NotI (enzymes donnant des extrémités 5'sortantes) situés respectivement vers l'extrémité 3'du gène phoR et vers l'extrémité 5'du gène phoP ont été repérés (ils sont soulignés en italiques et en gras sur la séquence SEQ ID NO : 1 de la figure 1) et considérés comme étant bien situés pour servir de sites d'insertion à une cassette d'interruption.

- Deux oligos A et B (en gras sur la séquence de la figurel) ont alors été conçus de façon à amplifier par PCR toute la région.

- Le fragment amplifié à l'aide de ces oligos a ensuite été cloné dans le site SmaI du plasmide pIJ2925 (Janssen and Bibb, 1993) pour donner pSGl.

- pSGl a été digéré par NcoI (site unique dans le plasmide). Le site NcoI a été amené à bord franc par le fragment Klenow et la cassette exisable Raac qui confère la résistance à l'apramycine (Blondelet-Rouault et al., 1997) a été cloné dans ce site, sous forme d'un fragment EcoRV pour interromprephoR et donner pSG2.

- pSGl a été digéré par NotI (site unique dans le plasmide). Le site NotI a été amené à bord franc par le fragment Klenow et la cassette 0 arc qui confère la résistance à l'apramycine (Blondelet-Rouault. et al., l9. 97) a été cloné dans ce site, sous forme d'un. fragment SmaI pour interromprephoP et donner pSG3.

- pSGl a été digéré par NotI et NcoI. Le fragment NotI-NcoI de l'insert a été éliminé et les sites NcoI et NotI ont été amené à bord franc par le fragment Klenow délété et la cassette Qaac qui confère la résistance à l'apramycine (Blondelet-Rouault et al., 1997) a été cloné sous forme d'un fragment SmaI à la place du fragment NcoI- NotI délété pour interrompre conjointement phoR et phoP. et pour donner pSG4.

- L'insert de pSG2 a été cloné sous forme d'un fragment EcoRI-XbaI (amené à bord franc par le fragment Klenow) dans le site BamHI (amené à bord franc par le fragment Klenow) de pGM160, pour donner pSG7. pGM160 est un vecteur navette E. coli/S. lividans à réplication thermosensible chez S. lividans. Il porte les gènes bla et tsr qui confèrent la résistance à l'ampicilline chez E. coli et au nosiheptide chez S. lividans respectivement, ainsi que le gène aacCl qui confère la résistance à l'apramycine à E. coli et S. lividans - Les inserts de pSG3 et pSG4 ont été transférés sous forme de fragments BglII dans le site BamHI de pGM160 (Muth et al., 1989) pour donner respectivement les plasmides pSG5 et pSG6.

- Ces plasmides pSG5, pSG6 et pSG7 ont été introduit chez S. lividans par les techniques de transformation habituelles (Hopwood et al., 1985). Les colonies transformées ont été sélectionnées en présence de nosiheptide.

- Afin de procéder à un remplacement des gènes phoR et phoP sauvages par leurs allèles interrompus, des colonies indépendantes de S. lividans TK24 contenant pSG5, pSG6 ou pSG7 et donc résistantes au nosiheptide ont été broyées et mises à pousser indépendamment pendant 24 h à 30°C dans 2 ml de milieu TSB (Hopwood et al., 1985 contenant de l'apramycine à 25 µg/ml.

- Le mycélium ainsi produit a ensuite été potterisé et le broyat a servi à inoculer à faible densité 2 ml de milieu TSB contenant de l'apramycine à 25 ug/ml.

- Les cultures ont été mises à pousser à 41°C pendant 48 heures afin de permettre l'élimination du plasmide réplicatif.

- Le mycélium a ensuite été récolté, broyé, et soniqué de façon à avoir des fragments mycéliens correspondant à une seule cellule. Ces derniers ont été étalés en dilution sur des boîtes de milieu HT agar (Hopwood et al., 1985) contenant de l'apramycine à 50, ug/ml afin d'avoir des colonies bien séparées.

- Les colonies sporulées ont ensuite été répliquées sur milieu HT et milieu HT contenant du nosiheptide à 20, ug/ml afin de repérer les colonies sensibles au nosiheptide.

Environ 15 % des colonies résistantes à l'apramycine étaient sensibles au nosiheptide.

Ces dernières ayant perdu le plasmide réplicatif étaient susceptibles d'être les doubles recombinants attendus.

- La surproduction d'antibiotique, l'actinorhodine, par la souche mutée pour phoP est constatée de visu (Figure 5) ; en effet en milieu liquide, les cultures de S. lividans muté pour phot apparaissent beaucoup plus sombres (Figure 5 à gauche) que celles de la souche sauvage (Figure 5 à droite) du fait de la production accentuée d'un composé bleu, l'actinorhodine.

- Alternativement, il est possible prélever des carottes de milieu nutritif gélosé ayant servi à la croissance de S. lividans, muté et non muté, de les dissoudre dans de l'eau en

chauffant à 90°C, puis de mesurer l'absorbance à 600 nm des solutions ainsi obtenues afin de quantifier l'actinorhodine ayant diffusé dans le milieu gélosé.

Exemple 2 Inactivation du régulon Pho de Streptomyces ambofaciens Streptomyces ambofaciens produit au moins deux antibiotiques, la spiramycine et la congocidine. Afin d'analyser dans cette souche les effets de l'inactivation de l'opéron Pho, les gènes phot et phoP de S. ambofaciens ont été inactivés, selon le protocole décrit dans l'exemple 1, à l'aide des plasmides pSG5 et pSG6.

La souche mutée de S. amblofariens obtenue est testée pour sa capacité. de surproduction de spiramycine et de congocidine par rapport à la souche sauvage correspondante.

La surproduction de la spiramycine est mise en évidence par un dosage biologique, comme cela est décrit dans Gourmelen et al. (1998) Antimicrob. agents chemother. 42 : 2612- 2619.

Brièvement, la présence de spiramaycine dans le milieu de culture de S. ambofaciens est mesurée par le prélèvement d'un échantillon du milieu de culture dont on imbibe un disque de papier absorbant de type Whatman. Ce disque est alors déposé sur une boite de culture sur laquelle une souche bactérienne indicatrice sensible à la spiramycine et résistant à la congocidine a été préalablement ensemencée. Le diamètre d'inhibition de croissance bactérienne observé autour du disque de papier, indicatif de la quantité d'antibiotique présente dans le milieu de culture, est alors mesuré.

La présence de congocidine est mesurée de manière semblable, en utilisant une souche bactérienne indicatrice sensible à la congocidine et résistant à la spiramycine.

Légende des figures Figure 1 : Séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 d'un fragment de 3541bp de S coelicolor contenant l'opéron phoR phoP codant la kinase sensorielle et le régulateur du régulon Phosphate. Les codons de début et de fin de traduction sont en italiques et les séquences en aa sont fournies. Les oligonucléotides A et B utilisés pour l'amplification par PCR du fragment d'ADN qui a servi à l'interruption de l'operon phoR phoP de S. lividans sont en gras. Les sites NotI et NcoI sont soulignés en gras et en italiques. Les sites PstI et BspEI sont soulignés et en gras.

Figure 2 : séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 : Mutant phoR : : Qaac Figure 3 : séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 : Mutant phoP : : ! 2aac Figure 4 : séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 : Double mutant phoR/phoP::#aac Figure 5 : photographie d'une culture de S. lividans muté pour phoP (à gauche) et d'une culture de S. lividans sauvage (à droite). La culture de S. lividans muté selon l'invention (à gauche) apparaît beaucoup plus sombre du fait de la sur-production d'un antibiotique de couleur bleue, l'actinorhodine.

REFERENCES : 1. Akiyama, M., E. Crooke, and A. Kornberg. 1992. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. J Biol Chem. 267 (31) : 22556-61.

2. Blondelet-Rouault, M. H., J. Weiser, A. Lebrihi, P. Branny, and J. L. Pernodet.

1997. Antibiotic resistance gene cassettes derived from the omega interposon for use in E. coli and Streptomyces. Gene. 190 (2) : 315-7.

3. Hopwood DA, B. M., Chater KF, Kieser T, Bruton CJ, Kieser HM, Lydiate DJ, Smith CP, Ward JM and schrempf H. 1985. Genetic Manipulation of Streptomyces : a laboratory Manual., Norwich : John ines Foundation.

4. Janssen, G. R., and M. J. Bibb. 1993. : Derivatives of pUC18 that have BglII sites flanking a modified multiple cloning site and that retain the ability to identify recombinant clones by visual screening of Escherichia coli colonies. Gene. 124 (1) : 133-4.

5.-Muth, G., B. Nussbaumer, W. Wohlleben, and A. Pülher. 1989. A vector system with temperature-sensitive replication for gene disruption and mutational cloning in streptomycetes. Mol Gen Genet. 219 : 341-348.